Załącznik III AUTOREFERAT W JĘZYKU POLSKIM

Transkrypt

1 Dr inż. Katarzyna Andraszek Katedra Genetyki i Hodowli Koni Instytut Bioinżynierii i Hodowli Zwierząt Wydział Przyrodniczy Uniwersytet Przyrodniczo-Humanistyczny w Siedlcach ul. B. Prusa Siedlce Załącznik III AUTOREFERAT W JĘZYKU POLSKIM

2 1. Imię i Nazwisko - Katarzyna Andraszek 2. Posiadane dyplomy, stopnie naukowe/artystyczne z podaniem nazwy, miejsca i roku ich uzyskania oraz tytułu rozprawy doktorskiej. - magister inżynier zootechniki, Wydział Rolniczy, Wyższa Szkoła Rolniczo- Pedagogiczna w Siedlcach (obecnie Wydział Przyrodniczy, Uniwersytet Przyrodniczo-Humanistyczny w Siedlcach), 1996 r. - doktor nauk rolniczych w zakresie zootechniki, Wydział Rolniczy, Akademia Podlaska w Siedlcach (obecnie Wydział Przyrodniczy, Uniwersytet Przyrodniczo- Humanistyczny w Siedlcach, na podstawie rozprawy doktorskiej Charakterystyka chromosomów mitotycznych i mejotycznych oraz analiza zawartości jądrowego DNA gęsi włoskiej (Anser anser), r., promotor: prof. dr hab. Elżbieta Smalec 3. Informacje o dotychczasowym zatrudnieniu w jednostkach naukowych - asystent, Katedra Genetyki i Hodowli Koni, Instytut Bioinżynierii i Hodowli Zwierząt, uniwersytet Przyrodniczo-Humanistyczny w Siedlcach (obecna nazwa jednostki), r. - adiunkt, Katedra Genetyki i Hodowli Koni, Instytut Bioinżynierii i Hodowli Zwierząt, Uniwersytet Przyrodniczo-Humanistyczny w Siedlcach, r. do chwili obecnej. 4. Wskazanie osiągnięcia wynikającego z art. 16 ust. 2 ustawy z dnia 14 marca 2003 r. o stopniach naukowych i tytule naukowym oraz o stopniach i tytule w zakresie sztuki (Dz. U. nr 65, poz. 595 ze zm.): a. Tytuł osiągnięcia naukowego. Cykl pięciu publikacji naukowych pod tytułem: Struktura i aktywność jąderek w spermatocytach wybranych gatunków zwierząt gospodarskich. b. Wykaz prac (autor, rok wydania, tytuł publikacji, nazwa wydawnictwa) dokumentujący osiągniecie naukowe: O.1. Andraszek K., Smalec E., 2007, Number and size of nucleoli in the spermatocytes of European domestic goose (Anser anser), Archiv für Geflügelkunde/European Poultry Science, 71 (5), O.2. Andraszek K., Gryzińska M., Knaga S., Wójcik E., Smalec E., 2012, Number and size of nucleoli in the spermatocytes of chicken and Japanese quail, Folia Biologica (Krakow), 60 (3-4), O.3. Andraszek K., Smalec E., 2012, Structure of the nucleoli in domestic cattle spermatocytes, Folia Histochemica et Cytobiologica, 50 (3),

3 O.4. Andraszek K., Gryzińska M., Wójcik E., Knaga S., Smalec E., 2014, Age-dependent change in the morphology of nucleoli and methylation of genes of the nucleolar organizer region in a Japanese quail model Coturnix japonica (Temminck and Schlegel, 1849) (Galliformes: Aves), Folia Biologica (Krakow), 62 (4), O.5. Andraszek K., Danielewicz A., Smalec E., Kaproń M., 2010, Identification of the nucleoli in domestic horse spermatocytes - preliminary investigations, Roczniki Naukowe Polskiego Towarzystwa Zootechnicznego, 6 (4), Wkład wnioskodawcy w wyżej wymienione prace przedstawiono w załączniku V, natomiast oświadczenia współautorów w załączniku VII. c. Omówienie celu naukowego/artystycznego ww. pracy/prac i osiągniętych wyników wraz z omówieniem ich ewentualnego wykorzystania. Jąderko wśród struktur jądra komórkowego po raz pierwszy zauważył i opisał Fontana w 1781 roku, jednak dopiero pod koniec XIX wieku zauważono, że jego wielkość ma znaczący wpływ na aktywność komórki. Stwierdzono również, że w spermatocytach ssaków jąderka są dosyć duże i dobrze widoczne w mikroskopie świetlnym, ze względu na dużą ilość części stałych (nawet do 85% objętości jąderka) oraz na zdolność załamywania światła (Hernandez-Verdun, 2011). 1. Rola jąderka i nukleologeneza Jąderka są produktem aktywności rejonów jąderkotwórczych NOR (ang. Nucleolar Organizer Regions) określonych chromosomów. Geny w rrna ulokowane są w pętlach DNA chromatyny chromosomów (Gonzalez i Sylvester, 1997). Ekspresja tych genów regulowana jest przez przegrupowanie chromatyny oraz czynników wywołujących konkretne procesy epigenetyczne (McStay i Grummt, 2008). Liczba jąderek w prawidłowo funkcjonującym jądrze komórkowym jest równa lub mniejsza od liczby rejonów jąderkotwórczych chromosomów mitotycznych, ponieważ kilka NOR bierze udział w formowaniu jednego jąderka, lub jąderka leżące w bezpośrednim sąsiedztwie zlewają się ze sobą (Raška i in., 2006). Jąderka występują w jądrach prawie wszystkich komórek eukariotycznych, ponieważ zawierają geny metabolizmu podstawowego, wyjątek stanowią plemniki i dojrzałe erytrocyty ptaków (Kłyszejko-Stefanowicz, 2002; Raška i in., 2006). Ich masa jest większa od masy nukleoplazmy, w której są zawieszone. Dzięki charakterystycznej gęstości, zwartej strukturze i małej ilości wody (10%) jest organellą, którą w dogodny sposób można wyodrębnić. W związku z tym, po fragmentacji jądra komórkowego w roztworze soli jąderko pozostaje zachowane nawet po zniszczeniu większości struktur jądrowych i możliwa jest jego izolacja po odwirowaniu. Wyizolowane jąderko jest takie samo jak w jądrze żywej komórki, a nawet w niektórych przypadkach zachowuje aktywność transkrypcyjną (Olson, 2004; Hernandez- Verdun, 2011; Raška i in., 2006). Wielkość jąderka kręgowców waha się od 5-10 µm. Jest różna w zależności od zapotrzebowania komórki na rybosomy (Shaw i Jordan, 1995). W komórkach organizmów eukariotycznych jąderka mogą mieć formę nieregularną, owalną lub kulistą (Olson & Dundr, 2005). Nieregularne formy jąderka mogą świadczyć 2

4 o procesach starzenia się komórki oraz o zapoczątkowanym procesie apoptozy (Olson i in., 2002). Jąderka mniejsze i mikrojąderka wskazują na nieodwracalne uszkodzenia komórek, których przyczyną jest całkowite i nieodwracalne zahamowanie syntezy RNA (Horky i in., 2002). Jąderka są najmniej stabilnymi organellami w komórkach dorosłych ssaków. Ich cechy morfologiczne zależne są od wielu czynników. Do bodźców mających wpływ na zmiany w budowie jąderek można zaliczyć: gatunek zwierzęcia, typ i stopień zróżnicowania komórki, rolę, jaka dana komórka ma spełniać, stan fizjologiczny lub patologiczny organizmu, oraz faza cyklu komórkowego (Olson i in., 2002; Hernandez-Verdun, 2011). Epigenetyczne regulacje na poziomie jąderka i genów rrna są cały czas kluczowym tematem badań genetycznych. Jąderko ma zdolność zwiększania i zmieniania swoich rozmiarów, zagęszczania się i rozpraszania podczas każdego cyklu komórkowego. Jego funkcjonowanie zostało najlepiej poznane i opisane w komórkach somatycznych (Pikaard, 2002; Raška i in., 2006; Hernandez- Verdun, 2011). W mitozie jąderka są strukturami bardzo dynamicznymi. Wyrazem tego może być ich cykliczne zanikanie w czasie mitozy i pojawianie się przy jej zakończeniu (Scheer i Hock, 1999). Jąderko zanika podczas podziału komórkowego i odtwarza się w rekonstruowanych jądrach, jako rezultat aktywności NOR (Olson, 2004). Materiał jąderkowy pojawia się przy NOR-chromosomach, gdy zaczyna odtwarzać się jądro telofazowe. Następnie dochodzi do wznowienia syntezy rrna i jąderka stają się bardziej widoczne. W czasie interfazy jąderko ma kształt kulisty. W profazie, kiedy chromosomy stają się widoczne, oczywiste jest powiązanie jąderka z poszczególnymi chromosomami jąderkotwórczymi (Raška i in., 2006). Proces nukleologenezy jest nazywany również procesem biogenezy rybosomów. Tandemowo ułożone w procesie mitozy geny rrna, histony oraz cząsteczki białek tworzą aktywną transkrypcyjnie chromatynę rybosomalną (r-chromatynę) wypełniającą wnętrze jąderka. Jednak podczas telofazy r-chromatyna umiejscowiona jest w centrach włóknistych nowo powstającego jąderka. Dochodzi do transkrypcji rdna, czego produktem są włókna prerybosomowego RNA, tworzące centra włókniste w jąderku (Bartova i in., 2010). Elementy r-chromatyny, odpowiedzialne za proces transkrypcji, wytwarzają cząsteczki prerybosomowe zawierające kompletny transkrypt. Transkrypcja rdna jest wynikiem współpracy pomiędzy produktami metylacji DNA, modyfikacją histonów a także cząsteczkami chromatyny. Procesy te mają wpływ na transkrypcję obu nici rrna oraz loci kodujących mrna. Dużą rolę w omawianych procesach odgrywają również białka, między innymi takie jak białka heterochromatyny, białka fibrylarne, oraz nukleoliny, czynnie uczestniczących w syntezie i przetwarzaniu rrna (Di Mario, 2004). W głównym etapie procesu powstawania rybosomów biorą również udział białka wytworzone w cytoplazmie, które przechodzą potem do wnętrza jąderka. Początek biogenezie daje prekursor 45S RNA, który łącząc się z białkami tworzy cząsteczkę 80S. Nowo syntetyzowane cząsteczki rybosomów przemieszczają się z części granularnej jąderka do części włóknistej Z pierwotnej postaci cząstek rybosomalnych wycięte zostają trzy typy sekwencji rrna. Są to 18S, 5S oraz 28S. Jednak podczas budowy rybosomy obecny jest jeszcze jeden typ kwasu rybonukleinowego - rrna-srrns. Kwas ten syntetyzowany jest poza jąderkiem komórkowym, w zupełnie odrębnym chromosomie (Prieto i McStay, 2005). 3

