FORMOWANIE I REGENERACJA PĄKÓW PRZYBYSZOWYCH W KULTURACH in vitro PRZYLASZCZKI POSPOLITEJ (Hepatica nobilis SCHREB.)

Transkrypt

1 ZESZYTY PROBLEMOWE POSTĘPÓW NAUK ROLNICZYCH 2009 z. 539: FORMOWANIE I REGENERACJA PĄKÓW PRZYBYSZOWYCH W KULTURACH in vitro PRZYLASZCZKI POSPOLITEJ (Hepatica nobilis SCHREB.) BoŜena Szewczyk-Taranek, Zbigniew Pindel Katedra Roślin Ozdobnych, Uniwersytet Rolniczy im. H. Kołłątaja w Krakowie Wstęp Hepatica nobilis SCHREB. - przylaszczka pospolita (Ranunculaceae) jest cieniolubną byliną kwitnącą obficie wczesną wiosną, której dodatkową ozdobą są zimozielone, skórzaste liście. Masowe pozyskiwanie przylaszczki ze stanowisk naturalnych spowodowało, Ŝe od 2005 roku znalazła się pod ochroną gatunkową [PIĘKOŚ- MIRKOWA, MIREK 2006]. NajwaŜniejszym czynnikiem ograniczającym rozpowszechnienie tej ciekawej i dekoracyjnej byliny wiosennej w ogrodnictwie ozdobnym są trudności z jej mnoŝeniem. RozmnaŜanie generatywne jest procesem długotrwałym, okres juwenilny od wysiewu do kwitnienia trwa 4-5 lat [NOMIZU i in. 2004]. RozmnaŜanie generatywne nie moŝe być stosowane w uprawie odmian, w szczególności tych najcenniejszych, o pełnych kwiatach. Natomiast rozmnaŝanie roślin przez podział i sadzonkowanie kłącza jest mało wydajne [SZEWCZYK-TARANEK, PINDEL 2008]. Poszukując innych moŝliwości intensyfikacji mnoŝenia przylaszczek, rozwiązaniem byłoby opracowanie metody rozmnaŝania in vitro, która ma zastosowanie przede wszystkim w produkcji roślin trudno mnoŝących się wegetatywnie metodami tradycyjnymi. Ponadto rozmnaŝanie klonalne pozwala na skrócenie prac hodowlanych, uzyskanie roślin wyrównanych fenotypowo i produkcję roślin bez względu na porę roku [BACH 2001]. Z dostępnej literatury wiadomo, Ŝe problemem rozmnaŝania przylaszczki w kulturach tkankowych zajmują się zespoły badawcze w Japonii. Hepatica jest tam bardzo popularną byliną, m.in. dzięki zaawansowanej hodowli [NOMIZU i in. 2003]. W pracy przedstawiono wyniki badań nad wzbudzeniem pąków przybyszowych i regeneracją roślin przylaszczki pospolitej w kulturach in vitro. Materiał i metody Badania przeprowadzono w 2005 roku w laboratorium kultur tkankowych Katedry Roślin Ozdobnych UR w Krakowie. Do indukcji pąków przybyszowych uŝyto eksplantatów wtórnych - blaszek liściowych z przylaszczek zregenerowanych in vitro w kulturach pąków bocznych, na poŝywce MS zawierającej 2 µm BA i 0,2 µm NAA. Przed wyłoŝeniem na poŝywki liście nacinano wzdłuŝ nerwów głównych. Eksplantaty wykładano po 6 sztuk na szalki Petriego ( 7 cm) zawierające 15 ml poŝywki zestalonej 7% agarem Difco. Zastosowana poŝywka podstawowa wg MURASHIGE i SKOOGA [1962] (MS) zawierała 30 g dm -3 sacharozy oraz róŝne stęŝenia regulatorów

