(86) Data i numer zgłoszenia międzynarodowego: , PCT/EP03/ (87) Data i numer publikacji zgłoszenia międzynarodowego:

Transkrypt

1 RZECZPOSPOLITA POLSKA Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (12) OPIS PATENTOWY (19) PL (11) (21) Numer zgłoszenia: (22) Data zgłoszenia: (86) Data i numer zgłoszenia międzynarodowego: , PCT/EP03/ (87) Data i numer publikacji zgłoszenia międzynarodowego: , WO03/ (13) B1 (51) Int.Cl. C12N 15/40 ( ) A61K 39/12 ( ) C07K 14/08 ( ) (54) Wariant wirusa zakaźnego zapalenia torby Fabrycjusza (IBDV), szczepionki, sposób wytwarzania wariantu IBDV, sposób wytwarzania szczepionek, zastosowanie wariantów IBDV (30) Pierwszeństwo: , EP, , EP, (43) Zgłoszenie ogłoszono: BUP 15/05 (73) Uprawniony z patentu: INTERVET INTERNATIONAL B.V., Boxmeer, NL (72) Twórca(y) wynalazku: ADRIAAN ANTONIUS WILHELMUS MARIA VAN LOON, Sambeek, NL PAUL GUNTRAM, Bedburg Hau, DE (45) O udzieleniu patentu ogłoszono: WUP 11/11 (74) Pełnomocnik: rzecz. pat. Janina Kossowska PL B1

2 2 PL B1 Opis wynalazku Przedmiotem wynalazku jest wariant wirusa zakaźnego zapalenia torby Fabrycjusza (IBDV), szczepionki, sposób wytwarzania wariantu IBDV, sposób wytwarzania szczepionek, zastosowania wariantów IBDV. Wirus zakaźnego zapalenia torby Fabrycjusza (IBDV) jest przedstawicielem rodziny Birnaviridae. Wirusy w tej rodzinie mają bardzo podobną organizację genomową i podobny cykl replikacyjny. Genomy tych wirusów składają się z 2 segmentów (A i B) dwuniciowego (ds) RNA. Większy segment A koduje poliproteinę, która jest trawiona przez autoproteolizę z wytworzeniem dojrzałych białek wirusowych VP2, VP3 i VP4. VP2 i VP3 są głównymi białkami strukturalnymi wirionu. VP2 jest głównym immunogenem ochronnym gospodarza birnawirusów i zawiera regiony immunogenne odpowiedzialne za wywoływanie przeciwciał neutralizujących. Dla IBDV istnieją dwa serotypy, serotyp 1 i 2. Te dwa serotypy można rozróżnić testami neutralizacji wirusa (VN). Wykazano, że wirusy serotypu 1 są patogenne dla kurcząt, podczas gdy IBDV serotypu 2 wywołuje tylko pod-ostrą chorobę u indyków. Zakaźne zapalenie torby Fabrycjusza (IBD), zwane również chorobą Gumboro, jest ostrym, wysoce zakaźnym zakażeniem u kurcząt, którego podstawowym celem jest tkanka limfatyczna z wybiórczym tropizmem wobec komórek torby Fabrycjusza. Współczynnik zachorowalności w podatnych stadach jest wysoki, z szybką utratą wagi i średnimi do wysokich współczynnikami śmiertelności. Kurczęta, które wyzdrowieją z choroby, mogą mieć niedobory immunologiczne z powodu zniszczenia torby Fabrycjusza, która jest niezbędna dla mechanizmu obronnego u kurczęcia. Wirus IBD powoduje ciężką immunosupresję u kurcząt młodszych niż 3 tygodnie i wywołuje zmiany w torbie Fabrycjusza u kurcząt do 3 miesiąca życia. Przez wiele lat chorobie można było zapobiegać przez wzbudzanie wysokich poziomów przeciwciał w stadach hodowlanych przez zastosowanie inaktywowanej szczepionki u kurcząt, które wcześniej zaszczepiono atenuowaną żywą szczepionką IBDV. Utrzymywało to straty ekonomiczne spowodowane przez IBD na minimum. Przeciwciała matczyne u kurcząt pochodzących od szczepionych kur hodowlanych zapobiegały wczesnemu zakażeniu IBDV i zmniejszały problemy związane z immunosupresją. Ponadto, atenuowane żywe szczepionki były również skutecznie używane w stadach hodowlanych kurcząt po zaniku przeciwciał matczynych. Historycznie, wirusy IBD składały się tylko z jednego typu, znanego jako klasyczny" wirus IBD. Jednakże, w połowie lat 80-tych zaobserwowano ostrą chorobę w stadach szczepionych szczepionkami opartymi na klasycznym IBDV, w szczególności w Stanach Zjednoczonych. Stwierdzono, że chorobę tę wywołały wirusy IBD, które miały inną strukturę immunologiczną. Te nowe wirusy prawdopodobnie powstały jako wynik przesunięcia antygenowego. Pojawienie się tak zwanych szczepów wariantowych" IBDV wymagało zaplanowania nowych programów szczepień IBD, ponieważ klasyczne szczepy szczepionkowe IBDV nie mogły wywołać odpowiedniej ochrony krzyżowej. Najważniejszymi podtypami wariantowymi serotypu 1 IBDV zidentyfikowanymi w przeszłości były warianty Delaware-E, GLS, RS/593 i DS326. O wariancie Delaware-E donieśli Rosenberger i wsp. (Proc. 20th Natl. Meet, na Poultry Health and Condemnations; Ocean City, MD, USA, , 1985) i Snyder i wsp. (Avian Diseases 32, , 1985). Wirus GLS wyizolowano w Stanach Zjednoczonych w 1987 r., a DS326 (podobny do GLS) wyizolowano w Stanach Zjednoczonych w 1988 r. (Snyder i wsp., Arch. Virol. 127, , 1992 i van Loon i wsp. Proceedings of the International symposium on infectious bursal disease and chicken infectious anaemia, Rauischholzhausen, Niemcy, , 1994). Szczep RS/593 (wariant podobny do E) wyizolowano również w Stanach Zjednoczonych w 1993 r. (Snyder, i wsp. Proceedings of the International symposium on infectious bursal disease and chicken infectious anaemia, Rauischholzhausen, Niemcy, 65-70, 1994). W Europie jeszcze nie doniesiono o pojawieniu się wariantów szczepów IBDV. Do identyfikacji różnych typów IBDV jest obecnie stosowany panel przeciwciał monoklonalnych (Moab) neutralizujących wirusa w teście immunoenzymatycznym wyłapywania antygenu (AC-ELISA). Wzór reaktywności tych Moab z istniejącymi szczepami IBDV jest zebrany w Tabeli 1 poniżej. Ponadto, podstawa molekularna zmienności antygenowej między szczepami IBDV została wyjaśniona przez Vakharie i wsp. (Virus Research 31, ,1994). Zidentyfikowano region w białku VP2, który wykazuje najwięcej różnic aminokwasowych między szczepami IBDV i przypuszczalne aminokwasy zaangażowane w tworzenie neutralizujących epitopów.