5 Aktywność procesu nukleologenezy modyfikowana jest w zależności od ciągle zmieniającego się zapotrzebowania komórki na rybosomy. Odpowiedni przebieg ich produkcji jest warunkiem koniecznym do odbywania się metabolizmu komórki oraz prawidłowego przebiegu wzrostu, rozwoju i dojrzewania komórki. 2. Jąderko podczas spermatogenezy Proces spermatogenezy był i jest przedmiotem wielu badań. Został dokładnie opisany zarówno w odniesieniu do terminologii, jak i biologicznych etapów powstawania plemników. Najmniej poznanym i zbadanym aspektem spermatogenezy jest zjawisko fragmentacji jąderka podczas pierwszej profazy mejotycznej oraz jego reorganizacja po zakończonej mejozie. Analiza jąderek mejotycznych podejmowana jest najczęściej pod kątem dwóch mechanizmów, zmniejszania rozmiarów jąderek podczas mejozy oraz fragmentacji i ponownej reorganizacji jąderka. Uzupełnieniem tych badań są analizy dotyczące precyzyjnego położenia jąderka w spermatogonium i spermatocycie. Zmniejszenie rozmiarów jąderka jest wynikiem zmniejszania się w nim zawartości dwóch białek - białka C23 odpowiedzialnego za transkrypcję rrna i białka B23 odpowiadającego za składanie cząsteczek rrna (Takeuchi i Takeuchi, 1990; Biggiogera i in., 1991; Peruquetti i in., 2008, 2010). Wyniki badań sugerują, że fragmentacja jąderka zachodzi podczas profazy pierwszej mejozy. W okrągłych spermatydach jąderka są już zrekonstruowane, lecz mniejsze niż w spermatogoniach i wczesnych spermatocytach pierwszego rzędu. Prawdopodobnie fragmentacja jąderka następuje w pachytenie, podczas jego największej aktywności. Takie zachowanie jąderek obserwowano u większości strunowców (Wachtel i Stahl, 1993; Teruel i in., 2007). W jądrach podłużnych spermatyd i dojrzałych plemnikach nie obserwowano już jąderek. Obecność jąderka nie jest potrzebna w plemniku, ponieważ po zapłodnieniu zarówno jąderko męskiego, jak i żeńskiego przedjądrza w zygocie pochodzą od matki. Jąderko komórki jajowej w połączeniu z innymi produktami nukleoplazmatycznymi jest niezbędne do prawidłowego rozwoju embrionalnego (Lefèvre, 2008). Badania ultrastruktury komórki i jąderka umożliwią sprawdzenie, dlaczego jąderko ulega zmniejszeniu podczas mejozy i czy jest to wynikiem udziału fragmentów jąderka w montażu ciałek chromatoidalnych (CB) chromatiod body, które są obserwowane po zakończonym drugim podziale mejotycznym na obrzeżach jądra okrągłych spermatyd. Inna hipoteza tłumaczy zmniejszanie się jąderek na skutek migracji ich fragmentów do cytoplazmy komórek pod koniec profazy I (Peruquetti i wsp., 2012). W literaturze opisano, że montaż CB odbywa się równolegle z fragmentacją jąderka i oba te procesy są ze sobą skorelowane (Kotaja i in., 2007; Peruquetti i in., 2008, 2010). Udowodniono również, że przywrócenie morfologii jąderkowej po podziałach komórkowych jest niezwykle ważne. Jest to cecha przyczyniająca się do wyzerowania długości życia jąderka w gametogenezie, a co za tym idzie, do eliminacji przeróżnych przypadkowych uszkodzeń wywołanych starzeniem się komórki. Potwierdza to związek jąderka z telomerazą (Ünal i in., 2011). Okrągłe spermatydy posiadają już zreorganizowane jąderko, a ich CB osiągają maksymalną powierzchnię. Na tym etapie spermatogenezy CB mogą być obserwowane, jako samodzielne struktury lub w połączeniu z mitochondriami i systemem akrosomowym. 4

6 Wcześniejsze badania sugerują, że CB są związane z mitochondriami spermatocytów i pochodzą z materiału intermitochondrialnego (Fawcett i in., 1970). Reunov i in. (2000) sugerują, że CB pochodzą z genomu jądrowego, a następnie są uzupełnione o produkty genomu mitochondrialnego. Wykrycie obecności kilku elementów mitochondrialnych w CB może potwierdzać związek pomiędzy genomem jądrowym i mitochondrialnym, i przekazywanie tej interakcji z pokolenia na pokolenie. Również w badaniach (Peruquetti i in., 2012) potwierdzono związek pomiędzy mitochondriami spermatocytów i CB oraz udział CB w tworzeniu wstawki i witki plemników. Związek między CB a mitochondriami może także tłumaczyć udział CB w syntezie i transporcie apocytochromu c - izoformy cytochromu c, którego ekspresja jest obserwowana w tkance jądra oraz obecność oksydazy cytochromu c (COXI), istotnego komponentu mitochondrialnego (Haraguchi i in., 2005). Lokalizacja jąderek w spermatocytach jest ściśle określona przez specyficzną gatunkowo architekturę wewnętrzną jądra. Każdy chromosom zajmuje w jądrze swoje określone terytorium. Układ jąderek jest związany z pozycją NOR-chromosomów i lokalizacją NOR wchromosomach. Gatunki, u których obszary jąderkotwórcze są umiejscowione w terminalnych częściach ramion chromosomów posiadają jąderko zlokalizowane w peryferyjnej części jądra spermatocytu. Gatunki, u których NOR występuje w interstycjalnych częściach chromosomu mają jąderko w centralnej części jądra spermatocytu (Berrios i in., 2004). Rozmiar i liczba jąderek stopniowo zmniejszają się podczas spermatogenezy. Część materiału pochodzenia jąderkowego prawdopodobnie migruje do cytoplazmy i bierze udział w tworzeniu ciałek chromatoidalnych. Zjawisko fragmentacji jąderka i montażu CB zachodzi w tym samym czasie spermatogenezy. CB biorą udział w tworzeniu akrosomu, zstępowaniu mitochondriów do wstawki oraz tworzeniu białkowej osłony witki plemnika. 3. Jąderko w badaniach epigenetycznych Oprócz tego, że jąderko jest bezpośrednio związane z biogenezą rybosomu, udowodniono również jego zaangażowanie w inne procesy komórkowe (Santoro i Grummt, 2001; Olson i in., 2002; Gerbi i in., 2003; Raška i in., 2006). Niekonwencjonalna rola jąderek została opisana przede wszystkim w odniesieniu do epigenetycznych mechanizmów komórkowych. Jąderko bierze udział miedzy innymi w regulacji cyklu komórkowego, biogenezie rybonukleoproterin, proliferacji komórek. Udowodniono jego związek z kancerogenezą, zakażeniami wirusowymi, chorobami zwyrodnieniowymi i stresem komórkowym (Gerbi i in., 2003; Khurts, 2004; Nafe i Schlote, 2004; Raška i in., 2006; Boisvert i in., 2007). W onkologii, na podstawie morfologii jąderek klasyfikuje się kancerogenny wpływ onkogenów. Oceniana jest wtedy liczba, wielkość oraz lokalizacja jąderek w jądrze komórkowym (Nafe i Schlote, 2004; Raška i in., 2006). Istnieje bezpośredni związek pomiędzy aktywnością obszarów jąderkotwórczych, a podziałami komórki (Derenzini i in., 1990; Raška i in., 2006). Z jąderkiem jest związane białko c-myc, które jest produktem protoonkogenu. Białko to reguluje biogenezę rybosomu i wszystkie trzy ludzkie polimerazy. Kontroluje także syntezę rrna (Arabi, 2005; Oskarsson i Trumpp, 2005). Białkami o jąderkowej lokalizacji są także białka prb i p53. Białka te nazywane strażnikami genomu są onkosupresorami kontrolującymi cykl komórkowy i prawidłowy wzrost komórki (Ryan 5

7 i in., 2001). Białko p53 i jąderko są ze sobą funkcjonalnie połączone. Aktywacja białka p53 na skutek transformacji nowotworowej powoduje dezintegrację jąderek (Rubbi i Milner, 2003; Olson, 2004). W literaturze przedmiotu można znaleźć także prace dotyczące związku jąderka z infekcjami wirusowymi (Hiscox, 2002, 2003; Olson i wsp., 2002) oraz z jąderkową lokalizacją telomerazy (Lukowiak, 2001). Podczas cyklu komórkowego czynnik TRF2 telomeru jest zależny od funkcjonalnych i strukturalnych zmian jąderka (Khurts, 2004). Starzenie na poziomie komórkowym i morfologia jąderek są także procesami skorelowanymi. Badania genomu drożdży potwierdziły, że uszkodzenie genów rrna powoduje dezintegrację jąderek, która jest objawem starzenia się organizmu. Na morfologię jąderek ma również wpływ metylacja DNA. Od niej zależy konformacja genów kodujących rrna. Może być aktywna transkrypcyjnie, nazywana otwartą lub zamknięta, co jest związane z załamaniem transkrypcji. Postępujący proces metylacji związany z wiekiem osobnika może wyciszać wszystkie lub tylko niektóre geny odpowiedzialne za reorganizację jąderek po podziale komórkowym (Grummt i Pikaard, 2003). Epigenetyczne regulacje na poziomie jąderka i genów rrna są cały czas kluczowym tematem badań genetycznych. 4. Cel naukowy Celem naukowym opracowania jest analiza struktury jąderek podczas spermatogenezy u wybranych gatunków zwierząt gospodarskich oraz określenie ich liczby i rozmiarów w komórce oraz struktury w zależności od wieku organizmu, u którego były analizowane. Z uwagi na wpływ mechanizmów epigenetycznych na strukturę chromatyny podjęto także próbę analizy metylacji genów rrna i jej wpływu na morfologię jąderek. Szczegółowe cele naukowe zostały sformułowane w publikacjach dokumentujących osiągniecie naukowe. 1. Określenie liczby i wielkości jąderek w spermatocytach samców europejskiej gęsi domowej (Anser anser), kury domowej (Gallus gallus domesticus) i przepiórki japońskiej (Coturnix coturnix japonica) prace O.1, O Ustalenie liczby i morfologii jąderek w profazie pierwszego podziału mejotycznego, u samców bydła domowego i konia domowego prace O.3, O Określenie kształtu jąderek oraz analiza metylacji genu RN28S w spermatocytach samców przepiórki japońskiej (Coturnix japonica) należących do dwóch grup wiekowych praca O Wprowadzenie metodyczne We wszystkich analizowanych pracach materiałem poddanym analizie były spermatocyty pierwszego rzędu, z których jąder izolowano chromosomy mejotyczne. W przypadku materiału pochodzącego od ptaków stosowano procedurę opisaną przez Pollock i Fechheimer (1978), natomiast w przypadku ssaków wykorzystano metodykę Evans i in., (1964). Jąderka, podobnie jak i obszary jąderkotwórcze, wykazują powinowactwo do metali ciężkich i mogą być identyfikowane techniką barwienia azotanem srebra w koloidalnym roztworze ochronnym (Howell i Black, 1980). Jest to klasyczna metoda identyfikacji 6

