Badania wpływu Selolu i seleninu sodu na komórki HeLa in vitro

Transkrypt

1 Badania wpływu u i seleninu sodu na komórki HeLa in vitro Jadwiga DUDKIEWICZ WILCZYŃSKA, Izabela KSIĄŻEK, Karolina NOWAK, Piotr SUCHOCKI, Sylwia FLIS, Monika KILJAN, Elżbieta ANUSZEWSKA - Narodowy Instytut Leków; Warszawa Prosimy cytować jako: CHEMIK 2011, 65, 2, Wstęp Selen ma fundamentalne znaczenie dla zdrowia człowieka, bierze udział w wielu procesach fizjologicznych i dlatego jest zaliczany do mikroelementów niezbędnych do prawidłowego funkcjonowania organizmów wyższych [1]. Wyniki badań epidemiologicznych sugerują, że zwiększonemu ryzyku powstawania nowotworów towarzyszy niewystarczająca podaż selenu, natomiast klinicznych oraz eksperymentalnych wyraźnie wskazują, że selen zabezpiecza przed ich rozwojem [2, 3]. Biologiczna rola selenu została poznana wraz z odkryciem, że jest on m.in. składnikiem centrum aktywnego wielu enzymów. Najbardziej znanym przykładem enzymów selenozależnych jest rodzina peroksydaz glutationowych (GSH-px), których zasadniczą funkcją jest obrona organizmu przed stresem oksydacyjnym. W niedoborze selenu obserwuje się znaczne obniżenie poziomu GSH-px oraz zwiększenie produkcji aktywnych związków tlenu. Ustalono także, że to właśnie seleniny w erytrocytach, a nie selenometionina czy selenocysteina, reagują z glutationem, dając biologicznie aktywną formę selenu w postaci selenodiglutationu. Selenodiglutation, który powstaje w reakcji glutationu z selenem, będącym na +4 stopniu utlenienia, posiada silne właściwości antyoksydacyjne i przeciwnowotworowe, indukuje apoptozę komórek nowotworowych u ludzi [4 7]. W takiej postaci jest on także specyficznie wbudowywany do centrum aktywnego enzymów. Jednym z potencjalnych związków przeciwnowotworowych, dla którego obecnie prowadzone są badania zmierzające do ustalenia jego mechanizmu działania, jest 5%, związek organiczny zawierający selen(iv), stanowiący mieszaninę seleninotriglicerydów otrzymywanych na bazie oleju słonecznikowego [8]. Podstawowym badaniem przesiewowym potencjalnych produktów leczniczych jest ocena ich działania cytotoksycznego. W badaniach tych stosuje się techniki pozwalające na pomiar zmian, związanych z zaburzeniami procesów fizjologicznych komórek, powodowanych przez badaną substancję. Celem takich badań jest wyznaczenie wpływu badanej substancji na przeżywalność komórek w odniesieniu do kontroli, którą najczęściej stanowi hodowla komórek w samej pożywce lub hodowla poddana ekspozycji na inną substancję leczniczą, o znanej cytotoksyczności. Celem badań podjętych w tej pracy było porównanie cytotoksycznego działania, na komórki nowotworowe HeLa, badanego związku organicznego, zawierającego selen u 5% z seleninem sodu znanym nieorganicznym związkiem selenu. Badania przeprowadzono z wykorzystaniem metod: MTT, pomiaru białka całkowitego (Bradford) i cytometrii przepływowej z barwieniem Aneksyną V i jodkiem propidyny. Do wyznaczenia penetracji selenu do komórek wykorzystano metodę ICP- MS. 2. Część eksperymentalna 2.1 Badane związki i odczynniki 5% (w postaci liposomów, otrzymany z Zakładu Analizy Leków, WUM), selenin sodu (Sigma), MTT (Sigma), izopropanol (Labscan), odczynnik Bradforda (Bio-Rad Protein Assay), albumina ludzka (Biomed), FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit I (BD Pharmingen), PBS (buforowany roztwór soli), pełen i bez jonów Mg 2+ i Ca 2+ (Instytut Immunologii i Terapii Doświadczalnej), trypsyna, EDTA (Lonza), roztwór wzorcowy selenu do ICP-MS zawierający 1 mg/ml Se (Inorganic Ventures), roztwór wzorca wewnętrznego: Co o stężeniu 10 mg/l, kwas azotowy o stopniu czystości do ICP (Merck), woda redestylowana dodatkowo oczyszczana w systemie Nanopure Deionization System (Barnstead), argon 99,995% obj. (BOC GAZY, Warszawa). 2.2 Hodowla komórkowa Hodowlę komórek HeLa Human Cervix Carcinoma Cells, komórki ludzkiego nowotworu szyjki macicy (German Collection) prowadzono w atmosferze 5% CO 2, w temp. 37 C, w podłożu EMEM (Eagle s Minimum Essential Medium Lonza) z dodatkiem 10% FBS (Fetal bovine serum Lonza) oraz dodatkiem 1% antybiotyków (Penicylina, Streptomycyna, Amfoterycyna B Lonza). Komórki zaszczepiano, w zależności od czasu inkubacji z badanymi związkami, w ilości 1 lub 1,5 x 10 5 na studzienkę płytki 6-studzienkowej i 3 lub 5 x 10 3 na studzienkę płytki 96-studzienkowej (Nunc, Greiner). 2.3 Inkubacja z lekiem Po 24 h inkubacji komórek, w warunkach opisanych powyżej, wymieniano pożywkę na świeżą z badanymi związkami, w wybranym na podstawie badań pilotowych zakresie stężeń dla u, a dla seleninu sodu na podstawie danych literaturowych. Związki stosowano w zakresach stężeń, w przeliczeniu na selen: selenin sodu od 1 do12 µm Se, a od 6,25 do 500 µm Se. Obserwowano wpływ badanych związków na komórki HeLa po 24 lub 48 h inkubacji. Próbę kontrolną stanowiła odpowiednio hodowla komórek prowadzona w samej pożywce (dla seleninu sodu) i w pożywce z dodatkiem pustych liposomów (dla u), w ilości odpowiadającej najwyższemu stosowanemu stężeniu tego związku w danym teście. 2.4 Ocena żywotności komórek test MTT Po 24 lub 48 h inkubacji z placebo lub badaną substancją, usuwano pożywkę znad komórek i przepłukiwano dwukrotnie wszystkie dołki 75 µl PBS bez jonów Ca 2+ i Mg 2+. Następnie do każdej studzienki dodawano po 50 µl odczynnika MTT o stężeniu 0,25 mg/ml (wcześniej przygotowanego roztworu soli tetrazoliowej w PBS bez jonów Ca 2+ i Mg 2+ ). Po upływie 4 h rozpuszczano powstałe kryształy formazanu poprzez dodatek do studzienek 200 µl 99,7% izopropanolu. Absorbancję roztworów mierzono spektrofotometrycznie przy długości fali 540 nm, z zastosowaniem czytnika płytek iems Reader MF (Labsystems). Przyjmując żywotność komórek w hodowli kontrolnej za 100% obliczano, z uzyskanych wartości absorbancji, żywotność komórek w próbach z badanymi związkami. 2.5 Oznaczanie białka całkowitego metoda Bradforda Po 24 lub 48 h inkubacji z placebo lub badaną substancją, komórki w studzienkach przepłukiwano PBS bez jonów Ca 2+ i Mg 2+, a następnie zdejmowano z powierzchni studzienek przez zeskrobywanie i wirowano przez 7 min., 1500 rpm. Otrzymany osad przepłukiwano PBS i ponownie wirowano. Komórki zawieszano w 1 ml wody dejonizowanej. nauka technika nr 2/2011 tom