2 702 B. Szewczyk-Taranek, Z. Pindel wzrostu: benzyloadeniny (BA, 0,5 5,0 µm) i kwasu α-naftalenooctowego (NAA, 0,5 5,0 µm), ph 5,7. Kultury umieszczono w fitotronie w temperaturze 20 C, 80% wilgotności względnej, przy 16-godzinnym dniu (fotoperiod, PPFD 30 µmol m -2 s -1 ) lub w ciemności. Eksplantaty pasaŝowano co 6 tygodni (3 pasaŝe). Po upływie 18 tygodni oceniano wpływ auksyny i cytokininy zawartej w poŝywce oraz warunków świetlnych na indukcje pąków przybyszowych na fragmentach liści. Obliczono współczynnik namnaŝania (liczbę nowo powstałych pąków przybyszowych na eksplantat), a takŝe oceniono regenerację korzeni przybyszowych oraz indukcję kalusa. Następnie uzyskane pąki przybyszowe wykładano na poŝywkę stałą MS z dodatkiem: 2,0 µm BA i 0,2 µm NAA (do 200 ml kolb Erlenmayera) i kultywowano na świetle w warunkach opisanych wcześniej. Uzyskane wtórne pąki kątowe po kolejnych 18 tygodniach przeniesiono na poŝywki MS zawierające 2,0 µm BA i 0,2 µm NAA oraz 3,0 µm GA 3 w róŝnych kombinacjach (tab. 2). Po 6 tygodniach przeprowadzano obserwacje biometryczne licząc współczynnik namnaŝania pąków (liczba nowo powstałych pąków na regenerujący eksplantat), średnią wysokość roślin (mm). Obserwowano takŝe jakość zregenerowanych pąków: pojawienie się witryfikacji. Wszystkie doświadczenia zakładano w 8 powtórzeniach, po 6 eksplantatów w kaŝdym. Wyniki opracowano statystycznie metodą analizy wariancji, a istotność róŝnic oceniono testem Duncana na poziomie =0,05. Analizę wariancji dotyczącą danych procentowych przeprowadzono na wartościach transformowanych (transformacja Blissa). Wyniki i dyskusja Do inicjacji pąków przybyszowych uŝyto blaszek liściowych przylaszczki (eksplantatów wtórnych) z roślin uzyskanych w kulturach in vitro, na poŝywce MS zawierającej 2 µm BA i 0,2 µm NAA, poniewaŝ we wstępnych doświadczeniach liście pochodzące z przylaszczek rosnących w warunkach polowych (eksplantaty pierwotne) nie podjęły regeneracji, niezaleŝnie od sposobu dezynfekcji powierzchniowej i terminu ich pobrania (wyników nie przedstawiono). NOMIZU i in. [2003] wzbudzili pąki przybyszowe na fragmentach młodych liści przylaszczki pobieranych z poletek doświadczalnych, ale badania prowadzili na japońskiej odmianie botanicznej przylaszczki pospolitej (Hepatica nobilis var. japonica f. manga). Na zdolności regeneracyjne eksplantatów mogą mieć wpływ róŝnice odmianowe [BACH 2001]. W celu inicjacji pąków przybyszowych w kulturach przylaszczki, liście kultywowano na trzech poŝywkach o róŝnej proporcji cytokininy (BA) w stosunku do auksyny (NAA): cytokinina>auksyna, cytokinina=auksyna, cytokinina<auksyna (tab. 1). Intensywność formowania pąków przybyszowych na fragmentach liści zaleŝała od proporcji zastosowanych w poŝywce regulatorów wzrostu. Pąki przybyszowe pojawiły się po tygodniach trwania kultury, na poŝywce zawierającej 5 µm BA i 0,5 µm NAA (tab. 1). Pąki obserwowano. Procent eksplantatów formujących pąki przybyszowe nie zaleŝał od warunków świetlnych. 