8 obszarów jąderkotwórczych na chromosomach mitotycznych sprawdzająca się doskonale w identyfikacji jąderek mejotycznych. W przeciwieństwie do NOR obserwowanych w mitozie jąderka są strukturami dużymi. Barwienia z użyciem AgNO 3 umożliwiają stwierdzenie liczby, wielkości oraz kształtu jąderek. Analiza metylacji była prowadzona na DNA wyizolowanym z zawiesiny komórkowej wykorzystanej do analizy jąderek. Analizę metylacji wykonano za pomocą techniki MSP (methylation-specyfic PCR). Startery do reakcji zostały zaprojektowane na podstawie sekwencji genu RN28S - 28S ribosomal RNA (Gallus gallus) (NCBI, Gene ID ) Przedstawienie wyników Określenie liczby i wielkości jąderek w spermatocytach samców europejskiej gęsi domowej (Anser anser), kury domowej (Gallus gallus domesticus) i przepiórki japońskiej (Coturnix coturnix japonica) prace O.1, O.2. W spermatocytach badanych gatunków ptaków jąderka zidentyfikowano w sposób jednoznaczny bez względu na etap profazy i intensywność zabarwienia preparatów. Ponadto, w komórkach charakterystycznych dla wczesnej profazy obserwowano kinetochory centromerów, jako ciemne punkty na tle chromatyny (białka kinetochorów także wykazują pozytywna reakcje na srebro). W spermatocytach gęsi obserwowano zróżnicowaną liczbę jąderek. Zmienność tę stwierdzono w komórkach pochodzących od tego samego osobnika oraz między osobnikami. Ogółem w 199 komórkach pochodzących od 10 osobników stwierdzono 329 jąderek. Liczba jąderek u poszczególnych osobników wahała się od 1 do 4, średnio 1,65 w komórce. Komórki z 4 jąderkami występowały sporadycznie. U każdego osobnika zaobserwowano obecność jąderek różnej wielkości. Obserwowane jąderka subiektywnie klasyfikowano, jako duże lub małe. W ogólnej liczbie zidentyfikowanych jąderek 78% stanowiły duże, natomiast 22% małe. W spermatocytach kogutów również obserwowano zróżnicowaną liczbę jąderek. Zróżnicowanie obserwowano w komórkach tego samego osobnika i pomiędzy badanymi osobnikami. Liczba jąderek u poszczególnych osobników wahała się od 1 do 4, średnio 1,91 w komórce. W 500 badanych komórkach stwierdzono 23% komórek z jednym jąderkiem, 65% z dwoma, 11% z trzema i 15% z czterema. W ogólnej liczbie zidentyfikowanych jąderek, 34% sklasyfikowano jako duże, pozostałe 66% jako małe. W spermatocytach przepiórki także obserwowano zmienność liczby jąderek, zarówno wewnątrz osobniczą, jak i miedzy osobnikami. U poszczególnych osobników liczba jąderek wahała się od 1 do 2, średnio 1,13 w komórce. W 500 analizowanych komórkach, 88% miało jedno jąderko, a 12% dwa jąderka. U każdego osobnika obserwowano obecność jąderek różnej wielkości. W ogólnej liczbie jąderek, 12% sklasyfikowano jako duże, 88% jako małe. 7

9 Ustalenie liczby i morfologii jąderek w profazie pierwszego podziału mejotycznego u samców bydła domowego i konia domowego prace O.3, O.5. W spermatocytach bydła domowego zaobserwowano jedno jąderko, które było dobrze widoczne zarówno w komórkach charakterystycznych dla wczesnego, jak i późnego leptotenu. Na początku leptotenu występują jąderka o regularnym, prawie okrągłym, kształtcie oraz posiadające jednolitą strukturę. W końcowej fazie leptotenu jąderka ulegają dyspersji, nadal jednak stanowią zwartą strukturę. W obrębie jąderka można wtedy zaobserwować ciemne, drobne struktury, których liczba jest równa lub zbliżona do dziesięciu. Jest to liczba obszarów jąderkotwórczych występujących w kariotypie bydła domowego. W spermatocytach konia obserwowano zawsze jedno jąderko. Zróżnicowany był natomiast kształt jąderek w komórkach poszczególnych osobników, w zależności od wieku. Jąderka sklasyfikowano w trzech grupach: jąderka o regularnym, okrągłym kształcie, jąderka nieregularne i jąderka o strukturze zdefragmentowanej. Zaobserwowano, że w komórkach osobników młodych, dwuletnich przeważały jąderka o regularnej strukturze. W ogólnej liczbie jąderek analizowanych u dwuletnich koni, 62% stanowiły jąderka regularne, natomiast jąderka nieregularne stanowiły 38% jąderek. U dwuletnich koni nie obserwowano jąderek o zdefragmentowanej strukturze. W komórkach koni trzyletnich stwierdzono równy udział jąderek regularnych i nieregularnych, po 50% w każdej grupie. Podobnie jak w komórkach koni dwuletnich, również u koni trzyletnich nie występowały jąderka o zdefragmentowanej strukturze. Najbardziej zróżnicowane pod względem kształtu jąderek były komórki koni siedmioletnich. Regularne jąderka stanowiły niewielki odsetek, zaledwie 2% obserwowanych jąderek. Największą liczbę stanowiły jąderka o nieregularnym kształcie 67%. Ponadto, w komórkach siedmioletnich koni obserwowano także jąderka zdefragmentowane, które stanowiły 31% wszystkich jąderek. Określenie kształtu jąderek oraz analiza metylacji genu RN28S w spermatocytach samców przepiórki japońskiej (Coturnix japonica) należących do dwóch grup wiekowych praca O.4. W opisanych w pracy badaniach zidentyfikowano jąderka o zróżnicowanym kształcie w spermatocytach pierwszego rzędu u przepiórek w różnym wieku. U przepiórek obserwowano od 1 do 2 jąderek w komórce. Zidentyfikowane jąderka sklasyfikowano, jako regularne, nieregularne oraz zdefragmentowane. Udział jąderek o określonym kształcie różnił się w zależności od wieku ptaków. W komórkach przepiórek młodych (15-tygodniowych) stwierdzono przede wszystkim jąderka o regularnym, owalnym kształcie. W ogólnej liczbie 1128 jąderek ponad 96% stanowiły jąderka regularne. Jąderka nieregularne stanowiły niewiele ponad 3% wszystkich jąderek. W tej grupie nie stwierdzono jąderek zdefragmentowanych. W komórkach 52-tygodniowych przepiórek nie zaobserwowano jąderek regularnych. Jąderka nieregularne stanowiły ponad 37% wszystkich 1110 zidentyfikowanych jąderek. W tej grupie wiekowej najwięcej, ponad 62%, stanowiły jąderka zdefragmentowane. W wyniku reakcji MSP stwierdzono, że gen RN28S ulega metylacji zarówno u przepiórek 15 tygodniowych, jak i 52-tygodniowych. Badania wykazały, iż gen 28S rrna jest zmetylowany oraz wyciszony zarówno u 15 tygodniowych jak i 52 tygodniowych przepiórek. Gen 28S rrna w danych okresach rozwojowych jest wyciszany, 8

10 co wskazuje na to, że metylacja tego genu może być związana nie tylko z wiekiem, ale i z cyklem komórkowym. Konieczna jest analiza wszystkich genów zlokalizowanych w obszarze jąderkotwórczym (NOR), aby potwierdzić zależność metylacji z brakiem ekspresji oraz związek z cyklem komórkowym Komentarz do wyników Liczba jąderek w jądrze komórkowym jest równa lub mniejsza od liczby obszarów jąderkotwórczych. Uzyskane w badaniach wyniki częściowo potwierdzają tę rozbieżność. Zarówno w komórkach gęsi, przepiórek, bydła jak i koni potwierdzono regułę, że liczba jąderek jest równa lub mniejsza od liczby aktywnych NOR. Natomiast w komórkach kur liczba jąderek przewyższała liczbę aktywnych NOR opisanych dla Gallus domesticus. Przyczyną tego zróżnicowania może być występująca u kur trisomia, w tym przypadku dotycząca 16 pary chromosomów, na której zlokalizowany jest NOR. Więcej niż dwa jąderka w komórkach u kur obserwowali także Muscarella i in. (1985) oraz Delany i in. (1991), którzy potwierdzili, że zwiększona liczba jąderek może być przyczyną obecności trisomicznych lub tetrasomicznych jąder w komórkach badanych ptaków. Wpływ na zróżnicowanie liczby i wielkości jąderek w komórce, zarówno w aspekcie osobniczym, jak i gatunkowym, mają niewątpliwie zmiany w aktywności obszarów jąderkotwórczych. Wybarwiają się te odcinki NOR, w których transkrypcja zajdzie w następnym cyklu komórkowym, dlatego nie wszystkie NOR ujawniają się jednocześnie i nie wszystkie biorą udział w tworzeniu jąderek podczas konkretnego cyklu komórkowego. Zróżnicowana jest także aktywność transkrypcyjna chromosomów homologicznych. W obrębie homologów jeden może silniej reagować na srebro, a drugi słabiej. Ponadto wielkość obszarów jąderkotwórczych jest cechą polimorficzną. Polimorfizm wielkości obszarów jąderkotwórczych ujawnia się w postaci depozytów srebra lub sygnałów w hybrydyzacji in situ o różnych rozmiarach. Różnice te mogą tłumaczyć różną liczbę jąderek i zróżnicowane ich rozmiary w komórkach osobnika (Raška i in., 2006; Hernandez-Verdun, 2011). Porównanie liczby jąderek w komórkach somatycznych i w spermatocytach tego samego gatunku, dowodzi o zmniejszonej liczbie jąderek w spermatocycie. W komórkach somatycznych oraz w diploidalnych spermatogoniach liczba jąderek jest skorelowana z liczbą aktywnych obszarów jąderkotwórczych. W spermatocytach występuje najczęściej jedno, duże jąderko. Możliwe, że między mitozą, a mejozą podczas spermatogenezy dochodzi do akumulacji jąderek w celu uzyskania przez nie największej aktywności w pachytenie pierwszej mejozy (Teruel et al., 2007; Mosgoller, 2004). Jąderka ulegają degradacji przez całą profazę pierwszego podziału mejotycznego. Sposób w jaki zanikają jest prawdopodobnie charakterystyczny dla określonych grup kręgowców. Możliwe, że jest to cecha gatunkowa. W spermatocytach bydła domowego jąderka stopniowo ulegają defragmentacji i rozsypują się na drobne struktury, których liczba odpowiada liczbie obszarów jąderkotwórczych. Badania, w których analizowano liczbę i wielkość jąderek w spermatocytach ptaków, potwierdzają odmienny proces zaniku jąderek. U ptaków reorganizacja chromatyny podczas profazy pierwszego podziału mejotycznego i związana z tym procesem zmiana rozmiarów jądra komórkowego jest skorelowana ze 9

