I Wydział Lekarski / II Wydział Lekarski Wirusy DNA

Transkrypt

1 I Wydział Lekarski / II Wydział Lekarski Ćwiczenie 15 Wirusy DNA I. Seminarium: Właściwości ogólne i patogeneza zakaŝeń wybranych wirusów DNA w powiązaniu z ich chorobotwórczością II. Do wykonania: 1. Izolacja wirusa z materiał klinicznego (keratoconjunctivitis) w hodowli komórkowej 2. Diagnostyka mononukleozy zakaźnej odczyn monospot (wykrywanie przeciwciał heterofilnych nieswoista diagnostyka serologiczna) 3. Diagnostyka mononukleozy zakaźnej ciąg dalszy: wykrywanie przeciwciał przeciw antygenom VCA, EA i EBNA-1 wirusa EBV przy uŝyciu metody ELISA serologiczne odczyny swoiste 4. Diagnostyka serologiczna w przypadku reaktywacji zakaŝenia EBV 5. Odczyn ELISA w diagnostyce zakaŝeń parwowirusem B19 wykrywanie przeciwciał i antygenu wirusa w surowicy krwi 6. Odczyn immunoperoksydazowy w diagnostyce zakaŝeń adenowirusami III. Demonstracje: 1. Diagnostyka wirusowego zapalenia opon mózgowo rdzeniowych i mózgu zastosowanie metody multiplex-pcr. Sekwencje starterów, układy kontrolne. 2. Identyfikacja typu wirusa na podstawie porównania sekwencji nukleotydów z uŝyciem programu BLASTN /dr n. med. Maciej Przybylski/ 1

2 1. Izolacja wirusa z materiału klinicznego na hodowli komórkowej Opis przypadku: Do okulisty zgłosiła się 52-letnia kobieta uskarŝająca się na zaczerwienienie spojówek, łzawienie, uczucie piasku pod powiekami. Objawy te pojawiły się u niej poprzedniego dnia. W badaniu przedmiotowym lekarz stwierdził przekrwienie spojówek, łzawienie oraz pojedyncze, punktowe, niecharakterystyczne ubytki nabłonka rogówki. Pobrano wymaz ze spojówek. Materiał poddano wstępnej obróbce typowej dla badań wirusologicznych. Do wykonania: (Uwaga: wszystkie czynności związane z hodowlami komórkowymi wykonujemy przy zachowaniu jalowości) 1. Zlać poŝywkę wzrostową znad hodowli komórkowej (Vero hodowla komórek nabłonkowych z nerki małpiej, wraŝliwa na zakaŝenie zarówno herpeswirusami jak i adenowirusami) 2. Ze stojących na lodzie probówek z materiałem klinicznym umieszczonym w poŝywce utrzymującej pobrać 1 ml i przenieść do probówki z hodowlą 3. Obserwacja efektu cytopatycznego po 24 h (na jutrzejszym ćwiczeniu) Do wykrywania antygenów wirusowych w zakaŝonej hodowli komórkowej moŝna stosować odczyn immunoperoksydazowy, odczyn immunofluorescencji lub testy immunoenzymatyczne. 2. Diagnostyka serologiczna mononukleozy zakaźnej Opis przypadku (pacjent 1): Osiemnastoletni męŝczyzna zgłosił się do lekarza z powodu bólów gardła, osłabienia i wysokiej gorączki. W badaniu przedmiotowym lekarz stwierdził powiększenie migdałków, powiększenie węzłów chłonnych szyi, bolesność palpacyjną wątroby oraz powiększenie śledziony. W obrazie krwi stwierdzono umiarkowaną leukocytozę ( leukocytów/mm 3 ) oraz obecność limfocytów atypowych. Po rozpoznaniu wstępnym mononukleozy zakaźnej lekarz zdecydował się na wykonanie serologicznych testów diagnostycznych, które potwierdziłyby diagnozę wstępną. Odczyn Monospot (wykrywanie przeciwciał heterofilnych): W przebiegu mononukleozy zakaźnej wzrost miana przeciwciał heterofilnych często występuje juŝ w pierwszym tygodniu od pojawienia się objawów klinicznych. Do wykrywania przeciwciał heterofilnych stosuje się testy aglutynacyjne z uŝyciem stabilizowanych krwinek baranich zawierających antygeny heterofilne (test Paula-Bunnela-Davidsohna - PBD) krwinek końskich (test monospot ) lub lateksu opłaszczonego antygenem heterofilnym (test MZ).. Do wykonania: Na szkiełkach podstawowych sprawdzić reakcje surowic kontrolnych (dodatniej i ujemnej) z lateksem MZ. Następnie wykonać właściwe badanie z surowicą pacjenta. 2