10% eksplantatów formowało pąki przybyszowe w ciemności i 12%, gdy kultury pozostawały na świetle. Podobnie współczynnik namnaŝania pąków przybyszowych na liściach wynosił 2,5 sztuki na regenerujący eksplantat () lub 1,9 pąka na regenerujący eksplantat (), (tab. 1). Podobne wyniki uzyskali w badaniach nad przylaszczką NOMIZU i in. [2003]. Na poŝywce MS zawierającej 5 mg dm -3 BA i 0,5 mg dm -3 NAA (lub 1 mg dm -3 NAA) zainicjowali pąki przybyszowe u 20% eksplantatów po 16 tygodniach kultury. W badaniach własnych na poŝywce zawierającej równowagę auksyn i cytokinin (5 µm BA i 5 µm NAA) oraz na poŝywce z przewagą auksyn (0,5 µm BA i 5 µm NAA) zaobserwowano formowanie korzeni i tkanki kalusowej. Dodatek 5 µm NAA i 0,5 µm BA do poŝywki

3 FORMOWANIE I REGENERACJA PĄKÓW PRZYBYSZOWYCH spowodował bardzo intensywne róŝnicowanie korzeni przybyszowych u wszystkich eksplantatów, średnio 6,3 korzenia na eksplantat. Na tej poŝywce rozwijał się takŝe kalus, szczególnie w ciemności (100% eksplantatów formowało kalus), (tab. 1). Uzyskany kalus, mimo przeniesienia na świeŝą poŝywkę, o identycznym składzie, nie podejmował regeneracji i zamierał po 6 tyg. Wpływ stęŝenia regulatorów wzrostu i warunków świetlnych na formowanie pąków przybyszowych w kulturach in vitro przylaszczki pospolitej Effect of growth regulators concentration and conditions on formation of adventitious buds in in vitro culture of Hepatica nobilis Tabela 1; Table 1 Cechy regeneracji eksplantatów Explants regenerating factors Warunki świetlne Light conditions 5 µm NAA 0,5 µm BA PoŜywka podstawowa MS MS basal medium 5 µm NAA 5 µm BA 0,5 µm NAA 5 µm BA Eksplantaty z pąkami przybyszowymi (%) Explants with adventitious buds (%) Współczynnik namnaŝania Multiplication rate Eksplantaty regenerujące korzenie przybyszowe (%) Explants regenerating adventitious roots (%) Liczba korzeni na regenerujący eksplantat Number of roots per regenerating explant Eksplantaty formujące kalus (%) Explants forming callus (%) 0,0 a* 0,0 a 12,0 b 0,0 a 0,0 a 10,0 b 0,0 a 0,0 a 2,5 b 0,0 a 0,0 a 1,9 b 100,0 c** 54,0 b 2,0 a 100,0 c 60,0 b 6,0 a 6,5 c 4,5 b 0,1 a 6,2 c 4,6 b 0,5 a 80,0 b 6,0 a 4,0 a 100,0 c 10,0 a 4,0 a * średnie oznaczone tą samą literą nie róŝnią się istotnie przy α=0,05; means followed by the same letter do not differ significantly at α=0.05 ** 100% stanowiły wszystkie eksplantaty w kombinacji; all explants in combination =100% Tabela 2; Table 2 Wpływ gibereliny w poŝywce namnaŝającej na wzrost przylaszczki pospolitej in vitro Influence of gibberellin in multiplication media on growth of Hepatica nobilis in vitro PoŜywka podstawowa MS MS basal medium Współczynnik namnaŝania Multiplication rate Liczba liści na eksplantat Number of leaves per explant Wysokość liści (mm); Height of leaves (mm) Witryfikacja Vitrification (%) 2 µm BA+3 µm GA 3 0,45 a* 2,28 b 14,1 b 33,3** 2 µm BA+3 µm GA 3 0,90 a 3,94 c 19,2 c 28,6