11 zmniejszającymi się rozmiarami jąderek. Na początku profazy, we wczesnym leptotenie, jąderka są widoczne jako duże owalne struktury, natomiast pod koniec profazy są obserwowane jako niewielkie punkty związane z określonymi biwalentami. Jąderka charakteryzują się dużym polimorfizmem, a ich aktywność zmienia się w zależności od gatunku, typu komórki, stopnia jej zróżnicowania oraz fazy cyklu komórkowego (Derenzini i in., 2005). Morfologia i ultrastruktura jąderka jest zmienna w zależności od gatunku, typu komórki, stopnia zróżnicowania a także cyklu komórkowego. Komórki młode mają jąderka gładkie. W miarę starzenia się organizmu, kształt jąderka staje się nieregularny. Jąderko zmienia się także w odpowiedzi na różne stany fizjologiczne jak i patologiczne (Shaw i Jordan, 1995; Raška i in., 2004, 2006; Lam i in., 2005). W komórkach macierzystych jąderka są małe i liczne natomiast w komórkach proliferujących duże i nieliczne. W końcowym stadium różnicowania jąderka łączą się w pojedynczą strukturę (Olson i in., 2002). Ponadto, na morfologię jąderek mają także wpływ epigenetyczne mechanizmy działające na poziomie metylacji DNA. Geny kodujące rrna istnieją w formie aktywnej transkrypcyjnie i nieaktywnej transkrypcyjnie. Wyciszaniu mogą ulegać całe rejony NOR lub tylko niektóre geny organizatorów jąderka. Prawdopodobnie głównym mechanizmem regulującym aktywność NOR są procesy epigenetyczne. Starzenie powoduje dezintegrację jąderek. Wybór spermatocytów do badań nie był wyborem przypadkowym. W spermatocytach pierwszego rzędu jąderka są wyjątkowo duże, łatwe w identyfikacji i opisie. Metylacja DNA ma wpływ na morfologię jąderek. Od niej zależy konformacja genów kodujących rrna. Może być aktywna transkrypcyjnie, nazywana otwartą lub zamknięta, co jest związane z załamaniem transkrypcji(grumt i Pikaard, 2003; Staub i in., 2004). Wyciszenie genów rrna na drodze nadmiernej metylacji powoduje dezintegracje jąderek, która jest objawem starzenia się organizmu. Starzenie na poziomie komórkowym i morfologia jąderek są także procesami skorelowanymi. 5. Podsumowanie Analiza struktury jąderek, produktów regionów jąderkotwórczych, może być alternatywnym źródłem informacji na temat aktywności genów kodujących rrna. Ponadto jąderka ulegają degradacji dopiero pod koniec profazy. Można je łatwo zidentyfikować stosując rutynowe techniki cytogenetyczne. Analiza struktury jąderek może być prowadzona w standardowym mikroskopie świetlnym. Jąderko jest strukturą jądra komórkowego związaną przede wszystkim z biogenezą rybosomów i pośrednio odpowiedzialną za biosyntezę białek. W ciągu ostatnich kilku lat rozwój badań epigenetycznych ujawnił dodatkowe, równie istotne funkcje jąderka. Jest ono zaangażowane w najbardziej krytyczne dla organizmu procesy, takie jak starzenie na poziomie komórkowym i osobniczym oraz szeroko pojęty proces kancerogenezy. W związku z powyższym, jąderko od ponad stu lat jest przedmiotem zainteresowania nauk podstawowych i stosowanych. Coraz powszechniej podstawowe badania genetyczne i cytogenetyczne są rozszerzane o badania ewolucyjne, głównie dotyczące ewolucji genomów. 10

12 Jąderka mogą być z powodzeniem wykorzystywane w cytogenetycznych badaniach dotyczących procesów starzenia i zmian w strukturach komórkowych zachodzących na skutek starzenia się organizmów. Obecnie wielu naukowców traktuje poziom metylacji, jako wskaźnik wieku lub narzędzie do przewidywania długości życia. Nieprawidłowa metylacja może prowadzić do przedwczesnego starzenia się. Metylacja cytozyny stanowi bardzo dobry marker w badaniach nad ekspresją genów w zależności od wieku. 6. Piśmiennictwo 1. Arabi A., Wu S., Ridderstrale K., Bierho V.H., Shiue C., Fatyol K., Fahlen S., Hydbring P., Soderberg O., Grummt I., Lar on L.G., Wright A.P c-myc associates with ribosomal DNA and activates RNA polymerase I transcription. Nature Cell Biology, 7: Bartova E., Harnicarova-Horakova H., Uhlirova R., Raska I., Galiova G., Orloga D., Kozubek S Structure and Epigenetics of Nucleoli in Comparison With Non- nucleolar Compartments. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry, 58: Berrios S., Fernandez-Donoso R., Pincheira J., Page J., Manterola M., Cristina Cerda M Number and nuclear localization of nucleoli in mammalian spermatocytes. Genetica, 121: Biggiogera M., Kaufmann S.H., Shaper J.H., Gas N., Amalric F., Fakan S Distribution of nucleolar proteins B23 and nucleolin during mouse spermatogenesis. Chromosoma, 100: Boisvert F.M., van Koningsbruggen S., Navascués J., Lamond A.I The multifunctional nucleolus. Nature Reviews. Molecular Cell Biology, 8: Delany M.E., Robinson C.M., Goto R.M., Miller M.M Architecture and organization of chicken microchromosome 16: Order of the NOR, MHC-Y, and MHC-B Subregions. The Journal of Heredity, 100: Derenzini M., Pession A., Trere, D Quantity of nucleolar silver-stained proteins is related to proliferating activity in cancer cells. Laboratory Investigation, 63: Derenzini M., Pasquinelli G., O Donohue M.F., Ploton D., Thiry M Structural and functional organization of ribosomal genes within the mammalian cell nucleolus. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry, 54: Di Mario P.J Cell and molecular biology of nucleolar biology of nucleolar assembly and disassembly. International Review of Cytology, 239: Evans E.P., Breckon G., Ford C.E An airdrying method for meiotic preparation from mammalian testes. Cytogenetics, 15: Fawcett D.W., Eddy E.M., Phillips D.M Observations on the fine structure and relationships of the chromatoid body in mammalian spermatogenesis. Biology of Reproduction, 2: Gerbi S.A., Borovjagin A.V., Lange T.S The nucleolus: A site of ribonucleoprotein maturation. Current Opinion in Cell Biology, 15: Gonzalez I.L., Sylwester J.E Beyond Ribosomal DNA: on towards the telomere, Chromosoma, 105: Grummt I., Pikaard C.S Epigenetic silencing of RNA polymerase I transcription. Nature Reviews. Molecular Cell Biology, 4: Haraguchi C.M., Mabuchi T., Hirata S Chromatoid bodies: aggresome-like characteristics and degradation sites for organelles of spermiogenic cells. Journal of Histochemistry and Cytochemistry, 53:

13 16. Hernandez-Verdun D Structural Organization of the Nucleolus as a Consequence of the Dynamics of Ribosome Biogenesis. W: The Nucleolus. Red. Olson M.O.J., Springer New York Dordrecht Heidelberg London; Springer Science+Business Media. 17. Hiscox J.A Brief review: The nucleolus a gateway to viral infection? Archives of Virology, 147: Hiscox, J.A The interaction of animal cytoplasmic RNA viruses with the nucleus to facilitate replication. Virus Research, 95: Horky M., Kotala V., Anton M., Wiesierska-Gadek J., Nucleolus and apoptosis, Cell signaling, transcription, and translation as therapeutic targets. Annals of the New York Academy of Science, 973: Howell W.M., Black D.A Controlled silver-staining of nucleolus organizer regions with a protective colloidal developer a 1-step method. Experientia, 36: Khurts S., Masutomi K., Delgermaa L., Arai K., Oishi N., Mizuno H., Hayashi N., Hahn W.C., Murakami S Nucleolin interacts with telomerase. The Journal of Biological Chemistry, 279: Kłyszejko-Stefanowicz L Cytobiochemia: biochemia niektórych struktur komórkowych. PWN, Warszawa. 23. Kotaja N., Sassone-Corsi P The chromatoid body: a germ-cell-specific RNA- processing centre. Nature Reviews Molecular Cell Biology, 8: Lam Y.W., Trinkle-Mulcahy L., Lamond A.L The nucleolus. Journal of Cell Science, 118: Lefèvre B The nucleolus of the maternal gamete is essential for life. BioEssays, 30: Lukowiak A.A., Narayanan A., Li Z.H., Terns R.M., Terns M.P The snorna domain of vertebrate telomerase RNA functions to localize the RNA within the nucleus. RNA, 7: Mc Stay B., Grummt I The epigenetics of rrna genes: from molecular to chromosome biology. Annual Review of Cell Biology, 24: Mosgoeller W., Nucleolar ultrastructure in vertebrates. W: The Nucleolus. Red. Olson M.O.J., Kluwer, New York, USA. 29. Muscarella D.E., Vogt V.M., Bloom S.E The ribosomal RNA gene cluster in aneuploid chicken: evidence for increased gene dosage and regulation of gene expression. The Journal of Cell Biology 101: Nafe R., Schlote W Histomorphometry of brain tumours. Neuropathology and Applied Neurobiology, 30: Olson M.O The nucleolus. Kluwer Academic Plenum Publisher, London. 32. Olson M., Dundr M The moving part of the nucleolus. Histochemistry and Cell Biology, 123: Olson M.O., Hingorani K., Szebeni A Conventional and nonconventional roles of the nucleolus. International Review of Cytology, 219: Oskarsson T., Trumpp A The Myc trilogy: Lord of RNA polymerases. Nature Cell Biology, 7: Peruquetti R.L., Assis I.M., Taboga S.R., de Azeredo-Oliveira M.T.V Meiotic nucleolar cycle and chromatoid body formation during the rat (Rattus novergicus) and mouse (Mus musculus) spermiogenesis. Micron, 39: Peruquetti R.L., Taboga S.R., de Azeredo-Oliveira M.T.V Characterization of Mongolian gerbil chromatoid bodies and their correlation with nucleolar cycle during spermatogenesis. Reproduction in Domestic Animals, 45: Peruquetti R.L., Taboga S.R., de Azeredo-Oliveira M.T.V Morphological Changes 12

