Wielkość oraz liczba pęcherzyków zewnątrzkomórkowych jako potencjalne biomarkery uszkodzenia nerek u chorych na cukrzycę

Transkrypt

1 Wielkość oraz liczba pęcherzyków zewnątrzkomórkowych jako potencjalne biomarkery uszkodzenia nerek u chorych na cukrzycę Kraków, 4 marca 2016 mgr inż. Agnieszka Kamińska Zakład Fizyki Medycznej Wydział Fizyki, Astronomii i Informatyki Stosowanej UJ Promotor: prof. Ewa Stępień

2 Plan wystąpienia: 1.Wprowadzenie Formowanie, cechy oraz źródła mikropęcherzyków w ludzkim ciele Mikropęcherzyki jako biomarkery Płyny ustrojowe (osocze, mocz) jako dobre źródło mikropęcherzyków 2. Cel naszych badań 3. Badania kliniczne 4. Metodologia: TRPS, czasowo-rozdzielcza fluorescencja 5. Wyniki 6. Podsumowanie i wnioski

3 Zmiany w liczbie publikacji dotyczących mikropęcherzyków w ciągu ostatnich 15 lat, PubMed

4 1. Wprowadzenie Proces formowania mikropęcherzyków zewnątrzkomórkowych A THOUSAND WORDS ABOUT MICROPARTICLES IN CARDIOLOGY M. Konkolewska, S. Kurc, E. Stępień, Journal of Medical Science 2 (83) 2014

5 Egzosomy vs. Mikropęcherzyki Egzosomy Mikropęcherzyki Rozmiar nm 100 nm 1 μm Skład lipidowy cholesterol sfingomielina ceramidy, PS, tratwy lipidowe sfingomielina, PS, PA, kwas arachidonowy Białka DNA, mrna, microrna, integryny, białka z rodziny tertraspanin (CD9, CD81, CD63), białka szoku cieplnego (HSPs), GTPazy, aneksyna, flotilina Cell adhesion proteins (VEcadherin, E-selectin, sialomucin), DNA, mrna, mirna

6 Źródła mikropęcherzyków: - płytki krwi - komórki śródbłonka - komórki macierzyste - komórki nowotworowe - erytrocyty Gdzie możemy je znaleźć? - osocze - mocz - płyn mózgowo-rdzeniowy - medium komórkowe Zdjęcia z mikroskopu fluorescencyjnego oraz skaningowego przedstawiające aktywowane płytki krwi oraz komórki śródbłonka, które wydzielają EVs. Zdjęcia: Prof. Ewa Stępień

7 Funkcje: a) proces krzepnięcia krwi b) sygnalizacja międzykomórkowa - immunosupresja - prezentacja antygenów - transfer komponentów sygnalizacyjnych - stan zapalny - angiogeneza c) adhezja komórkowa Zastosowania kliniczne: - terapia - prognozowanie - biomarkery chorób M. Konkolewska, S. Kurc, E. Stępień A thousand words about micropartocles in cardiology. Journal of Medical Science 2 (83) 2014

8 Mocz jako dobre źródło mikropęcherzyków: łatwa dostępność nieinwazyjne pobranie względnie wysoka koncentracja pęcherzyków przy niskim zanieczyszczeniu dobrze zdefiniowane kryteria oceny dobrze poznane protokoły izolacji E. Van der Pol, A.G. Hoekstra, A. Sturck, C. Otto, T.G. van Leeuwen, R. Nieuwland. Optical and nonoptical methods for detection and characterization of microparticles and exosomes. J. Thromb. Haemost. 8 (12), (2010)

9 Rola podocytów w generowaniu EVs com/2009/11/glomerulus.html Genes and podocytes new insights into mechanisms of podocytopathy A. Bierzyńska, K. Soderquest, A. Koziell; Front. Endocrinol, 23 January 2015

10 2. Cel naszych badań Znalezienie związku między liczbą i rozmiarem mikropęcherzyków występujących w moczu a stopniem zaawansowania choroby nerek u pacjentów z cukrzycą II typu.