3 PL B1 3 T a b e l a 1 Różne warianty szczepów IBDV, jak określone przez wzór panelu Moab Szczep /Moab 8 B69 R63 10 BK A1 179 Klasyczny Delaware wariant (-E) RS/ GLS DS Moab VN R63 i B69 neutralizują klasyczne szczepy IBDV do wysokich mian, a Moab B69 specyficznie wiąże się z klasycznymi szczepami. Moab BK9 wyłącznie wiąże się ze szczepami Delavare wariant E. Dodatnią reakcję Moab 57 można wykorzystać do rozróżnienia szczepów GLS- i DS326 od wariantów szczepów klasycznych i Delaware. Te i inne Moab są na ogół wykorzystywane do rozróżnienia (wariantów) szczepów IBDV przez określenie wzoru reakcji w panelu dostępnych Moab. Hybrydoma wydzielające Moab są również dostępne z ATCC (Rockville, USA) pod następującymi numerami dostępu: R63 (HB-9490), 8 (HB-10174), B29 (HB-9746), BK-9(HB-10157), 67 (HB-11122), 57 (HB ), B69 (HB-9437) i 179 (HB-10158). Warianty szczepów IBDV i hybrydoma są również dostępne z Collection Nationale de Cultures de Microorganismes Institute Pasteur, Paryż, Francja pod następującymi numerami dostępu: DS 326(I-910), GLS(I-792 i I-793) i Moab 10 (I-2812). W niniejszym wynalazku zidentyfikowano nowy wariant IBDV, który wyizolowano z ogniska epidemicznego choroby, której nie w pełni zapobiegło podanie klasycznej szczepionki. Nowy wariant IBDV wykazujący zmieniony wzór reakcji z istniejącymi Moab VN, ujawniony niniejszym po raz pierwszy, dostarcza podstawy dla przygotowywania nowych szczepionek i metod diagnostycznych dla zapobiegania i monitorowania choroby wywoływanej przez ten nowy wariant IBDV. Zatem, niniejszy wynalazek dotyczy wariantu wirusa zakaźnego zapalenia torby Fabrycjusza (IBDV), który wiąże się z przeciwciałem monoklonalnym 10 i 67, wydzielanym przez linie komórek hybrydoma I-2812 i HB-11122, zdeponowane w Collection Nationale de Cultures de Microorganismes Institute Pasteur, Paryż, Francja i ATCC, Rockville, Stany Zjednoczone, odpowiednio. W zakres wynalazku wchodzą również szczepionki do zastosowania do ochrony drobiu przed chorobą powodowaną przez zakażenie IBDV, które zawierają warianty IBDV określone powyżej, razem z dopuszczalnym farmaceutycznie nośnikiem lub rozcieńczalnikiem. Ponadto wynalazek dotyczy sposobu wytwarzania wariantów IBDV określonych powyżej, przez namnażanie w hodowli komórkowej tych wariantów, a następnie zbiera z hodowli komórkowej. Wynalazek dotyczy również sposobu wytwarzania szczepionek określonych powyżej, w którym warianty IBDV określone powyżej miesza się z dopuszczalnym farmaceutycznie nośnikiem lub rozcieńczalnikiem. W zakres wynalazku wchodzi również zastosowanie wariantów IBDV według wynalazku do wytwarzania szczepionek dla drobiu przeciwko chorobie wywołanej zakażeniem IBDV. Do tej pory, w Europie nie zidentyfikowano żadnych szczepów IBDV innych niż klasyczny szczep IBDV. Ten nowy IBDV przedstawiający nowy wariant szczepu wyizolowano od zwierząt dotkniętych chorobą w stadzie, które zostało zaszczepione klasyczną szczepionką IBDV. Wirusy należące do tego nowego szczepu różnią się immunologicznie od klasycznego- i znanych wariantów wirusów IBD, jak wykazano przez zmianę ich wzoru wiązania Moab. Istniejące warianty podtypów IBDV są dobrze określone w dziedzinie, np. przez wykorzystanie ich wzoru reakcji z przeciwciałami monoklonalnymi. Niniejszy wariant IBDV nie ma epitopów 57 i BK9, które są charakterystyczne dla szczepów wariantowych GLS- i E, odpowiednio. Jednak, IBDV według wynalazku jest wirusem, który zawiera zarówno epitop 10 jak i 67. Moab 10 zazwyczaj reaguje ze szczepami klasycznym i podobnymi do GLS, podczas gdy Moab 67 reaguje wyłącznie ze szczepami podobnymi do wariantu E. Reakcję Moab z wariantem IBDV wykrywa się za pomocą AC-ELISA, która jest powszechnie używana w dziedzinie dla tego celu, jak opisana przez Snyder i wsp. (1992 supra) lub w zgłoszeniu patentowym U.S.A. nr 5,518,724. Do wykrywania powyższej reakcji. W niniejszym wynalazku stosuje się