14 of Mammalian Nucleoli during Spermatogenesis and Their Possible Role in the Chromatoid Body Assembling. ISRN Cell Biology, Article ID Pikaard C.S Transcription and tyranny in the nucleolus: the organization, activation, dominance and repression of ribosomal RNA genes. W: The Arabidopsis Book. Red. Somerville C.R., Meyerowits E.M., American Society of Plant Biologists, Rockville, USA. 39. Pollock D.L., Fechheimer N.S The chromosomes of cockerels (Gallus domesticus) during meiosis. Cytogenetics and Cell Genetics, 21: Prieto J.L, McStay B Nucleolar biogenesis: the first small steps. Biochemical Society Transactions, 33: Raška I., Koberna K., Malinsk J., Fidlerova H., Masata M The nucleolus and transcription of ribosomal genes. Biology of the Cell, 96: Raška I., Shaw P.J., Cmarko D New Insights into Nucleolar Architecture and Activity. Int. Rev., Cytol. 225: Reunov A., Isaeva V., Au D., Wu R Nuage constituents arising from mitochondria: is it possible? Development Growth and Differentiation, 42: Rubbi C.P., Milner J Disruption of the nucleolus mediates stabilization of p53 in response to DNA damage and other stresses. The EMBO Journal, 22: Ryan K.M., Phillips A.C., Vousden K.H Regulation and function of the p53 tumor suppressor protein. Current Opinion in Cell Biology, 13: Santoro R., Grummt I Molecular mechanisms mediating methylation dependent silencing of ribosomal gene transcription. Molecular Cell, 8: Scheer U., Hock R Structure and function of the nucleolus. Current Opinion in Cell Biology, 11: Shaw P.J, Jordan E.G The nucleolus. Annual Review of Cell and Developmental Biology, 11: Staub E., Fiziev P., Rosenthal A., Hinzmann B Insights into the evolution of the nucleolus by an analysis of its protein domain repertoire. Bioessays 26: Takeuchi I.K., Takeuchi Y.K Ethanol-phosphotungstic acid and bismuth staining of spermatid nucleoli in mouse spermiogenesis. Journal of Structural Biology, 103: Teruel M., Cabrero J., Perfectti F., Camacho J.P.M Nucleolus size variation during meiosis and NOR activity of a B chromosome in the grasshopper Eyprepocnemis plorans. Chromosome Research, 15: Ünal E., Kinde B., Amon A Gametogenesis eliminates age-induced cellular damage and resets life span in yeast. Science, 332: Wachtler F., Stahl A The nucleolus: a structural and functional interpretation. Micron, 24:

15 5. Omówienie pozostałych osiągnięć naukowo-badawczych Poza tematyką związaną ze strukturą jąderek w komórkach mejotycznych, prowadzone przeze mnie badania dotyczyły szeroko pojętej cytogenetyki zwierząt gospodarskich. Istotną część mojego dorobku naukowego stanowi charakterystyka chromosomów mitotycznych i mejotycznych u różnych gatunków zwierząt gospodarskich. Analiza niestabilności genomu została także podejmowana w ramach struktury chromosomów i jej wpływu na użytkowość zwierząt. Badanie prowadzone we współpracy z Katedrą Biologicznych Podstaw Produkcji Zwierzęcej Uniwersytetu Przyrodniczego w Lublinie dotyczą metylacji genomu i wybranych ptasich genów. Podejmowane przeze mnie tematy dotyczą także struktury chromatyny plemnika, w szczególności w aspekcie modyfikacji epigenetycznych. Publikacje interdyscyplinarne są natomiast owocem współpracy z jednostkami naukowymi w obrębie Wydziału Przyrodniczego Uniwersytetu Przyrodniczo-Humanistcznego w Siedlcach oraz jednostkami z innych polskich uczelni. Pozostałe osiągnięcia naukowo-badawcze zostaną przedstawione wg następującego układu. a. Charakterystyka chromosomów mitotycznych i mejotycznych. a.1 Genom a.2 Chromosomy mitotyczne a.3 Chromosomy mejotyczne a.4. Telomery b. Analiza niestabilności chromatyny c. Struktura chromatyny plemnika d. Metylacja e. Badania interdyscyplinarne a. Charakterystyka chromosomów mitotycznych i mejotycznych Publikacje przedstawione w tym rozdziale dotyczą analizy genomu ptaków oraz struktury mitotycznych i mejotycznych chromosomów wybranych gatunków zwierząt gospodarskich. Szczególnym typem chromosomów mejotycznych są opisane tutaj chromosomy szczoteczkowe. a.1. Genom Terminem genom określa się pełny komplet chromosomów i wszystkie zlokalizowane w nich geny. Ponieważ różne komórki tego samego organizmu mogą mieć różny poziom ploidalności, wielkość genomu zawsze odnosi się do haploidalnego zestawu chromosomów. Genom definiowany jako całkowita wielkość DNA zawartego w haploidalnym zestawie chromosomów określany jest liczbą par zasad (pb). Rozmiar tak definiowanego genomu można wyrazić także wielkością fizyczną masą DNA określaną, jako C-DNA (1C) i wyrażaną w pikogramach (pg). C odnosi się do słowa constans lub characteristic. Na tle innych gatunków ptaków najlepiej poznany jest genom kury domowej Gallus domesticus. Opublikowanie pełnej sekwencji genomu kury wskazało istnienie rejonów syntenicznych między genomem człowieka i ptaka, wskazujących, że pomimo 300 milionów lat 14

16 ewolucyjnego rozdzielenia ssaków i ptaków wiele sekwencji DNA zachowało swój konserwatyzm. Genom ptaków stanowi około jednej trzeciej genomu człowieka i jest jednym z najmniejszych wśród kręgowców. Najliczniejszą grupę kręgowców stanowią ptaki i paradoksalnie to ich genom jest najmniej poznany. Celem prac (II.A.1 i II.D.6) było ustalenie ilości C-DNA zawartego w jądrach komórek różnych tkanek gęsi domowej Anser anser (serce, płuco, skóra, trzustka, nerki, śledziona, wątroba, mózg, krew, jajnik i jądro). Materiał referencyjny stanowił preparat wykonany z krwi kury. Średnią zawartość C-DNA u Anser anser ustalono na poziomie 1,306 pg. Stwierdzono wysoki stopień zróżnicowania zawartości jądrowego DNA w analizowanych tkankach, ponad 25 %. Minimalną zawartość C-DNA stwierdzono w komórkach serca (0,471 pg), maksymalną zawartość C-DNA w komórkach jajnika (2,256 pg). Przeważająca liczba (ponad 57 %) jąder komórkowych wszystkich analizowanych tkanek charakteryzowała się zawartością C-DNA na poziomie od 1 do 1,5 pg. Na podstawie uzyskanych wyników stwierdzono, że zawartość jądrowego DNA jest dodatnio wysoko skorelowana z powierzchnią jądra komórkowego. Najniższym współczynnikiem korelacji charakteryzował się tkanka skórna (0,601), najwyższym komórki jajnika (0,920). Dla wszystkich analizowanych tkanek współczynnik korelacji oszacowano na poziomie 0,736. a.2. Chromosomy mitotyczne Celem pracy (II.A.2) było ustalenie wzoru prążków G na wybranych chromosomach gęsi domowej Anser anser. Na podstawie analizy wyników barwienia GTG stwierdzono, że na wszystkich analizowanych chromosomach obszary subcentromerowe ramion p i q oraz obszary telomerowe są pozbawione prążków pozytywnych. Świadczą o tym wyraźne jasne (negatywne) prążki obserwowane we wspomnianych obszarach chromosomów. Na analizowanych chromosomach zidentyfikowano czterdzieści osiem prążków pozytywnych (prążków G). W wyniku zastosowania barwienia GTG ustalono wzór prążków G na pierwszych ośmiu autosomach oraz chromosomach Z,W i sporządzono cząstkowy ideogram chromosomów gęsi domowej. Chromosomy mitotyczne gęsi domowej były także charakteryzowane w pracach (II.D.4) i (II.D.11). W pracy (II.D.4) porównano kariotyp gęsi domowej pochodzenia europejskiego Anser anser i azjatyckiego Anser cygnoides pod względem lokalizacji bloków heterochromatyny. Stwierdzono zróżnicowaną dystrybucję heterochromatyny konstytutywnej w chromosomach czwartej pary i chromosomach płci. Celem pracy (II.D.11) była identyfikacja prążków T oraz obszarów subtelomerowych w chromosomach gęsi domowej. Prążki T stanowią podzespół prążków R, wyjątkowo odporny na wysoką temperaturę. W ich obrębie występuje duże nasycenie par C-G. Ponadto prążki T są rejonami chromosomów o wysokiej zawartości genów, nawet w porównaniu z prążkami R. W wyniku zastosowania barwienia T stwierdzono obecność prążków na wszystkich analizowanych chromosomach. Na chromosomach submetacentrycznych prążki telomerowe obserwowano w obrębie obu ramion. Na akrocentrycznym chromosomie trzeciej pary oraz chromosomach płci Z i W można je było wyróżnić tylko na chromosomach metafazowych, jeszcze nie podzielonych na chromatydy. Na akrocentrycznej piątej parze chromosomów stwierdzono obecność prążka tylko w dystalnej części ramienia q. Na skutek wydłużonej inkubacji preparatów w gorącym 15