4 704 B. Szewczyk-Taranek, Z. Pindel +0,2 µm NAA 2 µm BA+0,2 µm NAA 3,28 b 0,60 a 8,6 a 0 *, ** objaśnienia jak w tabeli 1; explanations see Table 1 Otrzymane pąki przybyszowe wyłoŝone na poŝywkę MS wzbogaconą w 2 µm BA i 0,2 µm NAA w 62% regenerowały wtórne pąki kątowe. Na powyŝszej poŝywce pąki nie podejmowały wzrostu, obserwowano jedynie ich namnaŝanie. Dodatek do poŝywki GA 3 (3 µm) ograniczył namnaŝanie pąków kątowych, ale stymulował wyrastanie i wydłuŝanie liści (rys. 1). Procent eksplantatów regenerujących pąki boczne na poŝywkach z GA 3 był niski (10%-18%). Podobnie współczynnik namnaŝania był niŝszy na poŝywce zawierającej 2 µm BA i 3 µm GA 3 oraz na poŝywce z 2 µm BA, 0,2 µm NAA oraz 3 µm GA 3 i wynosił odpowiednio 0,45 i 0,9 pąka kątowego na regenerujący eksplantat (tab. 2). Eksplantaty kultywowane na poŝywce bez kwasu giberelinowego charakteryzowały się wyŝszym współczynnikiem rozmnaŝania (3,2 pąka kątowego na regenerujący eksplantat), (tab. 2). *, ** objaśnienia jak w tab. 1; explanations see Table 1 Rys. 1. Wpływ gibereliny w poŝywce na regenerację i wzrost wydłuŝeniowy liści z pąków bocznych przylaszczki pospolitej in vitro Fig. 1. Effect of gibberellin addition to MS medium on regeneration and elongation of axillary buds of Hepatica nobilis in in vitro culture NajwyŜsze eksplantaty (19,2 mm) rozwinęły się na poŝywkach z cytokininą i auksyną wzbogaconych w GA 3. Eksplantaty rosnące na poŝywce niezawierającej GA 3 były niŝsze i miały średnio 8,6 mm wysokości. Na poŝywkach z gibereliną notowano witryfikację u około 30% eksplantatów, co obniŝa znacznie jakość nowo powstałych pąków (tab. 2). W badaniach nad rozmnaŝanien in vitro innych gatunków z rodziny jaskrowatych przed ukorzenianiem dodawano do poŝywki GA 3. Pąki przybyszowe przylaszczki pospolitej odm. japońskiej, długości 1 2 mm wydłuŝały się na poŝywce z dodatkiem GA 3 (10 mg dm -3 ) wraz z BA (5 mg dm -3 ) [NOMITZU i in. 2003], ale tylko 50% z tych pąków podjęło dalszy wzrost. SEYRING [2002] przenosił eksplantaty ciemiernika w ostatnim pasaŝu przed ukorzenianiem na poŝywki z GA 3 (2,9 µm) i BA (2,2 µm), co polepszało jakość roślin ex vitro. Z kolei LIM i KITTO [1995] w kulturach ciemiernika nie

5 FORMOWANIE I REGENERACJA PĄKÓW PRZYBYSZOWYCH stwierdzili pozytywnego wpływu GA 3 na jakość roślin. Wnioski 1. Formowanie pąków przybyszowych w kulturach in vitro przylaszczki pospolitej zaleŝy od stęŝenia BA i NAA w poŝywce. Przewaga cytokininy (5,0 µm BA) nad auksyną (0,5 µm NAA) inicjuje proces powstawania pąków przybyszowych. 2. Dodatek kwasu giberelinowego (3,0 µm GA 3 ) do poŝywki stymuluje rozwój nowo powstałych pąków, powodując wydłuŝanie liści i jednocześnie obniŝa współczynnik namnaŝania pąków kątowych. 