Ocena przydatności podłoża chromogennego do izolacji Clostridium difficile z przewodu pokarmowego dzieci z biegunką

Transkrypt

1 MED. DOŚW. MIKROBIOL., 2012, 64: Ocena przydatności podłoża chromogennego do izolacji Clostridium difficile z przewodu pokarmowego dzieci z biegunką Assessment of the usefulness of chromogenic medium for the isolation of Clostridium difficile from the gastrointestinal tract of children with diarrhoea Joanna Kądzielska 1*, Hanna Pituch 1, Aleksandra Banaszkiewicz 2, Andrzej Radzikowski, 2 Dorota Wultańska 1, Piotr Obuch-Woszczatyński 1, Grażyna Młynarczyk 1 1 Katedra i Zakład Mikrobiologii Lekarskiej Warszawski Uniwersytet Medyczny w Warszawie 2 Klinika Gastroenterologii i Żywienia Dzieci, Warszawski Uniwersytet Medyczny w Warszawie Pięćdziesiąt dziewięć próbek kału pobranych od 43 dzieci z biegunką w celu przeprowadzenia rutynowej diagnostyki zakażenia C. difficile, zbadano na obecność toksyn A/B C. difficile stosując testy komercyjne. Jednocześnie te same próbki kału posiano na dwa podłoża selektywne do izolacji szczepu: CLO i CDIFF (biomerieux S.A., Francja). Hodowlę inkubowano odpowiednio 48 godz. i 24 godz. W 22 próbkach wykryto toksyny A/B C. difficile. Z 24 próbek kału posianych na podłoża selektywne wyhodowano szczepy C. difficile: z 8 próbek kału na podłożu CLO oraz z 16 próbek na podłożu CDIF. Podłoże CDIF jest bardziej efektywne do izolacji szczepów C. difficile z próbek kału pobranych od dzieci z biegunką. Słowa kluczowe: zakażenie C. difficile, dzieci, efektywność podłoża chromogennego do izolacji C. difficile ABSTRACT Introduction: Clostridium difficile is well known as an important cause of nosocomial infection. Laboratory diagnostics have included bacterial culture or more commonly, direct detection of preformed toxin in stool samples using different assays. The aim of this study was to evaluate and compare two selecitve media to isolation of C. difficile from paediatric diarrhoeal stool samples. Methods: Fifty nine stool samples, collected from 43 children with diarrhoea, were examined for routine laboratory diagnosis of C. difficile infection. Commercially available tests

2 198 J. Kądzielska i inni Nr 3 for detection of A/B toxins of C. difficile were performed. The same stool samples were cultured on two selective media for strain isolation: CLO and CDIFF (biomerieux S.A., France) and incubated 48h and 24h respectively. Results: Twenty two samples gave positive results for toxins A/B C. difficile. From 24 samples inoculated on selective media C. difficile strains were cultured: from 8 samples on CLO medium and from 16 samples on CDIFF medium. Conclusions: CDIFF medium is more effective for isolation of C. difficile strains from stool samples collected from children with diarrhoea. Key words: C. difficile infection, children, effectiveness of C. difficile chromogenic agar WSTĘP Clostridium difficile to ważny patogen zakażeń szpitalnych, wywołujący biegunkę poantybiotykową i rzekomobłoniaste zapalenie jelita grubego. W patogenezie zakażenia biorą udział toksyny: toksyna A (TcdA), toksyna B (TcdB) natomiast rola trzeciej toksyny tzw. toksyny binarnej nie jest do końca ustalona (5, 11). Za szczep toksynotwórczy uznaje się szczep, który wytwarza przynajmniej jedną toksynę (10). Wykrycie toksyn w próbce kału jest ważnym elementem diagnostyki mikrobiologicznej. Do niedawna metodą referencyjną był test neutralizacji cytotoksyczności na linii komórkowej. Jednak jest to metoda droga i czasochłonna oraz wymaga prowadzenia linii komórkowej. W związku z powyższym większość laboratoriów używa komercyjnych testów immunoenzymatycznych wykrywających toksyny TcdA i/lub TcdB. Testy te są szybkie i proste w wykonaniu, o dużej czułości i swoistości (1, 8, 11, 12, 13). Elementem diagnostyki zakażenia C. difficile jest wyhodowanie szczepu C. difficile. Dodatni wynik hodowli jest potwierdzeniem rozpoznania. Izolacja C. difficile z próbki kału umożliwia typowanie szczepu dla celów epidemiologicznych, oraz ewentualne badanie wrażliwości na leki przeciwbakteryjne stosowane w celach leczniczych. Badania lekowrażliwości wyhodowanych szczepów C. difficile nie jest w tej chwili obowiązkowe, ale być może ze względu na pojawianie się szczepów o obniżonej wrażliwości na metronidazol oraz wankomycynę może stać się w niedalekiej przyszłości niezbędnym elementem badania laboratoryjnego (2, 3, 4, 8, 9, 11). Zakażenia C. difficile u dzieci z nieswoistym zapaleniem jelit (NZJ) zdarzają się często i stanowi to ważny problem zarówno kliniczny jak i diagnostyczny (6, 15). Celem przedstawionych badań była ocena przydatności selektywnego podłoża chromogennego do izolacji C. difficile z próbek kału dzieci z nieswoistym zapaleniem jelit oraz dzieci z podejrzeniem biegunki infekcyjnej. MATERIAŁ I METODY Do badań użyto 59 próbek kału pobranych od dzieci i młodzieży w wieku 2-18 lat: 39 próbek kału od 23 dzieci z nieswoistym zapaleniem jelit (NZJ) oraz 20 próbek pobranych od

