Peptydy przeciwzakaźne neutrofili

Transkrypt

1 PRACA POGLĄDOWA Review Article Acta Haematologica Polonica 2009, 40, Nr 3, str JOANNA KOPEĆ-SZLĘZAK Peptydy przeciwzakaźne neutrofili Anti-infective neutrophil peptides Pracownia Immunofenotypowania, Zakład Diagnostyki Hematologicznej i Transfuzjologicznej, Instytutu Hematologii i Transfuzjologii, Warszawa Kierownik Pracowni Immunofenotypowania: Prof. dr hab. n. med. Joanna Kopeć-Szlęzak STRESZCZENIE Peptydy o własnościach przeciwzakaźnych są elementami układu odporności wrodzonej. Przeciwzakaźne peptydy neutrofili to małe kationowe białka bogate w cysteinę. W ziarnistościach neutrofili krwi obwodowej człowieka występują: defensyny α, katelicydyna i lipokalina w kompleksie z Ŝelatynazą. Te peptydy wykazują aktywność przeciw bakteriom Gram + i Gram oraz przeciw wirusom, a niektóre przeciw pasoŝytom. Ponadto wykazano związek poziomu stęŝenia defensyn z rozwojem cukrzycy, a takŝe zaobserwowano hamujące działanie katelicydyny na apoptozę neutrofili. Lipokalina natomiast działa bakteriostatycznie poprzez utrudnianie bakteriom dostępu do Ŝelaza w organizmie oraz jest zaangaŝowana w proces dojrzewania komórek hematopoetycznych linii erytroidalnej. SŁOWA KLUCZOWE: Peptydy przeciwzakaźne Neutrofile Defensyny-α Katelicydyna Lipokalina SUMMARY Antimicrobial peptides (AMPs) are components of the innate immune system. Anti-infective neutrophil peptides are small cationic and cysteine-rich antimicrobial molecules. Alfa defensins are abundant in polymorphonuclear leukocytes; the other antimicrobial peptides in neutrophils are catelicidin (LL-37) and lipocalin in complex with gelatinase. These peptides exhibit broad activity against Gram-positive and Gram negative bacteria and enveloped viruses. Additionally, alpha-defensins can suppress hepatic glucose production, cathelicidin suppresses neutrophil apoptosis. Lipocalin restricted growth of microorganisms in an iron dependent manner and is involved in red blood cell production in an autocrine fashion. KEY WORDS: Anti-infective peptides Neutrophils Defensins-α Cathelicidin Lipocalin WSTĘP Ziarnistości neutrofili zawierają peptydy o własnościach przeciwzakaźnych (ang. AMP Antimicrobial Peptides) i odgrywają istotną rolę we wrodzonej odpowiedzi immunologicznej na liczne patogeny pochodzące z mikroorganizmów. Peptydy przeciwzakaźne są bardzo starym ewolucyjnie elementem odporności wrodzonej; u czło-

2 586 J. KOPEĆ SZLĘZAK wieka są to defensyny i katelicydyna, oznaczana często jako LL-37 [1, 2]. Ponadto w ziarnach neutrofili stwierdzono występowanie lipokaliny (ang. NGAL- Neutrophil Gelatinase Associated Lipocalin), znanej takŝe pod nazwą lipokalina 2 (Lipocalin 2 - LCN2) [3]. Defensyny po raz pierwszy u człowieka zostały opisane przed 20 laty, jako peptydy o własnościach antybiotyków. Stwierdzono takŝe ich właściwości przeciwwirusowe; defensyny neutralizują równieŝ toksyny bakteryjne oraz modulują stan odporności organizmu zwiększając wrodzoną odporność na infekcje. Wykazują aktywność takŝe w procesach odporności adaptatywnej, wyraŝającą się oddziaływaniem na komórki immunokompetentne [4]. Katelicydyna to