17 buforze PBS stwierdzono degradację rejonu subtelomerowego na wszystkich analizowanych chromosomach. Zdegradowany rejon subtelomerowy obserwowano w obrębie dystalnych części obu ramion chromosomów submetacentrycznych oraz na ramieniu q chromosomów akrocentrycznych. Innym gatunkiem drobiu wodnego stanowiącym materiał badawczy były kaczki (II.D.1). W pracy zidentyfikowano obszary jąderkotwórcze w chromosomach kaczorów piżmowych. Obecność aktywnych NOR stwierdzono w terminalnych częściach czterech pierwszych par autosomów. Aktywne obszary jąderkotwórcze występowały na chromosomach z różną częstotliwością. Różna była też intensywność wysrebrzania się NOR na chromosomach homologicznych. Chociaż głównym tematem badań cytogenetycznych były chromosomy ptaków, charakterystykę kariotypu prowadzono także na innych gatunkach zwierząt gospodarskich. Obiektem badań były miedzy innymi koza (II.A.5), owca (II.D.2) i koń (II.D.10). W pracy (II.A.5) przeprowadzono badania, których celem było ustalenie liczby i lokalizacji aktywnych NOR na chromosomach mitotycznych, ustalenie liczby i rodzaju AS oraz określenie liczby jąderek w mejotycznych komórkach samców kozy polskiej białej uszlachetnionej. Zastosowanie techniki barwienia chromosomów roztworem AgNO 3 ujawniło aktywne obszary jąderkotwórcze w terminalnych częściach ramion q chromosomów par 2., 3., 4., 5., i 28. W ogólnej liczbie 80 analizowanych komórek stwierdzono 580 aktywnych NOR. Aktywny NOR najczęściej obserwowano chromosomach par 2. i 3., najrzadziej na chromosomach pary 5. W ogólnej liczbie 80 analizowanych komórek zaobserwowano 102 asoscjacje satelitarne. AS występowały najczęściej w komórkach posiadających 7 aktywnych NOR, natomiast najrzadziej w komórkach posiadających 3 lub 4 obszary jąderkotwórcze. Najczęściej w AS obserwowano udział chromosomów par 2. i 3. oraz chromosomów pary 28. Na chromosomach mejotycznych barwienie roztworem AgNO 3 ujawniło we wszystkich analizowanych komórkach dwa jąderka, z których jedno zawsze wybarwiało się mocniej, a drugie słabiej. Oba jąderka w komórce były takiej samej wielkości. W pracy (II.D.2) opisano kariotyp owcy domowej oraz sporządzono kariogram dla tego gatunku. Celem pracy (II.D.10) była charakterystyka kariotypu konia domowego pod względem markerów chromosomowych bloków chromatyny konstytutywnej oraz obszarów jąderkotwórczych. Prążki C w chromosomach konia zidentyfikowano w rejonach centromerowych wszystkich badanych chromosomów, z wyjątkiem jedenastej pary. Na chromosomie płci X, oprócz proksymalnego prążka C, obserwowano dodatkowy prążek w części interstycjalnej ramienia q. Chromosom Y był w 44% heterochromatynowy. Aktywne NOR zidentyfikowano w terminalnych częściach ramienia pierwszej pary chromosomów oraz w subcentromerowej części ramienia q par 28. i 31. Średnia liczba NOR w komórce wynosiła 3,61±1,03. Najczęściej obserwowano komórki posiadające trzy lub cztery aktywne NOR. a.3. Chromosomy mejotyczne Analizę cytogenetyczną u drobiu ogranicza charakterystyczna dla ptaków duża liczba diploidalna oraz obecność mikrochromosomów. Standardowe metody analizy chromosomów nie pozwalają na identyfikację mikrochromosomów. W związku z tym stosuje się alternatywne metody polegające na analizie chromosomów mejotycznych. Proces mejozy jest zazwyczaj obserwowany u osobników męskich, ponieważ spermatocyty są stosunkowo małe 16

18 jest ich dużo i są łatwo dostępne. Najczęściej chromosomy mejotyczne analizowane są w komórkach będących w pachytenie i diplotenie pierwszego podziału mejotycznego. Komórki charakterystyczne dla drugiego podziału mejotycznego występują nielicznie. W pracy (II.A.3) przedstawiono przebieg mejozy w spermatocytach gęsi, ze szczególnym zwróceniem uwagi na pierwszą profazę mejozy, fazę podczas której dochodzi do crossing over, procesu gwarantującego zmienność rekombinacyjną organizmów. Zaprezentowane wyniki są jedynym w dostępnym piśmiennictwie studium dotyczącym mejozy u ptaków i można je z powodzeniem traktować nie tylko, jako materiał aplikacyjny w zakresie cytogenetyki i biologii rozrodu ptaków, ale również jako pomoc w procesie dydaktycznym. Badania struktury chromosomów mejotycznych rozszerzono o analizę kompleksów synaptonemalnych. Kompleks synaptonemalny (SC) jest białkową strukturą, która łączy homologi podczas profazy I podziału mejotycznego i zapewnia prawidłowy przebieg rekombinacji genetycznej. Celem pracy (II.A.4) było uwidocznienie i identyfikacja kompleksów synaptonemalnych u gęsi domowej. Zastosowanie standardowych technik identyfikacji SCs nie umożliwia analizy ich molekularnej struktury. W mejotycznych komórkach jednodniowych piskląt i 17 tygodniowych osobników o obecności kompleksów symaptonemalnych można wnioskować na podstawie haploidalnej liczby biwalentów oraz ciemno wybarwionych kinetochorów i rejonów subtelomerowych. Eksperymentalne barwienie chromosomów fluorohromem DAPI pozwoliło zaobserwować charakterystyczną drabinkową strukturę SCs oraz przebieg tworzenia synapsis w obrębie homologów, od leptotenu aż po degradacje w późnym pachytenie. Szczegółowa molekularna struktura kompleksu synaptonemalnego może być analizowana jedynie przy użyciu mikroskopu elektronowego lub skaningowego. W dostępnej literaturze obecność biwalentów jest jednoznaczna z określeniem kompleks synaptonemalny z uwagi na fakt, iż biwalent jest bezpośrednim skutkiem istnienia kompleksu synaptonemalnego. Jednak biwalent i kompleks synaptonemalny to dwie odmienne struktury. Tematyka kompleksów synaptonemalnych była także podejmowana w rozdziale monografii (II.E.1) oraz w pracy przeglądowej (II.D.7). We wspomnianych pracach zwrócono uwagę na specyfikę formowania kompleksów synaptonemalnych. Opisano w nich także proces formowania biwalentu płciowego Kompleks synaptonemalny u organizmów wyższych rozpoczyna swoje formowanie od rejonów telomerowych i wydawać by się mogło, że również u ptaków, jako pierwsze synapsis utworzą krótsze mikrochromosomy. Jednak w komórkach ptaków pierwsze kompletne synapsis osiągają makrobiwalenty. Zjawisko to tłumaczy specyficzny charakter genomu ptaków, który w przeciwieństwie do ssaków, jest obdarzony znaczną liczbą sekwencji telomerowych w interstycjalnych miejscach ramion chromosomów. Występowanie interstycjalne położonych sekwencji telomerowych na makrochromosomach wiąże się ze zwiększeniem liczby miejsc inicjacji formowania się SC, co tłumaczy szybsze osiągniecie synapsis. W biwalentach akrocentrycznych istnieją dwa potencjalne miejsca inicjacji, które znajdują się dystalnej i proksymalnej części ramienia q. Krótkie ramiona p ulegają parowaniu znacznie później. Chromosomy płciowe ptaków są w większości upakowane w postaci euchromatyny z pominięciem regionów centromerowych i całego krótkiego ramienia chromosomu W. Podczas pachytenu osie chromosomów Z i W tworzą biwalent połączony kompleksem 17

19 synaptonemalnym, rozciągającym się wzdłuż całej osi chromosomu W. Nieco później niesparowany odcinek ramienia Z zaczyna się wyraźnie skracać (od wczesnego do połowy pachytenu) tworząc strukturę serpentynopodobną tak, aby osiągnąć długość elementów lateralnych uformowanego SC. W ten sposób ramię Z skręca się, tworząc pętlę wokół prostego ramienia W, wskazującą na rozmiar niehomologicznego parowania się tych chromosomów w tym rejonie. Szczególnym typem chromosomów mejotycznych są chromosomy szczoteczkowe. W monografii (II.D.5) oraz w pracy przeglądowej (II.D.12) przedstawiono szczegółowe studium na temat struktury i funkcji chromosomów szczoteczkowych. Chromosomy szczoteczkowe, występujące w rozwijających się oocytach dojrzałych płciowo samic, ze względu na swoje rozmiary i strukturę stanowią bogate w detale obiekty analizy cytogenetycznej. Ich długość dzięki dekondensacji chromatyny rośnie i waha się w granicach 400 do 800 m, dzięki czemu są nawet do 30 razy większe niż chromosomy mitotyczne. Pojęcie chromosomów szczoteczkowych (lampbrush chromosomes - LBCs) wprowadził Ruckert w 1892 roku. Nazwa wzięła się stąd, że porównał je do szczotek wykorzystywanych do czyszczenia lamp ulicznych w XIX wieku. Chromosomy szczoteczkowe są mało poznanymi strukturami. Nieznany jest zarówno dokładny mechanizm tworzenia się tych form chromosomów z ich małych form mitotycznych, jak również ich funkcja w oocycie. Wiadomo, że są przejściowymi strukturami obecnymi podczas pierwszego podziału mejotycznego w przedłużonej fazie diplotenu. Wywodzą się z niewielkiej telofazowej formy z końca ostatniej oogonialnej mitozy, skąd wchodząc w stadium diplotenu pierwszego podziału mejotycznego przechodzą gwałtowną dekondensację prowadzącą do powstawania bardzo dużych struktur chromosomów. Chromosom szczoteczkowy we wczesnej profazie jest biwalentem złożonym z dwóch koniugujących homologów, stając się ostatecznie tetradą. Oś każdego z chromosomów homologicznych stanowią dwie helisy DNA (chromatydy siostrzane). Każda nić zawiera dużą liczbę rejonów skondensowanej chromatyny (są to chromomery widoczne w postaci ciemno zabarwionych nieregularnych struktur widocznych także w jądrze interfazowym) poprzedzielanych pętlami bocznymi chromatyny zdekondensowanej. W homologicznych odcinkach biwalentu chromatyna jest w stanie kondensacji (spiralnie zwinięta) lub zdekondensowana w postaci pętli bocznych po dwie dla każdego chromosomu, a cztery na poziomie biwalentu. Pętla stanowi część osi chromosomu, ma zdolność rozciągania się i kurczenia. Rutynowa analiza chromosomów mitotycznych umożliwia jedynie charakterystykę ich morfologii. Aktywność transkrypcyjną genów można oceniać tylko metodami molekularnymi polegającymi na detekcji ilości produkty transkrypcji. Aktywność transkrypcyjna chromosomów szczoteczkowych widoczna jest już w mikroskopie świetlnym i można ją oceniać na podstawie zmian w budowie morfologicznej. W pracach (II.A.6) i (II.A.10) dokonano analizy aktywanosci transkrypcyjnej szczoteczkowych chromosomów gęsi przed i po sezonie reprodukcji. W badaniach aktywność transkrypcyjna chromosomów szczoteczkowych była analizowana na podstawie obecności pętli bocznych i struktur markerowych. W chromosomach szczoteczkowych zmiany aktywności transkrypcyjnej widoczne są, jako zmiany w budowie morfologicznej i zależą od procesów fizjologicznych komórki. Aktywność transkrypcyjna stwierdzana była na podstawie 18