4 4 PL B1 również test AC-ELISA, jak opisany przez van der Marel i wsp. (Dtsch. Tierartzl. Wschr. 97, 81-83, 1990). Test ten zasadniczo obejmuje trzy etapy. W pierwszym etapie masa antygenowa badanego antygenu IBDV jest badana przez Moab - ELISA z użyciem Moab, które reaguje z IBDV, np. Moab B29. W drugim etapie homogenaty toreb Fabrycjusza kurcząt zakażonych IBDV bada się w ELISA na ich reaktywność z (odpowiednim) panelem Moab w standardowych warunkach. Po trzecie, oblicza się współczynniki absorpcji przez stosunek między masą antygenową - Moab a innymi Moab. Jest ogólnie przyjęte, że istnieje biologiczna zmienność w naturze między organizmami tego samego gatunku. Dla celów tego wynalazku oznacza to, że mogą istnieć różne izolaty wariantu IBDV jak określony powyżej. Izolaty te zawierają epitopy 10 i 67, ale można zaobserwować jedną lub więcej różnic w sekwencjach nukleotydowych w ich genomach. Korzystnie wariant IBDV według wynalazku jak określony powyżej zawiera kodony dla aminokwasów Ser (pozycja 222), His (pozycja 249), Ala (pozycja 256) i Ser (pozycja 278) w regionie kodującym VP2 segmentu A genomu IBDV. Numery wskazujące tu pozycje aminokwasowe i nukleotydowe są oparte na całkowitej sekwencji segmentu A genomu IBDV jak opisane przez Mundt i Müller (J. Gen. Virol. 77, , 1995; nr dostępu NCBI X84034). Bardziej korzystnie, wariant IBDV według wynalazku zawiera region kodujący VP2, który koduje białko VP2 mające sekwencję aminokwasową regionu zmiennego (aa ) jak pokazana w Sekw. Nr Id.:. 1, bardziej szczegółowo, region kodujący VP2, który koduje białko VP2 o sekwencji aminokwasowej jak pokazana w Sekw. Nr Id.:. 1. Najbardziej korzystnym wirusem według wynalazku jest izolat IBDV GB02, którego próbkę zdeponowano w Institute Pasteur, Paryż, Francja pod nr dostępu I-2811 oraz izolat GB02 PP, który reprezentuje IBDV GB02 oczyszczony z łysinek i jest zdeponowany w Instytucie Pasteura, Paryż, Francja pod nr dostępu I Wariant IBDV według wynalazku można otrzymać od Instytutu Deponującego lub można wyizolować ze środowiska naturalnego i zidentyfikować przez wspomniane powyżej Moab, jak opisano w Przykładzie 1. Z wariantu IBDV według wynalazku został wyizolowany polinukleotyd obejmujący sekwencję nukleotydową kodującą białko VP2 wariantu IBDV według wynalazku, a konkretnie polinukleotydy, który obejmuje sekwencję kodującą region zmienny VP2 mającą sekwencję aminokwasową jak pokazano w Sekw. Nr Id.:. 1. Oprócz kodującej sekwencji białka VP2 polinukleotyd może również obejmować sekwencje kodujące dla innych białek strukturalnych kodowanych przez segment A genomu IBDV, tzn. VP3 i VP4. Klony cdna zawierające cały region kodujący segmentu A nowego wariantu IBDV można przygotować zgodnie ze standardowymi procedurami klonowania opisanymi w stanie techniki dla tego celu (Vakharia i wsp., Avian Diseases 36, , 1992; WO 91/1114, WO 95/26196 i US 5,595,912). Polipeptyd obejmujący sekwencję aminokwasową białka VP2 wariantu IBDV według wynalazku, korzystnie jak przedstawiona w Sekw. Nr. Id: 1 można uzyskać przez ekspresję rekombinowanego DNA z użyciem polinukleotydu określonego powyżej w standardowym systemie ekspresji. Białko VP2 nowego wariantu IBDV może być wykorzystywane w postaci białka podjednostkowego lub w postaci cząstki podobnej do wirusa (VLP), gdy jest współwytwarzane z białkiem VP3 i VP4, korzystnie przez rekombinowanego bakulowirusa, w celu przygotowania szczepionki IBDV. Szeroka różnorodność kombinacji komórek gospodarza i wektorów do klonowania może być użyteczna do zastosowania w klonowaniu sekwencji kwasu nukleinowego. Polinukleotyd można wklonować do odpowiedniego systemu ekspresji, takiego jak bakteryjny system ekspresji (np. E. coli DH5α), wirusowy system ekspresji (np. Bakulowirus), system drożdżowy (np. S. cerevisiae, Pichia) lub komórki eukariotyczne (np. komórki Cos, BHK, MDCK, MDBK, HeLa, PK15). We wszystkich systemach polinukleotyd jest najpierw klonowany do właściwego wektora pod kontrolę odpowiedniego promotora konstytutywnego lub indukowalnego. Odpowiednimi wektorami obejmującymi polinukleotyd są, na przykład, kosmidy, plazmidy bakteryjne lub drożdżowe, plazmidy do szerokiego zakresu gospodarzy i wektory pochodzące z kombinacji plazmidu i faga lub DNA wirusowego. Przykładami odpowiednich wektorów do klonowania są wektory plazmidowe, takie jak plazmidy pbr322, różne puc, pembl i Bluescript. Gdy wektor rekombinantowy jest stosowany do ekspresji polipeptydu może on ponadto obejmować sekwencję kontroli ekspresji funkcjonalnie połączoną z sekwencją kwasu nukleinowego kodującego białko.