3 3. Odczyn ELISA w diagnostyce mononukleozy zakaźnej poszukiwanie swoistych przeciwciał (c.d. punktu 2.) Wykrycie w surowicy swoistych przeciwciał skierowanych przeciw antygenom wirusa Epsteina-Barr stanowi potwierdzenie zakaŝenia. W odniesieniu do do objawów klinicznych, wyników testów laboratoryjnych i wyników testów nieswoistych (P-B-D, test lateksowy MZ, monospot) ułatwia postawienie jednoznacznej diagnozy mononukleozy zakaźnej. Swoista odpowiedź humoralna w mononukleozie zakaźnej: W przebiegu mononukleozy zakaźnej jako pierwsze pojawiają się przeciwciała anty-vca (przeciw antygenowi kapsydu), nieco później anty-ea (przeciw antygenowi wczesnemu), przy czym przeciwciała te nie pojawiają się u wszystkich ludzi, u których występują objawy mononukleozy zakaźnej. Jako ostatnie pojawiają się przeciwciała anty-ebna (przeciw antygenowi jądrowemu). Utrzymujące się długotrwale wysokie miano przeciwciał anty-ebna charakterystyczne jest dla zakaŝeń przewlekłych wywołanych przez EBV oraz dla zmian limfoproliferacyjnych o etiologii EBV. 4. Zastosowanie odczynu ELISA do wykrywania swoistej odpowiedzi humoralnej (IgM, IgG) wobec antygenów EBV w przypadku reaktywacji zakaŝenia latentnego (pacjent 2) Oprócz diagnostyki w przypadku podejrzenia mononukleozy zakaźnej, która jest najpowszechniejszą formą objawową ostrego pierwotnego zakaŝenia EBV w populacji immunokompetentnej, swoiste testy serologiczne mogą być pomocne w ocenie statusu odpowiedzi humoralnej w przypadkach zakaŝeń pacjentów z grup ryzyka w 3

4 odniesieniu do cięŝkich postaci zakaŝeń EBV. U pacjentów poddanych immunosupresji, z wrodzonymi zaburzeniami immunologicznymi oraz u pacjentów cierpiących na nowotwory, zarówno zakaŝenia pierwotne jak i wynikajace z reaktywacji latentnego EBV mogą prowadzic do szeregu zespołów klinicznych takich jak zespoły limfoproliferacyjne, chroniczne aktywne zakaŝenie EBV lub zespoły zbliŝone do mononukleozy, lecz o cięŝszym przebiegu. 5. Odczyn ELISA w diagnostyce przełomu aplastycznego związanego z zakaŝeniem parwowirusem B19 Opis przypadku Z powodu powtarzających się od kilku dni krwawień z nosa, matka zdecydowała się przyprowadzic do przychodni 8-letniego chłopca. W wywiadzie stwierdzono w okresie ostatnich dwóch tygodni postępujące zmniejszenie aktywności ruchowej, senność, brak apetytu i utrzymującą się podwyŝszoną temperaturę ciała (37,5 C) przy wieczornym pomiarze. W badaniu przedmiotowym z odchyleń stwierdzono bladość skóry oraz drobne wybroczyny na błonach śluzowych jamy ustnej i gardła. Wykonano badanie laboratoryjne krwi. Stwierdzono niedokrwistość normocytową, znacznie zmniejszoną liczbę retikulocytów, granulocytopenię z względną limfocytozą oraz małopłytkowość. Stwierdzono takŝe znacznie wydłuŝony czas krwawienia, wzrost stęŝenia Ŝelaza w surowicy i zwiększone OB. Na podstawie wyników badań klinicznych i laboratoryjnych stwierdzono zmniejszoną czynność krwiotwórczą szpiku. Jako jedną z moŝliwych przyczyn uznano zakaŝenie parwowirusem B19. Lekarz zlecił wykonanie badań serologicznych: oznaczenie przeciwciał przeciw parwowirusowi B19 w klasach IgM i IgG oraz oznaczenie antygenu wirusa B19 we krwi pacjenta. Przebieg zakaŝenia pierwotnego parwowirusem B19 4