20 obecności pętli bocznych na chromosomach oraz struktur markerowych po zastosowaniu standardowego barwienia chromosmów barwnikiem Coomasie Brillant Blue. Jest to najprostsza i najczęściej stosowana technika identyfikacji chromosomów szczoteczkowych. Analizę porównawczą prowadzono na podstawie obecności następujących struktur markerowych (GLLs giant lumpy loops, MLs marker loops, DBLs distal boundary loops, PBLs proximal boundary loops, TLs telomeric loops, TBLs telomeric bow-like loops, TLLs - telomeric lumpy loops, DBs double bridge, Chs chiasmata, PBs protein bodies. Odpowiednie biwalenty uzyskane przed i po reprodukcji posiadają zbliżoną wielkość, różnią się natomiast budową morfologiczną. Chromosomy szczoteczkowe uzyskane po okresie reprodukcji posiadają zredukowane pętle boczne będące miejscem intensywnej aktywności transkrypcyjnej, uwidaczniają się w nich natomiast nieaktywne chromomery. Struktury markerowe, takie jak duże pętle boczne (ML) oraz pętle telomerowe (T, TLL i GLL) są elementami, które najpóźniej ulegają degradacji po zakończonej reprodukcji i w związku z tym stanowią podstawę do identyfikacji poszczególnych biwalentów w różnych okresach aktywności transkrypcyjnej komórki. Inny obraz chromosomów uzyskanych od gęsi przed i po sezonie reprodukcji wynika ze zmiany aktywności transkrypcyjnej, która jest związana z procesami fizjologicznymi organizmu i uwidacznia się w budowie morfologicznej chromosomu. LBCs gęsi przed sezonem reprodukcyjnym charakteryzowały się dużymi pętlami bocznymi świadczącymi o aktywnej transkrypcji. Chromosomy uzyskane od gęsi pod koniec sezonu reprodukcji charakteryzowały się małymi pętlami bocznymi i widocznymi chromomerami, co jest związane z mniejszą aktywnością transkrypcyjną komórki. Porównanie aktywności transkrypcji na chromosomach uzyskanych od gęsi przed i po sezonie reprodukcji pozwoliło także ustalić, że chiazmy, PBs oraz struktury markerowe takie jak duże pętle boczne (ML) oraz pętle telomerowe (T, TLL i GLL) są strukturami, które najpóźniej ulegają degradacji po zakończonej reprodukcji. Celem pracy (II.A.9) było porównanie aktywności transkrypcyjnej chromosomów szczoteczkowych ze wzorem GTG odpowiednich chromosomów mitotycznych. Aktywne transkrypcyjnie rejony LBCs z dobrze wykształconymi pętlami bocznymi korespondowały z pozytywnymi prążkami G. Na chromosomach szczoteczkowych liczba wyznaczonych obszarów aktywnych transkrypcyjnie była większa niż analogicznych prążków G na odpowiadających im chromosomach mitotycznych. Wynika to z mniej skondensowanej struktury LBCs, która umożliwiła uzyskanie wzoru o wyższej rozdzielczości. Obserwowane dodatkowe prążki na LBCs odpowiadały lokalizacji szerokich pozytywnych prążków w wyznaczonych rejonach chromosomów mitotycznych, w związku z tym wzór prążków G i wzór aktywnych transkrypcyjnie rejonów LBCs uznano za analogiczny. Zespół naukowy Katedry Genetyki i Hodowli Koni jest jedyną w Polsce i jedną z nielicznych na świecie jednostką zajmującą się tematyką chromosomów szczoteczkowych. Mieliśmy zaszczyt przedstawienia wyników naszych badań na specjalnej sekcji poświęconej chromosomom szczoteczkowym, w ramach 18 Międzynarodowej Konferencji Cytogenetycznej w Manchester (II.D.37). 19

21 a.4. Telomery Tematyka telomerów była podejmowana zarówno w odniesieniu do chromosomów mitotycznych, jak i mejotycznych. Została przedstawiona w dwóch pracach przeglądowych (II.D.8) i (II.D.9). Telomery są dystalnymi częściami ramion chromosomów organizmów eukariotycznych. Odgrywają istotną rolę w utrzymaniu stabilności chromosomów i w replikacji zakończeń chromosomów. Telomery eukariontów mają podobna strukturę. Są to tandemowe powtórzenia motywu (TTAGGG)n. Sekwencje telomerowe odgrywają szczególne znaczenie w badaniach ewolucyjnych kariotypu ptaków. Ewolucja kariotypu ptaków rozpoczęła ok. 250 mln lat temu w erze triasu, jako skutek odseparowania się tych organizmów od gadów. Zainicjował się wówczas istotny proces akumulacja mikrochromosomów, które średnio stanowiły 12,4 Mb wielkości genomu. Pochodzenie mikrochromosomów opiera się na przypuszczeniach i teoriach. Początkowo uznawano, że były to chromosomy pierwotne, które tworzyły w wyniku fuzji makrochromosomy. Obecnie, na podstawie modelu rozpadu i fuzji uznano, iż przynajmniej 10 par mikrochromosomów jest wynikiem pęknięć makrochromosomów. Zlokalizowanie powtórzeń (TTAGGG)n w różnych częściach chromosomów znacznie różniących się gatunków ptaków może doprowadzić do odpowiedzi czy wysoce zmienna liczba mikro imakrochromosomów może mieć związek z telomerami. Telomery mogą być gubione lub mogą przyrastać podczas powstawania nowych gatunków w trakcie ewolucji gatunków. Silny konserwatyzm sekwencji telomerowej i jej obecność na telomerowych i nietelomerowych obszarach może być narzędziem, które umożliwia rekonstrukcję ewolucyjnych rearanżacji kariotypowych. b. Analiza niestabilności chromatyny Niestabilność chromosomowa jest terminem określającym wzrost liczby złamań i innych uszkodzeń chromosomów, w komórkach somatycznych badanej grupy w porównaniu z populacją kontrolną. Niestabilność chromatyny jest czynnikiem generującym powstawanie kolejnych mutacji, najczęściej dotyczących struktury chromosomów. Ich efektem są transformacje nowotworowe, wady rozwojowe, zamieralność embrionów, problemy w reprodukcji. Wyniki badań pozwalają zidentyfikować osobniki nadwrażliwe na czynniki genotoksyczne i opracowanie kryterium eliminowania ich z programów hodowlanych. Identyfikacja niestabilności chromatyny podczas embriogenezy oraz okresów przed, po i podczas reprodukcji u samców i samic, umożliwi identyfikowanie przyczyn zamieralności zarodków, obniżonej wylęgowości i reprodukcji. Niestabilność chromatyny, zarówno na poziomie DNA, jak i chromosomów metafazowych jest traktowana jako test wrażliwości populacji i wrażliwości indywidualnej na mutageny i może być stosowana jako element biomonitoringu populacji. W pracach (II.A.11), (II.A.12) oraz (II.A.15) analizowano wpływ niestabilności chromatyny na użytkowość drobiu. Celem pracy (II.A.11) była ocena częstotliwości wymian chromatyd siostrzanych SCE (ang. sister chromatyd exchange) w chromosomach kur zielononóżka kuropatwiana i polbar. Średnia liczba SCE na komórkę wynosiła 7,22 u zielononóżki i 8,43 u polbara. Wyższą średnią liczbę SCE obserwowano w grupie kur charakteryzujących się gorszą nieśnością w porównaniu do grupy kur wykazujących lepszą nieśność. Różnice były istotne 20

22 statystycznie. Dokonano również szczegółowej analizy występowania SCEs na chromosomie pierwszym, drugim i trzecim. Najwięcej SCEs zaobserwowano na chromosomie pierwszym, najmniej na trzecim. Najwięcej wymian zaobserwowano w proksymalnej części chromosomów. Praca (II.A.12) dotyczyła oceny częstości zachodzenia wymian chromatyd siostrzanych w chromosomach brojlerów z objawami chondrodystrofii w porównaniu ze zdrowa grupa kontrolną. Średnia liczba wymian na komórkę wynosiła 6,8. U kur z chondrodystrofią wartość ta kształtowała się na poziomie 8,5; u kur zdrowych 5,1. Stwierdzono istotne statystycznie różnice między obiema grupami kur. Wyższą średnią liczbę wymian obserwowano u samców niż u samic, odpowiednio 6,9 i 6,7. Różnice były jednak poniżej poziomu istotności. Określono częstość SCEs na trzech pierwszych parach chromosomów. Najwięcej SCEs zidentyfikowano w części proksymalnej chromosomu pierwszej pary. Badania prowadzone w ramach pracy (II.A.19) dotyczyły występowania niestabilności chromosomowych u przepiórki japońskiej. Niestabilność oceniano testem SCE oraz identyfikowano łamliwe miejsca chromosomów. Analizie poddano dwa pokolenia ptaków. W badanej populacji średnia częstość zachodzenia wymian chromatyd siostrzanych wynosiła 6.04±0.45 i miejsc łamliwych 1.17±0.79. W pracy zbadano zależność pomiędzy uzyskanymi wynikami z niestabilności chromosomów z wynikami cech reprodukcyjnych przepiórek. Stwierdzono korelacje pomiędzy niestabilnością chromosomów na poziomie 0,51-0,64 w pokoleniu F1 i 0,1-0,23 w pokoleniu F2. Metodą stosowaną w identyfikacji niestabilności chromosomów jest także test kometowy. Jego zastosowanie w analizach opisano w pracy przeglądowej (II.A.15). Jest to podstawowa metoda analizy stopnia fragmentacji DNA na skutek działania czynników genotoksycznych. Test kometowy polega na rozdziale elektroforetycznym DNA analizowanych komórek. Test kometowy umożliwia analizę kilku różnych modyfikacji DNA, przy stosunkowo niewielkich zmianach w podstawowej procedurze testu. Metoda ta identyfikuje jednoniciowe i dwuniciowe pęknięcia DNA oraz wszelkie modyfikacje chemiczne i enzymatyczne, które mogą się przekształcić w pęknięcia DNA lub chromatyd. Test kometowy daje możliwość detekcji uszkodzeń DNA na poziomie pojedynczej komórki. Mogą nim być analizowane dowolne tkanki, z których uzyskuje się zawiesinę komórkową. Analizowane komórki zatapia się w agarozie na szkiełku mikroskopowym. Po wytrawieniu białek pozostaje DNA. Szkiełko poddaje się elektroforezie i barwi substancją fluorescencyjną. Uzyskuje się obraz w postaci komet. Głowa to miejsce unieruchomienia komórki przed lizą, ogon to uszkodzone fragmenty DNA. Miarą poziomu uszkodzeń DNA jest długość ogona i ilość zawartego w nim DNA. Test kometowy znajduje zastosowanie w badaniach aplikacyjnych w toksykologii genetycznej, monitoringu naprawy DNA po chemioi radioterapii, ekotoksykologii, żywieniu zwierząt i człowieka, biomonitoringu genotoksyczności, epidemiologii, ocenie materiału deponowanego w bankach nasienia i bankach krwi. c. Struktura chromatyny plemnika Rozwój biologii, genetyki molekularnej oraz technologii umożliwia ujawnienie coraz większej różnorodności w strukturze plemnika. Ich poznanie umożliwia z kolei wykrycie i zrozumienie podłoża defektów plemnika, które w wielu przypadkach dotyczą zmian 21

