Długoterminowe przechowywanie nasienia ryb jesiotrowatych - kriokonserwacja

Transkrypt

1 Innowacyjne techniki oceny biologicznej i ochrony cennych gatunków ryb hodowlanych i raków Długoterminowe przechowywanie nasienia ryb jesiotrowatych - kriokonserwacja

2 Czy można przezwyciężyć śmierć i zatrzymać życie na dowolnie długi czas?

3

4 Kriokonserwacja Kriokonserwacja czyli technologia głębokiego zamrażania przechowywania - rozmrażania jest techniką umożliwiającą przechowywanie materiału biologicznego przez bardzo długi okres czasu. 16 sierpnia

5 Kriokonserwacja Podczas przechowywania w temperaturze poniżej 139 C woda przechodzi w stan krystaliczny; jej cząsteczki drgają, lecz nie przemieszczają się, co uniemożliwia przebieg jakichkolwiek reakcji chemicznych (Farrant i Ashwood-Smith 1980). W tej temperaturze jedynym zagrożeniem natywności materiału biologicznego jest promieniowanie tła oraz protony promieni kosmicznych powodujące jonizację, która akumuluje się z upływem czasu. Teoretycznie wyliczono, że takie oddziaływanie może uszkodzić zamrożone komórki po do lat przechowywania (Mazur 1976), czy nawet dopiero po lat (Ashwood-Smith 1980).

6 Procesy fizykochemiczne zachodzące podczas zamrażaniarozmrażania materiału biologicznego zniszczenie przez dehydratację 16 sierpnia

7 Cele kriokonserwacji materiału biologicznego tworzenie chimer, tworzenie organizmów transgenicznych GMO), tworzenie banku genów.

8 Znaczenie kriokonserwacji gamet ryb 1. Ochrona dziko żyjących populacji zagrożonych wyginięciem [Norwegia od 1988 roku realizuje program ochrony ponad 100 rodzimych populacji łososia, w której podstawowym narzędziem jest kriokonserwacja nasienia (Gausen, 1993)]. 2. Przechowywanie genomów osobników należących do cennych linii hodowlanych, osobników wytworzonych na drodze manipulacji genomowych i genowych. 3. Możliwość przeprowadzenia tarła w sytuacji, gdy tarlaki nie osiągają w tym samym czasie gotowości tarłowej, lub też okres tarłowy przypada w różnych porach roku.

9 Znaczenie kriokonserwacji gamet ryb 4. Możliwość przeprowadzenia tarła w sytuacji, gdy tarlaki znajdują się w dowolnie oddalonych od siebie miejscach. 5. Możliwość zminimalizowania efektu chowu wsobnego poprzez wymianę materiału genetycznego. 6. Możliwość zweryfikowania skuteczności prac selekcyjnych. 7. Ułatwienia w pracach naukowych.

10 Znaczenie kriokonserwacji nasienia ryb jesiotrowatych 1. Ochrona bioróżnorodności 2. Przechowywanie genomów osobników należących do cennych linii hodowlanych, osobników wytworzonych na drodze manipulacji genomowych i genowych. 3. Możliwość przeprowadzenia tarła w sytuacji, gdy tarlaki dojrzewają asynchronicznie lub znajdują się w dowolnie oddalonych od siebie miejscach. 4. Możliwość zminimalizowania efektu chowu wsobnego poprzez wymianę materiału genetycznego Możliwość zweryfikowania skuteczności prac selekcyjnych. 6. Ułatwienia w pracach naukowych.

11 Technika kriokonserwacji W procesie kriokonserwacji można wyróżnić kilka etapów: czynności przygotowawcze przed zamrażaniem, zamrażanie, przechowywanie, rozmrażanie.

12 Czynności przygotowawcze przed zamrażaniem selekcja tarlaków, pobór nasienia, zabezpieczenie nasienia przed kontaktem z wodą i schłodzenie go, kontrola jakości nasienia, podejmowanie decyzji kontynuowanie procesu technologicznego lub zaniechanie procedury.

13 Zamrażanie nasienia faza wstępna Rozrzedzanie mlecza: dobór rozcieńczalnika (skład chemiczny: proste - złożone), dobór stopnia rozrzedzenia mlecza (od 1:1 do 1:20), dobór krioprotektora, zapewnienie właściwych warunków rozrzedzania (zminimalizowanie szoku termicznego i osmotycznego).

14 Krioprotektory Przenikające: - wnikają do komórki, zmniejszają tempo dyfuzji wody, neutralizują skutko szoku osmotycznego, zmniejszają tempo powiększania się kryształów lodu, -są to, m.in. glicerol, metanol, glikol etylenowy lub propylenowy, DMSO (dimetylosulfotlenek), DMA (dimetyloacetamid); Nieprzenikające: podnoszą - obniżają temperaturę zamarzania i temperaturę zeszklenia, -są to, m.in. cukry (np. glukoza, sacharoza), białka (np. surowica, mleko, żółtko jaja kurzego), polimery (np. PVP)

15 Skład wybranych rozrzedzalników stosowanych do mrożenia nasienia ryb jesiotrowatych Krioprotektor Rozcieńczalnik Gatunek 16% DMSO 118 mm Tris-HCl, 400 mm sacharoza jesiotr syberyjski 5% DMSO 10 mm Tris, 25 mm NaCl bester 17,5% glikol etylenowy 10 mm Tris, 25 mm NaCl jesiotr syberyjski, bester 5% metanol 10 mm Tris, 25 mm NaCl bester 10% metanol 10 mm Tris, 25 mm NaCl lub 30 mm Tris, 0,25 mm KCl, 23,4 mm sacharoza 17,5% metanol 10 mm Tris, 25 mm NaCl bester jesiotr syberyjski, rosyjski, bester, sterlet, bieługa

16 Zamrażanie nasienia faza wstępna Konfekcjonowanie rozrzedzonego nasienia: słomki (0,25 0,5 ml), ampułki (0,5 1 ml ), kulki ( μl)

17 Zamrażanie nasienia Metody zamrażania: na suchym lodzie krople rozrzedzonego nasienia nanosi się na taflę suchego lodu w programowanych elektronicznie kriostatach w parach azotu

18 Zamrażanie nasienia ryb jesiotrowatych Przygotowane na styropianowym statywie słomki (poj. 0,25 i 0,5 ml) z nasieniem jesiotra Zamrażanie nad powierzchnią ciekłego azotu (odległość 3 4 cm, czas mrożenia 3 5 min, tempo mrożenia C/min)

19 Przechowywanie nasienia (Bank Nasienia) Czas przechowywania: do lat

20 Rozmrażanie nasienia W zależności od sposobu konfekcjonowania nasienia rozmrażamy: w łaźni wodnej (temp C) słomki, ampułki; w płynie rozmrażającym (temp C) kulki. Najczęściej stosowane płyny rozmrażające to roztwór NaCl, NaHCO 3, płyn celomatyczny.

21 Rozmrażanie nasienia ryb jesiotrowatych Zanurzenie słomek w łaźni wodnej: temperatura: 40 C, czas rozmrażania: słomki o pojemności 0,25 ml 6 s słomki o pojemności 0,5 ml 7-8 s

22 Odsetek wyklutych larw (%) ,00 81,50 24,57 23,60 78,20 40,60 80,60 79,80 75,40 56,27 57,70 45,13 Nasienie świeże Nasienie mrożone Liczba plemników/ziarno (x 10 3 ) Liczba plemników/jajo a odsetek wyklucia po zapłodnieniu ikry świeżym i kriokonserwowanym nasieniem sterleta (n=3)

23 Dziękuję za uwagę