I Wydział Lekarski II Wydział Lekarski WIRUSY RNA

Transkrypt

1 I Wydział Lekarski II Wydział Lekarski WIRUSY RNA Prelekcja 1. Charakterystyka i znaczenie kliniczne pikornawirusów 2. Wirus kleszczowego zapalenia mózgu (KZM), epidemiologia, patogeneza, chorobotwórczość, leczenie i kontrola zakażeń 3. Wirusowe zakażenia błony śluzowej żołądka i jelit Do wykonania: 1. Odczyn hemaglutynacji wirusowej (diagnostyka grypy) badanie jakościowe. 2. Odczyn SRH wykrywanie przeciwciał przeciwko wirusowi różyczki 3. Odczyn lateksowy w diagnostyce zakażeń rotawirusami Demonstracje 1. Odczyn ELISA diagnostyka nagminnego zapalenia przyusznic (NZP). 2. Próba kolorowa (odczyn neutralizacji) wirusy poliomyelitis; poszczepienny przegląd epidemiologiczny. 3. ELISA oznaczanie poziomu przeciwciał IgM w diagnostyce kleszczowego zapalenia mózgu. 4. Diagnostyka zakażeń Hantawirusem ELISA oznaczanie swoistych przeciwciał

2 1. Odczyn hemaglutynacji wirusowej diagnostyka grypy W październiku do lekarza zgłosiła się 52 letnia pacjentka z objawami: złe samopoczucie, gorączka, bóle głowy oraz bole mięśniowe, suchy kaszel, śluzowy katar, utrata apetytu. W wywiadzie ustalono, że pacjentka jest nauczycielem w szkole podstawowej i choruje na astmę. Lekarz, podejrzewając zakażenie wirusem grypy, pobrał wymaz z nosogardzieli i wykonał szybki test diagnostyczny w kierunku grypy. Uzyskano wynik negatywny. Celem potwierdzenia badania, materiał przesłano do laboratorium, gdzie zakażono nim permisywną linię komórkową (MDCK). Po 5 dniach hodowli w zakażonej linii zauważono efekt cytopatyczny (CPE). Z przygotowanego supernatantu wykonano test hemaglutynacji. 1. Jakie są inne metody laboratoryjnej diagnostyki grypy? 2. Jakie są możliwości leczenia i profilaktyki grypy? DO WYKONANIA Na szkiełko podstawowe nanosimy kroplę supernatantu znad hodowli komórkowej (MDCK). Dodajemy kroplę krwinek kurzych, mieszamy i odczytujemy wynik badania. Wynik odczytujemy porównując uzyskany obraz z odczynami kontrolnymi K+ kontrola dodatnia, K- kontrola ujemna. DEMONSTRACJA Wykrywanie antygenów wirusów grypy A i B w wymazach z nosa za pomocą techniki immunochromatograficznej. Szybki, jakościowy test in vitro wykrywający antygeny powierzchniowe H i N wirusa grypy typu A i B wyekstrahowane z próbek z dróg oddechowych. INTERPRETACJA WYNIKÓW Kolorowa linia w części okienka testowego oznaczonego C, wskazuje na właściwa pracę testu. Linia ta jest linią kontrolną. Część okienka testowego oznaczona T wskazuje na wynik oznaczenia. Jest to linia testowa. Wynik dodatni: Obecność dwóch kolorowych linii w okienku testowym ( T i C ) niezależnie, która pojawiła się pierwsza, wskazuje na wynik pozytywny.

