Metoda bezpośredniego uzyskiwania podwojonych haploidów z mikrospor zarodków rzepaku ozimego (Brassica napus L.)

Transkrypt

1 Tom XIX Rośliny Oleiste 98 Teresa Cegielska-Taras, Laurencja Szała Instytut Hodowli i Aklimatyzacji Roślin, Zakład Roślin Oleistych w Poznaniu Metoda bezpośredniego uzyskiwania podwojonych haploidów z mikrospor zarodków rzepaku ozimego (Brassica napus L.) Direct production of doubled haploid plants from microspore-derived embryos of winter oilseed rape (Brassica napus L.) Szybkie otrzymywanie roślin bezpośrednio z mikrosporowych zarodków jest podstawowym warunkiem wydajnej produkcji linii DH rzepaku ozimego. Wstępne wyniki badań wykazały, że mikrosporowe zarodki rzepaku ozimego w stadium liścieni ( 22 dniowe) są zdolne do rozwoju w rośliny wtedy, kiedy zostaną poddane działaniu temperatury 1 C przez 14 dni przed przeniesieniem do temperatury 24 C. W celu uzyskiwania skutecznego podwojenia liczby chromosomów izolowanych mikrospor dodawano kolchicynę do pożywki w ciągu 24 godzin prowadzenia kultury. An efficient method enabling to obtain in a short time plants from microspore-derived embryos is of a great importance for the production of homozygous oilseed rape. Our preliminary investigations revealed that those embryos at the cotyledonary stage (aprox. 22 days), are competent to develop into plantlets when exposed to 1 C for 14 days, prior to the recovery period at 24 C. In order to improve the efficiency of diploidization of the isolated microspores colchicine was added to the medium for the first 24 h of culture. Wstęp Mikrospory posiadają szczególną zdolność do rozwoju w rośliny haploidalne drogą androgenezy in vitro. Działanie stresu, u Brassica napus jest to wysoka temperatura o C, indukuje sporofitowy rozwój mikrospory, zapobiegając rozwinięciu płodnego pyłku (droga gametofitowa). Podwojone haploidy (DH) powstałe wskutek działania kolchicyną (np. na mikrospory tuż po izolacji) są całkowicie homozygotyczne, a przez to niezwykle atrakcyjne w genetycznych manipulacjach oraz różnych programach hodowlanych. Celem pracy jest opracowanie metody bezpośredniego uzyskiwania roślin podwojonych haploidów z mikrosporowych zarodków rzepaku ozimego.

2 354 Teresa Cegielska-Taras... Materiał i metody Materiał do badań stanowiły odmiany rzepaku ozimego: Bor, Kana oraz mieszańce F1: BK 09, BK 2994, H-7. Przygotowanie roślin dawców mikrospor oraz kulturę mikrospor połączoną z kolchicynowaniem in vitro prowadzono według metodyki opisanej wcześniej (Cegielska-Taras, Szała 97). Prawidłowo wykształcone zarodki po 28 dniach kultury wykładano na pożywkę stałą B 5 z dodatkiem 2% sacharozy, 0,1 mg/l GA 3 i 0,8% agaru. Na szalki Petriego o średnicy 9 cm nakładano po 10 zarodków. Następnie szalki umieszczano na okres 14 dni w temperaturze 1 C przy 8-godzinnym oświetleniu. Po tym czasie szalki przenoszono w warunki pokoju hodowlanego: 24 C temperatura i 16-godzinne oświetlenie. W ciągu kolejnych trzech tygodni zaobserwowano rozwój prawidłowych pędów z merystemu wierzchołkowego zarodka oraz także rozwój korzeni. Młode rośliny przenoszono do gleby. Opisany tok postępowania przedstawia schemat 1. Izolacja mikrospor Traktowanie kolchicyną (18 godz.; 0,005%) NLN-13 Inkubacja w ciemności w 30 C 10 dni Inkubacja w ciemności w 24 C 4 dni Wytrząsanie na świetle do zazielenienia 3 dni Wytrząsanie na świetle NLN-8 2 dni Kultura zarodków na pożywce B 5 z 0,1 mg/l GA 3 w 1 C 14 dni Pokój hodowlany 24 C 21 dni Przeniesienie do gleby NLN pożywka (Lichter 82) NLN-8 płynna pożywka NLN z 8% sacharozą NLN-13 płynna pożywka NLN z 13% sacharozą B 5 stała pożywka wg Gamborga z 2% sacharozą i 0,8% agarem (Gamborg 68) GA 3 kwas giberelinowy Schemat 1. Schemat wydajnego uzyskiwania roślin podwojonych haploidów bezpośrednio z mikrosporowych zarodków rzepaku ozimego The system of efficient regeneration of winter rapeseed doubled haploids directly from microspore-derived embryos

