MEDYCYNA DOŚWIADCZALNA I MIKROBIOLOGIA

Transkrypt

1 MEDYCYNA DOŚWIADCZALNA I MIKROBIOLOGIA ORGAN NARODOWEGO INSTYTUTU ZDROWIA PUBLICZNEGO PAŃSTWOWEGO ZAKŁADU HIGIENY I POLSKIEGO TOWARZYSTWA MIKROBIOLOGÓW 3-4 ROK LXVII KWARTALNIK 2015 NARODOWY INSTYTUT ZDROWIA PUBLICZNEGO - - PAŃSTWOWY ZAKŁAD HIGIENY

2 MEDYCYNA DOŚWIADCZALNA I MIKROBIOLOGIA Organ Narodowego Instytutu Zdrowia Publicznego Państwowego Zakładu Higieny i Polskiego Towarzystwa Mikrobiologów REDAKCJA Redaktor: WALDEMAR RASTAWICKI Zastępca Redaktora: RAFAŁ GIERCZYŃSKI Sekretarz: KATARZYNA ZACHARCZUK Redaktor językowy (język polski): STANISŁAW KAŁUŻEWSKI Redaktor językowy (język angielski): MARIA DOMINGUEZ Redaktor statystyczny: DANIEL RABCZENKO KOMITET REDAKCYJNY D. Dzierżanowska - Warszawa, S. Giedrys-Kalemba - Szczecin, E. Gołąb - Warszawa, E. Gospodarek - Bydgoszcz, P.B. Heczko - Kraków, A. Jaworski - Łódź, B. Litwińska - Warszawa, K. Piekarska - Warszawa, B. Różalska - Łódź, A. Stankiewicz - Warszawa, E.M. Szewczyk - Łódź, A. Szkaradkiewicz - Poznań, J. Szych - Warszawa, E.A. Trafny - Warszawa, S. Tyski - Warszawa, M.L. Zaremba - Białystok, A.A. Zasada - Warszawa, Z. Zwolska - Warszawa Adres Redakcji: Warszawa 36, ul. Chocimska 24 medmikrobiol@pzh.gov.pl Tel: ; Fax: Indeks Punktacja za publikację wg MNiSW 5 pkt. Index Copernicus 4,82 pkt. Kwartalnik Medycyna Doświadczalna i Mikrobiologia jest indeksowany w bazie danych pn. Polska Bibliografia Lekarska (PBL). NARODOWY INSTYTUT ZDROWIA PUBLICZNEGO - - PAŃSTWOWY ZAKŁAD HIGIENY Skład i druk: Libra-Print Daniel Puławski, Al. Legionów 114b, Łomża tel./fax ,

3 SPIS TREŚCI PRACE ORYGINALNE T. Wołkowicz, A. Januszkiewicz, A. Chróst, N. Wolaniuk, A.B. Kubiak, M. Majchrzak, J. Szych, P. Parniewski. Ocena przydatności metody (GTG) 4 -PCR do różnicowania jednofazowych szczepów Salmonella enterica o wzorze antygenowym 1,4,[5],12:i: W. Rastawicki, S. Kałużewski. Zastosowanie odczynu immunoenzymatycznego ELISA do poszukiwania przeciwciał dla lipopolisacharydowych antygenów somatycznych O oraz otoczkowego antygenu Vi pałeczek Salmonella Typhi u osób z epidemicznego ogniska duru brzusznego E. Skulska, B. Młynarczyk-Bonikowska, S. Walter de Walthoffen, G. Młynarczyk, M. Malejczyk, S. Majewski. Porównanie metody Real- -Time PCR z metodą bezpośredniej immunofluorescencji w laboratoryjnej diagnostyce chlamydiozy u pacjentów Kliniki Dermatologii i Wenerologii Warszawskiego Uniwersytetu Medycznego K. Śmietańska, A. Chróst, W. Rastawicki. Problemy w serologicznej diagnostyce atypowych zapaleń płuc na przykładzie wyników badań w kierunku zakażeń wywoływanych przez Legionella pneumophila oraz Mycoplasma pneumoniae A. Częścik, A. Trzcińska, M. Dunal-Szczepaniak, J. Siennicka. Wpływ stymulacji wirusem odry na ekspresję receptorów Toll-like w komórkach PBMC A. Wiatrzyk, M. Polak, K. Krysztopa-Grzybowska, U. Czajka, A. Lutyńska. Lekowrażliwość szczepów Lactobacillus rhamnosus wyizolowanych z produktów probiotycznych PRACE POGLĄDOWE M. Małopolska, M. Fol. Przeszczep jelitowej flory bakteryjnej w leczeniu choroby związanej z Clostridium difficile M. Dyląg. Etiologiczne czynniki kryptokokozy co warunkuje ich patogenność?.. 221

4 CONTENTS ORIGINAL ARTICLES T. Wołkowicz, A. Januszkiewicz, A.Chróst, N. Wolaniuk, A.B. Kubiak, M. Majchrzak, J. Szych, P. Parniewski. Usefulness of the (GTG) 4 -PCR for typing of monophasic Salmonella enterica isolates with antigenic shame 1,4,[5],12:i: W. Rastawicki, S. Kałużewski. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELI- SA) for detection of antibodies to Salmonella Typhi lipopolysaccharide O and capsular polysaccharide Vi antigens in persons from outbreak of typhoid fever E. Skulska, B. Młynarczyk-Bonikowska, S. Walter de Walthoffen, G. Młynarczyk, M. Malejczyk, S. Majewski. The Comparison of Real-Time PCR and direct immunofluorescence in laboratory diagnostics of chlamydiosis in patients of Department of Dermatology and Venereology Medical University of Warsaw K. Śmietańska, A. Chróst, W. Rastawicki. Problems in the serological diagnosis of atypical pneumonia caused by Legionella pneumophila and Mycoplasma pneumoniae A. Częścik, A. Trzcińska, M. Dunal-Szczepaniak, J. Siennicka. Measles virus stimulation effect on the expression of Toll-like receptors in PBMC. 189 A. Wiatrzyk, M. Polak, K. Krysztopa-Grzybowska, U. Czajka, A. Lutyńska. Susceptibility of Lactobacillus rhamnosus strains isolated from probiotic products to antimicrobial agents REVIEWS M. Małopolska, M. Fol. Intestinal microbiota transplantation for the treatment of Clostridium difficile infection M. Dyląg. Etiological factors of cryptococcosis what makes them pathogens?

5 MED. DOŚW. MIKROBIOL., 2015, 67: Usefulness of the (GTG) 4 -PCR for typing of monophasic Salmonella enterica isolates with antigenic shame 1,4,[5],12:i:- * Ocena przydatności metody (GTG) 4 -PCR do różnicowania jednofazowych szczepów Salmonella enterica o wzorze antygenowym 1,4,[5],12:i:- * Tomasz Wołkowicz 1, Aleksandra Januszkiewicz 1, Anna Chróst 1, Natalia Wolaniuk 1, Anna B. Kubiak 2, Marta Majchrzak 2, Jolanta Szych, Paweł Parniewski 2 Department of Bacteriology, National Institute of Public Health National Institute of Hygiene 1 Department of Molecular Genetics, Institute of Medical Biology Polish Academy of Science 2 Jednofazowe pałeczki Salmonella enterica o wzorze antygenowym 1,4,[5],12:i:- stanowią narastający problem zdrowia publicznego. Dokładna identyfikacja tych szczepów z zastosowaniem rutynowych testów fenotypowych (badania właściwości biochemicznych i serologicznych szczepów) jest kosztowna i czasochłonna. Analizowana w prezentowanym badaniu metoda (GTG) 4 -PCR wykazała przydatność do genoserotypowania kilku najczęściej obserwowanych serotypów pałeczek Salmonella. Niestety, zastosowanie tej metody do rozróżnienia jednofazowych S. Typhimurium, nie pozwoliło na wyróżnienie profilu prążków charakterystycznego dla takich szczepów. Niemożliwe okazało się również rozróżnienie profilów (GTG) 4 -PCR uzyskanych dla szczepów wzorcowych S. Typhimurium, S. Farsta, S. Tsevie czy S. Glocester. Wyraźnie odrębne profile uzyskano jedynie dla pałeczek S. Tumodi, S. Lagos oraz S. Agama. Słowa kluczowe: Salmonella; jednofazowe 1,4,[5],12:i:-; serotypowanie; TRS-PCR ABSTRACT Introduction: Monophasic Salmonella enterica strains presenting the antigenic shame 1,4,[5],12:i:- are becoming more prevalent. Accurate identification of such strains is hard * This study was prepared as a scientific project for young scientists funded (number 6/EMMŁ) from funds for statutory activity for 2014.

6 156 T. Wołkowicz i inni Nr 3-4 with routine using biochemical and serological tests. Such strains can be identified with molecular tests. In this study we have tested the usefulness of (GTG) 4 -PCR for the diagnostic of such monophasic strains. This usefulness of this method was previously confirmed for genoserotyping of S. Enterica, Typhimurium, Infantis, Virchow, Hadar, Newport and Anatum. Materials and Methods: 76 strains with antigenic shame 1,4,[5],12:i:-, isolated in Poland in years were tested. Additionally (GTG) 4 -PCR patterns were obtained for reference strains of serotypes S. Lagos, S. Agama, S. Farsta, S. Tsevie, S. Glocester and S. Tumodi. (GTG) 4 -PCR was performed with DreamTaq DNA polymerase. Obtained patterns were analysed with BioNumerics software. Results: No pattern specific for monophasic pattern was identified. Additionally it was also impossible to differentiate patterns obtained for S. Typhimurium, S. Farsta, S. Tsevie and S. Glocester. Only reference strains of serotypes S. Tumodi, Farsta and Agama has the distinguishable patterns of (GTG) 4 -PCR. Conclusions: Analysed (GTG) 4 -PCR method do not show the ability to distinguish S. enterica serotypes from group O4, H:i, including monophasic strains with the antigenic shame 1,4,[5],12:i:-. Keywords: Salmonella; monophasic 1,4,[5],12:i:-; serotyping; TRS-PCR INTRODUCTION Salmonella are still the most common etiological agents of bacterial gastrointestinal infections in Europe (5). According to data published by the Department of Epidemiology of the National Institute of Public Health National Institute of Hygiene, it shows that although the total number of strains of Salmonella isolated in Poland each year steadily declining, it is still the most common etiological agent of bacterial diarrhoea. In 2013 more than 7.5 thousand strains of Salmonella were isolated in Poland (13). Salmonella Enteritidis was the most frequently isolated serotype (77% of all cases in 2012) in Poland as in Europe (12). However, annual several hundred strains of serotype Salmonella Typhimurium (322 (3.8%) isolates in 2012) is also isolated. A growing problem is the occurrence of Salmonella Typhimurium isolates, without the second phase flagella, that present antigenic shame 1,4,[5],12:i:- (2, 6, 9, 15). These bacteria are a major public health problem particularly because of the fact that most of them are presents reduced susceptibility to different antibiotics such as ampicillin, streptomycin, tetracycline or sulphonamides (7). Due to the lack of the second phase flagellar antigen, these strains are serious diagnostic problem. In the routinely conducted phenotypic diagnostic (biochemical and serological tests) they are indistinguishable from potentially possible monophasic variations (although in practice not observed) of the rest Salmonella strains with somatic antigen group O:4 with the first phase flagellar antigen H:i, that is Salmonella Lagos, Agama, Farsta, Tsevie, Glocester or Tumodi. The exact determination of belonging to a particular S. enterica serotype of monophasic strains with antigenic shame 1,4,[5],12:i:- is only possible with the molecular biology methods. One of them is the technique of DNA-DNA hybridization on microarrays (9). Unfortunately, it requires an expensive equipment such as sophisticated camera for reading, expensive reagents and high-qualified personnel. Specific PCR assays,

7 Nr 3-4 Jednofazowe szczepy S. enterica 1,4,[5],12:i:- 157 that are able to distinguish monophasic Salmonella Typhimurium strains, are also already designed (4, 14). Such PCRs are usually designed only for one mechanism that disrupt the second phase flagellar or phases shift. One of the interesting method suitable for genoserotyping of Salmonella is based on TRS-PCR method with a 5 N 6 (GTG) 4 primer. Previously, we have demonstrated the usefulness of this method for genoserotyping S. enterica strains belonging to one of the most frequently isolated serotypes such as S. Enteritidis, S. Typhimurium, S. Virchow, S. Infantis, S. Hadar, S. Newport and S. Anatum (10). In this study we examined the usefulness of this method for the differentiation of Salmonella strains with the antigenic shame 1,4,[5],12:i:-. MATERIALS AND METHODS Bacterial strains. Material consisted of 76 strains Salmonella enterica subsp. enterica with the antigenic shame 1,4,[5],12:i:- isolated in and collected in the Department of Bacteriology NIZP-PZH. All strains has been reidentified in the Department of Bacteriology NIZP-PZH as a part of NCN N N research project. In addition, the control strains of serotype Salmonella Typhimurium ATCC 70072, Lagos KOS 1967, Agama KOS 1968, Farsta KOS 1969, Tsevie KOS 1970, Glocester KOS 1971 and Tumodi KOS 1972 were used to obtain the (GTG) 4 -PCR profiles characteristic of these serotypes. (GTG) 4 -PCR. Genomic DNA was isolated from the overnight culture using a lysis buffer with proteinase K (Sigma-Aldrich), 6 M GTC solution (MP Biomedicals), extraction with phenol-chloroform-isoamyl alcohol (49.5:49.5:1) and precipitation with isopropanol (Sigma-Aldrich). PCR reaction was performed with a single primer with the sequence 5 N 6 (GTG) 4, which usefulness in genoserotyping of S. enterica strains has been demonstrated previously (10). The reaction mixture had the following composition: 19,65μl deionized water (Sigma), 2,5μl 10x DeamTaq Green Buffer (Thermo Scientific) 0,5μl 10mM dntp mix (Sigma-Aldrich), 0,5μl 10mM primer 1,5μl DMSO (AppliChem), 0,1μl polymerase DreamTaq with concentration of 5 U/ ml and 0,5μl template DNA. The PCR reaction comprised the following steps: initial denaturation at 95 C for 3 min, then 35 cycles of 95 C for 1 min, 55 C for 1 min and 72 C for 2 min, followed by a final extension step at 72 C for 8 min. The PCR products were separated on 1.6% agarose gel (Agarose Electrophoresis Grade, MP Biomedicals) using the Midori Advanced Green dye (Nippon Genetics). Obtained profiles were analysed and compared with a BioNumerics v6.6 software (Applied Maths). The similarity of the profiles were determined by using the Pearson correlation (optimization of 1%, the curves smoothing value 1%) and UPGMA clustering algorithm. RESULTS Dendrogram showing the mutual similarity of (GTG) 4 -PCR profiles of the tested strains is shown in Figure 1. It is possible to distinguish a large group consisting of 54 strains which showed bands profiles similarity of about 87%. To this group two reference strains were classified: S. Typhimurium and S. Gloucester, for which the relative similarity of the profiles was as high as 96%. This result indicates that these serotypes could not be distinguished with this method.

8 158 T. Wołkowicz i inni Nr 3-4 Fig. 1. Dendrogram showing the similarity of (GTG) 4 -PCR profiles of the tested S. enterica strains

9 Nr 3-4 Jednofazowe szczepy S. enterica 1,4,[5],12:i:- 159 Among the tested strains, it is possible to distinguished a group of 20 strains for which the similarity of the profiles was 91%. In this group reference strain of S. Farsta serotype was also been included. Similar profile (87% similarity) was also obtained for strains of S. Tsevie. However, (CGC) 4 -PCR profiles obtained for strains of this group, were poorer and not so clear than for the previously described strains from the dominant group. This may be due characteristic of these isolates, or it may indicate some imperfections of analysed method. Only profiles obtained for the reference strains of S. Lagos and S. Tumodi clearly distinguished these strains from the other tested strains. DISCUSSION Monophasic strains of S. enterica with antigenic shame 1,4,[5],12:i:- was first isolated in Spain in 1997 (3). Studies conducted by Echeitę et al. (4) showed that these strains have the IS200 insertion sequences specific for the intergene region between genes flib-flia of S. Typhimurium serotype only. At the same time, these researchers concluded that the cause of disrupting the second phase flagella antigen is caused by the lacking of gene fljb. Based on these results and already developed primers, Tennant et al. (14) have constructed a multiplex-pcr that could be used to detect monophasic strains of S. Typhimurium. However, such simple PCR test cannot correctly detect all potential types of monophasic strains 1,4, [5], 12: i: -, because of the fact, that such phenotype may be the result of a variety changes, both in the gene fljb, as well as genes responsible for phase shift (e.g. in the hin gene that encodes the invertase) (11). Usefulness of bacteria genotyping based on amplification of sequences flanked by the triplet, repetitive sequences called TRS-PCR was validated for species such as Escherichia coli ((CGG) 4 -PCR) (1), Mycobacterium gordonae ((CAC) 4 -PCR) (17), Mycobacterium kansasii (8) and avium (16) (for both (CCG) 4 -PCR). In the case of S. enterica method based on the (GTG) 4 -PCR showed utility for genoserotyping of isolates belonging to serotypes S. Enteritidis, S. Typhimurium, S. Infantis, S. Virchow, S. Hadar, S. Anatum and S. Newport (10). These results suggested the possibility of using this method for the differentiation of other serotypes S. enterica, including the monophasic strains with the antigenic shame 1,4,[5],12:i:-. Results obtained by this study shows that the method based on (GTG) 4 -PCR should not be used for typing Salmonella from the group O:4, with a H:i first phase flagellar antigen. Our previous studies on the usefulness of this method were carried out on isolates belonging to the most frequently isolated Salmonella. These serotypes belongs to very distant antigenic groups (e.g. somatic antigens groups O:4, O:6,7, O:6,8, O:9, O:3). This may be relevant to the presence of general genetic differences. However, results obtained in this analysis show that, in the case of the group consisting of the strains having a high antigenic similarity, and thus may also general genetic, this method does not allow a clear differentiation between the tested serotypes. As a result, it is impossible to determine the profile specific for monophasic strains of S. enterica with the antigenic shame 1,4,[5],12:i:-. or assignment of these strains to a particular serotype. Of course it has to be taken into consideration that the method based on N 6 (GTG) 4 primer was validated for different serotypes (10). Maybe usage of another N 6 (TRS) 4 primer would suit better for typing of monophasic S. enterica with antigenic shame 1,4,[5],12:i:-.

10 160 T. Wołkowicz i inni Nr 3-4 POLSKA WERSJA JĘZYKOWA Ocena przydatności metody (GTG) 4 -PCR do różnicowania jednofazowych szczepów Salmonella enterica o wzorze antygenowym 1,4,[5],12:i:- * Tomasz Wołkowicz 1, Aleksandra Januszkiewicz 1, Anna Chróst 1, Natalia Wolaniuk 1, Anna B. Kubiak 2, Marta Majchrzak 2, Jolanta Szych, Paweł Parniewski 2 Zakład Bakteriologii Narodowego Instytutu Zdrowia Publicznego Państwowego Zakładu Higieny 1 Zakład Genetyki Molekularnej Instytutu Biologii Medycznej Polskiej Akademii Nauk 2 WSTĘP Pałeczki z rodzaju Salmonella należą do najczęstszych czynników etiologicznych bakteryjnych zakażeń przewodu pokarmowego w Europie (5). Według danych publikowanych przez Zakład Epidemiologii Narodowego Instytutu Zdrowia publicznego Państwowego Zakładu Higieny wynika, że jakkolwiek ogólna liczba szczepów pałeczek Salmonella izolowanych w Polsce każdego roku systematycznie spada, wciąż jest to najczęstszy etiologiczny czynnik bakteryjnych biegunek. W 2013 roku wyizolowano w Polsce ponad 7,5 tysiąca izolatów pałeczek Salmonella (13). W Polsce, podobnie jak w całej Europie, najczęściej izoluje się pałeczki Salmonella Enteritidis (77% przypadków w roku 2012) (12). Jednakże corocznie izolowanych jest również kilkaset szczepów serotypu Salmonella Typhimurium (322 (3,8%) izolaty w 2012 roku). Narastającym problemem jest pojawianie się szczepów Salmonella Typhimurium nieposiadających rzęsek drugiej fazy, o wzorze antygenowym 1,4,[5],12:i:- (2, 6, 9, 15). Bakterie te stanowią istotny problem zdrowia publicznego szczególnie ze względu na fakt, iż zazwyczaj charakteryzują się obniżoną wrażliwością na antybiotyki takie jak ampicylina, streptomycyna, tetracyklina czy sulfonamidy (7). Ze względu na brak antygenu rzęskowego drugiej fazy, szczepy te stanowią poważny problem diagnostyczny. W rutynowo prowadzonym badaniu właściwości fenotypowych są one bowiem nierozróżnialne od potencjalnie możliwych jednofazowych wariantów (choć w praktyce nie obserwowanych) pozostałych pałeczek Salmonella z grupy O:4 posiadających w pierwszej fazie antygen rzęskowy H:i, czyli pałeczek Salmonella Lagos, S. Agama, S. Farsta, S. Tsevie, S. Glocester czy S. Tumodi. Dokładne określenie przynależności do konkretnego serotypu pałeczek o fenotypie 1,4,[5],12:i:- możliwe jest jedynie z zastosowaniem metod biologii molekularnej. Jedną z takich metod jest technika hybrydyzacji DNA- -DNA na mikromacierzach (9) wymaga ona jednak posiadania drogiego sprzętu takiego jak kamera do odczytów, drogich odczynników oraz wykwalifikowanego personelu. Istnieją również opracowane testy PCR pozwalające odróżnić jednofazowe szczepy Salmonella Typhimurium (14). * Badania zostały zrealizowane w ramach projektu badawczego finansowanego ze środków na działalność statutową za rok 2014: 6/EMMŁ.

11 Nr 3-4 Jednofazowe szczepy S. enterica 1,4,[5],12:i:- 161 Jedną z ciekawszych metod, wykazującą przydatność do genoserotypowania pałeczek Salmonella, jest metoda TRS-PCR z zastosowaniem startera 5 N 6 (GTG) 4. Wcześniej wykazano użyteczność tej metody do genoserotypowania pałeczek Salmonella należących do jednych z najczęściej izolowanych serotypów takich jak S. Enteritidis, S. Typhimurium, S. Virchow, S. Infantis, S. Hadar, S. Newport i S. Anatum (10). W poniższej pracy sprawdzono przydatność tej metody do różnicowania pałeczek Salmonella o wzorze antygenowym 1,4,[5],12:i:-. MATERIAŁ I METODY Szczepy bakteryjne. Materiał do badań stanowiło 76 szczepów Salmonella enterica subsp. enterica o wzorze antygenowym 4,[5],12:i:- wyizolowanych w latach i zgromadzonych w kolekcji Zakładu Bakteriologii NIZP-PZH. Szczepy te były reidentyfikowane w Zakładzie Bakteriologii NIZPPZH w ramach projektu badawczego NCN N N Dodatkowo użyto szczepów kontrolnych serotypów Salmonella Typhimurium ATCC 70072, S. Lagos KOS 1967, S. Agama KOS 1968, S. Farsta KOS 1969, S. Tsevie KOS 1970, S. Glocester KOS 1971 oraz S. Tumodi KOS 1972, w celu uzyskania profili TRSPCR charakterystycznych dla wymienionych serotypów. (GTG) 4 -PCR. Genomowe DNA było izolowane z nocnej hodowli z zastosowaniem buforu lizującego z proteinazą K (Sigma-Aldrich), 6M roztworu GTC (MP Biomedicals), ekstrakcją mieszaniną fenol-chloroform-alk. izoamylowy (49,5:49,5:1) oraz precypitacją izopropanolem (Sigma-Aldrich). Reakcje PCR przeprowadzono z zastosowaniem pojedynczego startera o sekwencji 5 N 6 (GTG) 4, którego przydatność w typowaniu serotypów Salmonella wykazano wcześniej (10). Mieszanina reakcyjna posiadała następujący skład: 19,65µl wody dejonizowanej (Sigma), 2,5µl 10x DeamTaq Green Buffer (Thermo Scientific), 0,5µl 10mM mieszaniny dntp (Sigma-Aldrich), 0,5µl 10mM startera, 1,5µl DMSO (AppliChem), 0,1µl polimerazy DreamTaq o stężeniu 5U/µl oraz 0,5µl matrycowego DNA. Program reakcji PCR zawierał następujące etapy: Wstępna denaturacja w 95 C przez 3 min, następnie 35 cykli: 95 C przez 1 min, 55 C przez 1 min oraz 72 C przez 2 min, a następnie końcowy etap elongacji w 72 C przez 8 min. Produkty PCR rozdzielano w 1,6% żelu agarozowym (Agarose Electrophoresis Grade, MP Biomedicals) z zastosowaniem barwnika Midori Green Advanced (Nippon Genetics). Analizę uzyskanych profili prowadzono z użyciem oprogramowania BioNumerics v6.6 (Applied Maths). Wzajemne podobieństwo profili określano używając korelacji Pearsona (optymalizacja 1%, stopień wygładzenia krzywych 1%) i algorytmu klasteryzacji UPGMA. WYNIKI Dendrogram obrazujący wzajemne podobieństwa profili (GTG) 4 -PCR badanych szczepów przedstawiono na rycinie 1. Przeprowadzone analizy pozwoliły na wyodrębnienie dużej grupy, obejmującej 54 szczepy, dla których uzyskane profile prążków wykazywały podobieństwo około 87%. Do grupy tej zakwalifikowane zostały także dwa szczepy wzorcowe: S. Typhimurium oraz S. Gloucester, dla których wzajemne podobieństwo profili wynosiło aż

12 162 T. Wołkowicz i inni Nr %. Wynik ten wskazuje, że serotypy te nie mogłyby być rozróżniane przy zastosowaniu analizowanej metody. Wśród pozostałych badanych szczepów możliwe jest wyróżnienie grupy 20 szczepów dla których podobieństwo profili wynosiło 91%. Do grupy tej zaliczony został również szczep wzorcowy S. Farsta. Zbliżony profil (87% podobieństwa) uzyskano również dla szczepu S. Tsevie. Profile prążków uzyskane dla szczepów z tej grupy były jednak uboższe i mniej wyraźne, niż dla wcześniej opisanych szczepów z dominującej grupy. Może to być wynikiem charakterystycznym dla tych izolatów lub też może świadczyć o pewnej niedoskonałości analizowanej metody. Profile uzyskane dla szczepów wzorcowych S. Lagos oraz S. Tumodi jako jedyne wyraźnie odróżniały się od profili pozostałych badanych szczepów. DYSKUSJA Jednofazowe szczepy S. enterica o wzorze antygenowym 1,4,[5],12:i:- zostały po raz pierwszy wyizolowane w Hiszpanii w 1997 roku (3). Badania przeprowadzone przez Echeitę i wsp. (4) wykazały, że szczepy te posiadają sekwencję insercyjną IS200 charakterystyczną dla regionu międzygenowego pomiędzy genami flib-flia pałeczek S. Typhimurium. Równocześnie badacze ci stwierdzili, że przyczyną niewytwarzania rzęsek drugiej fazy jest brak kodującego je genu fljb. Na podstawie uzyskanych wyników i opracowanych starterów, Tennant i wsp. (14) opracowali multiplexpcr mogący służyć do wykrywania jednofazowych szczepów S. Typhimurium. Jednakże, co sami autorzy testu przyznają, tego typu prosty test PCR może nie wykrywać poprawnie wszystkich potencjalnych wariantów szczepów jednofazowych 1,4,[5],12:i:-, gdyż taki fenotyp może być wynikiem bardzo różnorodnych zmian, zarówno w samym genie fljb, jak i w genach odpowiedzialnych za zmienność fazową (zarówno ją regulującyc jak i genu hin kodującego białko-inwertazę) (11) Przydatność metody genotypowania bakterii oparta na amplifikacji sekwencji flankowanych przez trójkowe sekwencje repetytywne, nazwana TRS-PCR, została potwierdzona dla takich gatunków jak: Escherichia coli ((CGG) 4 -PCR) (1), Mycobacterium gordonae ((CAC) 4 -PCR) (17), Mycobacterium kansasii (8) i avium (16) (dla obydwu (CCG) 4 -PCR). W przypadku pałeczek Salmonella enterica metoda oparta na (GTG) 4 -PCR okazała się przydatna do genoserotypowania izolatów należących do serotypów S. Enteritidis, S. Typhimurium, S. Infantis, S. Virchow, S. Hadar, S. Anatum i S. Newport (10). Wyniki te sugerowały możliwość wykorzystania tej metody do różnicowania także innych serotypów pałeczek S. enterica, w tym być może do oznaczania szczepów jednofazowych o wzorze antygenowym 1,4,[5],12:i:-. Uzyskane w poniższym badaniu wyniki wskazują jednak, że metoda (GTG) 4 -PCR nie powinna być stosowana do typowania pałeczek Salmonella z grupy O:4, posiadających w pierwszej fazie antygen rzęskowy H:i. Dotychczasowe badania przydatności tej metody były prowadzone na izolatach należących do najczęściej izolowanych serotypów Salmonella. Serotypy te należą do bardzo odległych grup antygenowych (np. grupy antygenów somatycznych O:4, O:6,7, O:6,8, O:9, O:3). Może to przekładać się na występowanie dużych różnic ogólnogenomowych. Jednakże uzyskane w prezentowanej analizie wyniki wskazują, że w przypadku grupy złożonej ze szczepów wykazujących wysokie podobieństwo anty-

13 Nr 3-4 Jednofazowe szczepy S. enterica 1,4,[5],12:i:- 163 genowe, a więc być może także ogólnogenomowe, metoda ta nie pozwala na jednoznaczne rozróżnienie badanych serotypów. W efekcie niemożliwe jest więc ani określenie profilu prążków charakterystycznego dla jednofazowch szczepów S. enterica o wzorze antygenowym 1,4,[5],12:i:-, ani przypisanie tych szczepów do konkretnego serotypu. Należy jednakże pamiętać, że metoda oparta o starter N 6 (GTG) 4 została wybrana jako najlepiej typująca pałeczki wcześniej analizowanych serotypów (10). Być może więc zastosowanie innego startera N 6 (TRS) 4 do typowania szczepów jednofazowych o wzorze antygenowym 1,4,[5],12:i:- pomogłoby uzyskać lepsze wyniki typowania takich pałeczek S. enterica. REFERENCES 1. Adamus-Bialek W, Wojtasik A, Majchrzak M, Sosnowski M, Parniewsi P. (CGG) 4 -Based PCR as a novel tool for discrimination of uropathogenic Escherichia coli strains: comparison with enterobacterial repetitive intergenic consensus-pcr. J Clin Microbiol 2009; 47: Centers for Disease Conttrol and Prevention. Salmonella surveillance: annual summary 2005 Atlanta Department of Health and Human Services Echeita MA, Aladuena A, Cruchaga S, Usera MA. Emergence and spread of atypical Salmonella enterica serotype 4,5,12:i:- strain in Spain. J Clin Microbiol 1999; 37: Echeita MA, Herrera S, Usera MA. Atypical, fljb-negative Salmonella enterica subsp. Enterica strain of serovar 4,5,12:i:- appears to be a monophasic variant of serovar Typhimurium. J Clin Microbiol 2001; 39: European Food Safety Authority, European Centre for Disease Prevention and Control. The European Union Summary Report on Trends and Sources of Zoonoses, Zoonotic Agents and Food-borne Outbreaks in EFSA J 2014; 12: Hoszowski A, Samcik I, Lalak A, Skarżyńska M i inni. Charakterystyka jednofazowych izolatów Salmonella enterica serowar Typhimurium (1,4,[5],12:i :-). Med Wet 2014; 70: Hugas M, Beloeil P. Controlling Salmonella along the food chain in the European Union - progress over the last ten years. Eurosurveillance 2014; 19: Kubiak AB, Wojtasik A, Augustynowicz-Kopeć E, Zabost A, Zwolska Z, Parniewski P. TRS-PCR- -based genotyping of Mycobacterium kansasii. Progr Med 2011; XXIV: Madajczak G, Wołkowicz T, Dera-Tomaszewska B, Wasiak M, Chróst A, Szych J. Występowanie i charakterystyka jednofazowych pałeczek Salmonella enterica subsp. enterica o wzorze antygenowym 1,4,[5],12:i:- izolowanych w Polsce w latach Med Dośw Mikrobiol 2014; 66: Majchrzak M, Krzyżanowska A, Kubiak AB, Wojtasik A, Wołkowicz T, Szych J, Parniewski P. TRS-based PCR as a potential tool for inter-serovar discrimination of Salmonella Enteritidis, S. Typhimurium, S. Infantis, S. Virchow, S. Hadar, S. Newport and S. Anatum. Mol Biol Rep. 2014; 41: Merickel SK, Haykinson MJ, Johnson RC. Communication between Hin recombinase and Fis regulatory subunits during coordinate activation of Hin-catalyzed site-specific DNA inversion. Genes Dev 1998; 12: Sadkowska-Todys M, Czarkowski MP. Salmonellosis in Poland in Przegl Epidemiol 2014; 68: Sadkowska-Todys M, Zieliński A, Czarkowski MP. Infectious diseases in Poland in Przegl Epidemiol 2015; 69: Tennant SM, Diallo S, Levy H, Livio S i inni. Identification by PCR of non-typhoidal Salmonella enterica serovars associated with invasive infections among febrile patients in Mali. PLoS Negl Trop Dis 2010; 4:e621.

14 164 T. Wołkowicz i inni Nr Wasyl D, Hoszowski A. Occurrence and characterization of monophasic Salmonella enterica serovar typhimurium (1,4,[5],12:i:-) of non-human origin in Poland. Foodborne Pathog Dis 2012; 9: Wojtasik A, Kubiak AB, Krzyżanowska A, Majchrzak M, Augustynowicz-Kopeć E, Parniewski P. Comparison of the (CGG) 4 -based PCR and MIRU-VNTR for molecular typing of Mycobacterium avium strains. Mol Biol Rep 2012; 39: Wojtasik A, Majchrzak M, Adamus-Bialek W, Augustynowicz-Kopeć E, Zwolska Z, Dziadek J, Parniewski P. Trinucleotide repeat sequence-based PCR as a potential approach for genotyping Mycobacterium gordonae strains. J Microbiol Methods 2011; 85: Received: 18 XI 2015 r. Autor Adress: Warszawa, ul. Chocimska 24, Department of Bacteriology, National Institute of Public Health National Institute of Hygiene.

15 MED. DOŚW. MIKROBIOL., 2015, 67: Zastosowanie odczynu immunoenzymatycznego ELISA do poszukiwania przeciwciał dla lipopolisacharydowych antygenów somatycznych O oraz otoczkowego antygenu Vi pałeczek Salmonella Typhi u osób z epidemicznego ogniska duru brzusznego Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for detection of antibodies to Salmonella Typhi lipopolysaccharide O and capsular polysaccharide Vi antigens in persons from outbreak of typhoid fever Waldemar Rastawicki, Stanisław Kałużewski Zakład Bakteriologii Narodowego Instytutu Zdrowia Publicznego Państwowego Zakładu Higieny w Warszawie Przedstawiono wyniki badania poziomu przeciwciał dla antygenu somatycznego O oraz antygenu otoczkowego Vi w próbkach surowicy osób chorych na dur brzuszny oraz osób ze styczności z chorymi na dur brzuszny z ogniska epidemicznego w Kraśniku w latach Przeprowadzone badania wykazały obecność swoistych przeciwciał dla antygenu somatycznego i antygenu Vi odpowiednio u 80% i 53,3% chorych na dur brzuszny oraz 51,4% i 45% osób ze styczności. Ze względu na wysoką czułość i swoistość metody oraz możliwość oznaczania poziomu przeciwciał w poszczególnych klasach immunoglobulin, odczyn ELISA może być stosowany w serodiagnostyce zakażeń wywoływanych przez pałeczki S. Typhi, badaniach epidemiologicznych w ogniskach epidemicznych czy też w badaniu skuteczności szczepień przeciwko durowi brzusznemu. Słowa kluczowe: Salmonella Typhi, dur brzuszny, ELISA, antygen somatyczny, otoczkowy antygen Vi ABSTRACT Introduction: The laboratory diagnosis of typhoid fever is dependent upon either isolation of S. Typhi from a clinical sample or the detection of raised titers of serum antibodies in the Widal test or the passive hemagglutination assay (PHA). In this study we evaluated

16 166 W. Rastawicki, S. Kałużewski Nr 3-4 the usefulness of ELISA for detection of antibodies to S. Typhi lipopolysaccharide O and capsular polysaccharide Vi antigens in the sera of persons from outbreak of typhoid fever. Material and methods: Fifteen serum samples from patients with laboratory confirmed typhoid fever and 140 sera from persons suspected for contact with typhoid fever patients from outbreak in 1974/75 in Poland were tested by ELISA. Additionally, as the control group, we tested 115 sera from blood donors for the presence of S. Typhi anti-lps and anti-vi antibodies. Results:. Anti-LPS and anti-vi antibodies were detected in 80% and 53.3% of sera obtained from patients with laboratory confirmed typhoid fever, respectively. The high percentages of positive results in ELISA were also noted in the group of persons suspected for contact with typhoid fever patients (51.4% and 45%) but not in the group of blood donors (7.8% and 6.1%, respectively). Conclusions: The ELISA could be a useful tool for the serological diagnosis of typhoid fever in patients who have clinical symptoms but are culture negative, especially during massive outbreaks of typhoid fever. Key words: Salmonella Typhi, typhoid fever, ELISA, LPS somatic antigen, capsular polysaccharide Vi antigens WSTĘP Dur brzuszny jest ostrą chorobą zakaźną wywoływaną przez pałeczki duru brzusznego Salmonella enterica serowar Typhi. Choroba charakteryzuje się zróżnicowanymi objawami klinicznymi, stopniowym narastaniem objawów, długotrwałym okresem zdrowienia i skłonnością do nawrotów. Źródłem zakażenia jest zakażony objawowo bądź bezobjawowo człowiek. Materiałem zakaźnym jest przede wszystkim kał, rzadziej mocz. Dur brzuszny szerzy się głównie przez wodę i żywność zanieczyszczone wydalinami zakażonych ludzi. Szczególnie niebezpieczne są skażone ściekami zbiorniki wodne (awarie sieci wodociągowo- -kanalizacyjnej), produkty mleczne oraz jarzyny uprawiane na polach nawożonych odchodami ludzkimi. Możliwe jest także zakażenie bezpośrednie od zakażonego człowieka (14). Serologiczne badanie jest ważnym, chociaż w stosunku do badań bakteriologicznych, drugorzędnym sposobem laboratoryjnego rozpoznawania duru brzusznego. W dotychczasowej praktyce badania te ograniczają się do wykonania odczynu aglutynacji probówkowej (odczynu Widala) oraz odczynu hemaglutynacji biernej z antygenem O i Vi S. Typhi. Wadą odczynów zlepnych jest to, iż wykrywają one przeciwciała dla antygenów pałeczek Salmonella przede wszystkim w klasie immunoglobulin M. W przypadku nawrotów choroby, kolejnych zakażeń lub wykrywania nosicieli duru brzusznego koniecznym jest oznaczanie poziomu przeciwciał także w klasach IgA i IgG (4). Celem podjętych badań była wstępna ocena przydatności odczynu immunoenzymatycznego ELISA do poszukiwania przeciwciał klasy IgA, IgG i IgM dla antygenów somatycznych O oraz antygenu Vi pałeczek Salmonella Typhi u osób pochodzących z epidemicznego ogniska duru brzusznego.

17 Nr 3-4 Przydatność odczynu ELISA w serodiagnostyce duru brzusznego 167 MATERIAŁ I METODY Do badań wykorzystano 155 próbek surowicy pochodzących od osób podejrzanych o zakażenie pałeczkami S. Typhi bądź osób z bliskiego kontaktu z takimi chorymi, z ogniska epidemicznego duru brzusznego w Kraśniku w latach U 15 osób z tej grupy, dur brzuszny został potwierdzony uprzednio wykonanymi badaniami bakteriologicznymi lub serologicznymi, przeprowadzonymi odczynem Widala bądź hemaglutynacji biernej. Nie dysponowano danymi dotyczącymi objawów klinicznych czy też wyników uprzednio przeprowadzonych badań bakteriologicznych bądź serologicznych w kierunku zakażenia pałeczkami S. Typhi u pozostałych 140 osób z ogniska epidemicznego w Kraśniku osoby te zakwalifikowano do grupy osób ze styczności z chorymi na dur brzuszny. Próbki surowicy od czasu uzyskania do momentu badania były przetrzymywane w zamrożeniu bądź jako liofilizaty w chłodni. Dodatkowo, badaniom poddano 115 próbek surowicy uzyskanych od krwiodawców - klinicznie zdrowych dorosłych osób. Próbki te otrzymano w latach z Regionalnego Centrum Krwiodawstwa i Krwiolecznictwa w Warszawie. Odczyn immunoenzymatyczny ELISA. W badaniach wykorzystano zestaw ELISA opracowany we własnym zakresie. Test ELISA przeprowadzano na metapleksowych płytkach firmy Nunc zgodnie z metodyką opisaną w poprzednich publikacjach, oznaczając poziom przeciwciał klasy IgA, IgG oraz IgM (11). W odczynie ELISA wykorzystano preparat antygenu somatycznego przygotowany ze szczepu S. Typhi O-901 oraz preparat antygenu Vi uzyskany ze szczepu S. Typhi 6S zmodyfikowaną metodą Boivina (7). W wyniku przeprowadzonego miareczkowania metodą szachownicy ustalono użytkowe stężenie wszystkich preparatów antygenowych na 25 µg/ml. W badaniach zastosowano koniugaty firmy Dako (Polyclonal Rabbit Anti-Human IgA/IgG/IgM/HRP) w stężeniu użytkowym od 1/1500 do 1/ W każdej serii doświadczenia badano surowicę kontrolną o wysokim poziomie przeciwciał dla użytych preparatów antygenowych. Wyznaczanie wartości cut-off. Wartość cut-off ustalono na poziomie średniej arytmetycznej poziomu przeciwciał (OD 450 ) w próbkach surowicy uzyskanych od 115 krwiodawców powiększonej o dwa odchylenia standardowe. Statystyczne opracowanie wyników. Analizę statystyczną uzyskanych wyników przeprowadzono przy użyciu programu Instat (Instat Biostatistic). Istotność różnic w częstości wykrywania przeciwciał w próbkach surowicy osób należących do różnych grup oceniano testem niezależności chi-kwadrat z zastosowaniem poprawki Yatesa. Za znamienne statystycznie przyjęto różnice, gdzie poziomy istotności p były mniejsze od 0,05 (p<0,05). WYNIKI Częstość występowania przeciwciał dla antygenu somatycznego pałeczek S. Typhi w próbkach surowicy osób z ogniska epidemicznego duru brzusznego w Kraśniku oraz osób klinicznie zdrowych krwiodawców z Warszawy przedstawiono w tabeli 1. Przeciwciała dla antygenu somatycznego najczęściej wykrywano u osób chorych, z laboratoryjnie potwierdzonym durem brzusznym (80,0%). Przeciwciała te wykrywano również u przeszło połowy osób ze styczności z chorymi na dur brzuszny. Zarówno u osób chorych jak i osób ze styczności najczęściej wykrywano przeciwciała klasy IgM (odpowiednio 60,0% oraz 46,4%).

18 168 W. Rastawicki, S. Kałużewski Nr 3-4 Tabela 1. Częstość występowania przeciwciał dla antygenu somatycznego pałeczek Salmonella Typhi w próbkach surowicy osób z laboratoryjnie potwierdzonym durem brzusznym z ogniska epidemicznego w Kraśniku, osób ze styczności z chorymi na dur brzuszny z Kraśnika oraz osób klinicznie zdrowych krwiodawców z Warszawy. Grupa badanych osób Osoby z laboratoryjnie potwierdzonym durem brzusznym Osoby ze styczności z chorymi na dur brzuszny Osoby klinicznie zdrowe - krwiodawcy z Warszawy Liczba próbek Liczba (odsetek) próbek surowicy dodatnich w odczynie ELISA z antygenem somatycznym pałeczek S. Typhi IgA IgG IgM IgA/IgG/IgM 15 5 (33,3%) 8 (53,3%) 9 (60,0%) 12 (80,0%) (27,1%) 47 (33,6%) 65 (46,4%) 72 (51,4%) (3,5%) 6 (5,2%) 3 (2,6%) 9 (7,8%) W tabeli 2 przedstawiono częstość występowania przeciwciał dla antygenu Vi pałeczek S. Typhi w próbkach surowicy osób z durem brzusznym z ogniska epidemicznego w Kraśniku, osób ze styczności z chorymi na dur brzuszny z Kraśnika oraz osób klinicznie zdrowych krwiodawców z Warszawy. Podobnie jak w przypadku oznaczeń wykonanych odczynem ELISA z antygenem somatycznym, najczęściej wykrywano przeciwciała dla antygenu Vi u osób chorych na dur brzuszny (53,3%), nieco rzadziej u osób ze styczności (45,0%). Przeciwciała dla antygenu Vi najczęściej należały do klasy IgG. Statystyczna analiza istotności różnic między wynikami oznaczeń poziomu przeciwciał u osób chorych, osób ze styczności i osób zdrowych wykazała, że odczynem ELISA istotnie częściej (p<0,05) wykrywano przeciwciała w mianie diagnostycznie znamiennym, zarówno dla antygenu somatycznego jak i antygenu Vi pałeczek Salmonella, u osób chorych na dur brzuszny i u osób ze styczności niż u krwiodawców. Tabela 2. Częstość występowania przeciwciał dla antygenu Vi pałeczek Salmonella Typhi w próbkach surowicy osób laboratoryjnie potwierdzonym durem brzusznym z ogniska epidemicznego w Kraśniku, osób ze styczności z chorymi na dur brzuszny z Kraśnika oraz osób klinicznie zdrowych krwiodawców z Warszawy. Grupa badanych osób Osoby z laboratoryjnie potwierdzonym durem brzusznym Osoby ze styczności z chorymi na dur brzuszny Osoby klinicznie zdrowe - krwiodawcy z Warszawy Liczba próbek Liczba (odsetek) próbek surowicy dodatnich w odczynie ELISA z antygenem Vi pałeczek S. Typhi IgA IgG IgM IgA/IgG/IgM 15 4 (26,7%) 6 (40,0%) 3 (20,0%) 8 (53,3%) (21,4%) 48 (34,3%) 36 (25,7%) 63 (45,0%) (3,5%) 4 (3,5%) 4 (3,5%) 7 (6,1%)

19 Nr 3-4 Przydatność odczynu ELISA w serodiagnostyce duru brzusznego 169 DYSKUSJA Laboratoryjna diagnostyka duru brzusznego opiera się zarówno na wykryciu pałeczek S. Typhi w próbkach materiału klinicznego jak też na wykazaniu podwyższonego poziomu przeciwciał dla antygenu somatycznego oraz antygenu rzęskowego w odczynie aglutynacji probówkowej (odczynie Widala). Badania bakteriologiczne, będące złotym standardem w diagnostyce duru, mogą dawać, zwłaszcza u bezobjawowych nosicieli czy też osób, u których stosowano wcześniejszą antybiotykoterapię, wyniki fałszywie ujemne. Z drugiej strony, mogą występować fałszywie dodatnie wyniki odczynu Widala u osób zamieszkałych na terenach endemicznych dla duru brzusznego (8). Z tego względu, za diagnostycznie znamienny należałoby przyjąć co najmniej czterokrotny wzrost poziomu przeciwciał w dwóch kolejnych próbkach surowicy. Od szeregu lat podejmowane są udane próby zastąpienia odczynu Widala, odczynem immunoenzymatycznym ELISA, umożliwiającym oznaczenie poziomu przeciwciał dla antygenów somatycznych osobno w klasach IgA, IgG i IgM (10, 12, 13). Badania te wykazały, ze odczyn ELISA, charakteryzujący się wysoką czułością i swoistością, zwłaszcza podczas poszukiwania przeciwciał klasy IgG, może być efektywną metodą w diagnostyce duru brzusznego. Niewątpliwą zaletą zastosowania odczynu ELISA jest również fakt, że przy użyciu tej metody możliwe jest zbadania dużej liczby próbek surowicy w krótkim czasie, co może mieć znaczenie w przypadku wystąpienia masowych ognisk epidemicznych duru brzusznego. Zazwyczaj jako antygen w odczynie ELISA stosowany jest lipopolisacharydowy antygen somatyczny O. Trzeba mieć na uwadze, że ze względu na podobieństwo budowy antygenowej pałeczek Salmonella możliwe są nieswoiste reakcje krzyżowe z przeciwciałami skierowanymi dla pałeczek Salmonella należących innych serotypów. W serodiagnostyce duru brzusznego wykonywanej odczynem ELISA, oprócz antygenu somatycznego, został także wykorzystany antygen rzęskowy H (3, 5). Według Jesudason i wsp. (5) czułość i swoistość odczynu ELISA z antygenem somatycznym O wynosiła odpowiednio 89,4% i 94,9%, natomiast z antygenem rzęskowym H 68,1% oraz 97,4%. Badania serologiczne wykonywane odczynem ELISA mogą być także przydatne do badania nosicielstwa pałeczek duru brzusznego. Przez szereg lat wykorzystywano do tego celu odczyn hemaglutynacji biernej z preparatem antygenu Vi. Przyjęcie diagnostycznie znamiennego miana przeciwciał (>80) dla antygenu Vi w tym odczynie pozwoliło odróżnić nosicieli pałeczek duru brzusznego od zdrowych osób nie będących nosicielami (6). Autorzy ci podkreślają jednakże, że w serodiagnostyce nosicielstwa S. Typhi należy się liczyć z pewnym odsetkiem nosicieli, u których nie wykrywa się w surowicy przeciwciał anty Vi, lub poziom tych przeciwciał jest bardzo niski. Przykładowo, Losonsky i wsp. (9) wykryli odczynem ELISA obecność przeciwciał dla antygenu Vi u 81% nosicieli pałeczek S. Typhi i tylko u 12% osób z ostrą postacią duru brzusznego. Dur brzuszny występuje endemicznie w Indiach i Pakistanie, w Afryce, w Dalekowschodniej Azji, na Środkowym Wschodzie oraz w Ameryce Południowej i Środkowej. W krajach europejskich, w tym w Polsce, dur brzuszny występuje obecnie sporadycznie. Ze względu jednak na intensywny ruch turystyczny, istnieje możliwość, że dur brzuszny może być do Polski zawleczony. Z tego względu, szczepienia przeciw durowi brzusznemu są zalecane nie tylko pracownikom służb komunalnych, ale także osobom wyjeżdżającym

20 170 W. Rastawicki, S. Kałużewski Nr 3-4 do krajów, gdzie dur brzuszny występuje endemicznie (14). W przypadku wykonywania szczepień ochronnych celowe jest monitorowanie poszczepiennej odpowiedzi immunologicznej. Idealnym narzędziem służącym temu celowi może być odczyn ELISA, który charakteryzuje się wysoką czułością i swoistością oraz umożliwia precyzyjne określenie poziomu poszczepiennych przeciwciał dla antygenów pałeczek S. Typhi w poszczególnych klasach immunoglobulin. Przykładem takiego zastosowania tej metody, jest odczyn ELISA z antygenem Vi opracowany przez Ferry i wsp. (2). W odczynie tym, u zdrowych, nieszczepionych dorosłych osób średnia wartość poziomu przeciwciał dla antygenu Vi wynosiła 5,3 jednostek/ml natomiast u zdrowych dzieci 1,4 jednostek/ml. W grupie osób poddanych szczepieniu polisacharydową szczepionką Vi S. Typhi średni poziom przeciwciał wzrastał z wartości 3,9 do 39,2 jednostek/ml. Według tych autorów, trzykrotny wzrost poziomu przeciwciał dla antygenu Vi po szczepieniu jest dowodem na skuteczność przeprowadzonych szczepień przeciwko durowi brzusznemu (2). Prezentowana praca jest próbą zastosowania odczynu immunoenzymatycznego ELISA, z antygenami uzyskanymi we własnym zakresie, do poszukiwania swoistych przeciwciał dla antygenów S. Typhi u osób podejrzanych o dur brzuszny. Ze względu na obecnie sporadyczne występowanie tych zakażeń w Polsce, w prezentowanej pracy do badań przeznaczono próbki surowicy uzyskane podczas ogniska epidemicznego duru brzusznego w Kraśniku w latach Brak danych epidemiologicznych, danych z wywiadu lekarskiego czy też konkretnych wyników uprzednio wykonanych badań laboratoryjnych utrudnił dokładną ocenę przydatności opracowanego odczynu ELISA do badania osób chorych na dur brzuszny czy też nosicieli pałeczek S. Typhi. Z tego względu, celowe wydaje się kontynuowanie badań nad przydatnością odczynu ELISA zarówno do serodiagnostyki duru brzusznego jak też do badania skuteczności szczepień przeciwko Salmonella Typhi wykonywanych na terenie kraju. PIŚMIENNICTWO 1. Barret TJ, Blake PA, Brown SL. Enzyme-linked immunosorbent assay for detection of human antibodies to Salmonella typhi Vi antigen. J Clin Microbiol 1983; 17: Ferry BL, Misbah SA, Stephens P i inni. Development of an anti-salmonella typhi Vi ELISA: assessment of immunocompetence in healthy donors. Clin Exp Immunol 2004; 136: House D, Wain J, Ho VA i inni. Serology of typhoid fever in an area of endemicity and its relevance to diagnosis. J Clin Microbil 2001; 39: Jagielski M, Kałużewski S. Serodiagnostyka duru brzusznego i durów rzekomych. Wyd. Metod. PZH Warszawa Jesudason MV, Sridharan G, Arulselvan R i inni. Diagnosis of typhoid fever by the detection of anti-lps and anti-flagellin antibodies by ELISA. Indian J Med Res 1998; 107: Kałużewski S, Zaleska M. Serologiczna diagnostyka nosicielstwa Salmonella typhi niektóre aspekty metodyki i interpretacji odczynu hemaglutynacji biernej z antygenem Vi. Med Dośw Mikrobiol 1975; 27: Kopacka B. Immunologiczne i immunochemiczne badania nad antygenami Salmonella ze szczególnym uwzględnieniem antygenów O i Vi Salmonella typhi. Wyd. Metod. PZH, Warszawa Levine M,M, Grados O, Woodward WE i inni. Diagnostic value of the Widal test in areas endemic for typhoid fever. Am J Trop Med Hyg. 1978; 27:

21 Nr 3-4 Przydatność odczynu ELISA w serodiagnostyce duru brzusznego Losonsky GA, Ferreccio C, Kotloff KL i inni. Development and evaluation of an enzyme-linked immunosorbent assay for serum Vi antibodies for detection of chronic Salmonella typhi carriers. J Clin Microbiol 1987; 25: Nardiello S, Pizzella T, Russo M, Galanti B. Serodiagnosis of typhoid fever by enzyme-linked immunosorbent assay determination of anti-salmonella typhi lipopolysaccharides antibodies. J Clin Microbil 1984; 20: Rastawicki W. Humoralna odpowiedź na wybrane antygeny pałeczek Yersinia enterocolitica i Yersinia pseudotuberculosis w przebiegu jersiniozy u ludzi. I. Występowanie i poziom przeciwciał dla somatycznych antygenów pałeczek Yersinia oraz wydzielniczych białek Yop wykrytych odczynem ELISA. Med Dośw Mikrobiol 2006; 58: Sippel JE, Hanafy HM, Diab AS i inni. Serodiagnosis of typhoid fever in pediatric patients by anti-lps ELISA. Trans R Soc Trop Med Hyg 1987; 81: Sippel J, Bukhtiari N, Awan MB i inni. Indirect immunoglobulin G (IgG) and IgM enzyme-linked immunosorbent assays (ELISAs) and IgM capture ELISA for detection of antibodies to lipopolysaccharides in adult typhoid fever patients in Pakistan. J Clin Microbiol 1989; 27: Szczepienia Info. Portal internetowy: Otrzymano: 20 VII 2015 r Adres Autora: Warszawa, ul. Chocimska 24, Zakład Bakteriologii NIZP PZH w Warszawie

22

23 MED. DOŚW. MIKROBIOL., 2015, 67: Porównanie metody Real-Time PCR z metodą bezpośredniej immunofluorescencji z metodą w laboratoryjnej diagnostyce chlamydiozy u pacjentów Kliniki Dermatologii i Wenerologii Warszawskiego Uniwersytetu Medycznego The Comparison of Real-Time PCR and direct immunofluorescence in laboratory diagnostics of chlamydiosis in patients of Department of Dermatology and Venereology Medical University of Warsaw Ewa Skulska 1, Beata Młynarczyk-Bonikowska 1*, Szymon Walter de Walthoffen 2, Grażyna Młynarczyk 2, Magdalena Malejczyk 1, Sławomir Majewski 3 1 Zakład Diagnostyki Chorób Przenoszonych Drogą Płciową Warszawskiego Uniwersytetu Medycznego 2 Katedra i Zakład Mikrobiologii Lekarskiej Warszawskiego Uniwersytetu Medycznego 3 Klinika Dermatologii i Wenerologii Warszawskiego Uniwersytetu Medycznego Zakażenie Chlamydia trachomatis należy do najczęstszych chorób przenoszonych drogą płciową. Celem pracy było porównanie metody Real-Time PCR oraz bezpośredniej immunofluorescencji (Direct Immunofluorescence, DIF) w laboratoryjnej diagnostyce zakażeń C. trachomatis. Zbadano materiał pochodzący od 152 pacjentów. Zgodne wyniki Real-Time PCR i DIF uzyskano w przypadku 90% wszystkich badanych próbek. W pozostałych przypadkach: 9% stanowiły ujemne wyniki DIF przy dodatnim wyniku Real-Time PCR oraz 1% dodatnie wyniki DIF przy ujemnym wyniku Real- -Time PCR. Zgodne wyniki występowały częściej w próbkach pochodzących od kobiet (98% zgodności) niż od mężczyzn (84% zgodności). U pacjentów po antybiotykoterapii zgodne wyniki uzyskano w 88% pobranych próbek. Przeprowadzone badania wykazały stosunkowo wysoką zgodność obu metod w diagnostyce chlamydiozy i wyższą czułość metody Real-Time PCR w porównaniu z DIF. Słowa kluczowe: Chlamydia trachomatis, Real-Time PCR, DIF, immunofluorescencja bezpośrednia, diagnostyka laboratoryjna

24 174 E. Skulska i inni Nr 3-4 ABSTRACT Introduction: Chlamydial infection is one of the most common bacterial sexually transmitted diseases. The aim of the study was to compare Real Time PCR and Direct Immunofluorescence (DIF) in laboratory diagnostics of Chlamydia trachomatis infection in patients of Department of Dermatology and Venereology in Warsaw. Methods: We investigated the urethral, cervical, anal and pharyngeal specimens from 152 patients of Department of Dermatology and Venereology in Warsaw. We used DNA Bact Extra Pure Kit (Euroclone ) to isolate DNA. Real Time PCR DUPLICα 2nd Generation Detection Real Time Advanced Dual Easy Chlamydia trachomatis Kit (Euroclone ) was performed on termocycler Smart Cycler Dx. For direct immunofluorescence we used MicroTrack Chlamydia trachomatis Direct Specimen Test (Trinity Biotech). Results: In 90% of cases of Real Time PCR and DIF were consistent. 9% of samples were DIF negative and PCR positive and 1% were PCR negative and DIF positive. The results of PCR and DIF were identical more often in woman (98%)than in men (84%). In patients after antibiotics treatment the results of the two tests were consistent in 88%. Conclusions: In laboratory diagnostics of C. trachomatis infections the results of the Real Time PCR and DIF were highly consistent although Real Time PCR was more sensitive than DIF. Key words: Chlamydia trachomatis, Real-Time PCR, DIF, Direct immunofluorescence, laboratory diagnostics WSTĘP Chlamydia trachomatis jest jednym z najczęstszych etiologicznych czynników chorób przenoszonych drogą płciową (Sexually Transmitted Infections - STI) zarówno na świecie, jak i w Polsce. Według WHO w 2008 roku na świecie wystąpiło prawie 106 mln nowych przypadków zakażeń tym patogenem, i jak dotąd częstość zakażeń C. trachomatis pozostaje na stałym, wysokim poziomie (12). Infekcje wywołane przez C. trachomatis często mogą mieć charakter bezobjawowy. W USA, gdzie od pewnego czasu prowadzone są rutynowo badania przesiewowe, wykazano, że większość z potwierdzonych przypadków zakażeń C. trachomatis miało właśnie taki przebieg. Nieleczona chlamydioza może u kobiet spowodować zapalenie narządów miednicy małej (PID pelvic inflammatory disease), co często jest przyczyną niepłodności i ciąży pozamacicznej. Inną poważną konsekwencją jest okołoporodowa infekcja noworodka oraz zwiększone 3 5 krotnie ryzyko transmisji zakażenia HIV (1,11,14). Rozwój diagnostyki laboratoryjnej i wprowadzanie nowych, czułych, swoistych i szybkich metod diagnostycznych w kierunku zakażenia C. trachomatis jest głównym warunkiem wczesnego rozpoznania i leczenia, a tym samym zmniejszenia skutków powikłań, zmniejszenia ryzyka wystąpienia innych chorób przenoszonych drogą płciową oraz warunkiem poprawienia ogólnego stanu zdrowia populacji. CDC (Centers of Disease Control and Prevention) rekomenduje wprowadzenie diagnostycznych badań przesiewowych w grupie wszystkich kobiet w wieku od 16 do 25 roku życia (14). W przypadku kobiet diagnostyka jest utrudniona szczególnie

25 Nr 3-4 Real-time PCR i bezpośrednia immunofluorescencja w diagnostyce chlamydiozy 175 częstym (w 80-90%) bezobjawowym przebiegiem zakażenia, a u obu płci częstym brakiem dostępu do czułych metod diagnostycznych i spójnych programów przesiewowych. W krajach Europy Zachodniej i Północnej, w których od kilku lat prowadzone są badania przesiewowe oraz rutynowo wykonywane są testy diagnostyczne oparte na metodach amplifikacji kwasów nukleinowych (NAATs - nucleic acid associated techniques), liczba nowych przypadków zakażeń C. trachomatis u kobiet przewyższa liczbę nowych przypadków u mężczyzn (tzw. współczynnik M F czyli male to female ratio jest mniejszy niż 1). Średni współczynnik M-F w Europie w 2010 roku wynosił 0,69, co oznacza, że odnotowano o 44% więcej przypadków zachorowań u kobiet. Krajem o najwyższym współczynniku M-F w Unii Europejskiej (nieco ponad 3) jest Polska. Oznacza to, że w Polsce rejestrowanych jest 3 razy więcej przypadków zachorowań na chlamdiozę u mężczyzn niż u kobiet, co wyraźnie odbiega od średniej europejskiej. Podkreśla się, że niski współczynnik zgłaszanych przypadków oraz wysoki współczynnik M-F najprawdopodobniej odzwierciedla brak dostępu pacjentów do czułych metod diagnostycznych, brak odpowiednio prowadzonej diagnostyki u kobiet oraz brak programów badań przesiewowych, a nie jest odzwierciedleniem rzeczywiście niskiej zapadalności na chlamydiozę (3). W Polsce rejestracja chlamydiozy jest prowadzona od lat osiemdziesiątych. Szczyt zachorowań obserwowano w latach Od tego czasu następował stopniowy spadek liczby zgłaszanych przypadków zachorowań. W raporcie ECDC pierwsze dane z Polski pojawiają się w 2006 roku. Liczba zgłaszanych przypadków wynosiła w 2006 roku 612 (1,6 na ). Dostępne są dane z NIZP-PZH, według których w roku 2013 stwierdzono 309 przypadków (0,8 na ), a w 2014, 163 (0,42 na ). Podobnie jak w przypadku współczynnika M-F odbiega to wyraźnie od średniej europejskiej (186 na ). Na podstawie badań niewielkich grup osób można przypuszczać, że częstość występowania patogenu w Polsce jest znacznie wyższa niż wynika to z liczby zarejestrowanych przypadków. W grupie 66 mężczyzn bez objawów choroby (żołnierzy w wieku lat) C. trachomatis wykryto metodą PCR u 2 osób (3%) (4). W innym badaniu dotyczącym 166 kobiet, w tym 76 kobiet z jednym przebytym samoistnym poronieniem, 44 z dwoma lub więcej samoistnymi poronieniami i 46 w prawidłowej ciąży, wykryto C. trachomatis metodą PCR odpowiednio u 11,8%, 9,1% i 2,2% (13). Laboratoryjną diagnostykę chlamydialnych zakażeń dróg moczowo-płciowych można wykonywać kilkoma metodami. Od kilkudziesięciu lat stosowane są: hodowla, testy immunoenzymatyczne (enzyme immunoassay, EIA) oraz immunofluorescencja bezpośrednia (direct immunofluorescence, DIF). W ciągu ostatniej dekady nastąpiły ogromne zmiany w laboratoryjnej diagnostyce wielu chorób przenoszonych drogą płciową, polegające na coraz szerszym wprowadzeniu metod opartych na amplifikacji kwasów nukleinowych. Metody te umożliwiły uzyskanie dokładniejszej i szybszej diagnozy, ale jednocześnie, ze względu na wysokie koszty, w wielu krajach ciągle istnieją trudności ze wdrażaniem ich do rutynowej diagnostyki. NAATs od 2009 roku są rekomendowane przez CDC i rutynowo wykonywane w Stanach Zjednoczonych oraz w Unii Europejskiej (2, 5). Jednak w wielu krajach świata i Europy, w tym w Polsce, rutynowa diagnostyka w dalszym ciągu opiera się na DIF lub EIA, a NAATs dostępne są jedynie komercyjnie. W Polsce laboratoryjna diagnostyka chlamydialnych zakażeń dróg moczowo-płciowych opiera się głównie na metodzie DIF. Pozwala ona na wykrycie w materiale pobranym od pacjenta ciałek podstawowych chlamydii (Elementary Body, EB). Celem badania było porównanie metody opartej na bezpośredniej immunofluorescencji (DIF) z metodą Real-Time PCR w laboratoryjnej diagnostyce chlamydiozy u chorych

26 176 E. Skulska i inni Nr 3-4 zgłaszających się do Poradni przy Klinice Dermatologii i Wenerologii Warszawskiego Uniwersytetu Medycznego. MATERIAŁ I METODY. Do badania zostało zakwalifikowanych 152 pacjentów Kliniki Dermatologii i Wenerologii. W badanej grupie 59 osób prezentowało objawy kliniczne mogące sugerować chlamydiozę (wyciek, pieczenie lub dyskomfort w cewce moczowej, ból gardła, ból lub wydzielina zapalna z okolicy odbytu, u kobiet upławy, pobolewanie w dole brzucha), 8 osób miało kontakt z osobami zakażonymi C. trachomatis, a 24 osoby zgłosiły się na badanie kontrolne po antybiotykoterapii z powodu wcześniejszego zapalenia cewki moczowej osobową grupę kontrolną stanowiły osoby, które nie zgłaszały żadnych dolegliwości, nie zgłaszały żadnych objawów chorobowych i nie były seksualnymi partnerami pacjentów leczonych w naszej poradni z powodu STI, a powodem ich zgłoszenia się była chęć wykonania badań w kierunku chorób przenoszonych drogą płciową. Do tej grupy zakwalifikowano również 43 zdrowe kobiety skierowane do nas z kliniki ginekologicznej na badanie w kierunku chlamydiozy, w celu dopełnienia procedury kwalifikacyjnej do zabiegu zapłodnienia in vitro (program prowadzony przez Ministerstwo Zdrowia). Materiał w postaci wymazu z odpowiedniego miejsca (cewka moczowa, szyjka macicy, gardło, odbyt) do metody DIF pobierano sterylną bawełnianą wymazówką firmy Copan, Italia. W celu uzyskania DNA poszukiwanych drobnoustrojów materiał pobierano z tych samych okolic przy użyciu wymazówki transportowej Transystem firmy Copan, Italia. Do przeprowadzenia badania metodą DIF wykorzystano gotowy zestaw - MicroTrack Chlamydia trachomatis Direct Specimen Test, firmy TrinityBiotech. Test ten służy do wykrywania ciałek podstawowych (elementary body,eb) C. trachomatis w materiale pobranym od pacjenta. Preparaty oglądano w mikroskopie fluorescencyjnym (Axioskop firmy Opton) z obiektywami immersyjnymi 40x i 100x. Wynik dodatni stwierdzano na podstawie obecności w preparacie co najmniej 10 EB. Jako wynik ujemny przyjęto preparaty, w których obecne były tylko komórki nabłonkowe zabarwione na czerwono lub dodatkowo jaskrawo-zielone nieregularne punkty traktowane jako artefakty. Wynik uznawano za ujemny tylko wtedy, gdy w preparacie widoczne były wybarwione na czerwono komórki nabłonka, co świadczyło o tym, że materiał został prawidłowo pobrany od pacjenta. Izolacja DNA z pobranych próbek została przeprowadzona przy użyciu komercyjnego zestawu DNA Bact Extra Pure Kit firmy Euroclone. Procedurę przeprowadzono według protokołu podanego przez producenta. Metoda oparta jest na adsorpcji DNA na specjalnej kolumnie. Procedurę izolacji DNA wykonywano natychmiast po uzyskaniu materiału badawczego lub w ciągu 24 godzin. Do czasu izolacji DNA pobrany materiał przechowywany był w temp 5-8 C. Wyizolowane DNA przechowywano w temp. -20 C do czasu wykonania reakcji amplifikacji. W celu wykrycia w badanych próbach DNA C. trachomatis wykorzystano reakcję Real-Time PCR. Badania zostały wykonane na termocyklerze SmartCycler Dx przy użyciu komercyjnego zestawu amplifikacyjnego DUPLICα RealTime Advanced Dual Easy Chlamydia trachomatis Kit (Euroclone ). W przypadku diagnostyki zakażeń C. trachomatis poszukiwane były sekwencje w obrębie plazmidu oraz genu dla 16S rrna. Zestawy posiadają kontrolę wewnętrzną, której rolą jest wykluczenie ewentualnego zaha-

27 Nr 3-4 Real-time PCR i bezpośrednia immunofluorescencja w diagnostyce chlamydiozy 177 mowania reakcji PCR. Sonda typu TaqMan dla wykrycia C. trachomatis została wyznakowana fluorochromem typu FAM (6-carboxy-fluorescein) oraz wygaszaczem BHQ-1. Sonda wykorzystywana w kontroli wewnętrznej zestawu została wyznakowana fluorochromem typu HEX (hexachloro-6-carboxyfluorescein) oraz wygaszaczem BHQ-1. WYNIKI Wyniki uzyskane w poszczególnych grupach pacjentów przedstawiono szczegółowo w tabelach I i II. Ogółem w 152-osobowej grupie pacjentów diagnozowanych w kierunku C. trachomatis taki sam wynik metodą DIF i Real-Time PCR (oba wyniki negatywne lub oba wyniki pozytywne), stwierdzono u 137 osób, co stanowi 90% wszystkich wyników. Wyniki rozbieżne (DIF negatywny przy pozytywnym Real-Time PCR lub DIF pozytywny przy negatywnym Real-Time PCR) stwierdzono u 15 osób, co stanowi 10% wszystkich wyników w tym 9% (13 osób) stanowiły ujemne wyniki DIF przy dodatnim wyniku Real- -Time PCR oraz 1% (2 osoby w obu przypadkach byli to mężczyźni z wyciekiem z cewki moczowej i dysurią) dodatnie wyniki DIF przy ujemnym wyniku Real-Time PCR. Stosunek liczby wszystkich wyników zgodnych (WWZ) do liczby wszystkich prób badanych (WPB) wynoszący 0,9 stwierdzono zarówno w grupie obejmującej wszystkich pacjentów, jak również po wyłączeniu pacjentów po leczeniu. W Tabeli II zwraca uwagę wysoki stosunek WWZ/WPB = 0,98 w grupie wszystkich kobiet, podczas gdy w grupie wszystkich mężczyzn wyniósł on 0,84. Przedstawiony w Tabeli I najwyższy stosunek WWZ/WPB = 0,97 dotyczył grupy pacjentów zdrowych, czyli bezobjawowych, niebędących kontaktami, ani niebędących po leczeniu. Stosunek WWZ/WPB w grupie pacjentów objawowych, kontaktów i po leczeniu wyniósł odpowiednio 0,85/0,88/0,88 (Tabela I). Stosunek liczby zgodnych wyników dodatnich do liczby wszystkich wyników dodatnich miał wartość 0,42 w grupie Tabela I. Wyniki pacjentów diagnozowanych w kierunku Chlamydia trachomatis DIF(-)/ DIF(+)/ DIF(-)/ DIF(+)/ WWZ / ZWD / Grupy pacjentów PCR(-) PCR(+) PCR(+) PCR(-) WPB WWD (liczba) liczba % liczba % liczba % liczba % Łącznie (152) ,9 0,42 (137/152) (11/26) Łącznie z wykluczeniem po ,9 0,45 leczeniu (128) Objawowi (59) ,85 0,53 Kontakty (8) ,88 0 Zdrowi (bezobjawowi, nie kontakty, nieleczeni) ,97 0 (61) Po leczeniu (24) ,88 0,25 Stosowane skróty: DIF, immunofluorescencja bezpośrednia; PCR, Real-Time PCR, WWZ wszystkie wyniki zgodne WPB wszystkie próby badane, ZWD zgodne wyniki dodatnie, WWD wszystkie wyniki dodatnie

28 178 E. Skulska i inni Nr 3-4 Tabela II. Porównanie wyników pacjentów diagnozowanych w kierunku Chlamydia trachomatis z uwzględnieniem podziału na płeć. Grupy pacjentów (liczba) DIF(-)/ PCR(-) DIF(+)/ PCR(+) DIF(-)/ PCR(+) DIF(+)/ PCR(-) liczba % liczba % liczba % liczba % WWZ/ WPB ZWD / WWD mężczyźni (87) ,84 0,42 kobiety (65) ,98 0,5 Stosowane skróty: DIF, immunofluorescencja bezpośrednia; PCR, Real-Time PCR, WWZ wszystkie wyniki zgodne, WPB wszystkie próby badane, ZWD zgodne wyniki dodatnie, WWD wszystkie wyniki dodatnie wszystkich pacjentów, podczas gdy w grupie pacjentów objawowych miał wartość 0,53 a w grupie pacjentów po leczeniu 0,25 (Tabela I). DYSKUSJA W ostatnich latach przeprowadzono wiele badań w różnych krajach, porównując metody NAAT i DIF. Wyniki mogły się różnić, zależnie od grupy badanych osób, materiału, częstości występowania zakażeń C. trachomatis w danej populacji, rodzaju stosowanej NAAT i innych czynników. Badanie wymazów z szyjki macicy w grupie 68 studentek w Serbii metodami DIF i PCR wykazało czułość DIF 46% i swoistość 95% w stosunku do PCR(100%) (10). Inne badanie przeprowadzane w Indiach w grupie 96 kobiet z objawami sugerującymi zakażenie C. trachomatis wykazało dodatni wynik u 9 pacjentek metodą PCR, a u 11 metodą DIF. Dodatni PCR, a ujemny DIF wystąpił u jednej pacjentki, a odwrotne wyniki uzyskano dla 4 pacjentów (9). W badaniach dotyczących dużej grupy 397 kobiet i 253 mężczyzn pacjentów poradni dermatologiczno-wenerologicznej lub ginekologicznej w Rosji, porównano w diagnostyce C. trachomatis różne metody DIF (dwie komercyjne), hodowlę komórkową i 3 opracowane przez laboratoria we własnym zakresie testy PCR. Stwierdzono najwyższą czułość PCR wynoszącą %, zależnie od użytego testu i sposobu pobrania materiału. Czułość DIF w tych badaniach wynosiła 56-75%.Różne testy PCR wykazywały swoistość %, a testy DIF były swoiste w %. Swoistość hodowli wynosiła 100% jednak przy niskiej czułości (46%) (8). Na czułość i swoistość metod diagnostycznych mogą mieć wpływ różne czynniki. Czułość DIF może być znacznie obniżona w przypadku użycia nieoptymalnego dla tej metody materiału (mocz i wymaz z pochwy zamiast wymazów z cewki moczowej i szyjki macicy), pobrania wymazów w krótki czas po umyciu się lub oddaniu moczu przez pacjenta(zalecana jest przerwa 4 godziny) lub przy pozagenitalnej lokalizacji zakażenia (gardło, odbyt). W przypadku NAATs ze względu na większą łatwość pobierania zalecane jest stosowanie jako materiału moczu lub wymazu z pochwy (2, 5). W naszym badaniu użyto zarówno do PCR jak i DIF wymazów z cewki szyjki, co nie powinno mieć znaczącego wpływu na wyniki PCR. Nie przestrzegano bezwzględnie odstępu 4 godzin od umycia się i oddania moczu do pobrania próbek, co w pewnym stopniu mogło zmniejszyć

29 Nr 3-4 Real-time PCR i bezpośrednia immunofluorescencja w diagnostyce chlamydiozy 179 czułość DIF. Większość niezgodnych wyników w naszym badaniu to wyniki dodatnie metodą Real Time PCR, a ujemne metodą DIF, co wskazuje na wyższą czułość NAATs i potwierdza wyniki badań innych autorów porównujących obie metody (8, 9, 10). Real Time PCR jest również metodą o wysokiej swoistości. Najczęstszą przyczyną nieswoiście dodatnich NAATs jest kontaminacja, jednak w przypadku naszych badań nie podejrzewamy jej wystąpienia. Wśród badanych przez nas próbek, 7 pochodziło z okolic pozagenitalnych (3 z gardła i 4 z odbytu). W przypadku 2 próbek pobranych z odbytu uzyskano dodatni wynik Real Time PCR, a ujemny DIF, w pozostałych przypadkach wynik był ujemny przy zastosowaniu obu metod. Sugeruje to, że w pozagenitalnych lokalizacjach czułość NAATs jest znacznie większa niż DIF. Jedynie w dwóch przypadkach uzyskano dodatnie wyniki DIF a ujemne PCR. Oba dotyczyły wymazów z cewki od mężczyzn, z klinicznymi i mikroskopowymi objawami zapalenia cewki moczowej i z wykluczoną (mikroskopowo, w posiewie i w PCR) rzeżączką. Niezgodność DIF i PCR u tych pacjentów można wyjaśnić na dwa sposoby. Wyniki DIF mogły być fałszywie dodatnie jednak przeciwko temu wyjaśnieniu przemawia duże doświadczenie osób wykonujących badanie, stan zdrowia pacjentów i ich dobra reakcja na leczenie zakażenia C. trachomatis. Druga możliwość to zakażenie nie wychwycone przez PCR, a tylko metodą DIF. Większość NAATs ukierunkowana jest na wykrycie konkretnego fragmentu materiału genetycznego, który w przypadku chlamydii może być umiejscowiony w obrębie plazmidu lub chromosomu gen kodujący główne białko zewnętrznej błony komórkowej ciałka podstawowego lub rrna dla tego białka. W przypadku odmian genetycznych nie posiadających tego fragmentu najczęściej stosowane metody oparte na NAATs mogą dawać wyniki fałszywie ujemne. U C. trachomatis dotychczas opisano tylko kilka takich przypadków dotyczących głównie mutacji w obrębie plazmidu lub braku plazmidu. Bardzo szczegółowo przebadany został wariant C. trachomatis, u którego stwierdzono delecję 377 pary zasad w DNA plazmidowym, która to para jest typowym celem wykrywanym przez kilkanaście komercyjnych NAATs. Okazało się, że wyniki oparte na tych NAATs były w 20 65% fałszywie ujemne (7). Opracowane więc zostały specjalne NAATs dla wariantu szwedzkiego, który jest sporadycznie spotykany także poza krajami skandynawskimi (6). W naszych badaniach te testy nie były dostępne. Jednak użyty przez nas test Real Time PCR był oparty na poszukiwaniu 2 różnych fragmentów DNA, z których jeden zlokalizowany był w plazmidzie a drugi w bakteryjnym chromosomie, co zmniejsza możliwość uzyskania fałszywie ujemnego wyniku tą metodą. Warto podkreślić, że DIF jest jednakowo czuły niezależnie od wariantu genetycznego C. trachomatis. Większy odsetek uzyskanych przez nas zgodnych wyników u kobiet, może wynikać z małej liczby dodatnich wyników w tej grupie. Wynik dodatni metodą PCR uzyskano tylko u 2 z 63 badanych kobiet, a metodą DIF u 1. Do pełnej oceny zgodności wyników dodatnich potrzebna byłaby większa liczba. Jednak czułość DIF w stosunku do PCR w tym przypadku wynosiła około 50%, co jest porównywalne z uzyskanym wynikiem dla mężczyzn, wynoszącym 42%. Wyższa liczba zakażeń wykrytych u mężczyzn może wynikać z faktu, że więcej badanych mężczyzn niż kobiet zgłosiło się do naszej poradni z powodu objawów sugerujących zakażenie. Większość badanych kobiet nie zgłaszała żadnych objawów, a 43 kobiety bez objawów zakażenia (stanowiące część grupy kontrolnej) zostały przebadane w związku z planowanym zapłodnieniem in vitro (mogły więc stanowić inną grupę populacyjną niż typowi pacjenci poradni wenerologicznej). W podsumowaniu, nasze badania potwierdziły, że Real Time PCR jest metodą czulszą niż DIF i powinno się ją stosować zwłaszcza u osób skąpo objawowych lub bezobjawo-

30 180 E. Skulska i inni Nr 3-4 wych, kontaktów, innych niż genitalna lokalizacji zakażenia (gardło, odbyt). Co prawda, metoda DIF jest tańsza i szybsza ale mniej czuła, zwłaszcza w przypadkach skąpo i bezobjawowych oraz lokalizacji pozagenitalnej. Real Time PCR oraz inne NAATs mogą mieć niższą czułość w przypadku pewnych wariantów genetycznych C. trachomatis. W tych przypadkach wymagane może być zastosowanie innego testu NAAT, swoistego dla danego wariantu. W tych wypadkach metoda DIF wykazuje przewagę, gdyż umożliwia wykrycie ciałek podstawowych niezależnie od genetycznych odmian C. trachomatis. PIŚMIENNICTWO 1. Bhattar S, Bhalla P, Chadha S i inni. Chlamydia trachomatis infection in HIV-infected women: need for screening by a sensitive and specific test. Infect Dis Obstet Gynecol 2013; 2013: Centers for Disease Control and Prevention. Recommendations for the laboratory-based detection of Chlamydia trachomatis and Neisseria gonorrhoeae MMWR Recomm Rep 2014; 63: European Centre for Disease Prevention and Control. Annual epidemiological report sexually transmitted infections, including HIV and blood-borne viruses. Stockholm: ECDC, Korzeniewski K, Konior M, Lass A, Guzek A. Occurrence of Chlamydia trachomatis in military environment on the example of professional soldiers in the Polish Armed Forces. Int Marit Health 2014; 65: Lanjouw E, Ossewaarde JM, Stary A i inni European guideline for the management of Chlamydia trachomatis infections. Int J STD AIDS 2010; 21: Pineiro L, Bernal S, Bordes A i inni. Minimum spread of the new Swedish variant of Chlamydia trachomatis and distribution of C. trachomatis ompa genotypes in three geographically distant areas of Spain, Infection 2014; 42: Ripa T,Nilsson PA. A Chlamydia trachomatis strain with a 377-bp deletion in the cryptic plasmid causing false-negative nucleic acid amplification tests. Sex Transm Dis 2007; 34: Shalepo K, Savicheva A, Shipitsyna E i inni. Diagnosis of Chlamydia trachomatis in Russia--in- -house PCR assays may be effective but overall optimization and quality assurance are urgently needed. APMIS 2006; 114: Sood S, Mukherjee A, Bala M i inni. A pilot study for diagnosis of genital Chlamydia trachomatis infections by polymerase chain reaction among symptomatic Indian women. Indian J Dermatol Venereol Leprol 2012; 78: Tomanovic S, Cukic I, Obradovic M i inni.the diagnosis of Chlamydia trachomatis cervical infection among students by using classical and molecular methods. Srp Arh Celok Lek 2013; 141: Wasserheit JN. Epidemiological synergy. Interrelationships between human immunodeficiency virus infection and other sexually transmitted diseases. Sex Transm Dis 1992; 19: WHO. Global incidence and prevalence of curable sti , pp Wilkowska-Trojniel M, Zdrodowska-Stefanow B, Ostaszewska-Puchalska I i inni. The influence of Chlamydia trachomatis infection on spontaneous abortions. Adv Med Sci 2009; 54: Workowski KA, Bolan GA. Centers for Disease Control and Prevention. Sexually transmitted diseases treatment guidelines, MMWR Recomm Rep 2015; 64:1-137 Otrzymano: 22 X 2015 r. Adres Autora: Warszawa, ul. Koszykowa 82A, Klinika Dermatologii i Wenerologii, Warszawski Uniwersytet Medyczny

31 MED. DOŚW. MIKROBIOL., 2015, 67: Problemy w serologicznej diagnostyce atypowych zapaleń płuc na przykładzie wyników badań w kierunku zakażeń wywoływanych przez Legionella pneumophila oraz Mycoplasma pneumoniae Problems in the serological diagnosis of atypical pneumonia caused by Legionella pneumophila and Mycoplasma pneumoniae Karolina Śmietańska, Anna Chróst, Waldemar Rastawicki Zakład Bakteriologii Narodowego Instytutu Zdrowia Publicznego - Państwowego Zakładu Higieny w Warszawie Przeprowadzone badania odczynem ELISA i western-immunoblotting wykazały obecność przeciwciał dla Mycoplasma pneumoniae w próbkach surowicy uzyskanych od osób z serologicznie potwierdzoną legionellozą, jak też w próbkach surowicy osób podejrzanych w badaniu klinicznym o legionelozę, ale z ujemnym wynikiem badań serologicznych w tym kierunku. Taki obraz humoralnej odpowiedzi może świadczyć zarówno o występowaniu nieswoistych reakcji krzyżowych jak również być dowodem na to, że w serologicznej diagnostyce atypowych zapaleń płuc, ze względu na brak swoistych objawów klinicznych, nie można ograniczać się wyłącznie do poszukiwania przeciwciał dla jednego, wybranego patogenu. Słowa kluczowe: Atypowe zapalenie płuc, serodiagnostyka legionelozy, serodiagnostyka mykoplazmozy, przeciwciała, ELISA, western-blot ABSTRACT Introduction: The clinical presentation of atypical pneumonia is often similar to the presentation of more typical bacterial pneumonias and the etiological agent must be confirmed by laboratory diagnosis. This article will discuss the problems in the serological diagnosis of atypical pneumonia caused by Legionella pneumophila and Mycoplasma pneumoniae which are the agents most commonly associated with atypical pneumonia. Specifically, seeking the possibility of non-specific response, we evaluated the prevalence of antibodies to M. pneumoniae in serum samples obtained from patients suspected in clinical investigation for legionellosis.

32 182 K. Śmietańska, A. Chróst, W. Rastawicki Nr 3-4 Methods: The total numbers of 261 serum obtained from patients suspected in clinical investigation for legionellosis, were tested by in-house ELISA with M. pneumoniae sonicated antigen. Some of the positive sera were also re-tested by western-blot with high specific recombinant M. pneumoniae P1 protein. Results: The diagnostic significant level of IgA antibodies to M. pneumoniae were diagnosed by ELISA in 71 (27,2%) of tested serum samples. Some of the IgA-positive sera have also high level of IgG and IgM antibodies to M. pneumoniae (respectively 4,2% and 6,5%). Most from the 18 selected positive results obtained by ELISA were also confirmed by western- -blot. It was characteristic that IgA antibodies to M. pneumoniae were detected more than three times often in serum samples with positive serological tests for Legionnaires disease than in samples with negative results for L. pneumophila. Conclusions: This study showed the possibility of non-specific reactions in serological diagnosis of atypical pneumonia. However, according to the data of the literature, co-infections of L. pneumophila and M. pneumoniae can not be excluded. Key words: atypical pneumonia, serodiagnosis of legionellosis, serodiagnosis of mycoplasmosis, antibodies, ELISA, western-blot WSTĘP Atypowe zapalenie płuc ma odmienny przebieg od klasycznego, pneumokokowego zapalenia płuc (6). Po okresie wylęgania choroby, który trwa zazwyczaj od 7 do 20 dni, pojawia się ból głowy, mięśni, światłowstręt oraz nieproduktywny, suchy kaszel, utrzymujący się przez wiele tygodni. Radiologiczny obraz klatki piersiowej jest bardzo zróżnicowany i nie pozwala na postawienie jednoznacznego rozpoznania etiologii choroby. Przy atypowym zapaleniu płuc stosunkowo często dochodzi do występowania objawów spoza układu oddechowego, a antybiotyki z grupy β-laktamów nie mają działania terapeutycznego (20). Ze względu na brak charakterystycznych objawów klinicznych etiologiczny czynnik atypowego zapalenia płuc może być ustalony jedynie na podstawie mikrobiologicznych badań laboratoryjnych. Do częstych etiologicznych czynników atypowego zapalenia płuc należą pałeczki Legionella pneumophila oraz Mycoplasma pneumoniae. Zapalenie płuc wywołane przez L. pneumophila nosi nazwę choroby legionistów i stanowi od 2-19% wszystkich zapaleń płuc u ludzi (7,8). Powikłania narządowe głównie dotyczą układu nerwowego (zapalenie mózgu, porażenie nerwów obwodowych), układu pokarmowego (nudności, wymioty, biegunka) oraz układu krążenia (zapalenie wsierdzia, mięśnia sercowego) (6). Zakażenia wywołane przez M. pneumoniae stanowią od 4-40% objawowych infekcji układu oddechowego i charakteryzują się sezonowym nasileniem w okresie jesienno-zimowym (5,10,11,12,17). Powikłania w przebiegu mykoplazmozy mogą dotyczyć wielu narządów i przebiegają najczęściej jako zapalenie wątroby, wsierdzia, mięśnia sercowego, nerek, stawów, zapalenia mózgu, opon mózgowo-rdzeniowych czy też zapaleń wielonerwowych (16,18,19,). Ze względu na podobny kliniczny przebieg atypowego zapalenia płuc wywołanego przez obydwa drobnoustroje w różnicowej diagnostyce konieczne jest przeprowadzenie specjalistycznych badań laboratoryjnych, opierających się głównie na stwierdzeniu obecności w surowicy chorego

33 Nr 3-4 Problemy w serodiagnostyce atypowych zapaleń płuc 183 swoistych przeciwciał dla antygenów L. pneumophila oraz M. pneumoniae. W praktyce, często jednak zachodzi sytuacja, że zgodnie ze skierowaniem lekarskim, w próbce surowicy poszukiwane są odczynem ELISA jedynie przeciwciała swoiste dla jednego z tych patogenów. W przypadku uzyskania wyniku ujemnego często albo nie są podejmowane dalsze badania albo badania te są wykonywane w późniejszym okresie, co może prowadzić do opóźnienia w postawieniu rozpoznania i podjęcia celowanej antybiotykoterapii. Celem prezentowanej pracy była ocena częstości występowania przeciwciał dla antygenów M. pneumoniae w próbkach surowicy przysyłanych do badania w kierunku oznaczenia poziomu przeciwciał dla antygenów L. pneumophila. Dodatkowo, chcieliśmy sprawdzić czy próbki surowicy o wysokim poziomie przeciwciał dla antygenów L. pneumophila będą dawały nieswoiste krzyżowe reakcje z antygenem M. pneumoniae. MATERIAŁ I METODY Próbki surowicy. W badaniu wykorzystano 261 próbek surowicy uzyskanych od osób podejrzanych w badaniu klinicznym o legionelozę. Wszystkie próbki zostały przysłane do Zakładu Bakteriologii NIZP-PZH w Warszawie w latach w celu przeprowadzenia rutynowych badań diagnostycznych w kierunku obecności przeciwciał dla Legionella pneumophila serotypów 1-7 odczynem immunoenzymatycznym ELISA firmy Euroimmun. Zestaw ELISA firmy Euroimmun do oznaczania poziomu przeciwciał klasy IgA, IgG, IgM dla L. pneumophila. Badanie poziomu przeciwciał klasy IgA, IgG i IgM wykonano zgodnie z procedurą podaną przez producenta zestawu Euroimmun Anty-Legionella pneumophila ELISA ( IgA, IgG, IgM). Jako antygenu w zestawie firmy Euroimmun użyto lipopolisacharydu (LPS) L. pneumophila serotypów 1-7 (serotyp 1-Philadelphia-1, serotyp 2-Togus-1, serotyp 3-Blommington-2, serotyp 4-Los Angeles, serotyp 5-Dallas 1E, serotyp 6-Chicago 2, serotyp 7-Chicago 8). Zestaw ELISA NIZP-PZH do oznaczania poziomu przeciwciał klasy IgA, IgG, IgM dla Mycoplasma pneumoniae. Badanie przeprowadzono pośrednim testem immunoenzymatycznym ELISA na płytkach metapleksowych firmy Nunc (Maxisorp). W odczynie ELISA posłużono się instrukcją opracowaną we własnym zakresie ELISA NIZP-PZH z uwzględnieniem niezbędnych modyfikacji (13). Do opłaszczania płytek użyto homogennej zawiesiny fragmentów błon komórkowych szczepu FH M. pneumoniae, uzyskanych po wcześniejszym rozbiciu komórek ultradźwiękami. W odczynie ELISA posłużono się króliczymi, poliklonalnymi przeciwciałami sprzężonymi z peroksydazą chrzanową (DAKO) dla ludzkich immunoglobulin IgA, IgG, IgM. Przyjęto rozcieńczenie robocze koniugatu IgA 1/1500, IgG 1/10000, IgM 1/2500. Pomiaru absorbancji dokonano przy użyciu czytnika firmy AsysTech przy długości fali 450 nm. Zestaw western-immunobloting NIZP-PZH do potwierdzenia obecności przeciwciał w klasie IgA, IgG dla M.pneumoniae. W opracowanym we własnym zakresie odczyn western-immunoblotting zastosowano rekombinowane białko P1. Badanie przeprowadzono zgodnie z metodyką podaną uprzednio (14).

34 184 K. Śmietańska, A. Chróst, W. Rastawicki Nr 3-4 WYNIKI I ICH OMÓWIENIE Analiza wyników rutynowo wykonywanych badań serologicznych w kierunku legionelozy w Zakładzie Bakteriologii NIZP-PZH wykazała, że tylko u stosunkowo niewielkiego odsetka osób z atypowym zapaleniem płuc, podejrzanych w badaniu klinicznym o legionelozę, wykrywa się podwyższony poziom przeciwciał dla antygenów L. pneumophila. Powodem tego może być zarówno niska czułość metod serologicznych, zwłaszcza w początkowej fazie zakażenia L. pneumophila, jak również brak swoistych objawów klinicznych w przebiegu atypowego zapalenia płuc wywołanego różnymi patogenami, co może utrudniać lekarzowi prawidłowy dobór panelu badań wykonywanych w pracowniach mikrobiologicznych. Trzeba mieć na uwadze, że nie zawsze w przypadku uzyskania ujemnego wyniku badania serologicznego w kierunku legionelozy, wykonywane są dalsze badania w kierunku innych, potencjalnych przyczyn atypowego zapalenia płuc. Taka praktyka, podyktowana często względami ekonomicznymi, powoduje, że w wielu przypadkach nie udaje się ustalić etiologicznej przyczyny atypowych zapaleń płuc u ludzi. Z tego powodu, w prezentowanej pracy, postanowiono sprawdzić, czy w grupie 261 pacjentów z atypowym zapaleniem płuc, podejrzanych w badaniu lekarskim o legionelozę, będą osoby z podwyższonym poziomem przeciwciał dla antygenów M. pneumoniae. Dodatkowo, chcieliśmy sprawdzić czy próbki surowicy o wysokim poziomie przeciwciał dla antygenów L. pneumophila będą dawały nieswoiste krzyżowe reakcje z antygenem M. pneumoniae. Realizując wyznaczony cel, do badań wybrano 231 próbek surowicy uzyskanych od osób z ujemnym wynikiem serologicznego badania w kierunku legionelozy oraz 30 próbek, w których stwierdzono obecność diagnostycznie znamiennego poziomu przeciwciał dla antygenów L. pneumophila przynajmniej w jednej klasie immunoglobulin. Postanowiono, że we wszystkich 261 próbkach surowicy będzie się poszukiwać odczynem ELISA przeciwciał klasy IgA dla antygenów M. pneumoniae. Wybór poszukiwania przeciwciał tej klasy wynika z faktu, że są one swoistym i czułym serologicznym markerem aktualnej mykoplazmozy (3). Tabela I. Częstość występowania przeciwciał klasy IgA dla antygenów M. pneumoniae oznaczonych odczynem ELISA w 261 próbkach surowicy osób z atypowym zapaleniem płuc, podejrzanych w badaniu klinicznym o legionelozę. Badana grupa osób Liczba badanych próbek surowicy Liczba (odsetek) próbek surowicy, badanych odczynem ELISA w kierunku obecności przeciwciał klasy IgA dla antygenów M. pneumoniae Próbki z wynikiem dodatnim Próbki z wynikiem wątpliwym Próbki z wynikiem ujemnym Osoby z atypowym zapaleniem płuc, z dodatnim wynikiem badań (33,3%) 6 (20%) 14 (46,7%) serologicznych w kierunku legionelozy Osoby z atypowym zapaleniem płuc, z ujemnym wynikiem badań (9,1%) 34 (14,7%) 176 (76,2%) serologicznych w kierunku legionelozy Razem (11,9%) 40 (15,3%) 190 (72,8%)

35 Nr 3-4 Problemy w serodiagnostyce atypowych zapaleń płuc 185 Tabela II. Częstość występowania przeciwciał klasy IgA, IgG, IgM dla antygenów M. pneumoniae oznaczonych odczynem ELISA w wybranych 71 próbkach surowicy osób z atypowym zapaleniem płuc, podejrzanych w badaniu klinicznym o legionelozę, w których wykryto podwyższony poziom przeciwciał klasy IgA dla M. pneumoniae. Liczba (odsetek) próbek surowicy, badanych odczynem ELISA w kierunku obecności przeciwciał klasy IgA, IgG i IgM dla antygenów M. pneumoniae Przeciwciała klasy Przeciwciała klasy IgA Przeciwciała klasy IgG Badana grupa IgM Liczba badanych próbek Próbki z wynikiem dodatnim Próbki z wynikiem wątpliwym Próbki z wynikiem dodatnim Próbki z wynikiem wątpliwym Próbki z wynikiem dodatnim Próbki z wynikiem wątpliwym Osoby z atypowym zapaleniem płuc z podejrzeniem legionelozy w badaniu klinicznym (43,7%) 40 (56,3%) 3 (4,2%) 18 (25,4%) 2 (6,5%) 1 (1,4%) Przeprowadzone badania wykazały, że w 71 (27,2%) próbkach surowicy stwierdzono podwyższony poziom przeciwciał klasy IgA dla antygenów M. pneumoniae (w przypadku 31 próbek surowicy uzyskano wynik dodatni a w przypadku 40 próbek wynik wątpliwy w odczynie ELISA). Jednakże, ponad trzykrotnie częściej stwierdzano przeciwciała klasy IgA dla M. pneumoniae wśród próbek z wynikiem dodatnim dla L. pneumophila (33,3%) niż wśród próbek z wynikiem ujemnym dla tego patogenu (9,1%) (Tabela I). Na uwagę zasługuje fakt, że w przypadku 24, spośród wybranych 30 próbek surowicy, stwierdzono diagnostycznie znamienny poziom przeciwciał klasy IgA dla antygenów L. pneumophila (pozostałe 6 próbek nie było badanych na obecność przeciwciał klasy IgA dla L. pneumophila). W dalszym etapie badań postanowiono poszukać we wszystkich 71 próbkach surowicy, w których stwierdzono podwyższony poziom przeciwciał klasy IgA dla antygenów M. pneumoniae, również przeciwciał klasy IgG i IgM dla tego patogenu. Końcowe zestawienie uzyskanych wyników we wszystkich trzech klasach immunoglobulin przedstawiono w Tabeli II. I tak, badając odczynem ELISA 71 wybranych próbek surowicy, stwierdzono 3 (4,2%) wyniki dodatnie i 18 (25,4%) wyników wątpliwych w klasie IgG oraz 2 (6,5%) wyniki dodatnie i 1 (1,4%) wynik wątpliwy w klasie IgM. Podwyższony poziom przeciwciał klasy IgG i IgM dla M. pneumoniae, stwierdzono w podobnym odsetku u osób z dodatnim i ujemnym wynikiem serologicznego badania w kierunku legionelozy. Swoistość wyników uzyskanych w odczynie ELISA z antygenem M. pneumoniae w klasie IgA i IgG potwierdzano następnie referencyjnym odczynem western-immunoblotting. Do badań przeznaczono grupę 18 próbek surowicy, w przypadku których uzyskano wątpliwy wynik badania odczynem ELISA w klasie IgG. Dokładna analiza wykazała, że wśród tych 18 próbek surowicy, 6 próbek było dodatnich a 12 wątpliwych w odczynie ELISA podczas poszukiwania przeciwciał klasy IgA dla M. pneumoniae.

36 186 K. Śmietańska, A. Chróst, W. Rastawicki Nr 3-4 Tabela III. Częstość występowania przeciwciał klasy IgG dla antygenów M. pneumoniae oznaczonych odczynem western-immunoblotting w wybranych 18 próbkach surowicy osób z atypowym zapaleniem płuc, podejrzanych w badaniu klinicznym o legionelozę, w których wykryto podwyższony poziom przeciwciał klasy IgG dla M. pneumoniae odczynem ELISA. Badana grupa Osoby z atypowym zapaleniem płuc z wątpliwym wynikiem odczynu ELISA w klasie IgG dla M. pneumoniae Liczba badanych próbek Liczba (odsetek) próbek surowicy badanych odczynem western-immunoblotting w kierunku przeciwciał klasy IgG dla Mycoplasma pneumoniae Próbki z wynikiem dodatnim Próbki z wynikiem ujemnym (61%) 7 (38,9%) Przeprowadzone odczynem western-immunoblotting badania wykazały obecność przeciwciał klasy IgG w 11 (61,0%) próbkach surowicy, spośród 18 próbek z wątpliwym wynikiem w odczynie ELISA (Tabela III). Obecność przeciwciał klasy IgA wykazano odczynem western-immunoblotting w 5 (83,3%) próbkach z wynikiem dodatnim oraz 3 (25,0%) próbkach z wynikiem wątpliwym w odczynie ELISA w klasie IgA dla M. pneumoniae (Tabela IV). W prezentowanej pracy wykazano obecność przeciwciał dla antygenów M. pneumoniae w dużym odsetku osób z atypowym zapaleniem płuc, podejrzanym w badaniu klinicznym o legionelozę. Przeciwciała te występowały zarówno w próbkach surowicy uzyskanych od osób z serologicznie potwierdzoną legionelozą jak też w próbkach surowicy, w których przeciwciał dla pałeczek L. pneumophila nie wykryto. Tak więc, możemy mieć tu do czynienia zarówno z występowaniem nieswoistych reakcji krzyżowych jak też występowaniem u osób z atypowym zapaleniem płuc, pierwotnie podejrzanych w badaniu klinicznym o legionelozę, zakażeń wywołanych przez M. pneumoniae. Zarówno w przypadku legionelozy jak i mykoplazmozy, ze względu na problemy z izolacją zarazka z próbek materiału klinicznego, podstawą rutynowej diagnostyki labora- Tabela IV. Częstość występowania przeciwciał klasy IgA dla antygenów M. pneumoniae oznaczonych odczynem western-immunoblotting w wybranych 18 próbkach surowicy osób z atypowym zapaleniem płuc, podejrzanych w badaniu klinicznym o legionelozę, w których wykryto podwyższony poziom przeciwciał klasy IgG dla M. pneumoniae odczynem ELISA. Badana grupa Osoby z dodatnim wynikiem w odczynie ELISA w klasie IgA dla M. pneumonie Osoby z wątpliwym wynikiem w odczynie ELISA w klasie IgA dla M. pneumonie Liczba badanych próbek Liczba (odsetek) próbek surowicy badanych odczynie western-immunoblotting w kierunku Mycoplasma pneumoniae Próbki z wynikiem dodatnim Próbki z wynikiem ujemnym 6 5 (83,3%) 1 (16,7%) 12 3 (25,0%) 9 (75,0%)

37 Nr 3-4 Problemy w serodiagnostyce atypowych zapaleń płuc 187 toryjnej są wyniki badań serologicznych. Występowanie nieswoistych krzyżowych reakcji, związane prawdopodobnie z podobieństwem budowy antygenowej tych patogenów, utrudnia interpretację wyników. W piśmiennictwie dostępne są dane o występowaniu reakcji krzyżowych w serologicznej diagnostyce legionelozy podczas badania osób z zakażeniem wywołanym przez bakterie z rodzaju Campylobacter, Rickettsia, Proteus, Bordetella i Mycoplasma (1,2,4,9). Problem wzajemnych reakcji między Legionella pneumophila i Mycoplasma pneumoniae nie jest jednak do końca zbadany. Grady i Gilfillan (4) wykryli odczynem wiązania dopełniacza przeciwciała dla M. pneumoniae w 22 na 27 zbadanych próbek surowicy uzyskanych od osób z serologicznie potwierdzoną legionelozą. Renner i wsp. (15) badając z kolei próbki surowicy uzyskane od 1060 osób z ostrym stanem zapalnym układu oddechowego nie stwierdzili statystycznie istotnej zależności pomiędzy wynikami badań serologicznych przeprowadzonych w kierunku zakażeń wywoływanych przez L. pneumophila oraz M. pneumoniae. Jak pokazują wyniki prezentowanej przez nas pracy w próbkach surowicy z dodatnim wynikiem badań serologicznych w kierunku legionelozy ponad trzykrotnie częściej uzyskiwano wyniki dodatnie w klasie IgA dla M. pneumoniae niż w próbkach z wynikiem ujemnym dla L. pneumophila, co może świadczyć o występowaniu reakcji nieswoistych. Jak pokazują dane piśmiennictwa, oprócz występowania nieswoistych reakcji krzyżowych, nie można wykluczyć również jednoczesnego zakażenia osób pałeczkami L. pneumophila jak i M. pneumoniae (3). PODSUMOWANIE Etiologiczny czynnik atypowego zapalenia płuc jest szczególnie trudny do rozpoznania ze względu na brak swoistych objawów klinicznych w przebiegu choroby oraz trudności z izolacją zarazka z próbek materiału klinicznego. Z tego powodu w serologicznej diagnostyce zapaleń układu oddechowego nie można ograniczać się wyłącznie do poszukiwania przeciwciał dla jednego, wybranego patogenu. Jak pokazują wyniki prezentowanych badań oraz dane piśmiennictwa w interpretacji wyników serologicznych badań prowadzonych w kierunku legionelozy oraz mykoplazmozy należy brać pod uwagę występowanie nieswoistych reakcji krzyżowych. PIŚMIENNICTWO 1. Benson R. F., Thacker W. L., Plikaytis B. B., Wilkinson H. W. Cross-Reaction in Legionella Antisera with Bordetella pertussis Strains. Journal of Clinical Microbiology 1987; Collins M.T., Espersen F., Hoiby N., Cho S., Friis-Moller A., reif J. S. Cross-Reaction between Legionella pneumophila (serogroup 1) and twenty-eight other bacterial species, including other members of the family legionellaceae. Infection and immunity 1983; Easterbrook P.J., Smyth E. G. Post-infectious encephalomyelitis associated with Mycoplasma pneumoniae and Legionella pneumophila infection. Postgrad Med J 1992; 68: Grady GF, Gilfillan RF. Relation of Mycoplasma pneumoniae seroactivity, immunosuppresion, and chronic disease to Legionnaires` disease: a twelve-month prospective study of sporadic cases in Massachusetts. Ann Intern Med 1979; 90:

38 188 K. Śmietańska, A. Chróst, W. Rastawicki Nr Jahnz-Różyk K, Jurkiewicz D. Zakażenia w otolaryngologii i pneumonologii 2011; Zakażenia w pneumonologii, Zakażenia w chorobach przewlekłych. 6. Kałużewski S, Rastawicki W. Występowanie zakażeń Mycoplasma pneumoniae w Polsce w latach na podstawie wyników badań serologicznych. Med.Dośw.Mikrobiol 2014; 66: Korzon M. Wybrane prpblemy kliniczne, Atypowe zapalenie płuc u dzieci i młodzieży. Via Medica 2009; Kucharczyk P, Jahnz-Różyk K. Patofizjologia, epidemiologia i obraz kliniczny zakażeń wywołanych przez Legionella pneumophila. Int. Rev. Allergol. Clin. Immunol. Family Med. 2012;18: Palusińska-Szych M, Cendrowska-Pinkosz M. Występowanie i chorobotwórczość bakterii z rodziny Legionellaceae. Postępy Hig. Med. Dośw. 2008; 62: Pancer K. W. Cross-reaction in IgM ELISA tests to Legionella pneumophila sg1 and Bordetella pertussis among children suspected of legionellosis; potential impact of vaccination against pertussis? CentrEur J Immunol 2015; 40: Rasmussen JN, Voldstedlund M. Andersen RL i inni. Increased incidence of Mycoplasma pneumoniae infections detected by laboratory-based surveillance in Denmark in Euro Surveill 2010; 15: pii= Rastawicki W, Jagielski M. Mycoplasma pneumoniae. II. Klinika, epidemiologia i diagnostyka zakażeń. Post Mikrobiol 1998; 37: Rastawicki W, Kałużewski S, Jagielski M. Occurrence of serologically verified Mycoplasma pneumoniae infections in Poland in Eur J Epidemiol 1998; 14: Rastawicki W. Ocena odczynami tradycyjnymi i nowej generacji odpowiedzi humoralnej na antygeny Mycoplasma pneumoniae w przebiegu naturalnego zakażenia u ludzi. Występowanie i poziom mykoplazmowych przeciwciał u osób klinicznie zdrowych. Med. Dośw Mikrobiol 1995; 47: Renner ED, Helms CM, Hall NH i inni. Seroreactivity to Mycoplasma pneumoniae and Legionella pneumophila: lack of statistically significant relationship. J Clin Microbiol 1981; 13: Rokosz N, Rastawicki W, Zasada AA i inni. Mikrobiologiczna diagnostyka zakażeń układu oddechowego wywołanych przez pałeczki Legionella pneumophila. Pneumonol. Alergo. Pol. 2010; 78: Sopolińska E, Kalicki B, Grad A i inni. Zapalenie stawów w przebiegu zakażenia Mycoplasma pneumoniae ilustracja kliniczna. Pediatr Med. Rodz 2007; 3: Stypułkowksa-Misiurewicz H. Legioneloza(choroba legionistów).w: Magdzik W, Naruszewicz- -Lesiuk D. Zakażenia i zarażenia człowieka. Wydawnictwo Lekarskie PZWL, Warszawa Szewczyk E.M.Diagnostyka mikrobiologiczna, Wydawnictwo Naukowe PWN, Von Bonsdorf M, Pönka A, Törnroth T. Mycoplasma pneumonia associated with mesangiocapillary glomerulonephritis type II(dense deposit disease). Acta Med Scand 1984; 216: Otrzymano: 6 XI 2015 r. Adres Autora: Warszawa, ul. Chocimska 24, Zakład Bakteriologii NIZP-PZH

39 MED. DOŚW. MIKROBIOL., 2015, 67: Wpływ stymulacji wirusem odry na ekspresję receptorów Toll-like w komórkach PBMC Measles virus stimulation effect on the expression of Toll-like receptors in PBMC Agnieszka Częścik, Agnieszka Trzcińska, Milena Dunal-Szczepaniak, Joanna Siennicka Zakład Wirusologii, Narodowy Instytut Zdrowia Publicznego Państwowy Zakład Higieny w Warszawie W pracy opisano wpływ stymulacji wirusem odry komórek PBMC izolowanych od zdrowych osób szczepionych przeciwko odrze (seropozytywnych i seronegatywnych), na ekspresję receptorów Toll-like. Oceniano ekspresje receptorów TLR2 i TLR4 w odpowiedzi na stymulację ligandami dla tych receptorów (Pam3CSK i LPS) a także w odpowiedzi na stymulację szczepem szczepionkowym (E) i dzikimi (W1 i W2) wirusa odry. Słowa kluczowe: receptory Toll-like, ekspresja, real-time RT-PCR ABSTRACT Introduction: Toll-like receptors (TLRs) are an important component of a innate immune system. Stimulation of TLRs, through action with helper T cells, could change Th1/Th2 balance and thus affect adaptive immune response. Receptors TLR2 and TLR4 play important role in immune response to measles virus. The aim of this work was stimulation of the peripheral blood mononuclear cells (PBMC) and determination of Toll-like gene expression in these cells. Methods: PBMCs from 20 healthy donors were stimulated with measles viruses and ligands for TLR2 and TLR4. For examinations the real time RT-PCR (QuantiFast Assay, Qiagen) was used. The expression of Toll-like receptors was determined on mrna level, using real- -time one step RT-PCR (QuantiFast Assay, Qiagen) with simultaneous detection of TLR2 and TLR4 genes and housekeeping gene (GAPDH). Results: Virus-specific influence of wild measles virus strains activity on PBMC derived from vaccinated seronegative individuals manifested in higher level of expression of TLR2 and TLR4 genes in compare to the expression of these genes in PBMC of seropositive individuals. Conclusions: Toll-like receptors participate in the development of immune response to measles virus.

40 190 A. Częścik i inni Nr 3-4 Key words: Toll-like receptors, expression, real-time RT-PCR WSTĘP Receptory Toll-like (TLR) zostały odkryte stosunkowo niedawno a po raz pierwszy opisane u muszki owocowej Drosophila, u której warunkują odpowiedź przeciwgrzybiczą. Struktury te są ważnym elementem reakcji odpornościowej, stanowią pomost pomiędzy odpowiedzią wrodzoną (innate response) a nabytą (adoptive response). Przy udziale TLRs rozpoznawane są pewne struktury charakterystyczne dla patogenów (PAMP pathogen associated molecular patterns). W odróżnieniu od odpowiedzi nabytej, związanie receptora nie pociąga za sobą uruchomienia procesów pamięci immunologicznej (5, 6). Pobudzenie receptorów TLR skutkuje między innymi indukcją syntezy cytokin i na tej drodze wpływa na modyfikację odpowiedzi nabytej. Dzieje się tak poprzez oddziaływanie na limfocyty pomocnicze i ukierunkowywanie ich bądź w stronę Th1 (przewagi cytotoksyczności), bądź Th2 (przewagi odpowiedzi humoralnej) (7, 8). Pierwszymi elementami immunologicznej odpowiedzi aktywowanymi w wyniku kontaktu z wirusem odry (MeV) są te związane z odpowiedzią nieswoistą: interferonami (IFN), układem dopełniacza, komórkami NK oraz pobudzeniem receptorów Toll-like. Dostępne dane wskazują, że spośród wszystkich znanych receptorów TLR, na kształtowanie reakcji odpornościowej indukowanej przez MeV największe znaczenie ma aktywacja TLR2 oraz TLR4 (1, 2, 4). W pracy Bieback i wsp. (1) przedstawiono, że dzikie szczepy wirusa odry, ale nie szczepy szczepionkowe, aktywuje limfocyty T zarówno mysie jak i ludzkie poprzez receptor TLR2, a właściwość ta jest związana jest z obecnością hemaglutyniny. Celem pracy było określenie ekspresji receptorów TLR 2 i TLR 4 pod wpływem stymulacji wirusem odry, oraz udziału receptorów w kształtowaniu odpowiedzi poszczepiennej. MATERIAŁ I METODY W badaniu uczestniczyło 20 zdrowych ochotników szczepionych przeciwko odrze o znanym statusie serologicznym: seronegatywnych pomimo szczepienia (NEG, n=8), seropozytywnych w wyniku szczepienia (POS, n=12), od których pobierano 10 ml krwi żylnej, celem izolacji komórek PBMC (Peripheral Blood Mononuclear Cells). Komórki PBMC izolowano przy użyciu LSM (Lymphocyte Separation Medium, MP Biomedicals). Zebrane PBMC płukano w PBS, zawieszano w RPMI 1640 (Sigma, R8758) z dodatkiem 10% płodowej surowicy cielęcej (FBS) i liczono w komorze Bűrkera. Próbki zawierające 10 6 PBMC w 4 ml zawiesiny stymulowano dodając niżej wymienione stymulatory i stosując odpowiedni czas i temperaturę stymulacji: µl LPS (10 µg/ml), czas stymulacji 24h w 37 C µl Pam3CSK (1 µg/ml), czas stymulacji 6h w 37 C µl zawiesiny wirusa odry szczep Edmonston (E), zawierającą 1250 cząstek zakaźnych wirusa, czas stymulacji 24h w 37 C µl zawiesiny wirusa odry izolat 2281/3/2006 (W1) zawierającą 1250 cząstek zakaźnych wirusa, czas stymulacji 24h w 37 C

41 Nr 3-4 Ekspresja receptorów Toll-like w komórkach PBMC µl zawiesiny wirusa odry izolat 2521/3/2007 (W2) zawierającą 1250 cząstek zakaźnych wirusa, czas stymulacji 24h w 37 C µl PBS, czas stymulacji 24h w 37 C Warunki stymulacji określono w doświadczeniu opisanym w pracy opublikowanej uprzednio (3). Po etapie inkubacji próbki wirowano (250g, 10 minut, 20 C), nadsącz odciągano, osad worteksowano, przenoszono do probówek typu eppendorf i przechowywano w temperaturze -70 C do czasu izolacji mrna. Z komórek PBMC mrna izolowano przy użyciu zestawu Oligotex Direct mrna Mini Kit (QIAGEN, 70022). Proces izolacji przeprowadzono zgodnie z procedurą podaną przez producenta testu. Zgodnie z informacją producenta zestawu, odzysk mrna izolowanego wg tej procedury wynosił ponad 90%. Izolat mrna do dalszych analiz przechowywano w temperaturze -70 C. Poziom ekspresji receptorów Toll-like na poziomie mrna oznaczono metodą Real- -time RT-PCR z jednoczesną detekcją poszukiwanego genu (TLR2 lub TLR4) oraz genu referencyjnego (GAPDH) z wykorzystaniem zestawów: - QuantiFast Probe Assays (QIAGEN) zawierającego indywidualnie projektowane startery oraz sondę TaqMan (sonda hydrolizująca) dla genów TLR2 (Hs_TLR2_FAM_1, QF ), TLR4 (Hs_TLR4_FAM_1; QF ) lub genu referencyjnego dehydrogenazy gliceraldehydo-3-fosforanu; GAPDH (Hs_GAPDH_MAX_2, QF ). - QuantiFast Probe RT-PCR Plus Kit (QIAGEN, ) zawierającego zestaw buforów oraz enzymów (odwrotna transkryptaza Omniscript i Sensiscript, HotStarTaq Plus DNA polimeraza) niezbędnych do przeprowadzenia reakcji odwrotnej transkrypcji (mrna cdna) oraz amplifikacji (one-step RT-PCR) jednocześnie dla genu TLR2 lub TLR4 oraz genu referencyjnego GAPDH (format duplex detection) w czasie rzeczywistym (real-time). Zastosowany zestaw zawierał bufor umożliwiający efektywne usunięcie zanieczyszczeń genomowym DNA, które mogłoby generować fałszywie dodatnie odczyty. Reakcję Real-time PCR przeprowadzono zgodnie z procedurą podaną przez producenta zestawów, przy użyciu cyklera Rotor-Gene TM 6000 (Corbett Life Science). Na podstawie wyników wygenerowanych przez program Rotor-Gene 6000Series software v wyznaczono względny poziom ekspresji badanych genów Toll-like (TLR2 i TLR4) względem genu referencyjnego (GAPDH) stosując metodę Pfaffla. WYNIKI I ICH OMÓWIENIE W grupie 20 osób szczepionych przeciwko odrze, wykazujących różny poziom poszczepiennej odpowiedzi humoralnej: seronegatywnych pomimo szczepienia (NEG, n=8) i seropozytywnych w wyniku szczepienia (POS, n=12) oceniano względną ekspresję genów TLR2 i TLR4. Oceny dokonywano przy zastosowaniu metody Pfaffla wobec genu referencyjnego (GAPDH) po inkubacji z zawiesiną zawierającą cząstki wirusa odry szczepu szczepionkowego (E), szczepów dzikich (W1 i W2) oraz ligandów dla TLR2 i TLR4 Pam3CSK i LPS, odpowiednio.

42 192 A. Częścik i inni Nr Względna ekspresja genu TLR2/Pam3CSK 0,8 0,6 0,4 0,2 0 NEG POS Anty-MeV IgG Względna ekspresja genu TLR4/LPS NEG POS Anty-MeV IgG Ryc.1. Względna ekspresja genów dla TLR2 (wykres górny) i TLR4 (wykres dolny) po inkubacji z Pam3CSK i LPS w PBMC osób szczepionych przeciwko odrze, seronegatywnych (NEG) i seropozytywnych (POS). Nie obserwowano statystycznie istotnych różnic (p>0,05) w poziomie ekspresji TLR2 i TLR4 w komórkach PBMC pochodzących od osób seropozytywnych i seronegatywnych w stosunku do wirusa odry w odpowiedzi na działanie ligandów, które to poziomy wyniosły w grupie osób seronegatywnych i seropozytywnych, odpowiednio: 6,16±2,90 i 4,44±2,50 dla TLR2 po inkubacji z Pam3CSK, oraz 0,45±0,30 i 0,48±0,27 dla TLR4 po inkubacji z LPS (rycina 1). Poziom ekspresji badanych genów po inkubacji z zawiesinami zawierającymi różne szczepy wirusa odry wykazywał znacznie większe zróżnicowanie osobnicze niż po inkubacji z ligandami tych receptorów. Przeprowadzona analiza ujawniła istnienie wśród badanej grupy 5 osób, których wyniki znacznie odbiegały od średniej (ang. outliers). Wyniki wykraczające poza zakres (interquantile range dla współczynnika k=3) pominięto w dalszej analizie. Po wirusowo-swoistej stymulacji, wyższy poziom ekspresji badanych genów wykazywały komórki PBMC pochodzące od osób seronegatywnych (rycina 2). Dotyczyło to jednak tylko stymulacji szczepami dzikimi: dla TLR2 1,53±0,53 versus 1,16±0,57 po inkubacji ze szczepem W1 i 1,24±0,83 versus 0,59±0,59 po inkubacji ze szczepem W2, oraz dla TLR4 1,09±0,78 versus 1,05±0,66 po inkubacji ze szczepem W1 i 7,10±9,50 versus 3,54±7,09 po inkubacji ze szczepem W2. Po inkubacji ze szczepem szczepionkowym wirusa odry obserwowano sytuację odwrotną poziomy względnej ekspresji genów u osób serone-

43 Nr 3-4 Ekspresja receptorów Toll-like w komórkach PBMC 193 Ryc.2. Względna ekspresja genów TLR2 (wykres górny) i TLR4 (wykres dolny) przedstawiona jako średnia ± SD wyników uzyskanych w grupie osób szczepionych przeciwko odrze, wykazujących różny poziom odpowiedzi humoralnej: NEG (seronegatywni pomimo szczepienia) i POS (seropozytywni w wyniku szczepienia). PBMC inkubowano z zawiesiną zawierającą wirus odry szczepu szczepionkowego (E) i dwóch szczepów dzikich (W1 i W2). gatywnych były niższe od stwierdzonych u osób seropozytywnych: dla TLR2 1,00±0,31 versus 1,07±0,34 oraz dla TLR4 0,93±0,40 versus 1,28±0,49. Obserwowane różnice jedynie w przypadku ekspresji TLR4 po inkubacji ze szczepem W2 były istotne statystycznie (test Kruskal-Wallis, p=0,049). W przedstawionej pracy badano wpływ stymulacji szczepem szczepionkowym wirusa odry i szczepami dzikimi na ekspresję receptorów Toll-like u osób szczepionych przeciwko odrze. Otrzymane wyniki potwierdzają, że szczep dziki wirusa odry aktywuje receptor TLR2. Ponadto wykazano, że wyższy poziom ekspresji genów dla receptorów TLR obserwowano u osób seronegatywnych pomimo szczepienia.

44 194 A. Częścik i inni Nr 3-4 PODSUMOWANIE Receptory Toll-like wydają się być istotnym elementem wpływającym na kształtowanie odpowiedzi poszczepiennej, w szczególności u osób szczepionych seronegatywnych, które wykazują wyższy poziom ekspresji receptorów TLR. Nie mniej jednak z uwagi na niedużą liczebność grupy badanej konieczne jest przeprowadzenie badań na większą skalę z uwzględnieniem dużej grupy osób szczepionych seronegatywnych. PIŚMIENICTWO 1. Bieback K, Lien E, Klagge IM i inni. Hemagglutinin protein of wild-type measles virus activates toll-like receptor 2 signaling. J Virol 2002; 76: Częścik A, Trzcińska A, Siennicka J. Wirus odry reakcje odpornościowe związane z naturalnym zakażeniem i odpowiedzią poszczepienną. Post Mikrobiol 2011; 50: Cześcik A, Trzcińska A, Dunal-Szczepaniak M, Siennicka J. The use of real-time RT-PCR method for the determination of Toll-like genes expression at mrna level. Med Dosw Mikrobiol 2014; 66: Hahm B, Cho JH, Oldstone MB. Measles virus-dendritic cell interaction via SLAM inhibits innate immunity: selective signaling through TLR4 but not other TLRs mediates suppression of IL-12 synthesis. Virology 2007; 358: Janeway CA Jr, Medzhitov R. Innate immune recognition. Annu Rev Immunol 2002; 20: Tokarz-Deptuła B, Niedźwiedzka P, Deptuła W. Receptory Toll-podobne nowe znaczniki w immunologii. Alergia Astma Immunologia 2006; 11: van Els CA, Nanan R. T cell responses in acute measles. Viral Immunol 2002; 15: Xu D, Liu H, Komai-Koma M. Direct and indirect role of Toll-like receptors in T cell mediated immunity. Cell Mol Immunol 2004; 1: Otrzymano: 29 X 2015 r. Adres Autora: Warszawa, ul. Chocimska 24, Zakład Wirusologii, Narodowy Instytut Zdrowia Publicznego Państwowy Zakład Higieny

45 MED. DOŚW. MIKROBIOL., 2015, 67: Lekowrażliwość szczepów Lactobacillus rhamnosus wyizolowanych z produktów probiotycznych Susceptibility of Lactobacillus rhamnosus strains isolated from probiotic products to antimicrobial agents Aldona Wiatrzyk; Maciej Polak; Katarzyna Krysztopa-Grzybowska; Urszula Czajka, Anna Lutyńska Zakład Badania Surowic i Szczepionek, Narodowy Instytut Zdrowia Publicznego - Państwowy Zakład Higieny Probiotyki posiadające status GRAS (Generaly Recognized as Safe - powszechnie uznane za bezpieczne), podane w odpowiedniej dawce są zdolne do wywołania swoistych dla danego szczepu korzystnych efektów zdrowotnych u ludzi i zwierząt. Stale wzrasta liczba produktów probiotycznych dostępnych na rynku, zaliczanych szczególnie do kategorii żywności, których jakość nie jest rutynowo monitorowana. Wśród najczęściej stosowanych probiotycznych bakterii znajdują się szczepy należące do gatunku L. rhamnosus. Przeprowadzone badania 7 wybranych produktów probiotycznych potwierdziły prawidłową identyfikację L. rhamnosus na poziomie gatunku i szczepu, deklarowaną na opakowaniu oraz możliwość zastosowania celowanej antybiotykoterapii w przypadkach zakażeń uogólnionych w sześciu na siedem badanych produktów. Słowa kluczowe: probiotyk, Lactobacillus rhamnosus, wrażliwość na antybiotyki i chemioterapeutyki, bezpieczeństwo żywności ABSTRACT Introduction: Probiotics Generally Recognized as Safe (GRAS), when given in relevant dose, are able to induce strain-specific beneficial effects for health of humans or animals. Methods: L. rhamnosus strains originating from four medicinal products, 2 dietary foods for special medical purposes and dietary supplement, were tested for susceptibility to antibiotics and chemotherapeutics following L. rhamnosus and L.rhamnosus GG strain identity confirmation with use of PCR, rep-pcr and AFLP methods. Results and Conclusions: L. rhamnosus working seeds of medicinal products and isolates originating from dietary foods for special medical purposes or dietary supplement were found

46 196 A. Wiatrzyk i inni Nr 3-4 correctly classified on the levels of species or L. rhamnosus GG strain identities. Antibiotics and chemotherapeutics susceptibility profiles of L. rhamnosus strains allowed for choice of treatment options in six out of seven products under study. Key words: probiotic, lactobacilli, sensitivity to antibiotics and chemotherapeutics, food safety WSTĘP Bakterie fermentacji mlekowej, potocznie nazywane bakteriami kwasu mlekowego (LAB - lactic acid bacteria), stanowią integralną część mikroflory układu pokarmowego oraz niektórych odcinków układu oddechowego i błony śluzowej układu moczowo- -płciowego człowieka i zwierząt. Wyniki licznych badań potwierdzają, że bakterie probiotyczne hamują wzrost mikroorganizmów chorobotwórczych przez wytwarzanie związków o działaniu antybakteryjnym (19). Badania kliniczne wskazują, że podane w odpowiedniej dawce, określone probiotyczne szczepy bakterii są w stanie skracać czas trwania biegunek infekcyjnych, zmniejszać częstość ich występowania lub łagodzić przebieg biegunek poantybiotykowych lub biegunek podróżnych, a także zmniejszać objawy nietolerancji laktozy (12,17). Istnieją dane o ich korzystnym wpływie na działanie układu immunologicznego, w tym zapobieganiu atopii (18). Pewne gatunki probiotyków wytwarzają także enzymy hamujące karcynogenezę (11,24). Wyżej wymienione właściwości probiotyków stanowią jedynie wybrane przykłady spośród wielu opisanych w literaturze potencjalnych korzyści prozdrowotnego działania LAB. Ze względu na swoje prozdrowotne właściwości, szczepy probiotyczne stosowane są od dawna jako substancje czynne w produktach leczniczych, suplementach diety, dietetycznych środkach spożywczych specjalnego przeznaczenia medycznego lub jako dodatki do żywności. Zastosowanie szczepu probiotycznego w składzie produktów leczniczych lub należących do kategorii żywności u ludzi wymaga spełnienia szczególnych warunków, określonych przez Grupę Ekspercką Organizacji Stanów Zjednoczonych ds. Wyżywienia i Rolnictwa (FAO) oraz Światową Organizację Zdrowia (WHO). Według tych zaleceń, szczep probiotyczny powinien zostać wyizolowany od człowieka, właściwie zidentyfikowany z użyciem odpowiednich fenotypowych i genotypowych metod oraz scharakteryzowany pod względem właściwości funkcjonalnych oraz bezpieczeństwa w testach in vitro i badaniach wykonywanych z udziałem zwierząt. Bezpieczeństwo danego szczepu probiotycznego powinno zostać potwierdzone u ludzi w klinicznych badaniach fazy I i II, z uwzględnieniem metody podwójnie ślepej próby, randomizacji i grupy przyjmującej placebo (8,15). W fazie II klinicznych badań, obok oceny częstości występowania działań niepożądanych, powinna zostać określona także skuteczność probiotyku. Zalecany schemat badań zapewnia, że producent wprowadzając na rynek produkt probiotyczny, zastosował szczep o niskiej patogenności dla człowieka, który może zostać zaliczony do tzw. szczepów uznawanych za bezpieczne (Generally Recognised as Safe GRAS).

47 Nr 3-4 Lekowrażliwość L. rhamnosus izolowanych z probiotyków 197 W badaniach nad bezpieczeństwem probiotyków, szczególnej uwagi wymaga określenie wrażliwości drobnoustrojów na antybiotyki oraz chemioterapeutyki, najlepiej z lokalizacją genów oporności (9,16,22,23). Niepokojące dane dotyczące słabej jakości probiotyków dostępnych na rynku oraz niedostatecznej kontroli probiotyków znajdujących się w obrocie, skłaniają do przeprowadzenia pilotażowych badań z zakresu bezpieczeństwa ich stosowania (15). Zdarzające się przypadki ogólnoustrojowych zakażeń po spożyciu niektórych probiotyków u ludzi wskazują na zasadność badań nad lekowrażliwością szczepów probiotycznych w celu ułatwienia wyboru właściwej antybiotykoterapii (14,20). Celem pracy było potwierdzenie tożsamości gatunkowej szczepów L. rhamnosus zastosowanych w składzie wybranych produktów probiotycznych oraz oznaczenie ich wrażliwości na najczęściej stosowane antybiotyki i chemioterapeutyki. MATERIAŁ I METODY Szczepy bakteryjne/produkty probiotyczne. Materiał do badań stanowiło 11 szczepów L. rhamnosus: (i) 8 serii siewnych otrzymanych od wytwórców 4 produktów leczniczych 1PL, 2PL, 3PL, 4PL oraz (ii) wyizolowanych z 2 dietetycznych środków spożywczych specjalnego przeznaczenia medycznego (5DŚSSPM, 6DŚSSPM) i suplementu diety (7SD). Nazwy handlowe badanych produktów oraz oznakowanie szczepów zostały zakodowane. Charakterystykę produktów probiotycznych, stanowiących źródło analizowanych szczepów L rhamnosus pod względem składu i wskazań przedstawiono w Tabeli I. Ocenie poddano także prawidłowość oznakowania zastosowanych szczepów oraz deklarowanych wskazań. Izolacja bakterii. Zawartość opakowania bezpośredniego DŚSSPM lub SD po rozpuszczeniu i rozcieńczeniu w jałowym roztworze chlorku sodu, wysiewano na podłoże stałe de Man-Rogosa-Sharpe (MRS agar, Oxoid). Z hodowli inkubowanej w temperaturze 37 C, w warunkach beztlenowych (GENbox anaer, BioMerieux), izolowano czyste kultury bakterii, które następnie przechowywano w temperaturze -70 C w podłożu z glicerolem. Tożsamość. Przed oznaczeniem lekowrażliwości tożsamość badanych szczepów potwierdzono metodą PCR, przy użyciu starterów specyficznych dla gatunku L. rhamnosus (21) oraz szczepu L. rhamnosus GG (2). W reakcji PCR wykorzystano JumpStart REDTaq ReadyMix (Sigma) oraz po 0,5 μm każdego ze starterów. Warunki amplifikacji obejmowały: wstępną denaturację w 95 C/3 min, 35 cykli złożonych z 95 C/30 s, 55 C/30 s, 72 C/30 s oraz końcowe wydłużanie w 72 C/5 min. Kontrolę dodatnią stanowiły szczepy referencyjne: L. rhamnosus GG ATCC i L. rhamnosus PCM 492. Genotypowanie. Podobieństwo genetyczne badanych szczepów zostało określone metodami rep-pcr (repetitive sequence based PCR) oraz AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism). Badanie rep-pcr wykonano zgodnie z procedurą opisaną przez Coudeyas i wsp. (4) z modyfikacjami własnymi. W skład mieszaniny reakcyjnej wchodziło: 1,5 U polimerazy (AccuTaq LA DNA Polymerase, Sigma), 200 µm dntp (Promega), po 1µM starterów BOXA1R lub REP1R-I/REP2-I oraz odpowiednio, po 2,5 mm bądź 4 mm MgCl 2. Produkty rep-pcr rozdzielono w 1,5% żelu agarozowym (Sub-Cell GT Cell, Bio-Rad). Badanie AFLP przeprowadzono według zmodyfikowanej procedury opisanej przez Gzyl i wsp. (10). Do trawienia genomowego DNA wykorzystano po 5U odpowiednich enzymów

48 198 A. Wiatrzyk i inni Nr 3-4 Tabela I. Charakterystyka badanych produktów probiotycznych Lp/kategoria Oznakowanie gatunku i szczepu Wskazania 1PL 2PL 3PL 4PL 5DŚSSPM 6DŚSSPM 7SD L. rhamnosus 1/1PL L. rhamnosus 2/1PL L. rhamnosus 3/1PL L. rhamnosus 1/2PL L. rhamnosus 2/2PL L. rhamnosus 3/2PL L. rhamnosus 1/3PL L. helveticus 2/3PL L. rhamnosus 1/4PL L. gasseri 2/4PL Lactobacillus rhamnosus 1/5DŚSSPM Lactobacillus rhamnosus 1/6DŚSSPM Lactobacillus rhamnosus 1/7SD Saccharomyces boulardii 2/7SD - poantybiotykowe zapalenie jelit ze szczególnym uwzględnieniem leczenia wspomagającego rzekomobłoniastego zapalenia okrężnicy; jako leczenie głównie przy nawracającym rzekomobłoniastym zapaleniu okrężnicy - zapobieganie biegunce podróżnych - leczenie wspomagające w czasie i po antybiotykoterapii - leczenie wspomagające w biegunkach wirusowych u dzieci - leczenie wspomagające w zaburzeniu czynnościowym jelit spowodowanym brakiem prawidłowej flory bakteryjnej - zapobieganie biegunkom podróżnych - zaburzenia jelitowe wywołane kuracją antybiotykową - nawracające rzekomobłoniaste zapalenie okrężnicy - zapobieganie biegunce podróżnych - leczenie wspomagające po leczeniu antybiotykami - utrzymanie lub przywrócenie prawidłowej flory bakteryjnej pochwy kobiet w wieku 18 lat i starszych - zmniejszenie ryzyka wystąpienia powikłań związanych z antybiotykoterapią - wspomaganie odporności - skrócenie czasu trwania biegunki infekcyjnej - przywrócenie równowagi mikroflory jelitowej - zmniejszenie ryzyka odwodnienia - wyrównanie zaburzeń równowagi wodno-elektrolitowej - skrócenie czasu trwania biegunki - przywrócenie równowagi mikroflory jelitowej - zmniejszenie biegunki poantybiotykowej, ostrej biegunki infekcyjnej oraz biegunek podróżnych PL produkt leczniczy, DŚSSPM - dietetyczny środek spożywczy specjalnego przeznaczenia medycznego, SD suplement diety restrykcyjnych (New England Biolabs Inc.) w układach HindIII/TaqI oraz MfeI/BglII. Do otrzymanych fragmentów DNA przy użyciu T4 ligazy DNA dołączono swoiste sekwencje adaptorów. W skład mieszaniny reakcyjnej PCR wchodziło: 1 µl DNA poddanego restrykcji i ligacji, 1,5 U polimerazy (AccuTaq LA DNA Polymerase, Sigma), 2,65 mm MgCl 2,

49 Nr 3-4 Lekowrażliwość L. rhamnosus izolowanych z probiotyków lub 400 µm dntp (Promega), odpowiednio dla układu MfeI/BglII i HindIII/TaqI oraz odpowiednio 0,25/0,5 µm starterów BglII+2/MfeI+2 (5 -Cy5-GAG TAC ACT GTC GAT CTA N-3 /5 -GAG AGC TCT TGG AAT TGC C-3 ) lub 0,15/0,75 µm starterów HindIII+2/ TaqI+4 (5 -Cy5-GAC TGC GTA CCA GCT TAN-3 /5 -GAT GAG TCC TGA GCG AA-3 ). Warunki termiczne reakcji PCR dla układu HindIII/TaqI obejmowały: 1 cykl składający się z 94 C/60 s, 65 C/30 s, 72 C/60 s; 8 cykli z 94 C/30 s, temperaturą przyłączania starterów zmniejszającą się o 1 C na cykl (zaczynając od 64 C)/30 s, 72 C/60 s; 27 cykli z 94 C/30 s, 56 C/30 s i 72 C/60 s. Reakcja PCR dla układu MfeI/BglII przebiegała w następujących warukach: 94 C/3 min; 30 cykli z 94 C/60 s, 54 C/60 s, 72 C/90 s; 72 C/10 min. Produkty AFLP rozdzielano w żelu poliakrylamidowym przy użyciu ALFexpress II DNA Sequencer (Amersham Pharmacia Biotech Inc.). Wyniki genotypowania zostały poddane analizie z użyciem oprogramowania BioNumerics (Applied Maths) z zastosowaniem metody klasteryzacji UPGMA i współczynnika korelacji Pearson a. W obu metodach, AFLP i rep-pcr, profile genotypowania uzyskane z zastosowaniem różnych układów starterów poddano jednoczesnej analizie z użyciem z funkcji composite data set. Lekowrażliwość.Badane szczepy, przechowywane w stanie głębokiego zamrożenia, rozmrażano, posiewano na podłoże agarowe MRS, które następnie inkubowano w temp. 37 C przez h. Do oznaczenia lekowrażliwości zostały użyte bakterie kolejnego pasażu. Z wyhodowanych szczepów zostały sporządzone zawiesiny w 0,9% NaCl o gęstości 0,5 w skali McFarlanda. Posiewy i nakładanie krążków na płytki z agarem MRS o grubości 4 mm ± 0,5 mm wykonano zgodnie z zaleceniami Europejskiego Komitetu ds. Oznaczania Lekowrażliwości EUCAST (The European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing) (7). Do badań użyto 26 krążków z antybiotykami lub chemioterapeutykami (Oxoid i BioMerieux) tj.: penicylina (Pe 10 IU), ampicylina (AM 10 μg), amoksycylina (AMC 25 μg), piperacylina (PRL100 μg), cefuroksym (CXM 30 μg), cefotaksym (CTX 30 μg), ceftazydym (CAZ 30 μg), imipenem (IPM 10 μg), meropenem (MEM 10 μg), gentamycyna (GM 10 μg), neomycyna (N 30 μg), netylmycyna (NET 30 μg), tobramycyna (NN 10 μg), streptomycyna (S 10 μg), erytromycyna (E 15 μg), wankomycyna (VA 30 μg), doksycyklina (D 30 μg), trimetoprim-sulfametaksazol (SXT 1,25+23,75 μg), kwas nalidyksowy (NA 30 μg), klindamycyna (CC 2), kolistyna (CT 50 μg), metronidazol (MET 5 μg), teikoplanina (TEC 30 μg), cefradyna (CE 30 μg), cefepim (FEP 30 μg) oraz kloksacylina (OB 5 μg). Odczyt stref zahamowania wzrostu bakterii w mm wykonano po 48 h inkubacji płytek w temp. 37 C w atmosferze beztlenowej. W celu kontroli poprawności wykonywanych oznaczeń zastosowano 4 referencyjne szczepy o znanych profilach lekowrażliwości: Escherichia coli ATCC 25922, Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853, Staphylococcus aureus ATCC 29213, Enterococcus faecalis ATCC W celu pełnej oceny lekowrażliwości bakterii, stanowiących mieszaninę gatunków bakterii probiotycznych w określonej dawce, wykonano oznaczenie lekowrażliwości szczepów L. helveticus 2/3PL i L. gasseri 2/4PL, które obok L. rhamnosus, wchodziły w skład produktów 3PL i 4PL. Minimalne stężenie hamujące. Minimalne stężenie hamujące (MIC) wzrost badanych szczepów oceniono metodą dyfuzyjną przy użyciu pasków (E-testów M.I.C. Evaluator, Oxoid) ze stopniowo obniżającymi się stężeniami antybiotyków: gentamycyny (0, μg/ml), erytromycyny (0, μg/ml) i tetracykliny (0, μg/ml). Przygotowanie inokulum, warunki hodowli oraz szczepy referencyjne były identyczne

50 200 A. Wiatrzyk i inni Nr 3-4 jak w opisanej powyżej metodzie dyfuzyjno-krążkowej i dotyczyły wszystkich produktów z wyłączeniem produktu 7SD. Klasyfikacja lekowrażliwości została przeprowadzona na podstawie wartości granicznych MIC podanych przez EFSA. WYNIKI Tożsamość. Przy użyciu reakcji PCR z zastosowaniem gatunkowo oraz szczepowo swoistych starterów potwierdzono tożsamość badanych szczepów jako, odpowiednio L. rhamnosus oraz L. rhamnosus GG. Ocena oznakowania szczepów oraz wskazań. Oznakowanie zastosowanych gatunków oraz szczepów zostało prawidłowo przedstawione na opakowaniu. Zalecane wskazania były zgodne z właściwościami probiotycznymi zastosowanych szczepów i dotyczyły stabilizacji dysfunkcji przewodu pokarmowego. Genotypowanie. Analiza profili DNA, otrzymanych z użyciem metod rep-pcr i AFLP, potwierdziła przynależność badanych szczepów do gatunku L. rhamnosus (Ryc. 2). W obu metodach, na podstawie analiz podobieństwa genetycznego, badane szczepy zostały zaklasyfikowane do 3 grup. Wysokie podobieństwo genetyczne (około 96%) występowało wśród szczepów L. rhamnosus 1/1PL, 2/1PL, 3/1PL, 2/2PL, 3/2PL i 1/3PL. Do drugiej grupy zaliczono szczep 1/2PL o wysokim genetycznym podobieństwie ze szczepem kontrolnym PCM 492. Najbardziej oddaloną genetycznie grupą od pozostałych szczepów stanowiły szczepy L. rhamnosus GG, wyizolowane z 5DŚSSPM, 6DŚSSPM, 7SD oraz szczep 1/4PL. Całkowite podobieństwo genetyczne z zastosowaniem metod AFLP i rep-pcr oszacowane wśród analizowanych szczepów L. rhamnosus GG wyniosło odpowiednio 75% i 87%. Lekowrażliwość. Szczepy probiotyczne wchodzące w skład badanych produktów wykazywały szczepowo swoiste zróżnicowanie pod względem lekowrażliwości. Różnice w lekowrażliwości poszczególnych szczepów i sumarycznym profilu lekowrażliwości produktów przedstawiono w tabeli II. Sumaryczny profil lekowrażliwości produktu leczniczego 1PL, zawierającego w składzie 3 różne szczepy L. rhamnosus wykazujące zróżnicowaną lekowrażliwość na badane penicyliny, karbapenemy, makrolidy i tetracykliny, cefuroksym, cefotaksym i ceftazydym z cefalosporyn, gentamycynę, neomycynę i netylmycynę z aminoglikozydów, wykazywał całkowitą oporność na wszystkie badane leki. W przypadku pozostałych produktów wykazano sumaryczną lekowrażliwość na: - penicyliny, karbapenemy, makrolidy, tetracykliny, cefuroksym, cefotaksym i ceftazydym z cefalosporyn, neomycynę i netylmycynę z aminoglikozydów w przypadku produktu 2PL, - penicyliny z wyjątkiem kloksacyliny oraz makrolidy w przypadku produktu 3PL, - penicyliny, cefuroksym, cefotaksym i ceftazydym z cefalosporyn, karbapenemy, tetracykliny oraz klindamycynę z makrolidów w przypadku produktu 4PL, - penicyliny, makrolidy i tetracykliny, cefuroksym, cefotaksym i ceftazydym z cefalosporyn, imipenem z karbapenemów, neomycynę i netylmycynę z aminoglikozydów w przypadku produktu 5DŚSSPM. Produkty 6DŚSSPM i 7SD charakteryzowały się podobną sumaryczną wrażliwością na badane leki do 5DŚSSPM, przy czym 6DŚSSPM był dodatkowo wrażliwy na meropenem, z kolei 7SD w porównaniu do 6DŚSSPM był wrażliwy na gentamycynę.

51 Nr 3-4 Lekowrażliwość L. rhamnosus izolowanych z probiotyków 201 Ryc. 1. Podobieństwo genetyczne szczepów L. rhamnosus na podstawie wyników typowania metodami rep-pcr (A) i AFLP (B). Gwiazdkami zostały oznaczone szczepy kontrolne.

52 202 A. Wiatrzyk i inni Nr 3-4 Tabela II Różnice sumarycznego profilu lekowrażliwości produktów probiotycznych oraz lekowrażliwości poszczególnych szczepów wchodzących w ich skład Strefa zahamowania wzrostu [mm] lub wartość MIC [µg/ml]* Badany produkt lub badany szczep penicyliny cefalosporyny karbapenemy aminoglikozydy makrolidy tetra-cykliny polipeptydy Pe AM AML PRL OB CXM CTX CAZ CE FEP IPM MEM GM N NET NN S E CC D TE VA TEC L. rhamnosus L. helveticus PL L. rhamnosus 1/1PL * ,25* * 6 6 L. rhamnosus 2/1PL * ,25* 36 6 >256* 6 6 L. rhamnosus 3/1PL * >256* ,25* 6 6 2PL L. rhamnosus 1/2PL * ,25* ,5* 6 6 L. rhamnosus 2/2PL * ,12* ,5* 6 6 L. rhamnosus 3/2PL * ,25* * 6 6 3PL L. rhamnosus 1/3PL * * 30 6 >256* 6 6 L. helveticus 2/3PL * ,25* * PL L. rhamnosus 1/4PL * ,06* * 6 6 L. gasseri 2/4PL * ,25* * DŚSSPM L. rhamnosus 1/5DŚSSPM 6DŚSSPM L. rhamnosus 1/6DŚSSPM * ,25* * * ,25* * 6 6 7SD L. rhamnosus 1/7SD nb 6 6 penicylina (Pe), ampicylina (AM), amoksycylina (AMC), piperacylina (PRL), cefuroksym (CXM), cefotaksym (CTX), ceftazydym (CAZ), imipenem (IPM), meropenem (MEM), gentamycyna (GM), neomycyna (N), netylmycyna (NET), tobramycyna (NN), streptomycyna (S), erytromycyna (E), wankomycyna (VA), doksycyklina (D), trimetoprim-sulfametaksazol (SXT), kwas nalidyksowy (NA), klindamycyna (CC), kolistyna (CT), metronidazol (MET), teikoplanina (TEC), cefradyna (CE), cefepim (FEP), kloksacylina (OB); PL produkt leczniczy, DŚSSPM dietetyczny środek spożywczy specjalnego przeznaczenia medycznego, SD suplement diety, nb nie badano Polami zacieniowanymi zaznaczono oporność sumaryczną na zastosowane leki. * wartości MIC (µg/ml); wartości graniczne wg EFSA MIC (µg/ml) (6)

53 Nr 3-4 Lekowrażliwość L. rhamnosus izolowanych z probiotyków 203 Minimalne stężenie hamujące. Otrzymane wyniki MIC przedstawiono w Tabeli II. Wartości MIC wybranych antybiotyków określono wobec referencyjnych wartości wyznaczonych przez EFSA w dokumencie z 2012 roku Guidance on the assessment of bacterial susceptibility to antimicrobials of human and veterinary importance (6). Wysokie wartości MIC, w porównaniu do stężeń podanych przez EFSA wskazujące na oporność, występowały u większości badanych szczepów dla gentamycyny (>16µg/ml). Trzy szczepy L. rhamnosus wykazywały oporność na tetracyklinę, z których dwa, wchodzące w skład produktów 1PL i 3PL, wykazywały wysoką oporność na ten antybiotyk (MIC>256µg/ml). Dwa szczepy L. rhamnosus wykazywały oporność na erytromycynę, z których jeden, wchodzący w skład produktu 1PL, wykazywał wysoką oporność na ten antybiotyk. DYSKUSJA Wzrastające spożycie preparatów zawierających probiotyki przez ludzi w każdym wieku, zarówno zdrowych jak i chorych, przyczyniło się do nasilenia działań zmierzających do optymalizacji bezpieczeństwa ich stosowania. W 2002 roku grupa robocza FAO/WHO opracowała raport Guidelines for the evaluation of probiotics in food zawierający wytyczne i zalecenia dla wytwórców produktów o statusie probiotyku (8). Zalecenia te odnoszą się nie tylko do każdego nowego szczepu probiotycznego, ale także do szczepów uprzednio zaklasyfikowanych, jako GRAS. Zastosowanie wymogów potwierdzających status GRAS szczepów probiotycznych, dotychczas obowiązujące w Stanach Zjednoczonych, jest obecnie weryfikowane przez powoływane w krajach europejskich zespoły ekspertów (BIOHAZ Panel) w celu oceny zasadności umieszczania ich na liście The Qualified Presumption of Safety (QPS). Dotychczas, jakość produktów probiotycznych, szczególnie zaliczanych do kategorii żywności w Polsce, nie jest rutynowo kontrolowana, a zasadność stosowania statusu GRAS nie podlega weryfikacji. Przeprowadzona analiza wskazań badanych produktów wykazała, że były one zgodne z udowodnionymi właściwościami L. rhamnosus, obejmującymi korzystne działanie na dysfunkcje przewodu pokarmowego. Tożsamość wszystkich badanych szczepów została potwierdzona metodami genetycznymi na poziomie gatunku L. rhamnosus lub szczepu L. rhamnosus GG, co wskazuje, że produkty probiotyczne poddane badaniom, zostały pod względem gatunku lub szczepu prawidłowo oznakowane na opakowaniu. Badania genotypowania metodami rep-pcr i AFLP, oprócz potwierdzenia tożsamości, wykazały zmienność między-szczepową L. rhamnosus GG, co może wynikać z różnic pochodzenia szczepu, liczby i warunków pasażowania, sposobu zapewnienia stabilności poprzez swoiste procedury utrzymywania serii siewnych oraz swoistych procesów wytwarzania. Wykryta zmienność między-szczepowa potwierdza zasadność podjęcia dalszych badań nad różnicami funkcjonalnymi szczepów L. rhamnosus GG, ponieważ swoiste procesy mikroewolucji mogą mieć wpływ na utrzymanie stabilności ich prozdrowotnego działania. Jednym z podstawowych wymagań oceny bezpieczeństwa stosowania probiotyków jest oznaczenie wrażliwości na antybiotyki. Ocena wrażliwości na antybiotyki, stanowiąc szczepowo swoistą cechę, posiada kluczowe znaczenie przy wyborze terapii w przypadku zdarzeń niepożądanych, kiedy w szczególnych warunkach szczep probiotyczny może stać się czynnikiem etiologicznym uogólnionego zakażenia (25). Analiza ponad 200 przypadków infekcji wywołanych tymi drobnoustrojami, wykonana przez Cannon i wsp. (3) wykaza-

54 204 A. Wiatrzyk i inni Nr 3-4 ła, że w większości takich przypadków, czynnikiem etiologicznym były szczepy L. casei (35,7%) lub L. rhamnosus (22,9%), a skuteczność wdrożonej terapii zależała od zastosowania odpowiedniego leku. W większości przypadków, lekami z wyboru były: penicyliny i cefalosporyny oraz w terapii skojarzonej: penicyliny + aminoglikozydy lub cefalosporyny + aminoglikozydy. Szczepy L. rhamnosus pochodzące z badanych produktów probiotycznych posiadały charakterystyczne dla danego gatunku, ale nie identyczne, wyznaczone metodą dyfuzyjno-krążkową, profile lekowrażliwości. Lekowrażliwość szczepów wobec gentamycyny, tetracykliny i erytromycyny, dla których znane są wartości referencyjne kwalifikacji oporności szczepu wykonano zgodnie z zaleceniami EFSA. W przeprowadzonych badaniach wszystkie szczepy L. rhamnosus charakteryzowały się opornością na zastosowane chemioterapeutyki (SXT, MET, NA), co jest zgodne z wynikami otrzymanymi przez innych autorów (1,5,26). Analiza sumarycznego profilu lekowrażliwości badanych produktów wykazywała możliwość zastosowania celowanej terapii w 6 produktach na 7 badanych. Obecnie postuluje się, aby do zaleceń wyboru szczepów probiotycznych do stosowania u ludzi, wprowadzić zasadę konieczności stosowania jedynie takich szczepów, które wykazują wrażliwość na nie mniej niż 3 powszechnie stosowane antybiotyki, co umożliwia racjonalny wybór terapii w przypadku wywołania zakażeń inwazyjnych (13). W kontekście tego zalecenia bezpieczeństwo stosowania jednego z produktów leczniczych 1PL pozostaje wątpliwe ze względu na fakt, że skład szczepów w ujęciu całościowym warunkował oporność na wszystkie badane antybiotyki i chemioterapeutyki. Należy podkreślić, że w przypadku tego produktu wytwórca powinien ocenić czy inne związki mogą zagwarantować opcje terapeutyczne w przypadku zakażeń ogólnoustrojowych. Otrzymane wyniki MIC wskazują także na konieczność podjęcia badań nad lokalizacją genów oporności na gentamycynę (10 z 13 badanych szczepów), erytromycynę (3 z 13 badanych szczepów) i tetracyklinę (4 z 13 badanych szczepów). Potencjalna obecność ruchomych elementów genetycznych wśród szczepów Lactobacillus spp., tj transpozonów lub plazmidów, może stwarzać ryzyko przeniesienia genów oporności na inne komensalne lub patogenne bakterie, bytujące w tej samej niszy. W piśmiennictwie dostępne są wyniki badań przeprowadzonych in vitro potwierdzające możliwość transferu genów oporności różnych szczepów probiotycznych do innych bakterii (9 12). Pomimo, że większość badań wskazuje na naturalny charakter oporności L. rhamnosus na wankomycynę (6) istnieją także przesłanki o możliwości transferu operonu vana zlokalizowanego na plazmidach lub transpozonach do innych gatunków lub rodzajów bakterii, w tym bakterii probiotycznych na drodze horyzontalnego transferu genów (29,30). Ze względu na niedostateczną wiedzę na temat podłoża oporności szczepów L. rhamnosus stosowanych w składzie DŚSSPM i SD określenie lokalizacji wykrytej oporności na gentamycynę, tetracyklinę i erytromycynę oraz potwierdzenia naturalnego charakteru oporności na wankomycynę jest wysoce uzasadniona. PODSUMOWANIE 1. Potwierdzono, że zależny od szczepu charakter wrażliwości na badane antybiotyki i chemioterapeutyki zapewnia opcje terapeutyczne w 6 na 7 badanych produktów probiotycznych.

55 Nr 3-4 Lekowrażliwość L. rhamnosus izolowanych z probiotyków Wyniki genotypowania metodami rep-pcr i AFLP potwierdziły różnice genetyczne wśród szczepów L. rhamnosus GG wyizolowanych z badanych produktów probiotycznych, które mogą być wynikiem mikroewolucji swoistej dla danego procesu wytwarzania. Finansowanie Praca została wykonana w ramach realizacji projektu statutowego NIZP-PZH nr 1/EM 3N. PIŚMIENNICTWO 1. Blaiotta G, Capua M Di, Coppola R, Aponte M. Production of fermented chestnut purees by lactic acid bacteria. Int J Food Microbiol 2012; 158: Brandt K, Alatossava T. Specific identification of certain probiotic Lactobacillus rhamnosus strains with PCR primers based on phage-related sequences. Int J Food Microbiol 2003; 84: Cannon JP, Lee TA, Bolanos JT, Danziger LH. Pathogenic relevance of Lactobacillus: a retrospective review of over 200 cases. Eur J Clin Microbiol Infect Dis 2005; 24: Coudeyras S, Marchandin H, Fajon C, Forestier C. Taxonomic and strain-specific identification of the probiotic strain Lactobacillus rhamnosus 35 within the Lactobacillus casei group. Appl Environ Microbiol 2008; 74: Danielsen M, Wind A. Susceptibility of Lactobacillus spp. to antimicrobial agents. Int J Food Microbiol 2003; 82 : EFSA. Guidance on the assessment of bacterial susceptibility to antimicrobials of human and veterinary importance. EFSA Panel on Additives and Products or Substances used in Animal Feed (FEEDAP). EFSA J 2012; 10: EUCAST. Reading guide. EUCAST disk diffusion method for antimicrobial susceptibility testing FAO/WHO. Guidelines for the evaluation of probiotics in food. Joint FAO/WHO Working Group Report on Drafting Guidelines for the Evaluation of Probiotics in Food London, Ontario, Canada, Gevers D, Huys G, Swings J. In vitro conjugal transfer of tetracycline resistance from Lactobacillus isolates to other Gram-positive bacteria. FEMS Microbiol Lett 2003; 225: Gzyl A, Augustynowicz E, Mosiej E i inni. Amplified fragment length polymorphism (AFLP) versus randomly amplified polymorphic DNA (RAPD) as new tools for inter- and intra-species differentiation within Bordetella. J Med Microbiol 2005; 54: Heczko P B, Strus M, Jawień M, Szymański H. Medyczne zastosowanie probiotyków. Wiad Lek 2005; LVIII: Jach M, Łoś R, Maj M, Malm A. Probiotyki - aspekty funkcjonalne i technologiczne. POST MIKROBIOL 2013; 52: Klare I, Konstabel C, Werner G i inni. Antimicrobial susceptibilities of Lactobacillus, Pediococcus and Lactococcus human isolates and cultures intended for probiotic or nutritional use. J Antimicrob Chemother 2007; 59: Kochan P, Chmielarczyk A, Szymaniak L i inni. Lactobacillus rhamnosus administration causes sepsis in a cardiosurgical patient is the time right to revise probiotic safety guidelines? Clin Microbiol Infect 2011; 17: Lutyńska A, Augustynowicz E, Wiatrzyk A. Problemy stosowania suplementów diety zawierających probiotyki. Probl Hig Epidemiol 2012; 93: Nawaz M, Wang J, Zhou A i inni. Characterization and transfer of antibiotic resistance in lactic acid bacteria from fermented food products. Curr Microbiol 2011; 62:

56 206 A. Wiatrzyk i inni Nr Ouwehand AC, DongLian C, Weijian X i inni. Probiotics reduce symptoms of antibiotic use in a hospital setting: a randomized dose response study. Vaccine 2014; 32: Ozdemir O. Various effects of different probiotic strains in allergic disorders: an update from laboratory and clinical data. Clin Exp Immunol 2010; 160: Rijkers GT, Bengmark S, Enck P i inni. Guidance for substantiating the evidence for beneficial effects of probiotics: current status and recommendations for future research. J Nutr 2010; 140: Sadowska-Krawczenko I, Paprzycka M, Korbal P i inni. Lactobacillus rhamnosus GG suspected infection in a newborn with intrauterine growth restriction. Benef Microbes 2014; 5: Song Y, Kato N, Liu C i inni. Rapid identification of 11 human intestinal Lactobacillus species by multiplex PCR assays using group- and species-specific primers derived from the 16S-23S rrna intergenic spacer region and its flanking 23S rrna. FEMS Microbiol Lett 2000; 187: Toomey N, Monaghan Á, Fanning S i inni. Assessment of antimicrobial resistance transfer between lactic acid bacteria and potential foodborne pathogens using in vitro methods and mating in a food matrix. Foodborne Pathog Dis 2009; 6: Toomey N, Monaghan Á, Fanning S, Bolton DJ. Assessment of horizontal gene transfer in Lactic acid bacteria A comparison of mating techniques with a view to optimising conjugation conditions. J Microbiol Methods 2009; 77: Verma A, Shukla G. Probiotics Lactobacillus rhamnosus GG, Lactobacillus acidophilus suppresses DMH-induced procarcinogenic fecal enzymes and preneoplastic aberrant crypt foci in early colon carcinogenesis in Sprague Dawley rats. Nutr Cancer 2013; 65: Yang C, Wang D, Zhou Q, Xu J. Bacteremia due to vancomycin-resistant Leuconostoc lactis in a patient with pneumonia and abdominal infection: Am J Med Sci 2015; 349: Zhou JS, Pillidge CJ, Gopal PK, Gill HS. Antibiotic susceptibility profiles of new probiotic Lactobacillus and Bifidobacterium strains. Int J Food Microbiol 2005; 98: Otrzymano: 13 XI 2015 r Adres Autora: Warszawa, ul. Chocimska 24, Zakład Badania Surowic i Szczepionek Narodowy Instytut Zdrowia Publicznego Państwowy Zakład Higieny awiatrzyk@pzh.gov.pl

57 MED. DOŚW. MIKROBIOL., 2015, 67: Przeszczep jelitowej flory bakteryjnej w leczeniu choroby związanej z Clostridium difficile Intestinal microbiota transplantation for the treatment of Clostridium difficile infection Małgorzata Małopolska, Marek Fol Katedra Immunologii i Biologii Infekcyjnej, Uniwersytet Łódzki, Łódź Zakażenia C. difficile będące często przyczyną biegunek poantybiotykowych czy rzekomobłoniastego zapalenia jelit stanowią narastający problem zdrowotny. Rosnąca liczba przypadków zachorowań na CZCD (choroba związana z C. difficile) oraz wielolekooporność bakterii zmusza do szukania nowych, skutecznych metod terapeutycznych. Przeszczep jelitowej flory bakteryjnej ( przeszczep kału ) jest obiecującą kuracją dla osób cierpiących na nawracające, o ciężkim przebiegu, niepoddające się standardowej kuracji zakażenia jelit wywołane C. difficile. Niskie koszty, prostota wykonania i wysoka skuteczność przy jednocześnie krótkim czasie leczenia powodują, że jest to metoda coraz częściej badana i wykorzystywana przez lekarzy. Szerszemu jej stosowaniu sprzyjałaby standaryzacja protokołów postępowania, a także pełne poznanie mechanizmów biologicznych leżących u podstaw działania tej metody. Słowa kluczowe: Clostridium difficile, jelitowa flora bakteryjna, choroba związana z C. difficile (CZCD) ABSTRACT The infections caused by C. difficile, responsible for the antibiotic-associated diarrhea and pseudomembranous colitis, are the growing health problem. An increasing number of C. difficile infection (CDI) cases and the phenomenon of multidrug-resistance of bacteria forces to find new, effective therapeutic methods. Intestinal microbiota transplantation ( fecal bacteriotherapy ) is a promising remedy for patients suffering from recurrent, severe, not susceptible to standard treatments intestinal infection caused by C. difficile. Low cost, easy implementation and high efficiency at a short time treatment cause that it is a method increasingly tested and practiced by physicians. However, it is required to standardize the

58 208 M. Małopolska, M. Fol Nr 3-4 treatment procedure, as well as better understanding the biological mechanisms on which the treatment is based on. Key words: Clostridium difficile, fecal microbiota, C. difficile infection (CDI) WSTĘP Laseczka Clostridium difficile stanowi element flory przewodu pokarmowego, jednakże jej rozwój tłumiony jest przez pozostałe drobnoustroje flory fizjologicznej (25). Ocenia się, iż w grupie noworodków i niemowląt aż 60% jest nosicielami tej bakterii, przy czym odsetek ten drastycznie spada po 1 roku życia i wynosi ok. 3% utrzymując się dalej na tym poziomie w całej populacji (18). Dysbioza w obrębie przewodu pokarmowego i zaburzenia mikrobioty jelitowej, będące często następstwem antybiotykoterapii, stwarzają warunki dla rozwoju infekcji wywoływanej przez C. difficile (3). W latach , w Europie i USA liczba pacjentów z zapaleniem jelit w przebiegu zakażenia C. difficile, nazywane chorobą związaną z C. difficile (CZCD), z ang. C. difficile infection (CDI) lub C. difficile-associated disease (CDAD), wzrosła o 100% (18), stając się w przeciągu ostatniej dekady światowym problemem zdrowotnym. Tylko w USA, w 2010 r. odnotowano aż przypadków CZCD, liczba zgonów szacowana jest na w ciągu roku (3), a roczne wydatki związane z leczeniem sięgają prawie 5 miliardów dolarów (20). W Polsce odnotowywany jest bardzo dynamiczny przyrost zakażeń C. difficile, z przypadków w 2009 r. do w 2013 r. (35). Infekcja manifestuje się bólem brzucha, gorączką, przedłużającą się, ostrą biegunką, spadkiem masy ciała (11), wreszcie rozwojem rzekomobłoniastego zapalenia jelit, a nieleczona może prowadzić do poważnych powikłań także do śmierci (8). Standardowa terapia z zastosowaniem metronidazolu i wankomycyny coraz częściej okazuje się nieskuteczna, czego efektem jest nawrót choroby w 30-60% przypadków (34). Szczególnie dotyczy to osób należących do grup podwyższonego ryzyka: starszych, hospitalizowanych i z obniżoną odpornością (20). Epidemiczny charakter ekspansji C. difficile łączy się nie tylko z opornością tej bakterii na antybiotyki, które w większości przypadków są pierwotną przyczyną niekontrolowanej kolonizacji jelit i w konsekwencji choroby (32), ale także z pojawieniem się nowego szczepu 027/BI/NAP1 (North American pulsotype 1), o dużo większej zjadliwości i zdolności do produkcji toksyny binarnej (5, 18, 19, 30, 32, 33). Niewystarczająca skuteczność standardowego postępowania terapeutycznego w przebiegu CZCD zmusza do poszukiwania alternatywnych metod leczenia. Jedną z nich, praktykowaną już w czasach starożytnych, a obecnie na nowo odkrywaną, jest przeszczep naturalnej jelitowej flory bakteryjnej za pośrednictwem kału, pobranego od zdrowego dawcy. Celem niniejszej pracy jest przedstawienie zagadnień związanych z terapią nazywaną potocznie przeszczepem kału, jako metody leczenia nawracających zakażeń jelitowych powodowanych przez C. difficile. CLOSTRIDIUM DIFFICILE PATOGENEZA, OBJAWY KLINICZNE C. difficile jest Gram-dodatnią beztlenową laseczką. Po raz pierwszy została opisana jako składnik naturalnej mikroflory jelitowej noworodków przez I. Halla oraz E.

59 Nr 3-4 Przeszczep jelitowej flory bakteryjnej w leczeniu CDAD 209 O Toole a w 1935 r. (19). Mimo zdolności do wytwarzania przetrwalników, co znacznie wzmaga jej wirulencję, u niemowląt i małych dzieci nosicielstwo przebiega bezobjawowo. Laseczkę tę rzadko izoluje się od osób dorosłych, a jej obecność w przewodzie pokarmowym człowieka została bezpośrednio powiązana z występowaniem przewlekłych biegunek i stanów zapalnych jelit u pacjentów w trakcie lub po przeprowadzeniu antybiotykoterapii (5, 32, 33). Patogenną formą C. difficile jest postać wegetatywna, zdolna do podziałów, zasiedlania jelita oraz produkcji toksyn będących głównym czynnikiem zjadliwości tych bakterii (19). Wytwarzane przez bakterie spory zdolne są do długotrwałego utrzymywania się w środowisku zewnętrznym, są one także oporne na działanie najczęściej stosowanych środków dezynfekujących i antyseptycznych, przez co mogą być przenoszone przez personel szpitalny od pacjentów zakażonych C. difficile na innych chorych. Uważa się, że jednym z głównych czynników ryzyka wystąpienia infekcji C. difficile jest długotrwałe stosowanie antybiotyków, prowadzące do znacznego zubożenia naturalnej mikrobioty jelit, a w skrajnych przypadkach niemal jej całkowitego wyniszczenia, co stwarza warunki do niekontrolowanego rozwoju i zasiedlania ścian jelita przez C. difficile (5,19). Ryzyko zakażenia wzrasta wraz z powtarzającymi się pobytami w szpitalu, wystawiającymi chorego na działanie spor, przyjmowaniem leków zobojętniających w przypadkach nadkwaśności, chemioterapią, zabiegami chirurgicznymi w obrębie przewodu pokarmowego, wprowadzaniem rurek nosowo-gardłowych, wystąpieniem u pacjenta zapalenia jelita, którego przyczyna jest inna niż infekcja C. difficile oraz oddziaływaniem innych czynników mogących wpływać na skład i funkcjonowanie naturalnej mikrobioty organizmu (19). Podatność na zakażenia rośnie z wiekiem. Obserwuje się znacznie większą liczbę zachorowań u osób powyżej 65 roku życia (19), stanowiących główną grupę ryzyka. W ostatnich latach pojawiły się także doniesienia o wzroście zachorowalności wśród osób nie zaliczanych do grup podwyższonego ryzyka, takich jak dzieci czy kobiety w ciąży, co wiązane jest z pojawieniem się epidemicznych szczepów C. difficile o zwiększonej wirulencji, jak np. 027/BI/NAP1 (5). Czynnikami w największym stopniu odpowiedzialnymi za zjadliwość laseczek C. difficile są wytwarzane przez nią toksyny: toksyna A i toksyna B. Prócz nich, szczepy tzw. hiperwirulentne, wytwarzają trzecią toksynę, znaną jako toksyna binarna (CDT) (5, 6, 13, 33). Toksyny uszkadzają komórki epitelialne nabłonka jelit niszcząc ich cytoszkielet aktynowy i przyczyniają się do powstawania charakterystycznych błon rzekomych na powierzchni jelita grubego, utworzonych ze złuszczonych komórek nabłonka jelitowego, komórek zapalnych i ściętego osocza (25). Przyjęło się uważać, iż toksyna A jest enterotoksyną oddziałującą na błonę śluzową jelita, zaś toksyna B jest cytotoksyną, o działaniu od 1000 do razy silniejszym od toksyny A (25). Wykazują aktywność glikozylotransferaz i po związaniu się z receptorem dostają się na drodze endocytozy do komórki docelowej blokując białka z rodziny Rho, Rac oraz Cdc42 GTPaz (10, 14), które biorą udział w wielu procesach komórkowych, takich jak transkrypcja, transport pęcherzykowy, migracja komórki czy jej programowana śmierć (26). Zablokowanie GTPaz przez toksyny C. difficile prowadzi do dezintegracji mikrofilamentów aktynowych i mikrotubul komórki, co skutkuje zmianą jej kształtu i indukcją procesów zaangażowanych w apoptozę (10). Następująca śmierć komórki powoduje uwolnienie cytokin oddziałujących m. in. na mastocyty, neutrofile oraz neurony. Te z kolei uwalniają gamę cytokin prozapalnych i neuropetydów, co skutkuje reakcją zapalną w obrębie nabłonka jelit, obniżając funkcje jego bariery. Dodatkowo, zwiększa się

60 210 M. Małopolska, M. Fol Nr 3-4 jego przepuszczalność i rośnie akumulacja płynu, prowadząca bezpośrednio do jednego z głównych objawów zakażenia C. difficile, jakim jest wodnista biegunka (10). Początkowo główną rolę w patogenezie C. difficile przypisywano toksynie A. W 1986 r. Mitchell (24) wraz ze współpracownikami opublikował na łamach czasopisma Gut wyniki badań, w których opisał efekt oddzielnego podania oczyszczonej toksyny A i toksyny B na jelito kręte i okrężnicę u królików. Jedynie w pierwszym przypadku zaobserwowano obfite wydzielanie płynu prowadzące do powstawania wodnistych biegunek, rzadko zabarwionych krwią, a w badaniu histologicznym potwierdzono częściową nekrozę komórek ściany jelita. U zwierząt wystawionych na działanie samej toksyny B nie zaobserwowano natomiast żadnych objawów choroby. Pierwszy przypadek wystąpienia biegunki spowodowanej infekcją szczepem C. difficile, który produkował jedynie toksynę B odnotowano w 1998 r. w Kanadzie (1). Badania in vivo przeprowadzone w 2009 r. przez Lyras i wsp. (21) na chomikach syryjskich, z wykorzystaniem mutantów C. difficile wykazujących defekt w wytwarzaniu bądź toksyny A, bądź toksyny B wykazały, iż dla wystąpienia objawów chorobowych konieczna jest toksyna B. Wyznacza to nową optykę postrzegania roli toksyn w patogenezie C. difficile, w której dotychczas podstawową funkcję przypisywano toksynie A, zaś toksyna B sama postrzegana była jako nieefektywna, ujawniająca swoje działanie dopiero w towarzystwie toksyny A, w postaci efektu synergistycznego (6). Szczepy hiperwirulentne C. difficile wytwarzają ponadto tzw. toksynę binarną (CDT, z ang. C. difficile toxin), a także odznaczają się zwiększoną produkcją toksyn A i B oraz większą odpornością na leki z grupy fluorochinolonów (33). Toksyna binarna składa się z dwóch komponentów: CDTa, o aktywności ADP-rybozylotransferazy, modyfikującego aktynę i CDTb wiążącego się z komórką docelową i umożliwiającego translokację CDTa do cytozolu. W efekcie dochodzi do depolimeryzacji aktyny tworzącej cytoszkielet oraz do formowania na powierzchni komórki epitelialnej wypukłości tworzących rodzaj sieci, zwiększających przywieranie bakterii (13). Toksyna ta wytwarzana jest przez szczep C. difficile 027/BI/NAP1, opisany pierwotnie w latach 80. XX wieku, ale dopiero na początku XXI wieku, po pojawieniu się w Kanadzie ognisk wzmożonej zapadalności na CZCD wśród osób nie należących do grup podwyższonego ryzyka, został zidentyfikowany jako szczep epidemiczny (14). W oporności tego szczepu na fluorochinolony upatruje się głównego czynnika sprzyjającego gwałtownemu wzrostowi zapadalności na CZCD, w szczególności w USA, Kanadzie i Europie (6, 14). Innym hiperwirulentnym szczepem epidemicznym, wytwarzającym toksynę binarną jest zidentyfikowany w Holandii szczep 078/BK/NAP7,8 (15). C. difficile wytwarza również p-krezol, związek będący pochodną fenolu. Wykazując działanie hamujące na mikroflorę jelitową (9) zwiększa on szanse C. difficile na skuteczną kolonizację ściany jelita. Wśród czynników wirulencji należy wymienić także fimbrie, odpowiedzialne za aktywny ruch laseczki, których liczba na komórce patogenu jest różna, w zależności od szczepu bakterii (minimum jedna wić) (23) oraz szereg białek, które ułatwiają adhezję do ścian jelita (33). Jednym z takich białek jest proteaza cysteinowa Cwp84. Wykazuje ona aktywność proteolityczną w stosunku do wielu białek macierzy zewnątrzkomórkowej enterocytów (7). Ponadto, bierze udział w dojrzewaniu prekursora białek warstwy S (położonej najbardziej na zewnątrz części komórki C. difficile) SlpA (4, 7). Powstające z prekursora, białka p36 i p47 budują warstwę S i spełniają rolę adhezyn (32). Do adhezyn zalicza się także następujące białka: białko szoku cieplnego GroEL (33), białko Cwp66 wchodzące w skład warstwy powierzchniowej komórki C. difficile, białko Fbp68 wiążące

61 Nr 3-4 Przeszczep jelitowej flory bakteryjnej w leczeniu CDAD 211 fibronektynę, co pozwala laseczce na adhezję do enterocytów gospodarza jednocześnie utrudniając rozpoznawanie bakterii jako patogenu przez układ immunologiczny (23). Uważa się, iż w zakażeniach C. difficile, znaczącą rolę odgrywa zdolność tych bakterii do tworzenia biofilmu. Prawdopodobnie ta właśnie zdolność odpowiedzialna jest za wielokrotne nawroty choroby (23). Specyficzna struktura i wielowarstwowość biofilmu sprawiają, że antybiotyki, które działają w szczególności na komórki wykazujące aktywny metabolizm, zdolne do podziału, oddziałują w głównej mierze tylko na zewnętrzne warstwy biofilmu, w których takie komórki się znajdują. Nawrót choroby następuje w momencie, w którym komórki bakteryjne z wewnętrznych warstw biofilmu zostają odsłonięte i nabywają pełnej aktywności metabolicznej. Stąd niejednokrotnie wprowadza się tzw. leczenie pulsacyjne wankomycyną, które polega na kilku kursach antybiotyku w określonych odstępach czasu (19). Za najważniejszy czynnik ryzyka rozwoju zakażenia C. difficile uważa się stosowanie antybiotyków, w szczególności o szerokim spektrum działania, np. cefalosporyny II i III generacji, klindamycyna, fluorochinolony, penicyliny. Podczas gdy C. difficile wykazuje względem nich oporność, niszczą one florę jelitową, stwarzając tym samym dogodne warunki dla rozwoju patogennej laseczki (18). Masowa kolonizacja jelita grubego przez C. difficile wywołuje schorzenia o dość zróżnicowanym przebiegu klinicznym, począwszy od ustępujących samoistnie biegunek, poprzez rzekomobłoniaste zapalenie jelita grubego, aż po bardzo ciężką postać CZCD obejmującą patologiczne poszerzenie jelita grubego (okrężnica olbrzymia, megacolon toxicum), wstrząs, kolektomię i w konsekwencji śmierć pacjenta (ok. 3% chorych i 11% zakażonych hiperwirulentnym szczepem) (18, 25). Jednym z pierwszych i najczęstszych objawów zakażenia C. difficile jest przedłużająca się biegunka (5, 29). Ocenia się, iż w przypadku 15-25% biegunek poantybiotykowych przyczyną jest zakażenie C. difficile (18). Zwykle pojawia się ona między piątym a siódmym dniem kuracji antybiotykowej i polega na oddawaniu większej liczby luźnych stolców, które mogą być zabarwione krwią. Biegunka wywoływana przez C. difficile zaliczana jest do biegunek osmotycznych. Charakteryzuje się uszkodzeniem błony śluzowej jelita cienkiego, a także zaburzeniami w składzie mikrobioty jelita grubego. Podczas jej trwania obserwuje się bóle brzucha, podwyższoną temperaturę ciała pacjenta i leukocytozę (33). W diagnostyce wykorzystuje się pomiar ph i oznaczenie osmolalności, odzwierciedlającej ilość substancji rozpuszczonych w kale, zwłaszcza sodu, potasu, chloru, glukozy. Ważny jest także test na obecność toksyn bakteryjnych. W leczeniu, po odstawieniu wcześniej podawanych antybiotyków, wykorzystuje się preparaty probiotyczne zawierające bakterie z rodzaju Lactobacillus. W ciężkich przypadkach podaje się także metronidazol lub wankomycynę (29). Powikłaniem długotrwałej biegunki może być rzekomobłoniaste zapalenie jelit. Szacuje się, że przyczyną ok. 95% przypadków tego schorzenia jest C. difficile (19). Przypadłość ta charakteryzuje się strukturalnym uszkodzeniem enterocytów spowodowanym toksynami wydzielanymi przez patogen i może obejmować całą powierzchnię błony śluzowej jelit. W obrazie endoskopowym obserwuje się żółte (mogą być także brunatne) włókniste błony rzekome powstające na ścianach jelita (31). Objawami są bóle brzucha, jego skurcze i wzdęcia oraz krwawa biegunka. Wykrywa się wzrost syntezy prostaglandyny E 2 i F 2alfa, a także tromboksanu B 2 w jelicie (31). Podobnie jak w przypadku przedłużającej się biegunki, ważnym testem potwierdzającym zakażenie C. difficile, jest badanie na obecność toksyn tego drobnoustroju w kale. Standardowe leczenie opiera się na podawaniu pacjentowi metronidazolu lub wankomycyny (18).

62 212 M. Małopolska, M. Fol Nr 3-4 Ciężki przebieg choroby manifestuje się m.in.: niedrożnością jelit, odwodnieniem, zaburzeniami elektrolitowymi, czy wreszcie toksycznym rozdęciem okrężnicy, objawiającym się silnym bólem brzucha i wzdęciami oraz prawie całkowitym lub zupełnym ustąpieniem biegunki. Obserwuje się także zmniejszenie ilości albumin w osoczu (hipoalbuminemia), niedociśnienie tętnicze i niewydolność nerek. W skrajnych przypadkach może dochodzić do perforacji jelita, zespołu uogólnionej reakcji zapalnej (SIRS, z ang. Systemic Inflammatory Response Syndrome), sepsy, a w konsekwencji do śmierci pacjenta (8). PRZESZCZEP KAŁU W LECZENIU ZAPALENIA JELIT W PRZEBIEGU ZAKAŻENIA CLOSTRIDIUM DIFFICILE Przeszczep naturalnej jelitowej flory bakteryjnej za pośrednictwem kału (FMT, z ang. Fecal Microbiota Transplantation) praktykowany był już w starożytności, a pierwsze zapiski na ten temat pochodzą z Chin, z IV wieku (3). Współczesna, tzw. medycyna zachodnia zwróciła uwagę na potencjał tej procedury w drugiej połowie XX. wieku. W 1958 roku, w USA, wykorzystano ją w leczeniu rzekomobłoniastego zapalenia jelit, którego przyczyną był Micrococcus pyogenes (12). Od pierwszego udokumentowanego przypadku zastosowania FMT podczas infekcji C. difficile w 1983 roku (3), terapia ta jest badana pod względem swojej skuteczności i mechanizmów działania, jak również zalecana pacjentom, którzy nie reagują na leczenie antybiotykami. Pacjenci kwalifikujący się do terapii FMT to osoby, u których stwierdzono wielokrotne (3 lub więcej) nawroty choroby. Uważa się, że osoba zakażona C. difficile to taka, która spełnia przynajmniej jedno z następujących kryteriów: 1. biegunka, ostre toksyczne rozdęcie okrężnicy lub niedrożność jelit oraz wykrycie w stolcu toksyny A i/lub toksyny B bądź wykazanie obecności szczepu C. difficile; 2. zdiagnozowane za pomocą badania endoskopowego lub stwierdzone w badaniu histopatologicznym rzekomobłoniaste zapalenie jelit (19). Leczenie rozpoczyna się od natychmiastowego zaprzestania podawania antybiotyku, którego przyjmowanie w konsekwencji doprowadziło do kolonizacji jelit przez C. difficile. U ponad 20% pacjentów z łagodnym przebiegiem CZCD jest to wystarczające dla ustąpienia objawów w ciągu godz. (18). Lekami pierwszego rzutu w terapii CZCD są metronidazol i wankomycyna. Ich skuteczność w pierwszym rzucie choroby jest dosyć wysoka (76-98%), jednak spada do około 60% przy nawrocie choroby (19). Dodatkowo, prawdopodobieństwo ponownego zakażenia wynosi ok. 20% i wzrasta przy kolejnej infekcji do 40-65% (3, 30). Osoba, u której wystąpiły kolejne nawroty choroby, niereagująca na leczenie wymienionymi wcześniej preparatami, może zostać poddana terapii FMT. Po zakwalifikowaniu pacjenta do przeszczepu kału, poszukuje się dawcy materiału. Dawcą może zostać osoba z otoczenia chorego (partner życiowy, rodzina), choć w niektórych przypadkach odradza się takie rozwiązanie. Spowodowane jest to możliwością zakażenia (także bezobjawowego nosicielstwa) laseczkami C. difficile osób stale przebywających z pacjentem. Potencjalny dawca powinien zostać przebadany przynajmniej pod kątem obecności w kale patogenów bakteryjnych, pasożytów układu pokarmowego, ich jaj oraz toksyn C. difficile. Zaleca się także badanie na obecność wirusa zapalenia wątroby typu A, B i C, wirusa HIV oraz badanie w kierunku kiły (3). Dawcą nie może zostać osoba skarżąca się na jakiekolwiek dolegliwości ze strony układu pokarmowego, cierpiąca na

63 Nr 3-4 Przeszczep jelitowej flory bakteryjnej w leczeniu CDAD 213 choroby autoimmunizacyjne czy alergie (2). Ponadto, potencjalnego dawcę dyskwalifikuje antybiotykoterapia przebyta w ciągu 3 miesięcy poprzedzających pobranie materiału, a także wykonanie w tym czasie tatuażu czy piercingu (3). Pobrany od dawcy materiał musi zostać odpowiednio przygotowany. Ważne jest, by sam przeszczep odbył się w ciągu 24 godzin od pobrania kału od dawcy (30). Czas ten wiąże się z przeżywalnością drobnoustrojów jelitowych poza organizmem gospodarza. Materiał zostaje rozcieńczony w wodzie, fizjologicznym roztworze soli lub w mleku. By dokładnie rozbić większe fragmenty stolca używa się blendera. Zaobserwowano, że lepsze efekty przynosi rozpuszczenie kału w wodzie (skuteczność ok. 98%) niż w roztworze soli (86%), jednak w pierwszym wariancie istnieje dwukrotnie większe prawdopodobieństwo nawrotu infekcji (16). Następnie, płyn będący niejednorodną mieszaniną, poddawany jest filtracji w celu usunięcia dużych nierozpuszczonych cząstek (30). Etap ten jest niezbędny, gdyż takie cząstki mogłyby spowodować zatkanie np. przewodu kolonoskopijnego podczas przeszczepu. Filtrację można przeprowadzić używając złożonej w kilka warstw gazy, filtrów do kawy, bądź też profesjonalnych filtrów ze stali nierdzewnej (30). Przefiltrowany płyn umieszcza się w strzykawkach i podaje pacjentowi przez rurkę nosowo-gastryczną (nosowo- -gardłową) do żołądka lub do dwunastnicy (w zależności od miejsca założenia rurki), lub kolonoskopijnie do kątnicy. Istnieje także możliwość zastosowania odwróconej lewatywy. Takie rozwiązanie stosuje się w przypadku pacjentów, u których przeszczep wykonuje się poza szpitalem (w domu) (11). Do tej pory nie potwierdzono wyższości żadnej z tych metod względem siebie. Zwykle objętość podanego płynu wynosi ok ml, przy czym najlepsze rezultaty otrzymuje się stosując objętość większą nawet niż 500 ml (skuteczność ok. 97%) (16, 30). Dodatkowo, stwierdza się czterokrotnie wyższe ryzyko nawrotu infekcji w przypadku podania ilości kału mniejszej niż 50g (16, 29). Niektóre procedury przewidują także podanie pacjentowi na godzinę przed przeprowadzeniem przeszczepu środków przeciwbiegunkowych, celem zmniejszenia prawdopodobieństwa natychmiastowego usunięcia materiału tuż po jego podaniu. Terapia przeszczepem kału polega na wymianie mikrobioty naturalnie bytującej w jelitach człowieka, której skład i funkcjonowanie zostały zaburzone np. przez działanie antybiotyków, na nową, pochodzącą od zdrowego dawcy (30). W kale osób chorych na CZCD odnotowuje się zwiększoną liczbę bakterii należących do Actinobacteria, Firmicutes i Proteobacteria, w przeciwieństwie do Bacteroides, których liczba spada (22). Choć dokładny mechanizm działania terapii nie jest do końca znany i wciąż stanowi przedmiot wielu badań, wiadomo, że podstawowym skutkiem zastosowania FMT jest przywrócenie naturalnej różnorodności mikrobioty jelitowej, co koryguje dysbiozę w obrębie jelit (3). Naturalna flora bakteryjna, obecna w przewodzie pokarmowym, odpowiedzialna jest między innymi za transformację pierwotnych kwasów żółciowych kwasu cholowego i kwasu chenodeoksycholowego, we wtórne kwasy żółciowe kwas deoksycholowy i kwas litocholowy. Udowodniono, że ich wzajemny stosunek ma bezpośredni wpływ na kiełkowanie przetrwalników wytwarzanych przez C. difficile. Kwas cholowy stymuluje ich rozwój, podczas gdy kwas chenodeoksycholowy wykazuje działanie hamujące, zapobiegając rozwojowi infekcji (33). Przy zaburzonym składzie mikrobioty dochodzi do zwiększenia wydzielania kwasu cholowego, gdyż nie jest on przekształcany do kwasu deoksycholowego. Terapia FMT, powodując odbudowanie mikrobioty jelitowej, indukuje także odpowiedź immunologiczną (2, 30). W badaniach prowadzonych na myszach germ-free, hodowanych

64 214 M. Małopolska, M. Fol Nr 3-4 w warunkach sterylnych i nieposiadających bakterii naturalnie bytujących w przewodzie pokarmowym, zaobserwowano zniekształcenie kosmków jelitowych, a także zwiększoną ilość śluzu wydzielanego przez komórki ściany jelita (17). Stwierdzono także, że podanie takim myszom choćby jednego szczepu probiotycznego ma korzystny wpływ na rozwój mikrokosmków i kształt enterocytów (17). Dodatkowo, zaobserwowano, że w zależności od rodzaju podanego szczepu bakterii, organizm gospodarza może być pobudzony do produkcji przeciwciał, zwłaszcza immunoglobulin klasy S-IgA (przeciwciała wydzielnicze klasy IgA) (17). Ponadto, składniki naturalnej mikrobioty organizmu utrzymują układ immunologiczny w stałej gotowości, oddziałując bezpośrednio na komórki prezentujące antygen czy komórki pamięci (17, 27). Podanie zrównoważonej pod względem różnorodności i ilości naturalnej mikrobioty, której źródło niewątpliwie stanowi kał, powoduje supresję rozwoju C. difficile, a także odbudowanie tzw. oporu kolonizacyjnego (30). Drobnoustroje flory jelitowej, podawane pacjentowi w formie przeszczepu kałowego, są zdolne do wytwarzania związków o działaniu bakteriobójczym lub bakteriostatycznym (np. bakteriocyny, biosurfaktanty), które w sposób bezpośredni oddziałując na bakterie chorobotwórcze mogą je niszczyć lub hamować ich rozwój. Ponadto, przeszczepione drobnoustroje konkurując o miejsce bytowania utrudniają adhezję C. difficile do powierzchni enterocytów (2, 17). Dotychczasowe badania wskazują na wysoką skuteczność FMT w leczeniu CZCD. Według różnych źródeł, efektywność takiej terapii, po jednorazowym przeprowadzeniu przeszczepu flory jelitowej, sięga 90-91% i wzrasta przy kolejnym nawet do 98% (3, 30). Terapia w oparciu o FMT może być prowadzona w różnych wariantach, wynikających np. z dodatkowego zastosowania preparatów probiotycznych, zarówno przed, jak i po przeprowadzeniu przeszczepu (28), modyfikacji przygotowania materiału do przeszczepu przez rozpuszczanie go w różnych rozcieńczlnikach (woda, fizjologiczny roztwór soli, mleko, jogurt, kefir itp.) (16), czy też z równoległego wdrożenia leczenia farmakologicznego (3, 16, 30), Zanik objawów chorobowych może nastąpić już w ciągu dwóch dób od przeprowadzenia przeszczepu (26), najpóźniej jednak po ok. tygodniu (3). Dochodzi do ustąpienia biegunki, normalizacji liczby białych krwinek, spadku gorączki, ogólnej poprawy samopoczucia oraz parametrów życiowych pacjenta (28). Całkowitą wymianę mikrobioty notuje się do ok. 16 tygodni po FMT (3). Dodatkowo, odsetek nawrotów choroby jest znacznie mniejszy wynosi do ok. 8%, w zależności od wariantu metody, w porównaniu do 20-65% w przypadku zastosowania antybiotykoterapii (3, 16, 28, 30). Dodatkowe zalety terapii z wykorzystaniem FMT to łatwość jej przeprowadzenia i niewysokie koszty leczenia (28). Niewątpliwie jej plusem jest ponadto brak jakichkolwiek strat po stronie dawcy oddającego materiał do przeszczepu oraz brak konieczności intensywnej opieki czy szczególnego nadzoru osoby poddanej tej procedurze. Dużym udogodnieniem dla pacjenta może być także fakt, że dawcą może zostać osoba spokrewniona oraz to, iż prostota terapii FMT pozwala na jej przeprowadzenie w domu chorego przez lekarza rodzinnego lub członków rodziny, po uprzednim pouczeniu ich przez lekarza specjalistę, bez niepotrzebnego przewożenia pacjenta do szpitala (11). Przeszczep flory jelitowej rozpatrywany jest także w kontekście terapii innych chorób, takich jak otyłość, jadłowstręt psychiczny, choroby autoimmunizacyjne, alergie pokarmowe, zaburzenia kwasochłonne przewodu pokarmowego, neurodegeneracyjne zaburzenia neurorozwojowe, nieswoiste zapalenia jelit czy zespół jelita drażliwego (2, 3). Uważa się bowiem,

65 Nr 3-4 Przeszczep jelitowej flory bakteryjnej w leczeniu CDAD 215 że między zaburzeniami w funkcjonowaniu naturalnej ludzkiej mikrobioty a powyższymi schorzeniami mogą istnieć pewne powiązania, stąd zainteresowanie terapią przeszczepu kału w ich leczeniu. Jednakże dotychczasowe badania albo nie wykazują takiego związku, albo wciąż są we zbyt wczesnej fazie, by móc mówić o jakichkolwiek sukcesach na tym polu. Jak każda terapia, także FMT może powodować pewne skutki uboczne.u nielicznych pacjentów obserwowano skurcze brzucha, gazy, zanik ruchów perystaltycznych, nudności (przy podaniu przez rurkę nosowo-gardłową). Jednak wszystkie te objawy ustępują maksymalnie po kilku miesiącach (3). Terapia FMT nie sprawia większego ryzyka, jednak w przypadku pacjentów z megacolon toxicum istnieje ryzyko perforacji jelita w trakcie przeprowadzenia przeszczepu metodą kolonoskopii (26). W przypadku podania materiału od nieprzebadanego lub niespełniającego kryteriów dawcy, może dojść do przekazania wraz z kałem patogennych bakterii, wirusów czy pasożytów (26). Ponadto istnieją także pewne trudności z zarejestrowaniem kału, jako preparatu leczniczego z uwagi na fakt, iż wciąż jego skład jest słabo poznany. Liczne i różnorodne drobnoustroje obecne w kale tworzą rodzaj mikroekosystemu, którego odtworzenie w sztucznym środowisku sprawia niebywałe trudności. Dodatkowo, należy pamiętać, że wszystkie dotychczasowe badania w kierunku poznania mechanizmów i skuteczności terapii FMT były przeprowadzane na pacjentach, których jedynym schorzeniem była infekcja jelit wywołana przez C. difficile. Stąd brak jest danych na temat potencjalnych efektów niepożądanych u osób z innymi dolegliwości, w tym z obniżoną odpornością (wrodzoną bądź nabytą) lub przyjmujących leki immunosupresyjne, którzy w ogóle nie są kwalifikowani do terapii FMT, z uwagi na utrudnioną u takich pacjentów odpowiedź immunologiczną przeciwko ewentualnym niepożądanym składnikom kału. Terapia FMT wciąż spotyka się ze sporą dezaprobatą ze strony społeczeństwa. W dużej mierze może to wynikać z samej specyfiki preparatu leczniczego, którym w tym przypadku jest kał materiał stanowiący dla wielu osób (także niektórych lekarzy) temat tabu. Problemem jest również brak regulacji prawnych odnoszących się do tego sposobu leczenia (3, 28). ALTERNATYWNE SPOSOBY LECZENIA ZAKAŻEŃ C. DIFFICILE W leczeniu CZCD, obok podstawowej terapii z zastosowaniem metronidazolu i wankomycyny, lub wciąż wzbudzającego kontrowersje przeszczepu naturalnej mikroflory jelitowej, podejmowane są próby wykorzystania innych, alternatywnych metod. Chociaż niektóre z nich wydają się być obiecujące, jednak żadna nie jest jeszcze w pełni gotowa do zastosowania w procesie leczenia. Jedną z najnowszych testowanych obecnie metod leczenia infekcji C. difficile jest przeszczep kału przeprowadzany za pomocą kapsułek kałowych. W 2014 roku, Youngster i wsp. (34) opublikował w Journal of American Medical Association wyniki badań przeprowadzonych na grupie 20 pacjentów z CZCD, przyjmujących specjalnie przygotowane kapsułki. Schemat zakwalifikowania chorych do przeszczepu, badania dawcy, pobranie i przygotowanie samego materiału nie różniły się od postępowania sugerowanego przy wariantach z użyciem rurki nosowo-gardłowej czy kolonoskopii. Przygotowana zawiesina kału, po przefiltrowaniu, była zatężana przez wirowanie i zawieszana ponownie w roztworze fizjologicznym NaCl w stosunku 1:10 z dodatkiem 10% glicerolu. Tak przygotowany roztwór

66 216 M. Małopolska, M. Fol Nr 3-4 umieszczano następnie w kapsułce i zamrażano w temperaturze -80 C. Kapsułki w liczbie 15 sztuk podawano pacjentom przez 2 kolejne dni. Skuteczność leczenia tak spreparowanym materiałem kałowym okazała się porównywalna do metod wykorzystujących kolonoskopię, rurki nosowo-gardłowe czy odwróconą lewatywę i wyniosła 90%. Czas ustąpienia objawów był nieznacznie dłuższy niż w przypadku wymienionych metod i wynosił 4 dni, przy czym 6 z 20 pacjentów wymagało ponownego podania materiału (nie zaobserwowano u nich poprawy po 72h). Autorzy konstatują, że taka forma przygotowania i podania preparatu jest bezpieczniejsza od wcześniej wymienionych, bowiem nie naraża pacjenta na powikłania towarzyszące niekiedy kolonoskopii (np. perforacja jelita), a działania niepożądane, takie jak: gorączka, ból głowy, zmęczenie czy wysypka, występują rzadko. Nie odnotowano także skutków ubocznych w postaci nudności czy wymiotów, jakie dają się zaobserwować w przypadku korzystania z rurki nosowo-gardłowej. Ponadto, zamrożenie kału pozwala na jego dłuższe przechowywanie w temp. -80 C. Jest to niewątpliwa zaleta, gdyż umożliwia dokładniejsze przebadanie dawcy już po pobraniu kału. Metoda ta pozwala także na zmniejszenie kosztów samej terapii w stosunku do podania materiału kolonoskopijnie. Jest też prosta do przeprowadzenia i nie wymaga specjalistycznego sprzętu. Poza niewątpliwymi zaletami, metoda ta nadal posiada pewne niedostatki. Wciąż istnieje m. in. ryzyko transmisji infekcji od dawcy za pośrednictwem kału. Ponadto, pula osób uczestniczących w prezentowanym badaniu była stosukowo niewielka, a dodatkowo nie obejmowało ono grupy otrzymującej placebo, ani grupy kontrolnej leczonej standardowo z wykorzystaniem wankomycyny czy metronidazolu. Mimo pozytywnych wyników sugeruje się, że istnieje prawdopodobieństwo zubożenia mikrobioty kałowej umieszczonej w kapsułce, która dostając się do zakażonych odcinków przewodu pokarmowego może ulec częściowemu strawieniu w żołądku biorcy przeszczepu. Niewątpliwie jednak jest to metoda warta uwagi i dalszych badań w celu potwierdzenia jej skuteczności i znalezienia optymalnego protokołu postępowania. Poszukując nowych antybiotyków użytecznych w leczeniu CZCD, uwagę zwraca się na fidoksymycynę, należącą do grupy makrocyklin. Jej działanie polega na hamowaniu syntezy RNA bakterii. Wciąż nie jest dobrze zbadana jej skuteczność, choć ocenia się ją na porównywalną z wankomycyną (16). Antybiotyk ten wykazuje swoją przydatność zarówno w leczeniu pierwotnych infekcji C. difficile, jak również w leczeniu nawrotów tego zakażenia zwłaszcza u pacjentów hospitalizowanych, którzy objęci są wysokim ryzykiem wystąpienia takich nawrotów, a także w przypadku osób ze znaną historią CZCD (19). W leczeniu infekcji C. difficile, spośród obecnie znanych i powszechnie stosowanych probiotyków, jedynie Saccharomyces boulardii wykazuje pewną skuteczność. Skuteczność ta nie odnosi się bezpośrednio do samego leczenia zakażenia, ale łączona jest z ok. 30% redukcją występowania nawrotów choroby (16). Wiadomo jednak, że prewencyjne przyjmowanie preparatów probiotycznych jest bezpieczne i efektywnie zapobiega występowaniu zaburzeń w składzie oraz funkcjonowaniu naturalnej mikrobioty człowieka, będących jedną z bezpośrednich przyczyn rozwoju CZCD. Duże nadzieje wiąże się z produkcją przeciwciał monoklonalnych zarówno przeciwko komponentom komórki C. difficile, jak również przeciwko wytwarzanym przez tę bakterię toksynom. Okazuje się, iż skuteczność przeciwciał w zapobieganiu nawrotom CZCD jest zbliżona do tej, osiąganej z użyciem metronidazolu, odpowiednio: 44% i 45% (16). Podawanie pełnych ludzkich przeciwciał monoklonalnych podczas infekcji, w połączeniu z kuracją wankomycyną lub metronidazolem wywiera korzystny wpływ na stymulację układu

67 Nr 3-4 Przeszczep jelitowej flory bakteryjnej w leczeniu CDAD 217 odpornościowego organizmu gospodarza (19). Wciąż prowadzone są badania z wykorzystabiem różnych rodzajów przeciwciał i różnych warianty ich łączenia, jednak ze względu na wysokie koszty takiej terapii, jest ona stosunkowo rzadko wykorzystywana. Nowe technologie umożliwiają produkowanie molekuł wiążących toksyny bakteryjne. Są to najczęściej syntetyczne polimery, które łącząc się z poszczególnymi metabolitami produkowanymi przez drobnoustroje, blokują ich niekorzystne działanie na organizm gospodarza. W leczeniu zakażeń jelitowych powodowanych laseczką C. difficile podejmuje się próby wykorzystania tolevameru. W połączeniu z wankomycyną i metronidazolem, polimer ten zmniejsza bezwzględne ryzyko wystąpienia nawrotów infekcji o ok %, co nie jest w pełni satysfakcjonującym rezultatem (16). Stosowany samodzielnie, nie odznacza się wysoką efektywnością w leczeniu pierwszego rzutu choroby: tolevamer 46%, metronidazol 72%, wankomycyna 81% (16). Wciąż poszukuje się nowych molekuł o większej zdolności wiązania toksyn i wyższej efektywności terapeutycznej. Ze względu na rosnącą liczbę zachorowań, poszukuje się też skutecznej szczepionki chroniącej przed zakażeniem C. difficile. Obecnie opracowywany jest bezpieczny toksoid tej laseczki, pozwalający na niezagrażającą pacjentowi immunizację organizmu, także podczas leczenia CZCD. Dotychczas potwierdzono wyleczenie trzech pacjentów po podaniu takiej eksperymentalnej szczepionki (19), co dobrze rokuje na kolejne badania. PODSUMOWANIE Zapalenie jelit w przebiegu zakażenia C. difficile to coraz powszechniejszy problem zdrowotny. Związane jest ono z drastycznym zaburzeniem równowagi specyficznego ekosystemu tworzonego przez naturalną mikroflorę jelitową, czemu towarzyszy niekontrolowana kolonizacja jelit przez tę chorobotwórczą laseczkę. Formą terapii tego rodzaju zakażenia okazuje się być przeszczep naturalnej mikrobioty jelitowej, zwany potocznie przeszczepem kału. Metoda ta choć znana od dawna, przez wieki zapomniana i pomijana, wraca obecnie do łask, zwłaszcza w leczeniu szczególnie ostrych i nawracających zakażeń, nie poddających się standardowej terapii z użyciem metronidazolu i wankomycyny. Chociaż nadal budzi spore kontrowersje zarówno w środowisku medycznym jak i u pacjentów, dotychczasowe badania wskazują na jej wyjątkową skuteczność i bezpieczeństwo. Stosowana w świecie od prawie 60 lat, metoda ta w Polsce po raz pierwszy została użyta w 2012 r., a obecnie przeszczep mikroflory jelitowej przeprowadzany jest w trzech ośrodkach: w Wołominie, Makowie Mazowieckim i Wejherowie. Potencjał tej metody może zostać w pełni doceniony w leczeniu zakażeń wywołanych hiperwirulentnymi szczepami C. difficile, których rozpowszechnienie doprowadzi do zmian epidemiologicznych w dotychczasowym obrazie choroby związanej z C. difficile. PIŚMIENNICTWO 1. al-barrak A, Embil J, Dyck B i inni. An outbreak of toxin A negative, toxin B positive Clostridium difficile-associated diarrhea in a Canadian tertiary-care hospital. Can Commun Dis Rep 1999; 25: Borody TJ, Khoruts A. Fecal microbiota transplantation and emerging applications. Nat Rev Gastroenterol Hepatol 2012; 9:

68 218 M. Małopolska, M. Fol Nr Brown WB. Fecal microbiota transplantation in treating Clostridium difficile infection. J Dig Dis 2014; 15: Calabi E, Ward S, Wren B i inni. Molecular characterization of the surface layer proteins from Clostridium difficile. Mol Microbiol 2001; 40: Carter G.P, Rood JI, Lyras D. The role of toxin A and toxin B in the virulence of Clostridium difficile. Trends Microbiol 2012; 20: Carter GP, Rood JI, Lyras D. The role of toxin A and toxin B in Clostridium difficile-associated disease. Gut Microbes 2010; 1: ChapetónMontes D, Candela T, Collignon A, Janoir C. Localization of the Clostridium difficile cysteine protease Cwp84 and insights into its maturation process. J Bacteriol 2011; 193: Cohen SH, Gerding DN, Johnson S i inni. Clinical practice guidelines for Clostridium difficile infection in adults: 2010 update by the Society for Healthcare Epidemiology of America (SHEA) and the Infectious Diseases Society of America (IDSA). Infect Control Hosp Epidemiol 2010; 31: Dawson LF, Donahue EH, Cartman ST i inni. The analysis of para-cresol production and tolerance in Clostridium difficile 027 and 012 strains. BMC Microbiol 2011; 11: 86. doi: / Demarest SJ, Salbato J, Elia M i inni. Structural characterization of the cell wall binding domains of Clostridium difficile toxins A and B; evidence that Ca 2+ plays a role in toxin A cell surface association. J Mol Biol 2005; 346: Duke PS, Fardy J. Recurrent Clostridium difficile infection treated with home fecal transplantation: a case report. J Med Case Rep 2014; 8: 393. doi: / Eiseman B, Silen W, Bascom G.S, Kauvar AJ. Fecal enema as an adjunct in the treatment of pseudomembranous enterocolitis. Surgery 1958; 44: Gerding DN, Johnson S, Rupnik M, Aktories K. Clostridium difficile binary toxin CDT. Mechanism, epidemiology, and potential clinical importance. Gut Microbes 2014; 5: Ghose G. Clostridium difficile infection in the twenty-first century. Emerg Microbes Infect 2013; 2: e62. doi: /emi Goorhuis A, Bakker D, Corver J i inni. Emergence of Clostridium difficile infection due to a new hypervirulent strain, polymerase chain reaction ribotype 078. Clin Infect Dis 2008; 47: Gough E, Shaikh H, Manges AR. Systematic review of intestinal microbiota transplantation (fecal bacteriotherapy) for recurrent Clostridium difficile infection. Clin Infect Dis 2011; 53: Górska S, Jarząb A, Gamian A. Bakterie probiotyczne w przewodzie pokarmowym człowieka jako czynnik stymulujący układ odpornościowy. Postepy Hig Med Dosw 2009; 63: Hryniewicz W, Martirosian G, Ozorowski T. Zakażenia Clostridium difficile. Diagnostyka, terapia, profilaktyka. Narodowy Instytut Leków. Wydanie I. Warszawa Le Monnier A, Zahar JR, Barbut F. Update on Clostridium difficile infections. Med Mal Infect 2014; 44: Lee CH, Belanger JE, Kassam Z i inni. The outcome and long-term follow-up of 94 patients with recurrent and refractory Clostridium difficile infection using single to multiple fecal microbiota transplantation via retention enema. Eur J Clin Microbiol Infect Dis 2014; 33: Lyras D, O Connor JR, Howarth PM i inni. Toxin B is essential for virulence of Clostridium difficile. Nature 2009; 458: Manges AR, Labbe A, Loo VG i inni. Comparative metagenomic study of alterations to the intestinal microbiota and risk of nosocomial Clostridium difficile-associated disease. J Intect Dis 2010; 202: Mehlich A, Górska S, Gamian A, Myc A. Wybrane aspekty zakażeń Clostridium difficile. Postepy Hig Med Dosw 2015; 69:

69 Nr 3-4 Przeszczep jelitowej flory bakteryjnej w leczeniu CDAD Mitchell TJ, Ketley JM, Haslam SC i inni. Effect of toxin A and B of Clostridium difficile on rabbit ileum and colon. Gut 1986; 27: Musz-Kawecka M, Hawro M, Golec K. Choroba związana z Clostridium difficile u pacjentów hospitalizowanych w Centrum Medycznym w Łańcucie badanie retrospektywne. Przegląd Medyczny Uniwersytetu Reszowskiego i Narodowego Instytutu Leków w Warszawie 2013; 3: Nowak J, Grzanka A, Żuryń A, Stępień A. Rodzina białek Rho i ich rola w cytoszkielecie komórki. Postepy Hig Med Dosw 2008; 62: Ohland CL, Macnaughton WK. Probiotic bacteria and intestinal epithelial barrier function. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol 2010; 298: G807-G Pathak R, Enuh HA, Patel A, Wickremesinghe P. Treatment of relapsing Clostridium difficile infection using fecal microbiota transplantation. Clin Exp Gastroenterol 2013; 7: Popińska K, Socha J. Przewlekła biegunka: Biegunka przedłużająca się. W: Gastroenterologia praktyczna. Red. J. Socha, Wydawnictwo Lekarskie PZWL, Warszawa 1999, Rohlke F, Stollman N. Fecal microbiota transplantation in relapsing Clostridium difficile infection. Therap Adv Gastroenterol 2012; 5: Stasiewicz J. Choroby jelit. W: Leczenie chorób przewodu pokarmowego. Red. J. Stasiewicz, Wydawnictwo Lekarskie PZWL, Warszawa1999, Stevens V, Dumyati G, Fine LS i inni. Cumulative antibiotic exposures over time and the risk of Clostridium difficile infection. Clin Infect Dis 2011; 53: Sun X, Hirota SA. The roles of host and pathogen factors and the innate immune response in the pathogenesis of Clostridium difficile infection. Mol Immunol 2015; 63: Youngster I, Russell GH, Pindar C i inni. Oral, capsulized, frozen fecal microbiota transplantation for relapsing Clostridium difficile infection. J Am Med Assoc 2014; 312: niesamowita_moc_naszych_bakterii.html (stan z dn. 14 lipca 2015 r.) Otrzymano: 6 VIII 2015 r. Adres Autora: Łódź, ul. Banacha 12/16, Katedra Immunologii I Biologii Infekcyjnej Uniwersytetu Łódzkiego

70

71 MED. DOŚW. MIKROBIOL., 2015, 67: Etiologiczne czynniki kryptokokozy co warunkuje ich patogenność? Etiological factors of cryptococcosis what makes them pathogens? Mariusz Dyląg Department of Genetics, Institute of Genetics and Microbiology, University of Wroclaw, Poland Istotny udział w rosnącej częstości występowania grzybic mają drożdże podstawkowe z rodzaju Cryptococcus. Spośród około siedemdziesięciu obecnie znanych gatunków z rodzaju Cryptococcus tylko dwa: Cryptococcus neoformans i Cryptococcus gattii jako anamorfy w swym pasożytniczym stadium rozwojowym w pełni wykształciły mechanizmy predysponujące je do bycia patogenami ludzi i zwierząt. Specyficzne atrybuty, istotne w patogenezie kryptokokozy, nazywane czynnikami wirulencji pozwalają im kolonizować tkanki ssaków. Niewątpliwie najważniejsze znaczenie w patogenezie odgrywają: polisacharydowa otoczka, obecność melaniny oraz zdolność do wzrostu w zakresie temperatur o C. Słowa kluczowe: Cryptococcus spp., otoczka, melanina, temperaturooporność ABSTRACT A significant participation in the growing prevalence of fungal infections have basidiomycete yeasts of the genus of Cryptococcus. Among about seventy actually known species belonging to Cryptococcus genus there are only two: Cryptococcus neoformans and Cryptococcus gattii, which as anamorphs in parasitic stage of its life fully evolved the mechanisms predisposing them to be a human and animal pathogens. Specific attributes important in the pathogenesis of cryptococcosis called virulence factors allow them to colonize the mammalian tissues. Undoubtedly, the most important role in the pathogenesis play: the presence of polysaccharide capsule, synthesis of melanin, and the ability to grow in the range of temperatures o C. Key words: Cryptococcus spp., capsule, melanin, temperature-resistance

72 222 M. Dyląg Nr 3-4 INTRODUCTION Statistical researches performed by US CDC (United States of America Center for Diseases Control in 2009 year has been showed that only in sub-saharan Africa among about 25 mln of patient population with HIV/AIDS every year about 1 mln fungal infections is caused by Cryptococcus spp. Moreover, over half of them (about 625 thousands) die (2,30). Clinically important etiological factors of cryptococcosis: C.neoformans and C.gattii with each year play more and more significant role. The first mentioned often causes menningo- -encephalitis in patients with lowered immunity among which in developed countries has been noted 10-15% of died cases (6,33). It is estimated that at the global scale the prevalence of cryptococcosis in patients with HIV infection comprises in the range of 6-8% (35). Second mentioned may be a etiological factor of cryptococcosis even in case of fully immunocompetent persons and the most often has been described in west part of the North America (20). Currently on the African continent cryptococcosis is the third most common cause of death among patients with HIV/AIDS ahead of tuberculosis (30). Although in developed countries cases of cryptococcosis are much rarer nevertheless still remains one of the most common infection among patients after transplant surgery, with hematologic malignancies and patients with HIV/AIDS. In the case of these patients, despite of the early and targeted therapy, there are still approximately 40% of deaths (9). Both C. neoformans and C. gattii are aggregated species, among which can be recognized different varieties - strains morphologically completely indistinguishable from each other, but showing 8-11% differences in the genomic DNA sequence. Thus, within the C. neoformans species there are distinguished varieties: neoformans (serotype D) and grubii (serotype A), and in the case of C. gattii four molecular types (VGI - VGIV) have been separated (6,28,48). Moreover, interspecies hybrids between C. neoformans and C. gattii have been found recently (8). Strains belonging to both species which are etiological factors of cryptococcosis can be both haploid and diploid, however over 90% of these infections are caused by the haploid strains of C. neoformans var. grubii, of which 99.9% is sexual type α (6,28,48). Initially pulmonary infection usually develops after basidiospore or blastospore inhalation and in a short time can be extended to the central nervous system. It should be noted that fungal cells of the genus Cryptococcus just after a few hours inside the alveoli produce a polysaccharide capsule and proliferate, what is particularly important in the pathogenesis of cryptococcosis (23,48). DETERMINANTS OF VIRULENCE The pathogenicity of C. neoformans and C. gattii is polygenic, these species have several virulence factors that play an important role in the development of cryptococcosis. Among these factors, the most important seem to be: the ability to produce the polysaccharide capsule, the deposition of melanin in the cell wall and the ability to grow at 37 C, what predisposes to proliferate in the human body (20,21,48). Significant impact on the virulence of these species has the calcineurin A pathway. As it was shown recently, this pathway has significant impact on the ability to grow in the temperature of human body (approx. 37 o C), under the conditions of elevated concentration of CO 2, and under the physiological ph of

73 Nr 3-4 Patogenność grzybów z rodzaju Cryptococcus 223 human blood (27,32). Specific enzymes such as phospholipase B, superoxide dismutase and urease, also promote the growth inside the human body (20). Moreover, under unfavorable conditions prevailing in the host system a lot of C. neoformans cells increase its volume even fold in contrast to typical size cells (5-7μm in cell body diameter). These giant cells (called,,titan cells ) are less susceptible to attack from the host immune cells and also more resistant toward the conditions of anoxia or macro-and micronutrients deficient (particularly iron) (28,47). It should be noted that for both of these species, especially in the first hours of infection development of the intracellular parasitism plays an extremely important role, and survival within macrophages closely correlates with pathogenicity for mammals (46). This is what an adaptation to intracellular parasitism and the evolution of mechanisms that allow to escape from phagocytic cells gives C. neoformans and C. gattii a significant advantage over the other yeast-like fungi in the colonization of the central nervous system (20). The huge importance for C. neoformans has also the ability to utilize alternative carbon and energy sources such as acetate, lactate, or different fatty acids when his cells live in the environment which is poor in glucose. This ability also predispose to survive inside the human body (20). POLYSACCHARIDE CAPSULE AS A VIRULENCE FACTOR One of the most important factors in the development of cryptococcosis is the polysaccharide capsule which is present on the outside of the cell wall (Photo. 1a, b). This structure protect cells of pathogenic fungus against the immune system components and simultaneously possessing immunomodulating action (23,31,40,42,48). This is because of the capsule colonies of the pathogenic species from Cryptococcus genus have a typical mucous structure with gloss when grows on a solid Sabouraud medium (14,29). Many times it has been shown that C. neoformans and C. gattii acapsular mutants are avirulent and can be readily phagocytosed and eliminated by cells of the immune system (29,48). Moreover it has been a b Photo. Ia, b. Polysaccharide capsule as a one of the most important virulence factors of Cryptococcus neoformans. The negative staining with nigrosin, light microscope (Carl Zeiss), magnification: a) 1000x; b). 2500x. Photo by Mariusz Dyląg.

74 224 M. Dyląg Nr 3-4 shown that mutants lacking this structure has not shown immunomodulatory actions (23,29). The capsule comprises three basic components: glukuronoxylomannan (GXM, ~95%), galaktoxylomannan (GalXM, ~5%) and mannoproteins (MP, ~1%) (29,37,48). Together, these three components form a capsule, which thickness depending on environmental conditions and can achieve 0.5 to 80 microns (29,37). It has been shown that environmental factors, such as CO 2 concentration, ph, temperature, glucose concentration, NaCl and iron (Fe III) have a significant effect on the thickness of this polysaccharide structure (23,29,48). It was described a number of genes identified as CAP10, CAP59, CAP60, CAP64 and CAP67 which are involved in the biosynthesis of the capsule. Until now for none of these genes has been found homologue in the genomes of other organisms (23,29). Actually it is known that the synthesis of the main component of the capsule - glukuronoxylomannan is under the control of the CAP59 gene (29). During the host-pathogen interaction several components of the capsule can be released into the serum and the surrounding tissues or they are also stored in the vacuoles of macrophages exerting an immunomodulating effect (23,40,41,42). It has been proven that this structure exhibits strong antyphagocytic properties (19,29). Moreover it has been shown that changes in the structure of capsule allow the fungal cell to cross the blood-brain barrier (5) and to spread of an infection from the lungs to the central nervous system, what as suggest various authors is based on the phenomenon of transcytosis (4,28). Paradoxically recently has been shown that the polysaccharide capsule both in vitro and in vivo inhibit the invasive growth of the fungus, preventing it from developing the mycelial form. This promotes virulent blastospores to spread from lung (as the primary site of infection) to other niches within the host organism (29). In the rapid spread of C. neoformans cells on different parts of the body an important role plays macrophages and other phagocytic cells which serves as a kind of a,,trojan Horse for pathogenic fungal cells (29,48). Although role which played the capsule during intracellular parasitism is not fully understood, it is known that this structure allows fungal cells to survive and proliferate within the macrophages (23,29,48). The more potent adherence properties and better potential for biofilm formation on the polystyrene surfaces in the case of the wild strains comparing to the acapsular mutants: Cap 59 and Cap 67 were also shown (29). In contrast to the cell wall and plasma membrane the polysaccharide capsule has a potent hydrophilic properties and gives the fungal cell negative charge. It has been shown that the wild strains with normally developed capsule have about eightfold higher electric charge in comparison to the mutants with disrupted genes which are responsible for synthesis of the several components of capsule (24). THE PROTECTIVE ROLE OF MELANIN The ability to synthesize a black pigment - melanin in the presence of suitable substrates is an additional factor enhancing virulence in the case of C. neoformans and C. gattii (23,38).These species accumulate melanin in the cell wall in the presence of such compounds as ortho- and para-diphenols or catecholamine derivatives like dopamine or 3,4-dihydroxyphenylalanine (DOPA) (38). In the case of Cryptococcus melanization results in an increase of the cell wall thickness and density (12). Time of melanization in the case of Cryptococcus spp. depends not only on the concentration of exogenous substrates but also

75 Nr 3-4 Patogenność grzybów z rodzaju Cryptococcus 225 from factors that act repressively on laccase activity such as glucose and the temperature (45). Both pathogenic species exhibit specific neurotropism (20) founding in the tissues of the nervous system substrates which are catecholamine derivatives and whose oxidation leads to the formation of melanin (46). The ability to synthesize DOPA-melanin by C. neoformans and C. gattii has been reported both in vitro and in vivo and also during the infection development in the brains of mammals (25,46). This property for this fungus was first observed in 1960 by Staib under the culture conditions on media containing appropriate substrates (39). Unlike the fungal species such as Exophiala dermatitidis or Aureobasidium pullulans that produce melanin constitutively on the pentaketide pathway in the case of Cryptococcus spp. the production of melanin is induced (Photo. II) for example on solid Caffeic Acid Agar medium (CAA) (16,39,49). In the case of Cryptococcus spp. melanin synthesis is under the control of LAC1 gene which encoding the laccase. This enzyme catalyzes the oxidation of exogenous catechol derivatives such as dopamine or DOPA into the decarboxydopachrome which spontaneously polymerize to melanin (38). This enzyme containing copper (Cu) enables to carry out the oxidation of substrates such as diphenols, aminophenols and methoxyphenol derivatives. A second gene which encoding the laccase (LAC2) is expressed at a low level and has no relevance to the virulence of C. neoformans (46). In a brain tissue typical substrates for melanin production by Cryptococcus is the dopamine as a specific neurocatecholamine (45). Nowadays it is known that melanin due to its antioxidant properties (17) can effectively protect cells against oxidative stress generated by the host immune cells (44), and even may have an immunosuppressive effect toward the host lymphocyte T cells (46). It has been proven that Cryptococcus spp. mutants which are unable to synthesize melanin have significantly reduced virulence compared to the isogenic wild type strains (38). The presence of melanin in the cell wall of Cryptococcus spp. not only protects fungal cells against the toxic products of immune cells, but also against defensins and protegrins which have antifungal activity (23). Melanin also allows fungal cells to survive inside the phagosomes due to the possibility of oxidation of iron Fe (II) to Fe (III), and the ability to inhibition of the formation of hydroxyl radicals (23). Melanin has Photo. II. The ability to melanin production on CAA medium (Caffeic Acid Agar), ph 6.5 by two different Cryptococcus species: a) Cryptococcus neoformans varietas grubii; b) Cryptococcus uniguttulatus. Photo by Mariusz Dyląg.

76 226 M. Dyląg Nr 3-4 equally important significance for Cryptococcus spp. cells when they are outside the host body where this natural pigment protects fungal cells against UV radiation (43), oxidizing agents (23) the enzymes hydrolyzing the cell wall (23) and silver ions characterized by a wide range of antimicrobial activity (15). Moreover, in the case of amphotericin B which is still is still,,gold standard in the treatment of cryptococcosis, the melanization has some negative impact on the efficiency of antifungal therapy (23). THE ABILITY TO PROLIFERATE AT TEMPERATURE 37 O C The ability to form polysaccharide capsule have also other species belonging to the Cryptococcus genus such as Cryptococcus laurentii or Cryptococcus uniguttulatus. Similarly, ability to synthesise melanin under suitable laboratory conditions also has been described in the case of Cryptococcus terreus (22). A much better example constitute a Cryptococcus podzolicus which as C. neoformans and C. gattii is capable to produce both capsule as melanin (34). None of these species is capable to develope at the mammal body temperature and therefore is not pathogenic for humans and animals (22,32). C. neoformans and C. gattii are the only among about seventy species from this genus which besides of the ability to melanin synthesis and capsule formation additionally can proliferate at a temperature of C (32,33). The ability to grow in the mammal body temperature is the most important feature of invasive fungal pathogens of human (22,32). It is that feature which distinguishes C. neoformans and C. gattii from the other species of the genus, and allowed them to evolve in a typical pathogens of humans and animals (22,32). It has been shown that the optimal temperature for growth of these species is 32 C, and the maximum temperature for which we can observe inhibition of growth is 40 C (32). Recently it has been shown that molecular base of temperature-resistance in the case of C. neoformans also is releated with a calcineurin A pathway. Additionally it has been shown that C. neoformans mutants Cna1 (with deleted gene which encoding calcineurin A) are temperature-sensitive losing their ability to grow at C and therefore they are avirulent (27). The subsequent and advanced investigations have shown that the Cna1 gene is not the sole which is involved in temperature-resistance of C. neoformans. Nowadays there are about twenty known genes which play an equally important role in the context of temperature-resistance, and thus also in the pathogenesis of cryptococcosis (23,32). As could be expected, similarly to the temperature-resistant strains of Saccharomyces cerevisiae trehalose and the genes associated with the synthesis pathway of this sugar also promote the growth of C. neoformans at higher temperatures (32). THE ROLE OF THE VIRULENCE FACTORS IN THE ENVIRONMENT Outside of the host body, which is usually a human or other mammal C. neoformans and C. gattii live as saprophytes able to sexual reproduction, which as a teleomorphs belongs to the genus Filobasidiella (33). The first mentioned commonly exists as a commensal in the digestive tracts of Columba livia and often is isolated from pigeon droppings.c. gattii known mainly from endemic areas as saprophyte colonizes the tree of the genus Eucalyptus (18). Whilst the ability to grow at 37 C, which is very important during the parasitic period of life, does not matter in the external environment then the ability to synthesize melanin and

77 Nr 3-4 Patogenność grzybów z rodzaju Cryptococcus 227 capsule seem to have a huge impact on the survival of C. neoformans in different ecological niches (23). Cryptococcus neoformans cells isolated from the pigeon faeces usually contain significant amounts of melanin in the cell wall. This natural pigment mainly protects them against UV radiation (17), extreme temperatures (23) and against the cell wall-degrading enzymes, among others produced by living in the soil microorganisms which feeding mycelium (23). The capsular polysaccharides also provide to C. neoformans and C. gattii cells very effective protection against phagocytosis by the various species of the soil amoebae (23,48). All these mechanisms, often specific only to the pathogenic species from the genus Cryptococcus, allow the cells of these fungi to survive under the unfavorable environment until the time in which they encounter favorable conditions for the development inside the body of predisposed host. ANTIFUNGAL DRUGS USED IN THE TREATMENT OF CRYPTOCOCCOSIS Actually we have limited therapeutic options for the treatment of cryptococcosis. A lot of attention was paid to this problem during the 9 th international conference focused on Cryptococcus and cryptococcosis, which was held in Amsterdam from May (50). It is well known that the echinocandin drugs are ineffective against fungi of the genus Cryptococcus (7,13). The natural resistance of Cryptococcus spp. towards echinocandins is due to differences in the cell wall composition, which is a cell target for these compounds (7). Other antifungal agents, although effective in vitro, are not allowed for the treatment of cryptococcosis mainly because of their limited applications for topical use only (26). In the treatment of cryptococcosis amphotericin B still plays a crucial role, which although very effective poses significant toxicity especially toward kidney and liver (26). This polyene antibiotic is also administered in combination with fluconazole or 5-fluorocytosine to achieve synergistic effect. Taking under consideration fact that the amphotericin B has a toxic properties toward the mammalian cells (26) and the growing number of C. neoformans strains resistant to fluconazole and other azoles (1) is not difficult to see that the current treatment options for the cryptococcosis are becoming increasingly limited. It was widely discussed during the 9 th International Conference on Cryptococcus and cryptococcosis (50). Both during the plenary session, as well as poster sessions were presented interesting alternatives for the treatment of cryptococcosis. Recently, we described the possibility of using 3-bromopyruvate in treating of cryptococcosis (10). In our study, evaluating the susceptibility toward fluconazole (Pfizer ) among the clinical strains of C. neoformans was showed significantly reduced sensitivity to this drug in the case of one of the tested strains. The MIC (minimal inhibitory concentration) of fluconazole was determined based on the reference E-test`s method (AB BIODISK ) on solid RPMI 1640 medium (Sigma-Aldrich ), ph 7.0 and supplemented with 2% glucose (POCH ) and also on SD minimal medium (0.67% Yeast Nitrogen Base, 2% glucose, 2% agar, ph 5.5). The MIC values in the case of all the susceptible strains were in the range 4-6 μg/ml whereas for the presented strain reduced susceptibility to fluconazole the MIC values obtained from three independent replicates were equal to 24 μg/ml (Photo. IIIa). The additional studies were performed to determine the most likely source of the observed phenotype of resistance to fluconazole in the case of this strain. The available literature

78 228 M. Dyląg Nr 3-4 Photo. IIIa, b. The susceptibility of Cryptococcus neoformans var. grubii nr. PMR 205/2008 to fluconazole: a) used solely, MIC= 24 μg/ml; and b) used in combination with tacrolimus (5μM), MIC= 6 μg/ml. Photo by Mariusz Dyląg. data (3,36) suggested participation of C. neoformans AFR1 gene in the generation of this phenotype. This gene poses the highest homology to well known Saccharomyces cerevisiae PDR5 and SNQ2 genes which encoding one of the most important proteins among the ABC transporters family (3). Using rhodamine 6G as a known substrate for S. cerevisiae Pdr5p (11) it has been shown that the tested strain also exhibited significantly reduced susceptibility toward this compound. The additional evidences for the involvement of AFR1 gene in this phenomenon were the results of experiments conducted with the use of tacrolimus (Sigma-Aldrich ). In this case evaluation of susceptibility to fluconazole used solely and in combination with tacrolimus (FK506) was also performed based on the E-tests method. It has been shown clearly synergistic effect for these compounds used together in the case of strain with reduced susceptibility to fluconazole. It should be mentioned that FK506 used solely did not show any inhibitory effect. The MIC value for fluconazole in case of this strain decreased from 24 μg/ml to 6 μg/ml (Photo. IIIb). Thus, the results obtained in experiments with rhodamine 6G and tacrolimus, which referring to those known from the literature (11) suggest that observed phenotype of this strain most likely is due to the activity of AFR1 gene or other genes under which control it is. Initially presented in this paper results will be the subject of further consideration. SUMMARY Increasing from year to year prevalence of cryptococcosis mainly is a consequence of the growing population of patients with HIV/AIDS. Thus there is an urgent need for new antifungal agents, non-toxic and effective in the treatment of this life-threatening fungal infection. Discussed in this paper virulence factors of C. neoformans and C. gattii distinguish these species among others from this genus and decided about their evolutionary success. The term,,emerging pathogen encountered in the literature fits perfectly into these species in the context of the current epidemiological situation considered in a global scale.