3 Uwaga: Zasadniczo większe stężenie antygenu w próbce powoduje silniejszą barwę linii T. Jeżeli stężenie antygenu jest bliskie granicy czułości, lecz jeszcze w zakresie czułości testu, to zabarwienie linii T będzie słabe. Wynik ujemny: Obecność tylko linii C w okienku testowym wskazuje na wynik negatywny. Wynik nieważny: Jeżeli po wykonaniu testu w okienku testowym nie pojawiają się kolorowe linie, wynik uważany jest za nieważny. Przyczynami nieważności testu są: nieprzestrzeganie instrukcji wykonania, przekroczenie okresu ważności zestawu. Rekomenduje się ponowne przeprowadzenie oznaczenia nowym testem 2. Odczyn SRH wykrywanie przeciwciał przeciwko wirusowi różyczki Do poradni K zgłosiły się dwie pacjentki. W wywiadzie ustalono, że nie przebyły różyczki, nie było możliwe także odtworzenie historii szczepień. Lekarz zlecił wykonanie badań serologicznych w celu oznaczenia ich wrażliwości na zakażenie. Od pacjentek pobrano krew na skrzep. Wykonanie badania: do baseników wyciętych w żelu zawierającym krwinki uczulone antygenem wirusa różyczki oraz dopełniacz, należy dodać pipetą automatyczną po 50 µl surowic: 1. surowicę kontrolną dodatnią (surowica K+ do SRH), 2. surowice kontrolną ujemną (surowica K- do SRH), 3. badane surowice kontrolne (surowice C i D do SRH), płytki inkubować w temp. 37ºC przez 1,5 godziny. Diagnostyka laboratoryjna różyczki (nabytej i wrodzonej) może być przeprowadzona z zastosowaniem metod molekularnych (RT-PCR), zwykle jednak rozpoznanie kliniczne potwierdzane jest przez stwierdzenie swoistych dla wirusa przeciwciał IgM lub 4-krotnego wzrostu IgG w dwukrotnym badaniu surowicy krwi (surowice parzyste) pobranej w czasie trwania ostrej fazy zakażenia (7-10 dzień od pojawienia się wysypki) i okresie rekonwalescencji. Izolacja wirusa jest rzadko stosowana. Wirus może być izolowany z

4 moczu, próbki krwi, płynu mózgowo-rdzeniowego, gardła i wykrywany w procesie interferencji z wirusem ECHO w hodowli komórek nerki małpy afrykańskiej. Przypadek 32. kobieta w 11. tygodniu pierwszej ciąży nie była wcześniej szczepiona przeciwko różyczce ani nie zgłaszała występowania objawów klinicznych wskazujących na zakażenie tym wirusem. W trakcie wizyty lekarskiej zgłosiła możliwość kontaktu z dzieckiem zakażonym wirusem różyczki w miejscowym ośrodku pomocy medycznej dla uchodźców, z którym współpracuje. Wyniki przeprowadzonych badań serologicznych były następujące: IgG 10 IU/ml - miano średnio + IgM - miano słabo + Niskie miano przeciwciał w klasie IgG i graniczny poziom IgM wskazywały na możliwość infekcji pierwotnej. Aby to potwierdzić, należało obligatoryjnie powtórzyć badanie przeciwciał. Po 14 dniach pobrano dodatkową próbkę krwi i uzyskano wyniki: IgG 55 IU/ml IgM słabo + *Awidność IgG 25% (niska) Nie stwierdzono przeciwciał przeciwko antygenowi strukturalnemu E2 (białko otoczki) Wykrycie tych przeciwciał ma znaczenie w wykluczeniu ostrej fazy zakażenia. *Awidność - miara funkcjonalnego wiązania przeciwciał, pomaga zróżnicować zakażenie pierwotne od nie-pierwotnego (reinfekcja). Interpretacja: Pierwotne zakażenie wirusem różyczki w pierwszym trymestrze ciąży albo w okresie okołokoncepcyjnym, co wskazuje na wysokie ryzyko zakażenia płodu. 1. Jakie są objawy syndromu różyczki wrodzonej? 2. Na czym polega eradykacja zespołu różyczki wrodzonej?