peptyd przeciwzakaźny, ale stwierdzono równieŝ jego działanie antyapoptotyczne na neutrofile [5]. Lipokalina neutrofili zwana takŝe syderokaliną, z uwagi na jej rolę w przenoszeniu jonów Ŝelaza Fe III, stanowi waŝny czynnik odporności wrodzonej w zwalczaniu infekcji bakteryjnych i uczestniczy w rozwoju komórek hematopoetycznych, głównie linii erytroidalnej [3]. Defensyny Defensyny są dzielone na dwie grupy: alfa i beta; w licznych pracach spotykane jest takŝe oznaczenie HNP (Human Neutrophil Peptide) dla defensyn alfa, HBD ((Human Beta Defensin) dla defensyn beta. Niektóre defensyny mogą działać jak chemokiny wykazując właściwości chemotaktyczne dla monocytów i niedojrzałych komórek dendrytycznych lub mogą indukować wytwarzanie chemokin [6]. W neutrofilach defensyny stanowią około 10% białek i wykazują szeroki zakres aktywności przeciwbakteryjnej, przeciwwirusowej i przeciw pasoŝytom. Obecnie znane są cztery postacie defensyn alfa, występujących jako stały składnik ziaren neutrofili krwi obwodowej u człowieka, a takŝe juŝ w komórkach prekursorowych linii mieloidalnej u człowieka. Defensyny w ziarnach obecne są w postaci nieaktywnej, a ich aktywacja następuje po usunięciu inhibitora w procesie proteolizy [4, 6]. Defensyny alfa 1 4 mogą występować takŝe w monocytach i limfocytach T CD8 (cytotoksycznych), gdzie są wytwarzane pod wpływem indukcji przez prozapalne cytokiny lub endotoksyny, pochodzenia bakteryjnego, głównie przez lipopolisacharydy (LPS) [6]. Stwierdzono, Ŝe u chorych z niedoborem ziaren w neutrofilach (tzw. zespół SDG Specific Granul Deficiency) defensyny nie występują i chorzy ci cierpią na liczne ostre infekcje bakteryjne. Defensyny z ziaren neutrofili równieŝ aktywują plazminogen pośrednicząc w ten sposób w procesie fibrynolizy, a takŝe działają mitogennie na fibroblasty [7]. Defensyny α są cząstkami o masie 3,5 4,0 kda mają 29 do 35 reszt aminokwasowych i trzy cysteinowe mostki wewnątrzmolekularne pomiędzy 1 6, 2 4 oraz 3 5 cysteiną. Formy defensyn róŝnią się pojedynczym aminokwasem na krańcu aminowym. Codziennie powstaje neutrofili/kg masy ciała i kaŝda taka porcja zawiera 10 mg defensyn. StęŜenie defensyn α wzrasta w miejscach procesów zapalnych, a w surowicy w infekcjach układowych. Geny dla defensyn α u człowieka są ulokowane

3 Peptydy przeciwzakaźne neutrofili 587 głównie w chromosomie 8p23.1, przy czym występuje polimorfizm genowy, a u 10% ludzi brakuje genu dla defensyny HNP3 [6]. Mechanizm szybkiego przeciwbakteryjnego działania defensyn oparty jest na depolaryzacji błony komórkowej bakterii, a następnie na utworzeniu otworów (por) w błonie komórkowej i wakuolizacji cytoplazmy, co doprowadza do autolizy komórki bakteryjnej [7]. Defensyny alfa mogą inaktywować niektóre wirusy: m.in. grypy, oraz wirusa HIV- 1. Mają one zdolność wiązania glikoprotein powierzchni komórek i wirusów włączając molekuły gp120 i CD4, co blokuje wnikanie wirusa HIV-1 do limfocytów T [8, 9]. Mechanizm obronny moŝe polegać równieŝ na hamowaniu replikacji wirusa poprzez zatrzymanie odwrotnej transkrypcji. Stwierdzono, Ŝe mechanizm ten jest zaleŝny od obecności surowicy [10]. Mechanizm