5 PL B1 5 Wszystkie te techniki są dobrze znane w dziedzinie i wyczerpująco opisane w protokołach dostarczanych przez producentów odczynników do biologii molekularnej (takich jak Promega, Stratagene, Clonetech, i/lub Invitrogen) i w literaturze lub referencyjnych podręcznikach, na przykład, w Rodriguez, R.L. i D.T. Denhadt, red., Vectors: A survey of molecular cloning vectors and their uses, Butterworths, 1988; Current Protocols in Molecular Biology, red.: F. M.Ausbel i wsp., Wiley N.Y., 1995; Molecular Cloning: a laboratory manual, wyd. Ill; red.: Sambrook i wsp., wyd. CSHL, 2001 i DNA Cloning, t. 1-4, wyd. II, 1995, red.: Glover i Hames, Oxford University Press). Jak przedstawiono w Przykładach, wariant IBDV według wynalazku wykazuje strukturę immunologiczną, który nie został wcześniej zaobserwowany. Nowy wariant IBDV może stanowić podstawę nowego typu szczepionki IBDV, która może skutecznie chronić drób przed stanami chorobowymi wynikającymi z zakażenia nowym wariantem IBDV. W zakres wynalazku wchodzi również szczepionka do zastosowania do ochrony drobiu przed chorobą powodowaną przez zakażenie IBDV, charakteryzująca się tym, że zawiera wariant IBDV, jak określony powyżej, razem z dopuszczalnym farmaceutycznie nośnikiem lub rozcieńczalnikiem. Wariant IBDV można włączyć do szczepionki jako żywy atenuowany lub inaktywowany wirus. Korzystnie w szczepionce według wynalazku wariant IBDV jest w postaci inaktywowanej. Korzystnie szczepionka ponadto zawiera jako składniki jeden lub więcej innych patogenów zakaźnych dla drobiu. Niniejszy wynalazek dotyczy sposobu wytwarzania wariantów IBDV według wynalazku, w którym warianty IBDV według wynalazku namnaża się w hodowli komórkowej, a następnie zbiera z hodowli komórkowej. Wynalazek dotyczy też sposobu uzyskiwania szczepionki według wynalazku, w której warianty IBDV określone powyżej miesza się z dopuszczalnym farmaceutycznie nośnikiem lub rozcieńczalnikiem. W celu wytworzenia szczepionki podatnego gospodarza inokuluje się wariantem IBDV według wynalazku i namnaża się wirusa do żądanego miana zakaźnego, po czym materiał zawierający IBDV zbiera się, ewentualnie inaktywuje i miesza z dopuszczalnym farmaceutycznie nośnikiem lub rozcieńczalnikiem. Każdy gospodarz, który jest zdolny do podtrzymywania replikacji IBDV może być stosowany do wytworzenia szczepionki według niniejszego wynalazku, w tym pierwotne (ptasie) hodowle komórkowe, takie jak komórki fibroblastów zarodka kurzego (CEF) lub komórki wątroby zarodka kurzego (CEL), linie komórek ssaczych, takie jak linia komórek VERO lub linia komórek BGM-70 lub linie komórek ptasich, takie jak QT-35, QM-7 lub LMH. Zazwyczaj, po inokulacji komórek wirus namnaża się przez 3-14 dni, po czym zbiera się supernatant hodowli komórkowej i, jeśli potrzeba, filtruje lub odwirowuje, w celu usunięcia resztek komórek. Wariant IBDV można również namnażać na zarodkach jaj kurzych. Atenuację wariantu IBDV można uzyskać przez standardowe, seryjne pasażowanie wirusa w hodowlach komórkowych, na przykład, w pierwotnych hodowlach komórkowych lub ustalonych liniach komórkowych, wymienionych powyżej (Bayyari i wsp., Avian Diseases 40, , 1996; Tsai i wsp., Avian diseases 36, , 1992). Alternatywnie wariant IBDV można namnożyć in vivo w zakażonych kurczętach, następnie wyizolować torby Fabrycjusza z tych zakażonych zwierząt, zmieszać z rozcieńczalnikiem i homogenizować mieszaninę. IBDV propagowany w ten sposób powszechnie stanowi podstawę inaktywowanej szczepionki. Szczepionkę według wynalazku zawierającą żywy wirus można przygotować i sprzedawać w postaci zawiesiny lub w postaci liofilizowanej, przy czym szczepionka dodatkowo zawiera farmaceutycznie dopuszczalny nośnik lub rozcieńczalnik typowo używany dla takich kompozycji. Nośniki obejmują stabilizatory, konserwanty i bufory. Odpowiednimi stabilizatorami są, na przykład, SPGA, węglowodany (takie jak sorbitol, mannitol, skrobia, sacharoza, dekstran, glutaminian lub glukoza), białka (takie jak wysuszona serwatka mleka, albumina lub kazeina) lub produkty ich degradacji. Odpowiednimi buforami są, na przykład, fosforany metali alkalicznych. Odpowiednimi konserwantami są timerosal, mertiolat i gentamycyna. Rozcieńczalniki obejmują wodę, bufor wodny (taki jak buforowana sól fizjologiczna), alkohole i poliole (takie jak glicerol). Korzystnie żywe szczepionki według wynalazki zawierają adiuwant. Przykłady odpowiednich składników i kompozycji z aktywnością adiuwanta są takie same jak wymienione powyżej.

6 6 PL B1 Chociaż podawanie przez iniekcję, np. domięśniowo, podskórnie lub in ovo żywej szczepionki według niniejszego wynalazku jest możliwe, szczepionka jest korzystnie podawana niekosztowną drogą podania masowego powszechnie stosowaną przy szczepieniu IBDV. Dla szczepienia IBDV ta droga obejmuje wodę pitną, rozpylanie i szczepienie za pomocą aerozolu. Korzystnie szczepionka według wynalazku korzystnie zawiera wariant IBDV w postaci inaktywowanej (zabitej). Zaletą inaktywowanej szczepionki IBDV jest wysoki poziom przeciwciał ochronnych o długiej trwałości, który można uzyskać. Celem inaktywacji wirusów zebranych po etapie namnażania jest wyeliminowanie reprodukcji wirusów. Ogólnie, można to uzyskać środkami chemicznymi lub fizycznymi dobrze znanymi w dziedzinie. Szczepionka zawierająca inaktywowany wariant IBDV może, na przykład, zawierać jeden lub więcej wspomnianych wyżej dopuszczalnych farmaceutycznie nośników lub rozpuszczalników odpowiednich dla tego celu. Korzystnie szczepionka według wynalazku zawiera adiuwant. Odpowiednie składniki lub kompozycje do tego celu obejmują wodorotlenek, fosforan, lub tlenek glinu, emulsje olej w wodzie lub woda w oleju oparte na przykład, na oleju mineralnym, takim jak Bayol F lub Marcol 52 lub na oleju roślinnym, takim jak octan witaminy E i saponiny. Szczepionka według wynalazku zawiera skuteczną dawkę wariantu IBDV jako aktywnego składnika, tzn. ilość immunizującego materiału IBDV, która wywoła odporność u szczepionych ptaków przeciwko prowokacji zjadliwym wirusem. Odporność jest tu określana jako wywołanie znacząco wysokiego poziomu ochrony w populacji ptaków po szczepieniu w porównaniu z grupą nieszczepioną. Typowo, żywa szczepionka według wynalazku może być podawana w dawce TCID 50 na zwierzę, korzystnie w dawce w zakresie od TCID 50 na zwierzę. Inaktywowane szczepionki mogą zawierać równoważnik antygenowy TCID 50 na zwierzę. Inaktywowane szczepionki są zazwyczaj podawane pozajelitowo, np. domięśniowo lub podskórnie. Chociaż szczepionka IBDV według niniejszego wynalazku może być skutecznie stosowana u kurcząt, także inny drób, taki jak indyki, perliczki i kuropatwy mogą być skutecznie szczepione tą szczepionką. Kurczęta obejmują brojlery, pulardy, stado reprodukcyjne i stado niosek. Wiek zwierząt otrzymujących żywą lub inaktywowaną szczepionkę według wynalazku jest taki sam, jak zwierząt otrzymujących konwencjonalne, żywe lub inaktywowane, szczepionki IBDV. Na przykład, brojlery (niezawierające przeciwciał pochodzenia matczynego - MDA) mogą być szczepione w wieku 1 dnia lub in ovo, podczas gdy brojlery z wysokimi poziomami MDA są korzystnie szczepione w wieku 2-3 tygodni. Stado niosek lub stado reprodukcyjne z niskimi poziomami MDA mogą być szczepione w wieku 1-10 dni z późniejszym szczepieniem dawką przypominającą inaktywowanej szczepionki w wieku 6-12 i tygodni. Korzystnie wynalazek obejmuje również szczepionki złożone zawierające oprócz wariantu IBDV opisanego powyżej, jeden lub więcej składników szczepionki innych patogenów zakaźnych drobiu. Korzystnie, złożona szczepionka dodatkowo zawiera jeden lub więcej szczepów szczepionkowych wirusa choroby Mareka (MDV), wirusa zakaźnego zapalenia oskrzeli (IBV), wirusa rzekomego pomoru drobiu (NDV), wirusa zespołu spadku nieśności kur (EDS), wirusa zakaźnego zapalenia nosa i tchawicy indyka (TRTV) lub reowirusa. Alternatywnie, złożona szczepionka dodatkowo zawiera szczep szczepionkowy IBDV o innej strukturze immunogennej, taki jak szczep szczepionkowy klasycznego wariantu E lub GLS. P r z y k ł a d y P r z y k ł a d 1 Izolacja i charakteryzacja wariantu IBDV Materiały i metody Izolacja nowego IBDV z materiału z toreb Fabrycjusza zakażonych kurcząt Nowy wirus wyizolowano z toreb chorych zwierząt według następującej procedury: Stado kurcząt zaszczepionych klasyczną szczepionką wykazywało mokre odchody, ogólną immunosupresję, słabe przybieranie na wadze, ale nie wykazało wysokiej śmiertelności (1-2%). Kurczęta z tego stada poddano badaniu post mortem. Zaobserwowano krwawienie niektórych mięśni i wyizolowano niektóre małe torby Fabrycjusza. Wyizolowano torby Fabrycjusza, dodano PBS i antybiotyki. Następnie, torby Fabrycjusza homogenizowano stosując perełki szklane i jałowy PBS. Homogenaty zbadano z użyciem testowego panelu Moab. Materiał IBDV, który wykazywał odmienny wzór panelu, był dalej pasażowany na zwierzętach. 0,1 ml tego homogenatu podano przez zakropienie