11 3. Badanie kliniczne PACJENCI Pacjenci z uregulowaną cukrzycą (CD) n=24 Pacjenci z nieuregulowaną cukrzycą (UD) n=36 Pacjenci cukrzycowi bez powikłań nerek (NRF) n=45 Pacjenci cukrzycowi z powikłaniami nerek (RF) n=15 Kryteria podziału: CD HbA1c <7% UD HbA1c >7% NRF GFR > 60 ml/min/1.73 m 2 RF GFR < 60 ml/min/1.73 m 2

12 Table 1. Clinical characteristics, blood, and urine biochemistry of study groups: C, CD, UD C n=12 CD n=24 UD n=36 p-value Age [years] 49 (11) 62 (15) 61 (12) Gender [Male/Female] 6/6 17/7 23/13 - Serum glucose [mmol/l] 5.2 ( ) 6.8 * ( ) 9 * (7.4-12) < Urine albumin [mg/l] 6.2 (4.3-11) 6.3* (2-22) 37 * (12-267) < Urine creatinine [mmol/l] 12 (9-17) 5.4 (4.2-9) 6.8 (4.8-11) Serum creatinine [umol/l] 72 (63-83) 77 (67-98) 79 (62-108) GFR [ml/min/1.73m 2 ] 84 (77-96) 77 (59-95) 79 (59-97) EVs density [number/ml] 5.2E10 (2.7E10-2.3E11) 8.4E10 (3.9E10-1.7E11) 5.2E10 (2.6E10-1.5E11) EVs mode diameter [nm] 106 ( ) 115 * ( ) 109* ( ) EVs mean diameter [nm] 123 (4) 134 (11) 129 (8)

13 Table 2. Clinical characteristics, blood, and urine biochemistry of study groups: C, RF, NRF C n=12 RF N=15 NRF N=45 p-value Age (years) 49 (11) 69 (11) * 60 (3) * Gender (Male/Female) 6/6 15/3 25/17 - Serum glucose [mmol/l] 5.2 ( ) 8.7 (6.5-11) 7.9 (6.5-10) < Urine albumin [mg/l] 6.2 (4.3-11) 51 (7-359) 14 (4-58) Urine creatinine [mmol/l] 12 (9-17) 5.9 ( ) 7.8 (4.4-11) Serum creatinine [umol/l] 72 (63-83) 119 * ( ) 73* (60-84) < GFR [ml/min/1.73m 2 ] 84 (77-96) 49 * (39-55) 89* (73-105) < EVs density [number/ml] 5.2E10 (2.7E10-2.3E11) 2.6E10* (2.0E10-8.2E10) 8.7E10* (4.0E10-1.9E11) EVs mode diameter [nm] 106 ( ) 111 ( ) 109 ( ) EVs mean diameter [nm] 122 ( ) 129 ( ) 129 ( )

14 4. Metody Tunable Resistive Pulse Sensing (qnano) Extracellular Vesicle Characterisation with Tunable Resistive Pulse Sensing, Izon Science

15 Tunable Resistive Pulse Sensing (qnano) Kuleczki polistyrenowei

16 Fluorescencja czasowo-rozdzielcza oznaczenie CD81 Schematic for TRIFic exosome assay. Assay/1653-CD81-TRIFic-exosome-assay-kit.html

17 5. Wyniki - TRPS Liczba EVs vs. poziom glukozy

18 5. Wyniki - TRPS Liczba EVs vs. stężenie kreatyniny

19 5. Wyniki Fluorescencja czasowo-rozdzielcza

20 6. Wnioski: Konieczność poszukiwania nowych, bardziej czułych biomarkerów wczesnego uszkodzenia nerek u chorych na cukrzycę Liczba oraz rozmiar EVs obecnych w moczu może stać się potencjalnym biomarkerem uszkodzenia nerek Mniejsza liczba mikropęcherzyków u pacjentów cukrzycowych z powikłaniami nerek może być związana z postępującą arteriosklerozą kłębuszków nerkowych Negatywna korelacja między liczbą mikropęcherzyków a poziomem glukozy u pacjentów z nieuregulowaną cukrzycą oraz u pacjentów z powikłaniami nerek, może być związana z rozwojem hiperglikemii u tych pacjentów

21 Podziękowania Promotor: prof. Ewa Stępień Zakład Fizyki Medycznej Dr Mark Platt Wydział Chemii Loughborough University Badania kliniczne: mgr Aleksandra Tokarz dr Beata Kuśnierz-Cabala Ketedra Biochemii Klinicznej Collegium Medicum UJ

22 Dziękuję za uwagę