5 *)TAC transient aplastic crisis DO WYKONANIA W ODCZYNACH ELISA (do punktów 3, 4, 5): Do wszystkich opisanych dołków dodać po 50 µl chromogenu (tetrametylbenzydyny TMB). Następnie pasek inkubować przez 10 min. w temp. pokojowej w ciemności. Po inkubacji naleŝy przerwać reakcję enzymatyczną dodając do wszystkich dołków po 50 µl 0,5N roztworu H 2 SO 4. Wynik naleŝy odczytać nie później niŝ pół godziny po przerwaniu reakcji. 6. Odczyn immunoperoksydazowy w diagnostyce zakaŝeń adenowirusami Opis przypadku: U 20 letniego męŝczyzny przebywającego na oddziale chirurgii, w ósmej dobie po wykonanym zabiegu splenektomii, pojawiły się objawy zapalenia płuc. U chorego występował napadowy suchy kaszel, płytki oddech i podwyŝszona temperatura ciała (38,8 C przy wieczornym pomiarze). Z wywiadu wynika, Ŝe pacjent miewał juŝ zapalenia płuc (ostatnio dwa lata temu). Pacjent pali papierosy. W badaniu osłuchowym stwierdzono szmery oddechowe w dolnej lewej części klatki piersiowej. W badaniu radiologicznym w dolnym płacie płuca lewego stwierdzono kilka obszarów nacieczonych śródmiąŝszowo. Lekarz, biorąc pod uwagę wirusową etiologię zakaŝenia, zlecił laboratoryjną identyfikację czynnika etiologicznego. Pośród innych badań mikrobiologicznych, wykonano badanie polegające na izolacji wirusa z popłuczyn oskrzelowych w hodowlach komórkowych. Po obróbce, materiał posiano na hodowle komórkowe wraŝliwe na zakaŝenie wirusami oddechowymi (paramyksowirusy, ortomyksowirusy, adenowirusy). Po trzech dniach w linii komórkowej A 549 (linia wraŝliwa na zakaŝenie adenowirusami) pojawił się nasilony efekt cytopatyczny. W pozostałych liniach efekt cytopatyczny nie wystapił. Z komórek hodowli wykonano rozmaz na szkiełkach podstawowych, z przeznaczeniem do odczynu immunoperoksydazowego z uŝyciem surowicy wzorcowej (przeciwciała monoklonalne przeciw białkom heksonów adenowirusów, swoiste wobec wszystkich typów adenowirusów wywołujących zakaŝenia u człowieka) Wykonanie odczynu: UWAGA: Na kaŝdym stole jest przygotowany preparat z utrwalonymi komórkami zakaŝonymi adenowirusem. Wirus został poddany inaktywacji. Uwaga! Dotknięcie okrągłego pola na szkiełku doprowadzi do starcia komórek! Nie dotykać! 1. Na preparat utrwalony na szkiełku podstawowym nakroplić 20 µl wzorcowej surowicy (Buteleczka z ciemnego szkła podpisana Chromogen IP ). 2. Inkubować przez 10 minut w 37 C w komorze wilgotnej 3. Szkiełko umieścić w szklanym kominku do płukania, zalać zbuforowanym roztworem soli fizjologicznej (PBS), płukać przez dwie minuty, delikatnie poruszając szkiełkiem. Po wyjęciu z kominka szkiełko delikatnie osuszyć bibułą. 4. Na preparat nakroplić 20 µl chromogenu, inkubować przez 5 minut w komorze wilgotnej w temperaturze pokojowej. 5. Powtórzyć punkt Odczytać pod mikroskopem świetlnym (w pow. 400x) 5