3 Nr 3 Izolacja C. difficile na podłożu chromogennym dzieci z podejrzeniem biegunki infekcyjnej. Obecność toksyn A i B C. difficile w próbkach kału oznaczano przy użyciu testów immunoenzymatycznych: Tox A/BII TM (TechLab, Inc., Blackburg, VA, USA) lub Vidas C. difficile Toxin A&B (biomerieux S.A., Francja). Próbki kału posiewano równocześnie na dwa podłoża selektywne do izolacji C. difficile: CLO agar (biomerieux S.A., Francja) oraz podłoże chromogenne ChromID TM C. difficile (biomerieux S.A., Francja). Oba podłoża inkubowano w warunkach ściśle beztlenowych w anaerostatach odpowiednio przez 48 h i 24 h w temp. 37 C. Do dalszej identyfikacji wybrano kolonie, które na podłożu CLO dawały żółto-zieloną fluorescencję w świetle UV (dł. fali 365 nm) i miały charakterystyczny zapach p-krezolu a na podłożu CDIF rosły w postaci charakterystycznych, czarnych kolonii. Dalszą identyfikację izolatu prowadzono na podstawie wykonania preparatu barwionego metodą Grama i wykrycia Gram-dodatnich laseczek oraz identyfikowania izolatu testem API20A. WYNIKI I ICH OMÓWIENIE Ogółem przebadano 59 próbek kału od pacjentów, w tym 39 pobranych od pacjentów z nieswoistym zapaleniem jelit, oraz 20 od pacjentów z biegunką, w kierunku obecności toksyn C. difficile oraz izolacji zarazka. Dodatnie wyniki testów na obecność toksyn A i B C. difficile uzyskano w przypadku 22 próbek kału (22/59) (Tabela II i III). Jednocześnie uzyskano 24 dodatnie wyniki posiewów w kierunku bakterii C. difficile: 8 na podłożu CLO (8/59) i 16 na podłożu CDIF (16/59) (Tabela I). Wszystkie izolaty, które wyrosły na podłożu CLO, wyrosły równocześnie na podłożu CDIF. W przypadku pacjentów z nieswoistym zapaleniem jelit oraz pozostałych pacjentów z biegunką z podłoża chromogennego CDIF Tabela I. Zestawienie liczby pacjentów oraz liczby próbek kału zbadanych w kierunku toksyn A/B C. difficile oraz hodowli szczepu na podłożach CLO i CDIF Liczba pacjentów Liczba próbek kału Liczba próbek dodatnich w kierunku toksyn A/B Dodatnia hodowla na podłożu CLO Dodatnia hodowla na podłożu CDIF Nieswoiste zapalenie jelit Biegunka infekcyjna Razem Tabela II. Wyniki testów immunoenzymatycznych w kierunku toksyn A/B C. difficile oraz hodowli szczepu na podłożach CLO i CDIF uzyskane z próbek kału pacjentów z nieswoistym zapaleniem jelit Wynik toksyn Hodowla na Hodowla na podłożu Hodowla ujemna (CLO Liczba próbek A/B podłożu CLO CDIF i CDIF) Dodatni Wątpliwy Ujemny Razem