neutralizacji adenowirusa przez defensyny alfa polega na zatrzymaniu uwalniania białka pvi z wewnętrznej otoczki białkowej (kapsydy) wirusa, która uczestniczy w procesie rozprzestrzeniania wirusa w zakaŝonej komórce [11]. W badaniach in vitro nad rolą defensyn alfa stwierdzono, Ŝe mogą one wykazywać efekt modulujący odporność komórkową poprzez aktywację molekuł kostymulacyjnych (np. CD28) na limfocytach T CD4 i CD80 i CD86 (na komórkach nabłonka płuc). Jednocześnie odnotowano wzrost adhezji pomiędzy tymi komórkami i uwalnianie IFN-gamma, IL-2 i IL-8 [12]. In vitro stwierdzono takŝe toksyczność ludzkiej defensyny alfa, przeciwko Trypanosoma cruzi, dzięki wytworzeniu por w błonie komórkowej i w błonie wici, a następnie wskutek zapoczątkowania fragmentacji DNA jądra komórkowego.w mikroskopie elektronowym zaobserwowano takŝe dezorganizację błony mitochondrialnej i pęcznienie mitochondriów. Jest to istotna, nowoodkryta rola defensyn alfa w przeciwpasoŝytniczej obronie organizmu [13]. Ostatnio, na podstawie badań u myszy, pojawiła się hipoteza, Ŝe defensyny hamują wytwarzanie glukozy w wątrobie poprzez szlak sygnalizacyjny inny niŝ insuliny, z udziałem m.in. Akt - kinazy seroninowo-treoninowej [14]. U człowieka defensyny beta nie występują w neutrofilach, ale są wytwarzane w monocytach i komórkach dendrytycznych mieloidalnych (mdcs) i plazmocytoidalnych (pdcs), m.in. po indukcji cytokinami prozapalnymi [15]. Defensyny beta mają jednakŝe wpływ na czas przeŝycia neutrofili, poniewaŝ stwierdzono, Ŝe defensyna HBD -3 hamuje ich apoptozę działając jako inhibitor na kaspazę -3 w szlaku apoptotycznym komórki [16]. Katelicydyna Katelicydyna to peptyd o własnościach antybakteryjnych, podobnie jak defensyny. Katelicydyna jest cząsteczką o masie 18 kda, oznaczana jest równieŝ symbolem LL37, a oznaczenie hcap-18- human Cationic Antimicrobial Protein dotyczy jej formy prekursorowej. Katelicydyna jest obecna w ludzkich neutrofilach w warunkach fizjologicznych, a takŝe moŝe być syntetyzowana pod wpływem działania czynników induk-

4 588 J. KOPEĆ SZLĘZAK cyjnych w monocytach, komórkach tucznych i w limfocytach T. Katelicydyna moŝe działać synergistycznie z defensynami i wykazuje dodatkowo aktywność angiogenną zarówno in vitro jak i in vivo. Katelicydyna w reakcjach odporności wrodzonej wywołuje degradację błony komórkowej patogenów. Ponadto peptydy pochodzące z cząsteczki katelicydyny wykazują równieŝ własności przeciwwirusowe i przeciwpasoŝytnicze [2, 17]. Katelicydyna jest takŝe inhibitorem apoptozy ludzkich neutrofili działając poprzez receptory związane z białkiem G. W procesie tym hamowana jest aktywność prokaspazy 3. Ponadto katelicydyna moŝe zmieniać równowagę białek z rodziny bcl-2 modyfikując w ten sposób proces apoptozy [5]. Katelicydyna wykazuje zdolność zapobiegania tworzenia biofilmu bakteryjnego przez Pseudomonas aeruginosa, m.in. wskutek zmniejszenia adhezji bakterii do podłoŝa [18]. Lipokalina Lipokalina to glikoproteina o masie cząsteczkowej 25 kda związana kowalentnie z metalloproteinazą (MMP-9) w ziarnistościach neutrofili człowieka. W piśmiennictwie anglojęzycznym występuje takŝe nazwa