6 DEMONSTRACJA: 1. Diagnostyka wirusowego zapalenia opon mózgowo-rdzeniowych i mózgu zastosowanie testu multiplex PCR (demonstracja) Opis przypadku: Do izby przyjęć szpitala rejonowego przywieziono 37-letniego męŝczyznę z temperaturą 39 C, dreszczami, silnym bólem głowy, nudnościami i wymiotami. W badaniu przedmiotowym stwierdzono zamroczenie, zaburzenia równowagi, lekki niedowład połowiczy oraz tachykardię. Pobrano krew i płyn mózgowo-rdzeniowy do badań ogólnych imikrobiologicznych. Badanie laboratoryjne płynu mózgowo-rdzeniowego wykazały umiarkowaną pleocytozę, poziom glukozy i białka w normie. Na podstawie wyników badań zdecydowano się wykonać równieŝ badanie wirusologiczne płynu mózgowo-rdzeniowego metodą multiplex-pcr pod kątem wirusa opryszczki. Badanie wykonano wg. procedury: I. Ekstrakcja DNA z próbki materiału klinicznego (200 µl płynu mózgowo-rdzeniowego) II. Amplifikacja DNA metodą reakcji łańcuchowej polimeryzacji III. Detekcja zamplifikowanych fragmentów DNA (rozdział elektroforetyczny produktów PCR w Ŝelu agarozowym) Zdjęcie Ŝelu po elektroforezie: 6

7 Oznaczenia: 100 bp M: znacznik długości produktu par zasad K (-): kontrola ujemna (DNA człowieka, wolne od DNA HSV) HSV 1 TK-, HSV 2 TK-: wzorcowe szczepy wirusa opryszczki zawierające zmutowany gen kinazy tymidynowej, oporne na acyklowir HSV 1 TK+, HSV 2 TK+: wzorcowe szczepy wirusa opryszczki zawierające prawidłowy gen kinazy tymidynowej, wraŝliwe na acyklowir P M-R: badany płyn mózgowo - rdzeniowy Długość produktów: HSV-1 (gen polimerazy DNA): 469 pz HSV-2 (gen polimerazy DNA): 390 pz Kinaza tymidynowa: 1200 pz 3. Identyfikacja typu wirusa na podstawie porównania sekwencji nukleotydów z uŝyciem programu BLASTN 1. W komputerze na sali ćwiczeń: w programie notatnik otworzyć plik sekwencji adenowirus.fas zawierający sekwencję produktu PCR przeprowadzonego ze starterami swoistymi dla adenowirusów (plik znajduje się na pulpicie). 2. Zaznaczyć całą sekwencję nukleotydów i skopiować ją (ctrl+c). 3. Otworzyć okno przeglądarki. Powinna być widoczna strona internetowa NCBI BLAST (basic local alignment search tool podstawowa wyszukiwarka lokalnych sekwencji komplementarnych). 4. W sekcji Basic BLAST wybrać program nucleotide blast 5. Wkleić skopiowaną sekwencję do okna Enter accesion number, gi or FASTA sequence (ctrl+v) 6. Sprawdzić, czy: a. Wybrana jest baza danych nucleotide collection (nr/nt) b. Zaznaczono opcję highly similar sequence c. Zaznaczono opcję Show results in a new window 7. Nacisnąć przycisk BLAST, w przegladarce pojawi się okno wyników. Poczekać, aŝ program przeszuka bazę danych. 8. Na podstawie podobieństwa sekwencji badanej i zestawu sekwencji z bazy danych zidentyfikować typ wirusa. Określić stopień podobieństwa najbardziej zbliŝonej sekwencji. Zidentyfikowany typ adenowirusa: Podobieństwo: [%] 7