5 3. Diagnostyka zakażeń rotawirusowych Odczyn lateksowy Lekarze pediatrzy skierowali do szpitala kilkoro dzieci w wieku miesięcy z objawami ostrej biegunki. Dzieci wymagały hospitalizacji z powodu znacznego odwodnienia organizmu. Od pacjentów pobrano kał. Po odwirowaniu uzyskano supernatant, który należy połączyć z lateksem opłaszczonym swoistymi dla rotawirusów przeciwciałami. Wynik odczytujemy porównując uzyskany obraz z odczynami kontrolnymi K+, K-. 1. Jakie są możliwości kontrolowania zakażeń rotawirusami? DEMONSTRACJA Szybki immunochromatyczny test do wykrywania antygenów rotawirusów i adenowirusów w próbkach kału. To jednostopniowy test immunochromatograficzny, w którym zastosowano kolorowe cząstki koloidu i specyficzne przeciwciała monoklonalne. Roztwór rozpuszczonej próbki kału wraz z mikrokuleczkami koloidu migruje wzdłuż paska na zasadzie swobodnej dyfuzji, po powierzchni membrany, gdzie wchodzi w kontakt z przeciwciałem. Pojawienie się barwnych linii świadczy o wykryciu antygenów adenowirusa i/lub rotawirusa. Obecność barwnej linii w polu Control jest kontrolą prawidłowej pracy testu.

6 4. Diagnostyka zakażenia Hantawirusem Opis przypadku: 46-letnia pielęgniarka dotychczas zdrowa zgłosiła się do lekarza z objawami ogólnego rozbicia, suchego kaszlu, drapania w gardle, chrypki. Mimo leczenia (Biseptol) po 5 dniach nastąpiło pogorszenie stanu zdrowia: wyraźne osłabienie, bóle głowy, mięśni, bóle pozagałkowe, gorączka do 40ºC, dreszcze, obfite poty. Z powodu nieprawidłowości w EKG przyjęta do szpitala gdzie wykluczono myocarditis. W kolejnych dniach zaobserwowano gorączkę o torze nieregularnym, tachykardię 100/min, wymioty i zażółcenie powłok. Badania laboratoryjne i objawy kliniczne sugerowały żółtaczkę mechaniczną z powodu kamiczego zapalenia pęcherzyka żółciowego. Chora została przeniesiona do Oddziału Chirurgicznego, gdzie wykonano cholecystektomię, po czym nieprzytomną z objawami niewydolności oddechowej, obniżonym ciśnieniem tętniczym i objawami zespołu wątrobowo-nerkowego przekazano na Oddział Intensywnej Terapii. Zastosowano wentylację zastępczą i farmakoterapię stabilizując krążenie. Chorą przekazano do Oddziału Obserwacyjno- Zakaźnego z podejrzeniem wirusowego zapalenia wątroby w stanie średnim, przytomną. W badaniach: żółtaczka z cechami cholestazy, umiarkowana niedokrwistość bez cech hemolizy z prawidłową leukocytozą i liczbą płytek krwi, ustępujące objawy niewydolności nerek. W oddziale wykluczono: zapalenie wątroby typu B i C, Zakażenie EBV i CMV, leptospirozę i autoimmunologiczne zapalenie wątroby. Kontynuowano antybiotykoterapię, wlewy glukozy i elektrolitów i leczenie hepatoprotekcyjne. Stan chorej pozwalał na wypisanie do domu z diagnozą polekowego (Biseptol) zapalenia wątroby i zespołu wątrobowo-nerkowego. W dalszej obserwacji ambulatoryjnej nie stwierdzono cech uszkodzenia wątroby i nerek, normalizacji uległa niedokrwistość. Retrospektywnie w próbce surowicy (pobranej w ostrym okresie choroby) stosując test immunoenzymatyczny wykryto przeciwciała w klasie IgM przeciw Puumalawirus (PUUV) rodzaj Hantawirus Na podstawie: Gorączka krwotoczna z zespołem nerkowym zakażenie hantawirusem występujące w Polsce. Knap JP, Trybusz A. Pol.Merk.Lek 2006, XXI, 125, 411. Anna Majewska