Neutrophil Gelatinase-Associated Lipocalin (NGAL). Lipokalina ma takŝe zdolność wiązania enterocheliny, nośnika o bardzo wysokimi powinowactwie do Ŝelaza. Podczas infekcji bakterie pobierają jony trójwartościowego Ŝelaza od ferrytyny, transferyny lub hemu organizmu gospodarza. W odpowiedzi na związany z infekcją niedobór Ŝelaza syntetyzowane są związki drobnocząsteczkowe, m.in. lipokalina, która poprzez ograniczanie dostępu do Ŝelaza bakteriom przeciwdziała ich namnaŝaniu. MoŜna zatem powiedzieć, Ŝe lipokalina działa jak naturalny bakteriostatyk [3]. Lipokalina ma takŝe swój udział w procesach hematopoezy. W badaniach in vitro stwierdzono, Ŝe lipokalina indukuje apoptozę i zatrzymuje dojrzewanie wczesnych komórek linii erytroidalnej w sposób autokrynny na zasadzie sprzęŝenia zwrotnego. Autorzy tych badań sądzą, Ŝe lipokalina moŝe stanowić nowy sposób leczenia niedokrwistości [19]. W przewlekłej białaczce szpikowej stwierdzono w okresie diagnozy wysoki poziom lipokaliny w surowicy krwi, a wzrost ten był równoległy do wzrostu ekspresji białka BCR-ABL [20, 21]. W innych badaniach wykazano wzrost poziomu lipokaliny w surowicy krwi u dorosłych (ale nie u dzieci) chorych na talasemię β, co autorzy tłumaczą udziałem lipokaliny w ochronnym działaniu przeciw toksyczności spowodowanej wolnymi rodnikami [22]. Ostatnio stwierdzono równieŝ, Ŝe w niektórych nowotworach, np. w raku piersi, występuje podwyŝszony poziom kompleksu: metaloproteinaza-9/lipokalina w moczu chorych [23]. U chorych w stanach ostrej niewydolności nerek brak jest miarodajnych markerów do jej wczesnego wykrywania. Okazało się, Ŝe poziom lipokaliny wzrasta na godzin przed obserwowanym wzrostem stęŝenia kreatyniny [24]. MoŜe to stanowić

5 Peptydy przeciwzakaźne neutrofili 589 podstawę dla nowej nieinwazyjnej metody monitorowania stanu choroby; konieczne jest jednak szczegółowe opracowanie metodyczne. Obecnie znane jest prawidłowe stęŝenie lipokaliny w surowicy, które wynosi 78,4 µg/l. Na podstawie przykładów z piśmiennictwa rysuje się moŝliwość oznaczania poziomu tego białka jako wczesnego wskaźnika uszkodzenia nerek w odpowiedzi na czynnik toksyczny, wykrywalnego jeszcze przed rozwinięciem się innych objawów niewydolności nerek [25]. Działanie przeciwgruźlicze peptydów neutrofili Peptydy neutrofili o własnościach przeciwzakaźnych wykazują aktywność przeciw prątkom gruźlicy [26] i ograniczają wzrost Mycobacterium tuberculosis. Stwierdzono, Ŝe ryzyko zakaŝenia gruźlicą jest odwrotnie proporcjonalne do liczebności neutrofili w krwi obwodowej. Endemia gruźlicy w niektórych krajach Afryki moŝe wiązać się z niŝszą liczbą neutrofili, a tym samym niŝszym stęŝeniem defensyn alfa i lipokaliny [27]. Mechanizm obrony organizmu przed bakteriami gruźlicy to m.in. fagocytoza apoptotycznych neutrofili przez makrofagi, czyli transfer peptydów o własnościach przeciwbakteryjnych z ziaren granulocytów obojętnochłonnych do makrofagów. Jest to przykład współpracy komórek odporności wrodzonej przeciwko patogenom wnikającym do komórek (Rycina 1). Peptydy przeciwzakaźne w ziarnistościach neutrofila Anti-infective peptides in the neutrophil granules apoptoza neutrofila neutrophil apoptosis ciałka apoptotyczne po fagocytozie przez makrofag apoptotic bodies after phagocytosis by macrophage Neutrophil ciałka apoptotyczne apoptotic bodies Ryc. 1. Schemat mechanizmu przejścia peptydów przeciwzakaźnych z ziaren neutrofila do makrofaga, na podstawie badań in vitro (wg 28, znacznie zmienione) Fig. 1. Neutrophil granules are delivered to macrophage via apoptosis and phagocytosis; diagram illustrates the experimental designes (acc. 28 significantly modificated) Peptydy przeciwzakaźne wykazują działanie głównie przeciwbakteryjne i przeciwwirusowe (Tabela 1), choć uczestniczą takŝe w innych procesach np. w gospodarce Ŝelazem. Obecnie rozwaŝane są moŝliwości stosowania defensyn jako immunomodula-

6 590 J. KOPEĆ SZLĘZAK tora [28], a lipokaliny do monitorowania rozwoju niektórych nowotworów i wczesnego wykrywania ostrej niewydolności nerek. Tabela 1. Peptydy przeciwzakaźne neutrofili Table 1. Anti-infective peptides in neutrophils Peptydy przeciwzakaźne Czynność Mechanizm działania 1. Defensyny alfa (Human Neutrophil Peptide) (HNP-1, HNP-2, HNP-3, HNP-4) 1. działanie antybakteryjne 2. działanie przeciwwirusowe 3. działanie przeciwpasoŝytnicze 4. aktywacja limfocytów T CD4 1. tworzenie por w błonie bakterii 2. blokowanie receptorów komórkowych dla wirusów i hamowanie replikacji wirusa 3. tworzenie por w błonie komórki i w wici (Trypanosoma) 4. indukcja wydzielania cytokin 2. Katelicydyna ( LL-37 ) 1. działanie antybakteryjne 2. modyfikacja apoptozy neutrofili 3. Lipokalina 2 (NGAL Neutrophil Gelatinase- Associated Lipocalin) 1. działanie bakteriostatyczne 2. udział w patogenezie niedokrwistości (immunomodulacja) 1. degradacja błony bakterii, przeciwdziałanie powstawaniu biofilmu Pseudomonas aeruginosa 2. hamowanie aktywności prokaspazy 3 i wpływ na bcl-2 1. ograniczenie wiązania Ŝelaza przez bakterie 2. indukcja apoptozy erytroblastów PIŚMIENNICTWO 1. Levy O. Antimicrobial proteins and peptides: anti-infective molecules of mammalian leukocytes. J Leukoc Biol 2004; 76: Kai Larsen Y, Agerberth B. The role of the multifunctional peptide LL-37 in host defense. Front Biosci 2008; 13: Deverajan P. Neutrophil gelatinase-associated lipocalin; new pathos for an old shuttle. Cancer Ther 2007; 5 (B): De Yang I, Biragyn A, Kwak L, Oppenheim J. Mammalian defensins in immunity: more than just microbicidal. Trends Immunol 2002; 23: Barlow P, Li Y, Wilkinson TS. The human cationic host defense peptide LL-37 mediates contrasting effects on apoptotic pathways in different primary cells of the innate immune systems. J Leukoc Biol 2007; 680: Lehrer R.I. Multispecific myeloid defensins. Curr Opin Hematol 2007; 14: Sahl HG, Pag U, Bonness S, Wagner S, Antcheva N, Tossi A. Mammalian defensins: structures and mechanism of antibiotic activity. J Leukoc Biol 2005; 77: Salvatore M, Garcia-Sastre A, Ruchala P, Lehrer RI, Chang T, Klotman ME. alpha-defensin inhibits influenza virus replication by cell-mediated mechanism(s). J Infect Dis. 2007; 196: Furci L, Sironi F, Tolazzi M, Vassena L, Lusso P. Alpha-defensins block the early steps of HIV-1 infection: interference with the binding of gp120 to CD4. Blood 2007; 109: Chang TL, Vargas JJ, Del Portillo A, Klotman ME Dual role of alpha-defensin-1 in anti-hiv-1 innate immunity. J Clin Invest 2005; 115:

7 Peptydy przeciwzakaźne neutrofili Smith JG, Nemerow GR. Mechanism of adenovirus neutralization by human alpha-defensins. Cell Host Microbe 2008; 3: Vaschetto R, Grinstein J, Del Sorbo L, i wsp. Role of human neutrophil peptides in the initial interaction between lung epithelial cells and CD4+ lymphocytes. J Leukoc Biol. 2007; 81: Nia M, Kleshchenko Y, i wsp. Human defensin α-1 causes Trypanosoma cruzi membrane pore formation and induces DNA fragmentation, which leads to Trypanosome destruction. Infect Immun. 2007; 75: Liu Hy, Collins QF, Moukdar F. i wsp. Suppression of hepatic glucose production by human neutrophil alpha-defensins through a signaling pathway distinct from insulin. J Biol Chem 2008; 283: Pazgier M, Li X, Lu W, Lubkowski J. Human defensins: synthesis and structural properties. Curr Pharm Des. 2007; 13: Nagaoka I, Nivonsaba F, tsutsumi-ishii Y, Tamura H, Hirata M. Evaluation of the effect of human β- defensins on neutrophil apoptosis. Int Immunol 2008; 20: Bowdish DM, Davidson DJ, Hancock RE Immunomodulatory properties of defensins and cathelicidins. Curr Top Microbiol Immunol. 2006; 306: Overhage J, Campisano A, Bains M, Torfs E, Rehm B., Hancock R. Human host defense peptide LL- 37 prevents bacterial biofilm formation. Infect Immun 2008; 76: Miharada K, Hiroyama T, Sudo K, Nagasawa T, Nakamura Y. Lipocalin 2 functions as a negative regulator of red blood cell production in an autocrine fashion. FASEB J 2005; 19: Villalva C, Sorel N, Bonnet ML. i wsp. Neutrophil gelatinase-associated lipocalin expression in chronic myeloid leukemia. Leuk Lymphoma 2008; 49: Arlinghaus R, Leng X. Requirement of lipocalin 2 for chronic myeloid leukemia. Leuk Lymphoma 2008; 49: Roudkenar MH, Halabian R, Oodi A, i wsp. Upregulation of neutrophil gelatinase-associated lipocalin, NGAL/Lcn2, in beta-thalassemia patients. Arch Med Res 2008; 39: Bauer M, Eickhoff JC, Gould MN, Mundhenke C, Maass N, Friedl A. Neutrophil-gelatinase associate lipocalin NGAL) is a predictor a poor prognosis in human primary breast cancer. Breast Cancer Res Treat 2007; 108: Ronco C. N-GAL: diagnosis AKI as soon as possible. Crit Care 2007; 11: Marchewka Z. Low molecular biomarkers in the nephrotoxixity. Adv Clin Exp med 2006; 15: Martineau A, Newton S, Wilkinson K i wsp. Neutrophil-mediated innate immune resistance to mycobacteria. J Clin Invest 2007; 117: Tan B, Beiken C, Bastion M i wsp. Macrophages aquire neutrophils granule for antimicrobial activity against intracellular pathogens. J Immunol 2006; 177: Kruse T, Kristensen H. Using antimicrobial host defense peptides as anti-infective and immunomodulatory agents. Expert Rev Anti Infect Ther. 2008; 6: Praca wpłynęła do Redakcji r. i została zakwalifikowana do druku r. Adres do korespondencji: Joanna Kopeć-Szlęzak Pracownia Immunofenotypowania, Zakład Diagnostyki Hematologicznej i Transfuzjologicznej, Instytut Hematologii i Transfuzjologii Warszawa ul. Indiry Gandhi 14 tel jszlez@poczta.onet.pl