3 Metoda bezpośredniego uzyskiwania podwojonych haploidów Wyniki i dyskusja Szybkie i bezpośrednie uzyskiwanie roślin z mikrosporowych zarodków jest ważnym etapem w masowej produkcji podwojonych haploidów rzepaku ozimego. Zarodki mikrosporowe rzepaku w połączeniu z selekcją lub mutacją in vitro wykorzystuje się w różnych programach hodowlanych. Jednak otrzymywanie z nich roślin przebiega zazwyczaj długo; ze względu na wiek zarodka istnieje konieczność wielokrotnego przekładania na różne pożywki indukujące powstawanie pędów i korzeni ( Cegielska-Taras i in. 97; Cegielska-Taras i in., w druku). Linie DH, zarówno rzepaku ozimego jak i innych gatunków, wykorzystuje się powszechnie w selekcji roślin o pożądanych cechach użytkowych. Dlatego dąży się do opracowania taniej metody otrzymywania roślin homozygotycznych w dużej liczbie z wybranych mieszańców lub odmian. Tabela 1 Bezpośrednie otrzymywanie roślin z mikrosporowych zarodków rzepaku ozimego po indukcji w temperaturze 1 C przez 14 dni Plants obtained directly from microspore-derived embryos of winter oilseed rape after exposure to 1 o C for 14 days Roślina dawca mikrospor Microspore donor plant BOR odmiana cv. BOR odmiana cv. KANA odmiana cv. BK 09 mieszaniec hybrid BK 2994 mieszaniec hybrid H-7 mieszaniec hybrid Wiek zarodka (liczba dni po izolacji mikrospor) Embryo age (days after isolation) Rozwój pędu z merystemu wierzchołkowego Shoot development directly from embryonic stem apex [%] 87,8 83,8 44,4 60,7 45,8 90,0 Prowadzone są prace nad wpływem różnych czynników indukujących merystem wierzchołkowy zarodków mikrosporowych do podziałów i różnicowania, takich jak: wiek, podsuszanie czy okresowe działanie niską temperaturą. Wynika z nich, że podstawowe znaczenie ma wiek zarodka, gdyż konwersja zarodków mikrosporowych (odpowiednik kiełkowania zarodków zygotycznych) możliwa jest po osiągnięciu morfologicznej, strukturalnej i fizjologicznej dojrzałości (Iwanowska i in. 97; Kott i Beversdorf 90).

4 356 Teresa Cegielska-Taras... Przedstawione badania wykazały, że zarodki rzepaku ozimego osiągnęły tę dojrzałość już po 3 tygodniach, podczas gdy rzepaku jarego, według Iwanowskiej i in. (97) oraz Kott (98), osiągają ją dopiero po 4 tygodniach prowadzenia kultury. Tylko w stadium gotowym do konwersji zarodki można poddać działaniu niskiej temperatury. Dla odmian jarych wystarczająca okazuje się ekspozycja w temperaturze 4 C w ciągu dni. W prezentowanej pracy zarodki rzepaku ozimego traktowano temperaturą 1 C w ciągu 14 dni przy 8-godzinnym oświetleniu. Różnicowanie pędu z wierzchołka merystemu najwyższe było u młodych zarodków 22 dniowych i wynosiło 60,7 90,0% (tab. 1). Kott i Beversdorf (90) wykazali 63% konwersję 21-dniowych zarodków rzepaku ozimego po indukcji w temperaturze 0 C przez 12 dni. W przeprowadzonych doświadczeniach zaobserwowano, że konwersja zarodków w rośliny malała wraz z ich wiekiem. Z wykładanych dniowych zarodków otrzymano jedynie około 45% prawidłowo wykształconych młodych roślin (tab. 1). Metoda bezpośredniego otrzymywania roślin z mikrosporowych zarodków rzepaku ozimego opisywana w niniejszej pracy jest już rutynowo stosowana przy masowej produkcji linii DH na potrzeby różnych programów hodowlanych. Jest to metoda szybka. Po upływie około 55 dni od izolacji mikrospor, prawidłowo wykształcone rośliny, w fazie 2 3 liści są przenoszone do gleby. Prezentowany sposób uzyskiwania podwojonych haploidów jest przede wszystkim wygodny i tani. Wymaga tylko jednego przeszczepienia, w warunkach sterylnych, trzytygodniowych zarodków na szalki z 12 ml pożywki. Po upływie następnych 35 dni młode rośliny znajdują się w stadium odpowiednim do wysadzania do gleby. Obniża się bardzo koszt uzyskania linii DH poprzez oszczędność nakładu pracy oraz materiałów. Otrzymany wysoki procent androgenicznych roślin z badanych roślin dawców mikrospor zachęcił do dalszych szczegółowych badań nad optymalizacją warunków indukowania konwersji zarodków. Wyniki tych prac będą przedmiotem kolejnych publikacji. Literatura Cegielska-Taras T., Szała L. 97. Regeneracja roślin z mikrosporowych zarodków rzepaku ozimego (Brassica napus L.), Rośliny Oleiste, XVIII (1) Cegielska-Taras T., Szała L., Gazecka B., Liersch A., Popławska W., Bartkowiak-Broda I. 97. Wczesna selekcja androgennych linii rzepaku ozimego z genem restorerem dla systemu CMS ogura i niską zawartością glukozynolanów. Zeszyty Naukowe Akademii Rolniczej w Krakowie, 250: Cegielska-Taras T., Szała L., Nałęczyńska A., Czernik-Kołodziej K., Ogrodowczyk M. 98. Selection in vitro for high erucic acid content in microspore-derived embryos of winter oilseed

5 Metoda bezpośredniego uzyskiwania podwojonych haploidów rape (Brassica napus L.) and production of homozygous lines. Journal of Applied Genetics w druku. Gamborg O. L., Miller R. A., Oijwa K. 68. Nutrient requirements of suspension culture of soybean root callus. Experimental Cell Research 50: Iwanowska A., Chomicz B., Tykarska T., Kuraś M. 97. Zarodki mikrosporowe Brassica napus L. cv. Topas i ich konwersja. Rośliny Oleiste, XVIII (1): 11-. Kott L. 98. Application of doubled haploid technology in breeding of oilseed Brassica napus. Ag. Biotech. News and Information, 10, 3, 69N-74N. Kott L., Beversdorf W. D. 90. Enhanced plant regeneration from microspore-derived embryos of Brassica napus by chilling, partial desiccation and age selection. Plant Cell, Tissue and Organ Culture, 23: Lichter R. 82. Induction of haploid plants from isolated pollen of Brassica napus L. Z. Pflanzenphysiol., 105: