Wielofazowość antygenów rzęskowych u pałeczek Salmonella* Salmonella multiphasic flagellar antigen

Transkrypt

1 Postepy Hig Med Dosw (online), 2012; 66: e-issn Review Received: Accepted: Published: Wielofazowość antygenów rzęskowych u pałeczek Salmonella* Salmonella multiphasic flagellar antigen Grzegorz Madajczak Zakład Bakteriologii Narodowego Instytutu Zdrowia Publicznego Państwowego Zakładu Higieny w Warszawie Streszczenie U pałeczek Salmonella obserwuje się więcej niż jedną fazę antygenów rzęskowych, co jest uwarunkowane występowaniem jednego, dwóch lub trzech genów, które niezależnie od siebie kodują białko strukturalne witki rzęski o właściwościach antygenowych. Gen flic koduje antygen rzęskowy pierwszej fazy, natomiast gen fljb drugiej fazy. Trzecia faza antygenu rzęskowego związana jest z genem umiejscowionym na plazmidzie. Ekspresja genów flic i fljb regulowana jest mechanizmem inwersji sekwencji fragmentu operonu hinfljba. Gen hin, kodujący inwertazę Hin, flankowany przez dwa regiony hixl i hixr, odwracany jest przez tetramer złożony z dimerów białek Hin i Fis. Proces ten włącza lub wyłącza ekspresję operonu hinfljba. Kiedy operon podlega ekspresji (jest włączony) wytwarzane są białka strukturalne witki rzęski FljB oraz białko FljA, które jest potranskrypcyjnym inhibitorem ekspresji genu flic. Oznacza to, że na powierzchni komórki pałeczki Salmonella mogą występować rzęski tylko pierwszej lub drugiej fazy. Czasem w wyniku mutacji w jednym z wymienionych genów, u bakterii dwufazowej dochodzi do unieczynnienia jednego z genów kodujących antygeny rzęskowe, w efekcie czego bakteria wytwarza antygen rzęskowy tylko jednej fazy (jednofazowe pałeczki Salmonella). W większości przypadków obserwuje się prawidłową ekspresję genu flic. W Europie w ostatnich latach najczęściej występującą jednofazową postacią są pałeczki Salmonella o wzorze antygenowym 1, 4 [5], 12: i. Słowa kluczowe: Salmonella antygen rzęskowy faza antygenów rzęskowych szczep jednofazowy regulacja ekspresji Summary In the Salmonella antigenic pattern, more than one phase of flagellar antigen is observed. The phase of flagellar antigen depends of the gene which encodes the protein building the filament of flagella. The flic gene encodes the 1 st phase of flagellar antigen and the fljb gene encodes the 2 nd phase of flagellar antigen. The third phase of flagellar antigen is encoded by one of the genes localized on the plasmid. Expression of the fljb gene (part of the hinfljba operon) is regulated by a mechanism of DNA fragment sequence inversion. The hin gene, which encodes Hin invertase, flanked by two regions hixl and hixr is inverted by Hin invertase together with Fis protein. This process turns on or turns off of the hinfljba operon. When this operon is turned on, FljB protein is produced (structural protein of flagella filament), and also FljA protein, which is a transcriptional repressor of the flic gene. This means that one Salmonella cell could have only one phase flagellar antigen 1 st or 2 nd phase. Sometimes, due to mutation in one of the mentioned genes, naturally diphasic Salmonella strains have the ability to produce only one phase of flagellar antigen. Mostly monophasic Salmonella with an active flic gene are observed. In recent * Publikacja powstała w ramach realizacji projektu badawczego finansowanego przez Narodowe Centrum Nauki, NN Postepy Hig Med Dosw (online), 2012; 66

2 Madajczak G. Wielofazowość antygenów rzęskowych u pałeczek Salmonella years such a strain, Salmonella enterica with the antigenic formula 1,4,[5],12: i: -, is one of the most often isolated strains from human cases in many European countries. Key words: Salmonella flagellar antigen flagellar antigen phase monophasic strain regulation of expression Full-text PDF: Word count: 2795 Tables: Figures: 3 References: 23 Adres autora: Wykaz skrótów: dr n. wet. Grzegorz Madajczak, Zakład Bakteriologii Narodowego Instytutu Zdrowia Publicznego Państwowego Zakładu Higieny, ul. Chocimska 24, Warszawa; gmadajczak@pzh.gov.pl AFLP amplified fragments length polymorphism; MLEE multilocus enzyme electrophoresis; LPS lipopolisacharyd; SSR site-specific DNA recombination; WHO GFN Global Foodborne Infections Network. Wstęp Pałeczki Salmonella enterica subsp. enterica są drugim co do częstości patogenem bakteryjnym, wywołującym zakażenie przewodu pokarmowego. Zróżnicowanie antygenów somatycznych i rzęskowych występujących wśród przedstawicieli tego podgatunku, pozwoliło na wyodrębnienie ponad 1500 serologicznych typów o odmiennej strukturze antygenowej i zróżnicowanej chorobotwórczości dla ludzi i zwierząt [8]. Antygeny somatyczne pałeczek Salmonella Pałeczki Salmonella enterica subsp. enterica ze względu na zróżnicowanie antygenów somatycznych zostały podzielone na grupy serologiczne (serogrupy), które początkowo określano kolejnymi dużymi literami alfabetu. Jednak wraz ze wzrostem liczby odkrywanych grup serologicznych zrezygnowano z zapisów literowych na rzecz oznaczeń cyfrowych kolejnych numerów tzw. cząstkowych antygenów somatycznych charakterystycznych dla danej grupy, np. O: 4 dla grupy BO [8]. Antygen somatyczny pałeczek Salmonella, podobnie jak i u innych przedstawicieli rodziny Enterobacteriaceae, ma charakter łańcucha polisacharydowego wchodzącego w skład lipopolisacharydu (LPS) ściany komórkowej. Z antygenem tym związana jest cecha szorstkości szczepu bakteryjnego (tzw. faza R), spowodowana utratą części lub wszystkich ogniw łańcucha polisacharydowego. Fenotypowo objawia się to zwiększoną skłonnością do wystąpienia w zawiesinie tych drobnoustrojów autoaglutynacji. Antygeny rzęskowe pałeczek Salmonella Szczepy pałeczek Salmonella należące do tej samej grupy serologicznej, tj. o wspólnym cząstkowym antygenie somatycznym są różnicowane na poszczególne typy serologiczne ze względu na występowanie określonych antygenów rzęskowych. Antygeny te są białkami strukturalnymi włókna (filamentu) rzęski [8,11]. SPI 1 SPI 2 fljabhin Subsp. I Subsp. VI Subsp. II Subsp. IIIb Subsp. IV Subsp. VII Subsp. IIIa S. bongori E. coli dwufaz. jednofaz. Ryc. 1. Drzewo filogenetyczne pałeczek Salmonella, obrazujące podział na pałeczki jedno i wielofazowe [12] Analizując strukturę antygenową pałeczek Salmonella wyróżnia się trzy fazy antygenów rzęskowych, za wytwarzanie których odpowiedzialne są geny umiejscowione w różnych miejscach genomu bakteryjnego. Jednak nie wszystkie pałeczki Salmonella wykazują trój-, czy bardziej powszechną dwufazowość antygenów rzęskowych. Przykładem szczepu, który wykazuje obecność trzeciej fazy antygenów rzęskowych jest Salmonella Typhi. Wśród przedstawicieli tego typu serologicznego notuje się występowanie różnych wariantów antygenów rzęskowych, w tym obecność antygenu trzeciej fazy oznaczonego symbolem z66 [1]. Na podstawie wyników badań genomu pałeczek Salmonella metodą MLEE, jak i AFLPwykazano, iż cecha wielofazowości pojawiła się jako końcowy etap różnicowania się w obrębie gatunku [12]. Jednak nawet wśród przedstawicieli podgatunku I (S. enterica subsp. enterica), który jak wynika z analizy rozwoju filogenetycznego rodzaju Salmonella powinien grupować pałeczki, u których wystepują antygeny rzęskowe dwóch lub trzech faz, a także pałeczki wykazujące stałą cechę jednofazowości brak antygenów rzęskowych jednej z faz [8]. 447

3 Postepy Hig Med Dosw (online), 2012; tom 66: AAGGTTTTTGATAA TTCCAAAAACTATT hixl RE hin TTATC AAAAACCTT AATAGTTTTTGGAA hixr fljb flja Ryc. 2. Budowa operonu hinfljba, z zaznaczeniem lewego (hixl) i prawego (hixr) miejsca odwróconych powtórzeń oraz miejscem stymulującym rekombinację (recombinational enhancer RE), do którego wiąże się białko Fis [3,17] A B C D hixl RE Hin Fis HU Ryc. 3. Przebieg procesu inwersji sekwencji regionu zawartego pomiędzy hixl i hixr. (A) do rozpoczęcia procesu konieczne jest DNA w formie super zwiniętej. (B) do regionów hixlr przyłączają się białka Hin, do regionu RE białko Fis. (C) białko HU inicjuje zmianę konformacji przestrzennej DNA, z udziałem białek Hin i Fis. (D) w wyniku oddziaływania inwertaz Hin odwróceniu ulega sekwencja pomiędzy regionami hixr Geny kodujące antygeny rzęskowe Geny kodujące białka strukturalne włókna rzęski, mające właściwości antygenowe, znajdują się w dwóch lub trzech miejscach genomu komórki. Dwa pierwsze kodujące antygeny rzęskowe I i II fazy, zlokalizowane są w obrębie chromosomu. Natomiast białko najrzadziej występującego antygenu rzęskowego III fazy kodowane jest przez gen występujący w obrębie DNA plazmidowego, np. flpa u trójfazowych wariantów S. Rubislaw, czy fljb z66 niektórych u S. Typhi [1,18]. Geny kodujące rzęski III fazy podlegają regulacji ekspresji niezależnej od regulacji ekspresji genów antygenów rzęskowych I i II fazy. W przypadku szczepów S. Typhi o wzorze antygenowym 9,12[Vi]: -: -: z 66, za występowanie dodatkowego nietypowego antygenu odpowiedzialny jest gen fljb z6 umiejscowiony na plazmidzie. Gen ten jest odpowiednikiem genu fljb, kodującego białko strukturalne rzęsek II fazy, których brak, podobnie jak i genu u typowych przedstawicieli tego serotypu o wzorze antygenowym 9,12[Vi]: d: - [1,8]. Geny kodujące białka strukturalne antygenów rzęskowych I i II fazy znajdują się na chromosomie bakteryjnym w obrębie operonu fli gen flic (I faza) w miejscu 40 oraz operonu flj gen fljb (II faza) w miejscu 56 (ryc. 2, 3). Ekspresja obu genów podlega koregulacji, przy nadrzędnej roli operonu flj. W skład tego operonu wchodzą trzy geny: hin kodujący białko biorące udział w regulacji ekspresji operonu hinfljba, gen fljb oraz flja. Ten ostatni koduje białko, które jest inhibitorem transkrypcji genu flic [17]. Wspomniane uprzednio pałeczki należące do typu serologicznego S. Typhi, jak i wielu innych, np. S. Reading, S. Bovismorbificans, S. Panama charakteryzują się możliwością występowania antygenu rzęskowego w fazie R (szorstki antygen rzęskowy). Zbieżność nazwy z fenotypem R dla antygenu somatycznego wynika z podobnego 448 mechanizmu powstawania zjawiska. Polega ono na delecji, u niektórych szczepów, fragmentu genu kodującego dany antygen rzęskowy, co objawia się brakiem wybranych epitopów wchodzących w skład kompleksu antygenowego rzęski. W sekwencji genu flic oraz fljb wyróżnia się początkowy obszar konserwatywny. W przypadku wspomnianych pałeczek S. Typhi zjawisko to polega na delecji fragmentu genu flic o wielkości 261pz, co wywołuje zmianą fenotypu H: d na H: j [7]. Natomiast w przypadku niektórych szczepów należących do innych typów serologicznych, u których może występować szorstkość antygenu rzęskowego, obserwuje się dodatni wynik reakcji aglutynacji ze wszystkimi surowicami dla kompleksu antygenów rzęskowych 1, np. surowicami H: 1,2, H: 1,5 itd. Brak jest jednak aglutynacji w surowicach dla antygenów cząstkowych H: 2, H: 5 itd. Również i w tym przypadku zjawisko to związane jest z delecją w obrębie genu kodującego antygen rzęskowy, lecz tym razem II fazy genu fljb. Antygen rzęskowy takich szczepów opisuje się symbolem R1 [8]. Regulacja ekspresji operonu hinfljba Ekspresja operonu hinfljba podlega kontroli na zasadzie zmiany orientacji sekwencji genu hin poprzez mechanizm swoistej miejscowo rekombinacji DNA SSR. Zjawisko to polega na rozkręceniu superkolistego DNA i ponownym jego skręceniu w ten sposób, iż tworzą się pętle, powodujące wzajemne zbliżenie się, umiejscowionych w obrębie operonu hinfljba, dwóch 14-nukleotydowych regionów hixl oraz hixr zawierających odwrócone powtórzenia (ryc. 2). To zaś doprowadza do rekombinacji tych regionów, czego następstwem jest zmiana orientacji sekwencji zawartej między regionami hixl i hixr. W opisanym wyżej procesie (ryc. 3), bierze udział produkt genu hin białko Hin, będące swoistą miejscowo

4 Madajczak G. Wielofazowość antygenów rzęskowych u pałeczek Salmonella rekombinazą serynową (inwertazą) wiążącą się w postaci dimeru z DNA w regionach hixlr genu hin. Białko to wytwarzane jest na stałym konstytutywnym poziomie, co umożliwia zmianę orientacji genu hin, gdy znajduje się w orientacji niekodującej. Innym istotnym czynnikiem biorącym udział w procesie inwersji jest białko Fis swoiście wiążące się z 65-nukleotydowym regionem stymulującym rekombinację (recombinational enhancer RE), który znajduje się w odległości około 100 nukleotydów od regionu hixl. Utworzenie kompleksu białek złożonego z tetrameru Hin, dimeru Fis doprowadza do przecięcia nici DNA w obrębie regionów hixlr i rekombinacji poprzez skręcenia powstałej helisy typu E. W wyniku tego procesu zmienia się orientacja łańcucha DNA zawartego między regionem hixl i hixr, co doprowadza do włączenia lub wyłączenia genu hin [3]. Włączony gen hin umożliwia ekspresję znajdujących się w tej samej ramce odczytu dwóch kolejnych genów fljb i flja. Efektem tego jest wytwarzanie białka antygenu rzęskowego II fazy oraz białka FljA, hamującym ekspresję genu flic. Proces ten polega na łączeniu się białka FljA z mrna genu flic, co uniemożliwia jego translację i doprowadza do jego degradacji. Następuje zablokowanie wytwarzania białka FliC budującego filament rzęski I fazy [11,23]. Powstające w tym samym czasie białko Hin przy następnym cyklu replikacji doprowadza do zmiany orientacji sekwencji genu hin i jego wyłączenia, co z kolei uniemożliwia ekspresję pozostałych genów, co skutkuje wytwarzaniem białka tworzącego włókno rzęski I fazy [3]. Sekwencje odwrotnie powtórzone (hixlr) znajdują się na zewnątrz od regionu kodującego białko, aczkolwiek wykazano, iż miejsce przyczepu rybosomów genu hin nakłada się z sekwencją hixl [17]. Mutacja w obrębie regionów hixlr nie wpływa na ekspresję genu fljb, jeśli sekwencja genu hin znajduje się w orientacji, gdy gen jest włączony. Badania nad sekwencją regionu podlegającego zmianie orientacji wykazały, iż zarówno miejsce wiązania rybosomów, jak i kodon start genu fljb znajduje się poza regionem oflankowanym przez regiony hixl i hixr [17]. Produkt ekspresji genu hin jest białkiem promotorowym dla genu fljb, które jak już wspomniano, jest białkiem strukturalnym włókna rzęski. Występowanie u pałeczek Salmonella antygenów rzęskowych wielu faz Jak wynika z drzewa filogenetycznego pałeczek Salmonella (ryc. 1), zdolność do wytwarzania antygenów rzęskowych drugiej fazy została nabyta późno w toku rozwoju filogenetycznego rodzaju Salmonella. Zjawisko to wiąże się prawdopodobnie z rozszerzeniem przez pałeczki Salmonella zakresu gospodarzy. Nowa cecha wielofazowość antygenów rzęskowych, umożliwiła adaptację bakteriom do zwierząt stałocieplnych [12,16]. U zwierząt zmiennocieplnych pałeczki Salmonella stanowią naturalny składnik flory jelitowej. U zwierząt stałocieplnych pałeczki Salmonella w zależności od serotypu i gospodarza mogą być bakteriami chorobotwórczymi lub niechorobotwórczymi. Mechanizmem obrony gospodarza przed zakażeniem jest wytwarzanie przeciwciał skierowanych przeciwko antygenom drobnoustroju, np. antygenom rzęsek, które są istotnym czynnikiem chorobotwórczości pałeczek Salmonella. Odpowiedzią pałeczek Salmonella było wykształcenie cechy ucieczki antygenowej, czyli zjawisko zmienności faz antygenów rzęskowych [12]. Według teorii McQuinstona i wsp. [12], dotyczącej dwufazowości pałeczek Salmonella, wykształcenie w toku ewolucji zdolności do wytwarzania rzęsek drugiej fazy pozwoliło tym drobnoustrojom na zajęcie nowej niszy ekologicznej w postaci nowych gospodarzy. Zdaniem tych autorów obecność w szczepie Salmonella antygenów rzęskowych tylko jednej fazy może ograniczać zdolność do wywoływania zakażenia niektórymi pałeczkami Salmonella tylko do ściśle określonych gospodarzy. Na przykład mogą to być pałeczki S. Typhi chorobotwórcze dla ludzi, czy pałeczki S. Gallinarum chorobotwórcze dla kur [12]. Jednak zdaniem autora niniejszej pracy, teoria ta nie znajduje pełnego uzasadnienia. Dowodem na to jest wiele typów serologicznych pałeczek Salmonella, których przedstawiciele są naturalnie jednofazowi, tak jak S. Enteritidis (1,9,12: g,m: -), czy S. Dublin (1,9,12[Vi]: g,p: -), a także wiele innych szczepów izolowanych zarówno od człowieka jak i wielu gatunków zwierząt. Innym przykładem są pałeczki S. Paratyphi B, niezużywające do swego wzrostu winianu sodowo-potasowego (fenotyp winian -), u których stwierdza się obecność dwóch faz antygenów rzęskowych (1,4,[5],12: b: 1,5), a których chorobotwórczość jest ściśle ograniczona do ludzi, podczas gdy przedstawiciele tego serotypu o fenotypie winian (+) S. Paratyphi B var. Java są izolowani od ludzi, jak i od przedstawicieli wielu gatunków zwierząt [6]. McQuinston i wsp. wykazują również, iż wykształcenie cechy wielofazowości antygenów rzęskowych przez pałeczki Salmonella może mieć związek z obroną tych drobnoustrojów przed ich naturalnymi wrogami, jakimi są niektóre pierwotniaki występujące w przewodzie pokarmowym zwierząt. Zmienność antygenowa oraz zmienna ruchliwość ma istotne znaczenie w obronie pałeczek Salmonella przed pierwotniakami, co wykazali Wildschutte i wsp. [22]. Baker i wsp. wykazali również, iż wykształcenie antygenu H: z66 zamiast H: d u pałeczek Salmonella Typhi może się raczej wiązać z oddziaływaniem pierwotniaków na te bakterie, niż układu immunologicznego człowieka [1]. Jednofazowość pałeczek Salmonella Wśród pałeczek Salmonella z podgatunku I, II, IIIb i VI obserwuje się drobnoustroje, u których stwierdza się obecność antygenów rzęskowych dwóch lub nawet trzech faz, jak i bakterie, u których naturalnie występują antygeny tylko jednej fazy kodowane przez gen flic [8]. W codziennej praktyce laboratoryjnej spotyka się również szczepy pałeczek Salmonella, u których nie można stwierdzić jednej z faz antygenów rzęskowych, mimo że należą do serotypu naturalnie dwufazowego. Częściej obserwuje się sytuację, gdy szczep wykazuje brak antygenu II fazy lub słabą reakcję aglutynacji w surowicy diagnostycznej dla tego antygenu. Zdecydowanie rzadziej obserwuje się analogiczną sytuację w odniesieniu do antygenu I fazy. Zjawisko to spowodowane jest różnicami w mechanizmach regulacji ekspresji genów kodujących antygeny obu faz. Regulacja ekspresji operonu hinfljba jest procesem zależnym od wielu innych czynników, co sprawia iż łatwiej może dojść do 449

5 Postepy Hig Med Dosw (online), 2012; tom 66: zaburzenia prawidłowego funkcjonowania tego procesu wskutek mutacji w jednym z uwikłanych genów. Ponadto nawet całkowite unieczynnienie operonu nie będzie miało takiego wpływu na funkcjonowanie komórki, jak miałoby w przypadku zmian w obrębie operonu fli. Ten bowiem, poza genem flic, zawiera geny kodujące białka innych elementów strukturalnych rzęski. Mutacje w tych genach mogą doprowadzić do całkowitej blokady wytwarzania rzęsek, co zdecydowanie wpłynie na chorobotwórczość bakterii [11]. Można więc postawić tezę, jak zrobili to McQuinston i wsp., iż w genomie pałeczek Salmonella, geny kodujące białko strukturalne II fazy włókna rzęski znalazły się jako koło zapasowe właściwego mechanizmu kodowania strukturalnego białka I fazy rzęsek [12]. Przykładem jednofazowych wariantów pałeczek Salmonella, należących do naturalnie dwufazowych serotypów, mogą być pałeczki Salmonella o wzorze antygenowym 9,12: l,v: - zaobserwowane na terenie Bułgarii, Danii i USA, opisane przez Petrova i wsp. [15]. Autorzy wraz z badaczami z wymienionych krajów, przeprowadzili analizy sekwencji genu fljb tych szczepów, a także inne badania porównawcze genomu. Pałeczki Salmonella o wzorze antygenowym 9,12: l,v: - mogą należeć do 4 różnych typów serologicznych: S. Mendoza (9,12: l,v: 1,2), S. Panama (9,12: l,v: 1,5), S. Kapemba (9,12: l,v: 1,7), S. Zaiman (9,12: l,v: e,n,x) oraz S. Goettingen (9,12: l,v: e,n,z15) [8]. Badania całkowitego DNA genomowego metodą PFGE nie dały jednoznacznej odpowiedzi na pytanie do jakiego typu serologicznego należą badane jednofazowe pałeczki Salmonella. Dopiero analiza sekwencji genu fljb wykazała, iż szczepy te mają gen, którego sekwencja jest w 100% zgodna z opublikowaną uprzednio sekwencją genu fljb, kodującego kompleks antygenowy H: e,n,z15 [13]. Pozwoliło to na stwierdzenie, iż szczepy te są jednofazowym wariantem pałeczek Salmonella Goettingen [15]. Analizując częstość występowania serotypów pałeczek Salmonella na terenie Europy, można stwierdzić, iż najczęściej występującym jednofazowym wariantem pałeczek Salmonella są te o wzorze antygenowym 1,4,[5],12: i: -. Zgodnie z danymi publikowanymi przez WHO GFN, pałeczki Salmonella o takim wzorze antygenowym znalazły się wśród 10 najczęściej występujących typów serologicznych pałeczek Salmonella izolowanych od ludzi w 2010 r. [21]. Pałeczki Salmonella o wzorze antygenowym 1,4,[5],12: i: - stały się najczęściej izolowanym od ludzi typem serologicznym w Luksemburgu [14]. Pałeczki Salmonella o wzorze antygenowym 1,4,[5],12: i: - jako szczep epidemiczny na terenie Europy zostały po raz pierwszy opisane przez Echeitę i wsp. [4]. W wyniku analizy sekwencji operonu hinfljb, a zwłaszcza sekwencji insercyjnej IS200 umiejscowionej w przestrzeni międzygenowej genów fljb i flja stwierdzono, iż szczepy te są jednofazowym wariantem pałeczek Salmonella Typhimurium [5]. Badania przeprowadzone przez Soyera i wsp. z użyciem PFGE i MLST wykazały, iż szczepy pałeczek Salmonella o takim wzorze antygenowym, izolowane na terenie USA i Europy są niejednorodne pod względem genetycznym [19]. Podobne wyniki uzyskali Hopkins i wsp., badając szczepy pałeczek Salmonella o wzorze antygenowym 1,4,[5],12: i: - izolowane od zwierząt i ludzi na terenie Europy [10]. Często szczepy te są nośnikami wyspy 450 genetycznej, odpowiedzialnej za zwiększoną oporność na leki przeciwbakteryjne [9,10,20]. Obecnie pałeczki Salmonella o wzorze antygenowym 1,4,[5],12: i: - nazywane są czasem Salmonella Typhimurium-like, ze względu na brak możliwości odróżnienia ich od typowych, dwufazowych pałeczek Salmonella Typhimurium, a także innych typów serologicznych pałeczek Salmonella z grupy BO, z antygenem H: i w pierwszej fazie. Przepisy prawa europejskiego nakazują traktowanie takich szczepów jako Salmonella Typhimurium (Rozporządzenie Komisji (UE) nr 517/2011). Laboratoryjna identyfikacja antygenów rzęskowych Oznaczając antygeny rzęskowe dwufazowego szczepu metodą aglutynacji szkiełkowej, z użyciem surowic monowalentnych, w populacji bakterii stanowiących pojedynczą kolonię, zwykle stwierdza się z tym samym nasileniem aglutynację antygenów obu faz. Jednak opisane wyżej mechanizmy regulujące ekspresję antygenów rzęskowych I i II fazy wykazują, iż na jednej komórce bakteryjnej występują antygeny rzęskowe tylko jednej fazy, tj. takie, których białko kodowane jest przez gen flic lub gen fljb [2,11]. Stwierdzenie występowania w populacji bakterii antygenów rzęskowych obu faz jednocześnie, jest wynikiem obecności komórek bakteryjnych, u których aktywny jest gen kodujący antygen I fazy i komórek z aktywnym genem kodującym antygen II fazy, mniej więcej w stosunku 1:1. Analizując zróżnicowanie antygenów rzęskowych pałeczek Salmonella można zauważyć, iż w wielu przypadkach dla jednej fazy stwierdza się występowanie kompleksu antygenów, np. kompleks G, do którego zalicza się antygeny G zawierające epitop g, takie jak: g,m, f,g, g,z 51 lub kompleks 1, do którego zalicza się antygeny 1,2, czy 1,5. Wiadomo jednak, że mająca właściwości antygenowe flagellina, jest polimerem pojedynczego białka kodowanego przez jeden konkretny gen [11]. Oznacza to, iż występowanie kompleksów odpowiada obecności kilku epitopów w obrębie jednego antygenu, co ma bezpośrednie uzasadnienie w sekwencji genów kodujących antygeny rzęskowe. W sekwencji genu flic, jak i fljb obserwuje się występowanie niezmiennej części konserwatywnej, odpowiadającej głównemu epitopowi np. g, oraz części zmiennej odpowiadającej pozostałym epitopom z danego kompleksu [13]. Wiedza na temat opisanego wyżej mechanizmu regulacji ekspresji genów kodujących antygeny rzęskowe, wykorzystywana jest w procedurze inwersji faz, kiedy to poprzez presję środowiska (obecność surowicy przeciw konkretnemu antygenowi rzęskowemu) selekcjonuje się populację bakterii tak, aby pozostały tylko te bakterie (lub ich znacząca przewaga), u których eksprymowany jest tylko gen jednej pożądanej fazy. W celu uzyskania inwersji faz rutynowo stosowany jest posiew na podłoże Garda z dodatkiem surowicy przeciwko antygenom, których ekspresję chce się zahamować. Istnieją dwie odmiany tej metody. Pierwsza z nich polega na posiewie szczepu na podłoże Garda na płytce o średnicy 5 cm i posiewie szczepu w centralnej części podłoża. Po rozejściu się szczepu na całą płytkę, pobiera się materiał z jej obrzeża. Powinien on zawierać bakterie, u których ekspresja danego antygenu uległa zahamowaniu. W przekonaniu autora, skuteczniejsza jest

6 Madajczak G. Wielofazowość antygenów rzęskowych u pałeczek Salmonella druga odmiana metody, w której podłoże Garda z surowicą dla hamowanego antygenu wlewa się do probówki bakteriologicznej z zanurzoną rurką Craiga. Szczep do inwersji posiewa się do środka rurki, a po przejściu na zewnątrz rurki pobrany materiał będzie zawierać wyselekcjonowaną populację bakterii z ograniczoną ekspresją lub brakiem ekspresji jednego z antygenów rzęskowych, przeciwko któremu stosowana była surowica. Doświadczenie autora wykazuje, iż proces ten trzeba czasami powtarzać wielokrotnie, a do kolejnych pasaży dodawać co raz to większą objętość surowicy. Jednocześnie należy podkreślić, iż niemożliwy jest proces zahamowania ekspresji pojedynczego antygenu znajdującego się w kompleksie z innym antygenem. Nie jest możliwe zahamowanie ekspresji antygenu H: 1 tak, aby uzyskać ekspresję antygenu H: 5. Związane jest to z tym, iż oba antygeny są kodowanane przez jeden i ten sam gen. Zahamowanie ekspresji jednego, zahamuje również ekspresję drugiego. Podsumowanie Przedstawiona wiedza na temat molekularnych aspektów biosyntezy antygenów rzęskowych pałeczek Salmonella ma bezpośredni wpływ na jakość pracy laboratoryjnej wykonywanej celem określenia przynależności serologicznej badanego szczepu. Zrozumienie mechanizmów regulacji biosyntezy antygenu rzęskowego pozwala na dobór właściwej metody badania (np. inwersja faz na podłożu z surowicą dla konkretnego antygenu) oraz prawidłową interpretację uzyskanych wyników (szczepy jednofazowe, szczepy z szorstkim antygenem rzęskowym, czy też szczepy z innym antygenem, niż I lub II fazy). Piśmiennictwo [1] Baker S., Hardy J., Sanderson K.E., Quail M., Goodhead I., Kingsley R.A., Parkhill J., Stocker B., Dougan G.: A novel linear plasmid mediates flagellar variation in Salmonella Typhi. PLoS Pathog., 2007; 3: e59 [2] Bonifield H.R., Hughes K.T.: Flagellar phase variation in Salmonella enterica is mediated by a posttranscriptional control mechanism. J. Bacteriol., 2003; 185: [3] Dhar G., Heiss J.K., Johnson R.C.: Mechanical constraints on Hin subunit rotation imposed by the Fis/enhancer system and DNA supercoiling during site-specific recombination. Mol. Cell, 2009; 34: [4] Echeita M.A.: Emergence and spread of an atypical Salmonella enterica subsp. enterica serotype 4,5,12:i:2 strain in Spain. J. Clin. Microbiol., 1999; 37: 3425 [5] Echeita M.A., Herrera S., Usera M.A.: Atypical, fljb-negative Salmonella enterica subsp. enterica strain of serovar 4,5,12:i:- appears to be a monophasic variant of serovar Typhimurium. J. Clin. Microbiol., 2001; 39: [6] European Food Safety Authority; European Centre for Disease Prevention and Control.: The European Union summary report on trends and sources of zoonoses, zoonotic agents and food-borne outbreaks in W: EFSA J. EFSA, p [7] Frankel G., Newton S.M., Schoolnik G.K., Stocker B.A.: Intragenic recombination in a flagellin gene: characterization of the H1-j gene of Salmonella typhi. EMBO J., 1989; 8: [8] Grimont P.A., Weill F.X.: Antigenic formulae of the Salmonella serovars. WHO Collaborating Centre for Reference and Research on Salmonella, Institut Pasteur, Paris, France [9] Guerra B., Soto S.M., Argüelles J.M., Mendoza M.C.: Multidrug resistance is mediated by large plasmids carrying a class 1 integron in the emergent Salmonella enterica serotype [4,5,12:i:-]. Antimicrob. Agents Chemother., 2001; 45: [10] Hopkins K.L., Kirchner M., Guerra B., Granier S.A., Lucarelli C., Porrero M.C., Jakubczak A., Threlfall E.J., Mevius D.J.: Multiresistant Salmonella enterica serovar 4,[5],12:i:- in Europe: a new pandemic strain? Euro Surveill., 2010; 15: [11] Macnab R.M.: Flagella and Motility. W: Escherichia coli and Salmonella: Cellular and Molecular Biology, red.: Neidhardt F.C. Washington DC: ASM Press, 1996, p [12] McQuiston J.R., Fields P.I., Tauxe R.V., Logsdon J.M. Jr.: Do Salmonella carry spare tyres? Trends Microbiol., 2008; 16: [13] McQuiston J.R., Parrenas R., Ortiz-Rivera M., Gheesling L., Brenner F., Fields P.I.: Sequencing and comparative analysis of flagellin genes flic, fljb, and flpa from Salmonella. J. Clin. Microbiol., 2004; 42: [14] Mossong J., Marques P., Ragimbeau C., Huberty-Krau P., Losch S., Meyer G., Moris G., Strottner C., Rabsch W., Schneider F.: Outbreaks of monophasic Salmonella enterica serovar 4,[5],12:i:- in Luxembourg, Euro Surveill., 2007; 12: E11 E12 [15] Petrov P., Hendriksen R.S., Kantardjiev T., Asseva G., Sørensen G., Fields P., Mikoleit M., Whichard J., McQuiston J.R., Torpdahl M., Aarestrup F.M., Angulo F.J.: Occurrence and characterization of Salmonella enterica subspecies enterica serovar 9,12:l,v:- strains from Bulgaria, Denmark, and the United States. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis., 2009; 28: [16] Porwollik S., Wong R.M., McClelland M.: Evolutionary genomics of Salmonella: gene acquisitions revealed by microarray analysis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2002; 99: [17] Simon M., Zieg J., Silverman M., Mandel G., Doolittle R.: Phase variation: evolution of a controlling element. Science, 1980; 209: [18] Smith N.H., Selander R.K.: Molecular genetic basis for complex flagellar antigen expression in a triphasic serovar of Salmonella. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1991; 88: [19] Soyer Y., Moreno Switt A., Davis M.A., Maurer J., McDonough P.L., Schoonmaker-Bopp D.J., Dumas N.B., Root T., Warnick L.D., Gröhn Y.T., Wiedmann M.: Salmonella enterica serotype 4,5,12:i:-, an emerging Salmonella serotype that represents multiple distinct clones. J. Clin. Microbiol., 2009; 47: [20] Trüpschuch S., Laverde Gomez J.A., Ediberidze I., Flieger A., Rabsch W.: Characterisation of multidrug-resistant Salmonella Typhimurium 4,[5],12:i:- DT193 strains carrying a novel genomic island adjacent to the thrw trna locus. Int. J. Med. Microbiol., 2010; 300: [21] WHO Global Foodborne Infections Network: GFN Country Databank. schema=portal ( ) [22] Wildschutte H., Wolfe D.M., Tamewitz A., Lawrence J.G.: Protozoan predation, diversifying selection, and the evolution of antigenic diversity in Salmonella. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2004; 101: [23] Yamamoto S., Kutsukake K.: FljA-mediated posttranscriptional control of phase 1 flagellin expression in flagellar phase variation of Salmonella enterica serovar Typhimurium. J. Bacteriol., 2006; 188: Autor deklaruje brak potencjalnych konfliktów interesów. 451