23 jądrowego i mitochondrialnego DNA, a których widocznym efektem są plemniki o zmienionej budowie morfologicznej. Barwienie azotanem srebra jest techniką prostą, tanią, dającą szybki wynik. Azotan srebra umożliwia identyfikację zróżnicowanej budowy główki plemnika oraz wyraźną identyfikację wstawki plemnika. W efekcie może być z powodzeniem stosowany, jako uzupełnienie rutynowych technik oceny morfologii nasienia lub jako technika samodzielna. Celem tego nurtu badań było określenie przydatności barwienia azotanem srebra w ocenie morfologii i identyfikacji struktur plemnika. W pracy (II.A.8) badano plemniki izolowane z jąder i nasienia. Barwienie azotanem srebra umożliwiło identyfikację wielu istotnych szczegółów budowy morfologicznej plemnika i może być z powodzeniem stosowane w ocenie morfologii plemnika. Białka główki plemnika mają charakter zasadowy i w efekcie po zastosowaniu azotanu srebra część akrosomowa główki wybarwia się mniej intensywnie, niż część dystalna. Z barwienia azotanem srebra wynika, że chromatyna jądra plemnika ma inny skład w części akrosomowej, a inny w części dystalnej, w której zlokalizowane są białka o charakterze kwaśnym i jąderko, pozytywnie reagujące na sole srebra. Strukturą doskonale identyfikowalną azotanem srebra jest wstawka. Wstawka plemnika w 80% swojej objętości złożona jest z mitochondriów, które zapewniają optymalna ilość energii niezbędnej do ruchu plemników. Gdy defekty mitochondriów występują w dużej liczbie plemników prowadzą do obniżonej lub całkowitej niepłodności osobnika. Stosując barwienie azotanem srebra wykonano szczegółową analizę morfometryczną plemników pięciu gatunków zwierząt. W pracy (II.A.17) oceniano plemniki świni, dzika, kozy i sarny, w pracy zaakceptowanej do druku w czasopiśmie Medycyna Weterynaryjna poddano wnikliwej analizie plemniki konia domowego. Barwienie AgNO 3 zróżnicowało główkę plemnika na część akrosomową i dystalną. W obrębie witki wyraźnie odznaczała się wstawka. Takie zabarwienie umożliwiało wykonanie szczegółowych pomiarów (długość główki plemnika, szerokość główki plemnika, obwód główki plemnika, pole powierzchni główki, obwód i pole części akrosomowej główki plemnika, długość wstawki plemnika, długość witki plemnika oraz łączną długość plemnika). Na podstawie wyników pomiarów morfometrycznych obliczono również parametry budowy morfologicznej plemnika. Zastosowanie barwienia azotanem do oceny morfologii i morfometrii plemników i wykorzystanie klasycznego utrwalacza cytogenetycznego do przechowywania próbek nasienia zostało opatentowane (II.D.1). Plemnik jest przykładem jednego z najbardziej zróżnicowanych typów komórek, a chromatyna haploidalnego genomu plemnika różni się w istotny sposób od komórki somatycznej składem chemicznym, strukturą i funkcją. Chociaż struktura chromatyny plemnika ma znaczący wpływ na zapłodnienie i rozwój zarodka, nadal przeważnie do oceny jakości nasienia stosuje się rutynowe techniki barwienia, a ocena plemników najczęściej ogranicza się do wykrywania ich nieprawidłowej budowy morfologicznej. Większość wad plemników ograniczających ich możliwość do zapłodnienia jest jednak skutkiem nieprawidłowości spermatogenezy. Są to zmiany o charakterze molekularnym, cytogenetycznym i epigenetycznym, związane z nieprawidłową organizacją chromatyny. Zmiany epigenetyczne, takie jak modyfikacje histonów i metylacja DNA są ściśle związane z organizacją chromatyny plemnika. W tym nurcie główną rolę odgrywa protaminacja. Podczas spermiogenezy chromatyna plemnika podlega radykalnym zmianom, od stosunkowo 22

24 zdekondensowanej formy histonowej, do wyjątkowo skondensowanej konformacji zdeterminowanej przez protaminy. Ocena upakowania chromatyny w plemniku jest nie tylko wskaźnikiem prawidłowości spermatogenezy, ale także prawidłowości ojcowskiego genomu i epigenomu oraz wyznacznikiem wartości biologicznej plemników. W (II.A.16) pracy poddano ocenie plemniki buhaja izolowane z ogona najądrza, po zabarwieniu AB (aniline blue) i CMA3 (chromomycin A3). W wyniku barwienia AB określono udział plemników z prawidłową zawartością histonów i ze zbyt wysoką zawartością histonów, odpowiednio 98,6% i 1,4%. Zastosowanie CMA3 umożliwiło identyfikację plemników z prawidłowym upakowaniem chromatyny oraz plemników o niskiej kondensacji chromatyny powstałej na skutek nieprawidłowej protaminacji, odpowiednio 98,65% i 1,35%. Badania białek jądrowych w aspekcie niepłodności pozwalają zrozumieć, jak ważny jest wpływ prawidłowej struktury chromatyny na funkcje plemników. d. Metylacja Metylacja DNA jest biochemicznym procesem kontrolującym strukturę chromatyny. Przyłączenie grupy metylowej do cytozyny w obrębie wysp CpG skutkuje zmianami w aktywności transkrypcyjnej genów oraz zmianą struktury i konformacji chromatyny. Znakowany grupami metylowymi obszar, przekształca się w heterochromatynę, a ekspresja genów znajdujących się w tym regionie zostaje zahamowana. Metylacja DNA jest procesem niezmiernie dynamicznym. System rozmieszczenia grup metylowych jest różny w różnych okresach życia i w różnych typach komórek. Około 90% genów człowieka w wieku dojrzałam jest wyciszonych. Zaburzenia w regulacji metylacji DNA skutkują aktywacją onkogenów, inaktywacją genów - supresorów nowotworów oraz zaburzeniami stabilności chromatyny. Dotychczas prowadzone badania na drożdżach, nicieniach, muszkach owocowych i myszach potwierdziły zmiany w ekspresji genów podczas starzenia się organizmów. Opis procesu metylacji, jego znaczenia oraz sposobów detekcji zmetylowanej cytozyny przedstawiono w pracach przeglądowych (II.D.13), (II.D.14) i (II.D.15). Celem pracy (II.A.13) było określenie metylacji genu CDKN2B podczas rozwoju embrionalnego u kur rasy Polbar za pomocą techniki MSP (methylation-specyfic PCR). Gen CDKN2B (cyclin-dependent kinase inhibitor 2B) zlokalizowany jest na chromosomie Z u ptaków w locus bar wraz z czterema innymi genami: micro-rna 31 (mirna-31), methylthioadenosine phosphorylase (MTAP), tripartite motif 36 (TRIM36), oraz protein geranylgeranyltransferase type I, β subunit (PGGT1B). Wszystkie są odpowiedzialne za aktywność melaniny w melanocytach. Badania wykazały, że gen CDKN2B nie jest wyciszony w 6 i 12 dobie rozwoju embrionalnego kur Polbar. Jako jeden z pięciu genów odpowiedzialnych za aktywność melaniny w melanocytach, będąc w znacznym stopniu aktywny, może przyczyniać się do produkcji tego barwnika. W pracy (II.A.20) oceniano wzór upierzenia piskląt Polbar w ciągu pierwszego miesiąca po ich wylęgu i analizowano, czy istnieje związek między zmianą koloru upierzenia, a zmianami poziomu metylacji genu CDKN2B. Uzyskane wyniki wskazują, że zarówno pierwszego dnia po wykluciu i w wieku 22 tygodni cytozyna w zamplifikowanym fragmencie może być metylowana. Oznacza to, że w badanych okresach rozwoju gen jest w znacznym stopniu aktywny. Stwierdzono, że różnice w upierzeniu młodych kur i kogutów są najbardziej widoczne w pierwszym dniu po wykluciu. Wraz z wiekiem, wzór upierzenia staje się jednolity u samców i samic. 23

25 Badania metylacji DNA genu CDKN2B u kur Polbar wprowadzają informacje na temat epigenetycznych mechanizmów autoseksingu tego gatunku oraz ogólną wiedzę na temat działania mechanizmów epigenetycznych u ptaków. Powyższy gen nie jest wyciszony w badanych okresach, co może sprzyjać aktywnej produkcji melaniny w melanocytach, a tym samym różnicować kurki od kogutków w pierwszej dobie po wykluciu. W pracy (II.A.14) oceniano poziom globalnej metylacji DNA w zależności od etapu rozwoju zarodka. Określono zawartość 5 metylocytozyny w DNA w szóstym dniu inkubacji podczas oddychania omoczniowego oraz w osiemnastym dniu inkubacji w trakcie oddychania płucnego w zarodkach kur rasy Polbar. Wykazano wyraźną zależność między etapem rozwoju osobniczego, a globalnym poziomem 5-metylocytozyny w DNA. W przeprowadzonych badaniach stwierdzono istotny statystycznie wzrost poziomu metylacji DNA pomiędzy szóstą a osiemnastą dobą inkubacji. Metylowana cytozyna jest ważnym epigenetycznym czynnikiem regulującym aktywność genów odpowiedzialnych za proces różnicowania. e. Badania interdyscyplinarne Opisywane w tej części prace są efektem współpracy z pracownikami Instytutu Bioinżynierii i Hodowli Zwierząt, którego jestem pracownikiem. Badania dotyczące struktury mięśni wybranych gatunków bydła zostały opisane w publikacji (II.A.1). Wyniki analiz obejmujących zróżnicowanie populacji kaczek na podstawie polimorfizmu białek surowicy krwi przedstawiono w publikacji (II.D.3). Opracowanie dotyczące genetycznych uwarunkowań sprawności fizycznej u koni zostało przedstawione w formie artykułu przeglądowego (II.D.16). Wyniki analizy lęgów sokoła i papużki falistej utrzymywanych w prywatnych hodowlach ukazały się odpowiednio w pracach (II.D.17) i (II.D.18). Badania na temat porównania jakości jaj kur rasy Araukana i Zielononóżka kuropatwiana zostały opisane w publikacji (II.A.18). 24