7 PL B1 7 do oka 14-dniowym białym leghornom SPF. 3-4 dni po inokulacji obecność IBDV w torbach Fabrycjusza zbadano z użyciem testowego panelu Moab. Pierwotne fibroblasty zarodków kurzych (CEF) przygotowano w końcowym stężeniu 2 x 10 6 /ml. Komórki hodowano w podstawowym podłożu minimalnym Eaglesa zawierającym 5% bydlęcej surowicy płodowej. Do 15 ml tej zawiesiny komórkowej dodano 0,1 ml izolatu GB02 IBDV (na poziomie 1 pasażu). Po inkubacji przez 3-6 dni w inkubatorze o wysokiej wilgotności w 37 C, supernatant zawierał szczep wirusa. Po 2 pasażach na CEF wirus dalej oczyszczono przez trzy oczyszczenia z łysinek na CEF. Następnie wirus hodowano w ten sam sposób, jak opisano powyżej na CEF przez 2 cykle. Próbkę oczyszczonego z łysinek izolatu GB02 (GB02 PP) zdeponowano w Institute Pasteur, Paryż, Francja pod nr dostępu IBDV GB02 po trzech cyklach oczyszczania z łysinek na CEF hodowano przez 2 pasaże w komórkach VERO. Po drugiej inkubacji w komórkach VERO przez 10 dni w 37 C, zawiesinę zakażonych komórek przesączono przez jałową gazę. Oznaczenie immunoenzymatyczne z wyłapywaniem antygenu (AC-ELISA) IBDV scharakteryzowano z wykorzystaniem FLISA stosując różne przeciwciała monoklonalne według van der Marel i wsp. (Dtsch.Tierartzi. Wschr. 97, 81-83, 1990): 1. Moab B29 opłaszczano 96-studzienkowe płytki mikrotitracyjne. Po opłaszczeniu, płytki płukano i studzienki płytek wypełniano dwu- lub trzykrotnymi seriami rozcieńczeń próbek homogenatów toreb i standardowego antygenu o znanej masie antygenowej. Po inkubacji i płukaniu płytek, inkubowano je z surowicą anty- IBDV hiperimmunogennego królika. Następnie płytki płukano ponownie i inkubowano z koniugatem (kozią immunoglobuliną przeciwko królikowi przyłączoną do peroksydazy chrzanowej). Na koniec, płytki inkubowano z roztworem substratu. Reakcję enzymatyczną zatrzymywano 4N H 2 SO 4. Absorpcję w studzienkach odczytywano przy 450 nm czytnikiem ELISA. Zawartość masy antygenowej w próbkach toreb w odniesieniu do standardowego antygenu obliczono przez analizę regresyjną. Zawartość antygenową próbek toreb wyraża się jako B29 EU/ml. 2. Następująca procedura była podobna do opisywanej dla ELISA B29 z następującymi wyjątkami: 1. Płytki opłaszczono różnymi Moab, 2. Próbki homogenatów toreb rozcieńczono do stężenia 5000 B29 EU/ml. Następnie pojedyncze rozcieńczenie umieszczono w studzienkach opłaszczonych różnymi Moab. Następne etapy były takie same, jak dla ELISA B Współczynniki absorpcji obliczono według następującego wzoru: E450 Moab X" - E450 tła dla Moab X" Współczynnik = E450 Moab B29 - E450 tła dla Moab B29 Współczynniki klasyfikuje się następująco: Współczynnik reaktywność objaśnienie 0-0,3 - Moab nie wiąże się ze szczepem wirusa 0,3-0,7 0 obniżone wiązanie Moab ze szczepem wirusa > 0,7 + całkowite wiązanie Moab ze szczepem wirusa Klonowanie i sekwencjonowanie segmentu A wariantu IBDV Materiał i metody Oczyszczanie wirusowego RNA Otrzymane torby Fabrycjusza kurcząt homogenizowano. Homogenat odwirowano przy x g przez 5 min w celu usunięcia resztek komórkowych. Dodano jedną objętość chloroformu do otrzymanego supernatantu i wytrząsano na wytrząsarce typu Vorteks. Po wirowaniu przy x g przez 5 min do otrzymanego supernatantu dodano proteinazę K i dodecylosiarczan sodu do końcowego stężenia 1 mg/ml i 0,5%, odpowiednio i inkubowano w 56 C przez 1 godz. Kwasy nukleinowe otrzymywano po ekstrakcji strawionych białek używając jednej objętości fenolu/chloroformu. Po jednej dodatkowej ekstrakcji fenolem z użyciem jednej objętości chloroformu kwasy nukleinowe wytrącono przez dodanie 1/10 objętości 3M octanu sodu (ph 5,2) i 2,5 objętości bezwodnego etanolu. Konstrukcja klonu cdna zawierającego segment Dla sklonowania cdna segmentu A oczyszczony RNA był odwrotnie transkrybowany do cdna i amplifikowany w reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) zgodnie ze standardowymi procedurami z użyciem metod opisanych przez Mundta i Vakharię (PNAS 93, , 1996). Odpowiednie pary starterów (BelgFP/BelgRP nukleotydy i ) dodano do rozpuszczonych kwasów nukleinowych. Mieszaninę starter-kwas nukleinowy dodano do mieszaniny re-