3. RozmnaŜanie przylaszczki metodą kultur tkankowych, drogą pąków przybyszowych i kątowych, jest skuteczną metodą zwiększającą wydajność mnoŝenia tego gatunku. Literatura BACH A RozmnaŜanie wegetatywne, w: Biotechnologia roślin. Malepszy S. (red.). PWN, Warszawa: LIM C.C., KITTO S.L Micropropagation of Helleborus orientalis Lam. and Aconitum uncinatum Linn. (Ranunculaceae). HortScience 30(4): MURASHIGE T., SKOOG F A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures. Physiologia Plantarum 15: NOMIZU T., NIIMI Y., KASAHARA S In vitro micropropagation of Yukiwariso (Hepatica nobilis Schreb. var. japonica f. magna) by leaf segment culture. Journal of the Japanese Society for Horticultural Science 72/3: NOMIZU T., NIIMI Y., WATANABE E Embryo development and seed germination of Hepatica nobilis Schreb. var. japonica was affected by temperature after sowing. Scientia Horticulturae 99: PIĘKOŚ-MIRKOWA H., MIREK Z Flora Polski. Rośliny chronione. Oficyna Wydawnicza Multico. Warszawa: 304. SEYRING M In vitro cloning of Helleborus niger. Plant Cell Reports 20: SZEWCZYK-TARANEK B., PINDEL Z RozmnaŜanie przylaszczki pospolitej (Hepatica nobilis Schreb.) za pomocą sadzonek kłączowych. Zesz. Probl. Post. Nauk Rol. 525: Słowa kluczowe: Hepatica nobilis, kultury in vitro, pąki przybyszowe, korzenie przybyszowe, BA, NAA, GA 3 Streszczenie Opisano metodę rozmnaŝania przylaszczki pospolitej (Hepatica nobilis SCHREB.) drogą wzbudzania pąków przybyszowych in vitro. Eksplantatami były liście przylaszczki pobierane z roślin rosnących w warunkach in vitro. UŜyto poŝywkę MS według Murashige i Skooga (1962) zawierającą róŝne stęŝenia: cytokininy BA (0,5 5,0 µm) i auksyny NAA (0,5 5,0 µm). Kultury utrzymywano w warunkach 16-godzinnego dnia lub w ciemności. Najwięcej pąków przybyszowych formowało się na eksplantatach liściowych na poŝywce wzbogaconej w 5 µm BA i 0,5 µm NAA niezaleŝnie od warunków świetlnych. Natomiast na poŝywkach zawierających jednakowe ilości auksyn i cytokinin oraz z przewagą auksyn obserwowano formowanie licznych korzeni i kalusa. Pąki przybyszowe róŝnicowały pąki kątowe na poŝywce zawierającej 2,0 µm

6 706 B. Szewczyk-Taranek, Z. Pindel BA i 0,2 µm NAA. WydłuŜanie liści uzyskano na identycznej poŝywce dodatkowo wzbogaconej w 3 µm GA 3. ADVENTITIOUS BUDS FORMATION DURING in vitro MICROPROPAGATION OF NOBLE LIVERLEAF (Hepatica nobilis SCHREB.) BoŜena Szewczyk-Taranek, Zbigniew Pindel Department of Ornamental Plants, Agricultural University, Kraków Key words: Hepatica nobilis, in vitro cultures, adventitious buds, adventitious roots, BA, NAA, GA 3 Summary A rapid system for Hepatica nobilis SCHREB. multiplication in vitro was described in the paper. Adventitious buds were induced on leaf segments derived from plants grown in vitro, on MS medium Murashige, Skoog (1962), supplemented with growth regulators: 5 µm BA and 0,5 µm NAA. On media contained balanced concentrations of BA and NAA or with NAA domination, callus and adventitious roots were induced. Adventitious buds formed secondary axillary buds on MS media containing 2 µm BA and 0,2 µm NAA. Prolongation and development of axillary shoots was obtained on the same media with addition of 3 µm GA 3. Dr BoŜena Szewczyk-Taranek Katedra Roślin Ozdobnych Uniwersytet Rolniczy im. H. Kołłątaja al. 29 Listopada KRAKÓW szewczykb@ogr.ar.krakow.pl