4 200 J. Kądzielska i inni Nr 3 częściej izolowano szczepy C. difficile oraz krótszy był czas hodowli. W przypadku wątpliwego wyniku badania na obecność toksyn A/B C. difficile (9 przypadków próbek pobranych z przewodu pokarmowego pacjentów z nieswoistym zapaleniem jelit) również na podłożu CDIF wykrywano częściej szczepy C. difficile (Tabela II). Uzyskane wyniki są obiecujące, mając na uwadze trudności na jakie dotychczas napotykano w izolacji szczepów C. difficile z próbek kału, w szczególności pochodzących od dzieci z NZJ. Tabela III. Wyniki testów immunoenzymatycznych w kierunku toksyn A/B C. difficile oraz hodowli szczepu na podłożach CLO i CDIF uzyskane z próbek kału pacjentów z biegunką Wynik toksyn A/B Liczba próbek Hodowla na podłożu CLO Hodowla na podłożu CDIF Hodowla ujemna (CLO i CDIF) Dodatni Wątpliwy Ujemny Razem PODSUMOWANIE W ostatniej dekadzie zaobserwowano wzrost częstości zakażeń C. difficile, ponadto pojawiły się nowe szczepy epidemiczne (7, 14). Hyperwiruletne szczepy powodujące epidemię związane są zwykle z poważniejszym przebiegiem choroby i znacznie większą śmiertelnością (8). W czasie epidemii biegunki szpitalnej obecne są często szczepy C. difficile należące do różnych genotypów (9). W wielu laboratoriach w USA i Wielkiej Brytanii diagnostyka biegunki poantybiotykowej ogranicza się do wykrywania toksyn C. difficile w próbkach kału, natomiast w wielu krajach europejskich wykonuje się zarówno testy do wykrywania toksyn jak i posiew próbki kału (2, 11). Niektóre testy immunoenzymatyczne stosowane do wykrywania toksyn (TcdA i/lub TcdB) w kale posiadają niską wartość predykcyjną wyników dodatnich (8, 14). Również obecność związków hamujących oraz zmienna ilość toksyn w próbce kału, a także niestabilność produktów mogą prowadzić do wyników fałszywie ujemnych (9, 11). Uzyskanie fałszywie dodatniego wyniku ma ważne implikacje kliniczne i epidemiologiczne, ponieważ pacjent z potwierdzeniem laboratoryjnym zakażenia C. difficile jest zazwyczaj leczony farmakologicznie, kohortowany lub podlega izolacji. Podnosi to koszty leczenia i negatywnie wpływa na politykę antybiotykową. Odwrotna sytuacja, czyli uzyskanie wyniki fałszywie ujemnego, może spowodować zakażenia krzyżowe i rozprzestrzenianie się C. difficile w środowisku szpitalnym (2, 14). Diagnostyka mikrobiologiczna i epidemiologia zakażeń C. difficile stanowią najważniejszy aspekt badań nad tym drobnoustrojem, z punktu widzenia zagrożeń jakie niesie ze sobą niewłaściwa polityka antybiotykowa i coraz częstsze zakażenia również w grupach tzw. niskiego ryzyka, do których zalicza się pacjentów pediatrycznych (9). Hodowla szczepów C. difficile, ważny etap badania diagnostycznego mikrobiologiczego, uznawana jest w dalszym ciągu za,,złoty środek w diagnostyce zakażeń wywołanych przez C. difficile.

5 Nr 3 Izolacja C. difficile na podłożu chromogennym 201 PIŚMIENNICTWO 1. Alcala L, Marin M, Madrid M i inni. Comparison of ImmunoCard Toxins A&B and the New Semi-automated VIDAS C. difficile Toxin A&B Tests for the Diagnosis of Clostridium difficile infection. J.Clin. Microbiol. 2010; doi: /jcm Delmee M, Van Broeck J, Simon A i inni. Laboratory diagnosis of Clostridium difficile-associated diarrhoea: a plea for culture. J Med Microbiol 2005; 54: Fenner L, Widmer A, Goy G i inni. Rapid and reliable diagnostic algorithm for detection of Clostridium difficile. J Clin Microbiol 2008; 46: Huang H, Weintraub A, Hong F i inni. Antimicrobial susceptibility and heteroresistance in Chinese Clostridium difficile strains. Anaerobe 2010; 16: Kim J.H, Muder R.R. Clostridium difficile enteritis: a review and pooled analysis of the cases. Anaerobe 2011; 17: Pascarella F, Martinelli M, Miele E i inni. Impact of Clostridium difficile infection on pediatric inflammatory bowel disease. J Peds 2009; 154: Pituch H, Bakker D, Kuijper E i inni. First isolation of Clostridium difficile PCR-ribotype 027/ toxinotype III in Poland. Pol J Microbiol 2008; 57: Perry J.D, Asir K, Halimi D i inni. Evaluation of a chromogenie culture medium for isolation of Clostridium difficile within 24 hours. J Clin Microbiol 2010; 48: Poxton J.R. Clostridium difficile. J Med Microbiol 2005; doi /jmm Rupnik M, Dupuy B, Fairweather N. F i inni. Revised nomenclature of Clostridium difficile toxins and associated genes. J Med Microbiol 2005; 54: Shin B, Kuak E.Y, Lee E. J i inni. Algorithm combining toxin immunoassay and stool culture for diagnosis of Clostridium difficile infection. J Clin Microbiol 2009; 47: Swindells J, Brenwald N, Reading N i inni. Evaluation of diagnostic tests for Clostridium difficile infection. J Clin Microbiol 2010; 48: Sy C, Rheu J. K, Kim M. H i inni. Comparison of simultaneous use of C. DIFF QUICK CHEK and VIDAS C. difficile Toxin A&B to detect C. difficile in fecal specimen. J. Lab. Med. Qual. Assur. 2009; 31: Wilcox M.H. Recomended protocol for testing for Clostridium difficile and subsequent culture. Evaluation report CEP08054, 2009; Wultańska D, Banaszkiewicz A, Radzikowski A i inni. Nawracające zakażenia Clostridium difficile u dzieci z nieswoistymi zapaleniami jelit-badanie pilotażowe. Pediatr. Współcz Gastroenterol Hepatol Żywienie Dziecka. 2009;11: Otrzymano: 21 VI 2012 r. Adres Autora: Warszawa, ul. Chałubińskiego 5, Katedra i Zakład Mikrobiologii Lekarskiej WUM

6