8 8 PL B1 akcyjnej [bufor reakcyjny(invitrogen), DTT (Invitrogen), mieszanina dntp (Promega), Superscript II (Invitrogen)]. Amplifikację odpowiednich fragmentów cdna a przeprowadzono z użyciem pary starterów BelgFP/BelgRP otrzymując w RT-PCR fragment BelgApart. PCR przeprowadzono z użyciem polimerazy Deep Vent (New England Biolabs) i 2 μl reakcji RT. Produkt amplifikacji klonowano z tępymi końcami i sekwencjonowano plazmidy zawierające odpowiednie fragmenty PCR. Procedura klonowania w celu uzyskania plazmidu zawierającego segment A pod kontrolą promotora polimerazy RNA T7 odpowiadała procedurze opisanej przez Mundta i Vakharię (1996, supra). Trzy plazmidy pochodzące z klonowania każdego fragmentu PCR (pbelgapart) analizowano przez sekwencjonowanie DNA w obu kierunkach. Sklonowane fragmenty PCR sekwencjonowano i otrzymane sekwencje analizowano z użyciem Wisconsin package, Wersja 8 (Genetics Computer Group, Madison, Wis., Stany Zjednoczone). Przyrównanie sekwencji nukleotydowej, jak również sekwencji aminokwasowej, przeprowadzono z użyciem ClustalW ( Test neutralizacji wirusa (VN) To doświadczenie przeprowadzono w celu oceny pokrewieństwa antygenowego IBDV GB02 ze znanymi szczepami referencyjnymi IBDV. Surowice zebrane po zakażeniu 3-tygodniowych kurcząt SPF IBDV GB02 zbadano w oznaczeniu neutralizacji wirusa przeciwko IBDV GB02, klasycznemu typowi IBDV D78 i amerykańskim typom wariantowym IBDV VarE i IBDV GLS-5. Jedną grupę 13 3-tygodniowych kurcząt zakażono IBDV GB02 drogą oczno-nosową. Przed rozpoczęciem eksperymentu i 4 tygodnie po zakażeniu od wszystkich kurcząt zebrano próbki krwi. Surowice zbadano na obecność/nieobecność przeciwciał IBDV w teście neutralizacji wirusa (VN). Surowice zbadano na obecność/nieobecność przeciwciał IBDV w teście neutralizacji wirusa według opisanej poniżej procedury. Seryjne dwukrotne rozcieńczenia surowic zmieszano z równą objętością zawiesiny wirusa zawierającą około 750 TCID 50 IBDV D78, IBDV GB02, IBDV VarE lub IBDV GLS-5. Po inkubacji przez 90 minut w 37 C dodano fibroblasty zarodka kurzego (CEF). Miana przeciwciał określono po 5 dniach inkubacji w 37 C przez badanie mikroskopowe pojedynczych warstw CEF na obecność/nieobecność CPE charakterystycznego dla IBDV. Miana przeciwciał były odwrotnością najwyższego rozcieńczenia, w którym IBDV był całkowicie zneutralizowany. Próbki surowicy z mianami <4 (log 2 ) uważano za ujemne wobec przeciwciał IBDV. Wyniki AC-ELISA Nowy wariant immunogenny IBDV wyizolowano z materiału torby Fabrycjusza. Wirus ten nazwano izolatem GB02. Wzór panelu dla tego nowego wariantu izolatu IBDV jest pokazany w Tabeli 2A. Wyniki próbek kontrolnych są podane w Tabeli 2B. T a b e l a 2A Wzór panelu dla nowego wariantu IBDV z różnymi Moab Próbka /Moab 8 R63 B69 10 BK A1 GB ND T a b e l a 2B Wzór panelu dla różnych IBDV z różnymi Moab Kontrole /Moab 8 R63 B69 10 BK A1 Klasyczny (F52/70) Wariant E GLS epitop obecny na wirusie, - epitop nieobecny na wirusie, ND = nie oznaczono W Tabelach 2A i 2B można zobaczyć, że nowo wyizolowany IBDV reagował w inny sposób z różnymi przeciwciałami monoklonalnymi niż próbki kontrolne. Nowy wirus reaguje zarówno z Moab 10 jak i Moab 67. Moab 10 zazwyczaj reaguje ze szczepami klasycznym i podobnym do GLS, ale nigdy w połączeniu z wirusami podobnymi do wariantu E. Moab 67 reaguje tylko z wirusami podobnymi do wariantu E i nigdy z wirusami klasycznym i podobnym do GLS. Kombinacja Moab 10 i Moab 67

9 PL B1 9 obecna na tym samym wirusie w tym samym czasie jest unikalną kombinacją, wskazującą, że wyizolowany wirus jest nowym wariantem IBDV. Próbka nowego wariantu IBDV z (2-giego) pasażu w CEF została zdeponowana w Collection Nationale de Cultures de Microorganismes Institute Pasteur, Paryż, Francja pod numerem dostępu I Dane sekwencji Ponadto wytworzono i zsekwencjonowano klon cdna zawierający gen VP2 nowego wariantu IBDV. Sekwencja nukleotydowa i przypuszczalna sekwencja aminokwasowa (aa) jest pokazana w Sekw. nr Id.: Wiadomo, że epitopy, które specyficznie reagują z różnymi Moab są położone na białku VP2, w szczególności, w tak zwanych regionach zmiennych, które na ogół obejmują aminokwasy 212 do 332 (patrz Vakharia i wsp., 1994, supra). Otrzymaną częściową sekwencję nukleotydową segmentu A porównano z sekwencjami różnych szczepów IBDV (Tabela 3).

10 10 PL B1 Przyrównanie sekwencji aminokwasowych różnych szczepów IBDV serotypu I. Częściową sekwencję aminokwasową belgijskiego izolatu GB02 kodowaną przez gen poliproteiny segmentu A przyrównano do sekwencji szczepu wariantu E (Var-E: numer dostępu w Genbank X54858), szczepu wariantu A (Var-A: M64285), szczepu australijskiego (Nucleic Acids Research, 1986,12, str ), wysoce zjadliwego szczepu UK661 (AJ318896), klasycznego szczepu Faragher (D00869) i szczepu wariantowego GLS (M97346). Numeracja sekwencji aminokwasowej zgodnie z Mundt i Müller (supra 1995). Porównywany region wykazał różnorodne zmiany aminokwasowe we wszystkich sekwencjach użytych dla porównywania sekwencji. Jest to dalszy dowód, że nowowyizolowany wirus stanowi nowy typ IBDV nieopisany do tej pory. Najwyższą liczbę zmian wykryto w regionie zmiennym VP2 (aa ). Porównanie homologii procentowej sekwencji nukleotydowych i aminokwasowych (92,3% do 95,9%) wykazało, że sekwencje nowego wirusa są tak bardzo różne względem podtypów IBDV, jak podtypy były różne między sobą. Oznaczenie VN Nie można było wykryć żadnych przeciwciał przeciwko IBDV D78, IBDV GB02, IBDV VarE i IBDV GLS-5 w surowicach otrzymanych przed rozpoczęciem doświadczenia. Średnie miana przeciwciała IBDV określone w surowicach zebranych 4 tygodnie po zakażeniu są przedstawione w tabeli poniżej: Inokulum T a b e l a 4 Średni log 2 miana przeciwciała VN IBDV (odchylenie standardowe) 4 tygodnie po zakażeniu względem... IBDV D78 IBDV GB02 IBDV VarE IBDV GLS-5 GB02 IBDV 1-szy pasaż na kurczętach seria 21D02 10,9 (2,5) 16,5 (0,9) 8,3 (2,3) 8,9 (2,1) Wyniki te pokazują, że po zakażeniu IBDV GB02 odpowiedź przeciwciał na IBDV GB02 jest znacząco wyższa niż odpowiedź przeciwciała na IBDV D78, IBDV VarE i IBDV GLS-5. Wskazuje to, że IBDV GB02 jest inny antygenowo od klasycznego typu IBDV D78 i od amerykańskich typów wariantowych IBDV VarE i IBDV GLS-5. P r z y k ł a d 2. Szczepienie kurcząt szczepionką opartą na wariancie IBDV Przebieg doświadczenia Dwie grupy 20 3-tygodniowych kurcząt SPF zaszczepiono inaktywowanym wariantem szczepionki IBDV lub klasyczną inaktywowaną szczepionką IBDV. Inna grupa 3-tygodniowych 20 kurcząt SPF nie była szczepiona i służyła jako kontrola. W 6 tygodni po szczepieniu, wszystkie szczepione i kontrolne kurczęta poddano prowokacji izolatem terenowym wariantu IBDV. W cztery dni po zakażeniu usunięto torby Fabrycjusza i zbadano na obecność/nieobecność wirusa prowokującego wariantu IBDV w wyłapującym antygen ELISA. Przed rozpoczęciem eksperymentu zebrano próbki krwi od 20 kurcząt. W 2, 4 i 6 tygodni po szczepieniu próbki krwi zebrano indywidualnie od wszystkich kurcząt. Surowice zbadano na obecność/nieobecność przeciwciał IBDV w teście neutralizacji wirusa (VN). Materiały i metody Szczepionka z wariantem IBDV Wariant IBDV (izolat GB02) wytworzono w komórkach VERO i następnie inaktywowano formaldehydem. Inaktywowany antygen IBDV GB02 zemulgowano w emulsji W/O, tak, że każda dawka zawierała 10 EU (w oparciu o R63 FLISA) IBDV GB02. Wszystkie kurczęta zaszczepiono 0,5 ml szczepionki IBDV GB02 drogą domięśniową w mięsień nogi. Szczepionka z klasycznym IBDV Klasyczny IBDV (izolat D78) wytworzono w komórkach VERO, a następnie inaktywowano formaldehydem. Inaktywowany antygen IBDV D78 emulgowano w emulsji W/O, tak, że każda dawka zawierała 10 EU (w oparciu o R63 ELISA) IBDV D78. Wszystkie kurczęta zaszczepione 0,5 ml szczepionki IBDV D78 drogą domięśniową w mięsień nogi. Materiał prowokujący IBDV GB02 oczyszczono z łysinek w CEF i następnie poddano pasażowi na kurczętach SPF. Wszystkie kurczęta prowokowano określonym mianem zakaźnym TCID 50 prowokującego wirusa GB02 drogą oczną.

11 PL B1 11 Serologia Surowice zbadano na obecność/nieobecność przeciwciał IBDV w teście neutralizacji wirusa według opisanej poniżej procedury. Seryjne dwukrotne rozcieńczenia surowic zmieszano z równą objętością zawiesiny wirusa zawierającą około 750 TCID 50 albo IBDV D78 albo IBDV GB02. Po inkubacji przez 90 minut w 37 C dodano fibroblasty zarodka kurzego (CEF). Miana przeciwciał określono po 5 dniach inkubacji w 37 C przez badanie mikroskopowe pojedynczych warstw CEF na obecność/nieobecność CPE charakterystycznego dla IBDV. Miana przeciwciał były odwrotnością najwyższego rozcieńczenia, przy którym IBDV był całkowicie zneutralizowany. Próbki surowicy z mianami <4 (log 2 ) uważano za ujemne wobec przeciwciał IBDV. ELISA z wyłapywaniem antygenu Dwa rozcieńczenia (1:2 i 1:4) homogenatów toreb dodano do przeciwciała monoklonalnego MCA 67 przeciw IBDV zaabsorbowanego na płytce mikrotitracyjnej. Po inkubacji przez 1,5 godz. w 37 C, obecność prowokującego wirusa IBDV GB02 związanego z MCA67 wykryto przez dodanie przeciwciała monoklonalnego MCA8 IBDV przyłączonego do peroksydazy chrzanowej. Próbki z wartościami absorbancji wyższymi niż 2-krotna średnia wartość tła były uważane za dodatnie wobec prowokującego wirusa IBDV GB02. Wyniki i dyskusja Serologia Nie można było wykryć żadnych przeciwciał przeciwko IBDV D78 i IBDV GB02 w surowicach otrzymanych przed rozpoczęciem doświadczenia. Średnie miana przeciwciał określone w surowicach zebranych w 2, 4 i 6 tygodni po szczepieniu przedstawiono w tabeli poniżej: T a b e l a 5 Średnie miano przeciwciała VN IBDV (odchylenie standardowe) w... tygodni po szczepieniu Inokulum 2 tyg. 4 tyg. 6 tyg. D78 GB02 D78 GB02 D78 GB02 IBDV D78 (10 EU/dawka) IBDV GB02 (10 EU/dawka) Kontrole (bez inokulacji) 3,8 (1,3) <4,0 (0,0) 11,6 (3,2) 6,0 (2,4) 12,8 (2,9) 6,0 (2,3) 5,8 (2,2) 6,3 (1,3) 9,4 (2,4) 12,0 (2,3) 9,7 (1,6) 14,0 (2,5) <4,0 (0,0) <4,0 (0,0) <4,0 (0,0) <4,0 (0,0) <4,0 (0,0) <4,0 (0,0) Wyniki te pokazują, że zarówno inaktywowana szczepionka D78 IBDV jak i inaktywowana szczepionka GB02 IBDV wywołują odpowiedź odpornościową po zaszczepieniu 3-tygodniowych kurcząt SPF. Po szczepieniu klasyczną inaktywowaną szczepionką D78 IBDV, oznaczenie neutralizacji krzyżowej wykazało względnie dużą różnicę w średnim mianie przeciwciała przeciwko homologicznemu antygenowi D78 IBDV i heterologicznemu antygenowi GB02. To ostanie wskazuje, że nowy wariat IBDV nie jest antygenowo spokrewniony z klasycznym IBDV. Wykrywanie prowokującego wirusa IBDV w torbach przez ELISA z wyłapywaniem antygenu Wyniki otrzymane przy wykrywaniu prowokującego wirusa w torbach usuniętych 4 dni po zakażeniu są przedstawione w tabeli poniżej. Inokulum T a b e l a 6 Odsetek toreb, w których został wykryty prowokujący wirus IBDV IBDV D78 (10 EU/dawka) 40% IBDV GB02 (10 EU/dawka) 0% Kontrole (bez inokulacji) 90%

12 12 PL B1 Wyniki pokazują, że po prowokacji izolatem terenowym IBDV GB02 nie można było wykryć żadnego wirusa prowokującego w żadnej z toreb uzyskanych od kurcząt szczepionych inaktywowaną szczepionką IBDV GB02. Z drugiej strony, prowokujący wirus IBDV GB02 można było wykryć w 40% toreb uzyskanych od kurcząt zaszczepionych inaktywowaną szczepionką IBDV D78. Ponieważ torba dla IBDV jest uważana za szczególnie pożądane miejsce replikacji wirusa, wyniki otrzymane w tym doświadczeniu wskazują, że inaktywowana szczepionka IBDV GB02 dostarcza kurczętom skutecznej ochrony przeciwko zakażeniu izolatem terenowym IBDV GB02. Zatem, wyniki wskazują, że szczepionka oparta na klasycznym IBDV nie dostarcza kurczętom skutecznej ochrony przeciwko zakażeniu nowym wariantem IBDV. Zastrzeżenia patentowe 1. Wariant wirusa zakaźnego zapalenia torby Fabrycjusza (IBDV), znamienny tym, że wiąże się z przeciwciałem monoklonalnym 10 i 67, wydzielanym przez linie komórek hybrydoma I-2812 i HB-11122, zdeponowane w Collection Nationale de Cultures de Microorganismes Institute Pasteur, Paryż, Francja i ATCC, Rockville, Stany Zjednoczone, odpowiednio. 2. Wariant IBDV według zastrz. 1, znamienny tym, że zawiera kodony dla aminokwasów Ser (pozycja 222), His (pozycja 249), Ala (pozycja 256) i Ser (pozycja 278) w regionie kodującym VP2 segmentu A genomu IBDV. 3. Wariant IBDV według zastrz. 2, znamienny tym, że zawiera region kodujący VP2, który koduje białko VP2 mające sekwencję aminokwasową regionu zmiennego jak pokazana w Sekw. Nr Id.: Wariant IBDV według zastrz. 3, znamienny tym, że jest izolatem GB02 wirusa, którego próbka została zdeponowana w Institute Pasteur, Paryż, Francja pod numerem dostępu I Szczepionka do zastosowania do ochrony drobiu przed chorobą powodowaną przez zakażenie IBDV, znamienna tym, że zawiera wariant IBDV określony w zastrz. 1-4, razem z dopuszczalnym farmaceutycznie nośnikiem lub rozcieńczalnikiem. 6. Szczepionka według zastrz. 5, znamienna tym, że wariant IBDV jest w postaci inaktywowanej. 7. Szczepionka według zastrz. 5 lub 6, znamienna tym, że ponadto zawiera jako składniki jeden lub więcej innych patogenów zakaźnych dla drobiu. 8. Szczepionka według zastrz. 5-7, znamienna tym, że zawiera adiuwant. 9. Sposób wytwarzania wariantu IBDV, znamienny tym, że wariant IBDV określony w zastrz. 1-4 namnaża się w hodowli komórkowej, a następnie zbiera z hodowli komórkowej. 10. Sposób wytwarzania szczepionki określonej w zastrz. 5-8, znamienny tym, że wariant IBDV określony w zastrz. 1-4 miesza się z dopuszczalnym farmaceutycznie nośnikiem lub rozcieńczalnikiem. 11. Zastosowanie wariantu IBDV określonego w zastrz. 1-4 do wytwarzania szczepionki dla drobiu przeciwko chorobie wywołanej zakażeniem IBDV. 12. Wariant IBDV według zastrz. 3, znamienny tym, że jest izolatem GB02 wirusa, którego próbka została zdeponowana w Institute Pasteur, Paryż, Francja pod numerem dostępu lub I Szczepionka do użycia do ochrony drobiu przed chorobą powodowaną przez zakażenie IB- DV, znamienna tym, że zawiera wariant IBDV określony w zastrz. 12, razem z dopuszczalnym farmaceutycznie nośnikiem lub rozcieńczalnikiem. 14. Szczepionka według zastrz. 13, znamienna tym, że wariant IBDV jest w postaci inaktywowanej. 15. Szczepionka według zastrz. 13 lub 14, znamienna tym, że ponadto zawiera jako składniki jeden lub więcej innych patogenów zakaźnych dla drobiu. 16. Szczepionka według zastrz , znamienna tym, że zawiera adiuwant. 17. Sposób wytwarzania wariantu IBDV określonego w zastrz. 12, znamienny tym, że wariant IBDV jest namnażany w hodowli komórkowej, a następnie zbierany z hodowli komórkowej, 18. Sposób wytwarzania szczepionki określonej w zastrz , znamienny tym, że wariant IBDV określony w zastrz. 12 miesza się z dopuszczalnym farmaceutycznie nośnikiem lub rozcieńczalnikiem. 19. Zastosowanie wariantu IBDV określonego w zastrz. 12 do wytwarzania szczepionki dla drobiu przeciwko chorobie wywołanej zakażeniem IBDV.

13 PL B1 13

14 14 PL B1 Departament Wydawnictw UP RP Cena 4,92 zł (w tym 23% VAT)