2 nauka technika W celu wyznaczenia całkowitej zawartości białka, 0,5 ml zawiesiny komórkowej poddawano lizie z 0,5 ml NaOH (1 M). Po dokładnym wymieszaniu komórek pobierano po 20 µl lizatu na studzienkę płytki 96-studzienkowej, w 6-krotnym powtórzeniu. Równolegle przygotowywano krzywą wzorcową dla albuminy, w zakresie stężenia 1 10 µg/ml. Do wszystkich studzienek dodawano po 180 µl odczynnika Bradforda i mierzono absorbancję przy zastosowaniu filtra 600 nm stosując spektrofotometr Multiscan Plus Typ 314 (Labsystem). Przyjmując zawartość białka całkowitego dla komórek kontrolnych za 100% obliczano odsetek żywotności komórek w próbach badanych. 2.6 Cytometryczne oznaczanie indukcji apoptozy komórkowej test z Aneksyną V i jodkiem propidyny Po 24 lub 48 h inkubacji z placebo lub badaną substancją, do probówek wirówkowych zbierano pożywkę znad komórek oraz komórki po wcześniejszym ich ztrypsynowaniu. Całość wirowano 7 min. przy 1500 rpm. Osad przepłukiwano PBS i ponownie wirowano. Po usunięciu supernatantu komórki zawieszano w buforze wiążącym (dostarczonym w zestawie), w ilości odpowiadającej stężeniu 1 x 10 6 komórek/ml. Następnie do probówek cytometrycznych przenoszono po 100 µl zawiesiny. Do każdej probówki dodawano po 5 µl Aneksyny V i 5 µl jodku propidyny. Mieszano i inkubowano w ciemności przez 15 min. Po tym czasie dodawano po 400 µl buforu wiążącego i poddawano analizie w cytometrze przepływowym FACS Calibur (Becton Dickinson), wyposażonym w oprogramowanie CellQuest. 2.7 Oznaczanie stopnia penetracji selenu metoda ICP-MS 0,5 ml zawiesiny komórek, przygotowanej zgodnie z punktem 2.5, poddawano mineralizacji w kwasie azotowym, z wykorzystaniem energii mikrofalowej, prowadzonej w systemie zamkniętym, w układzie 4-krokowym. Mineralizaty przenoszono ilościowo do kolb miarowych o pojemności 20 ml, dodawano po 20 µl roztworu wzorca wewnętrznego (wzorzec Co o stężeniu 10 µg/l) i uzupełniano wodą. Oznaczenie zawartości selenu w komórkach prowadzono w spektrometrze mas z plazmą indukcyjnie sprzężoną Thermo Electron X Series II firmy Thermo Electron Corporation, USA. Optymalny zakres pomiarowy w metodzie ICP-MS dla tego pierwiastka wynosi 0,1-2,5 µg/l. 3. Omówienie wyników Do ilościowego określenia aktywności cytotoksycznej potencjalnych chemioterapeutyków najczęściej wykorzystuje się różnego rodzaju testy komórkowe prowadzone w hodowli in vitro, w których oznaczane są różne parametry związane ze wzrostem (proliferacją) komórek. W pracy wykorzystano pośredni pomiar aktywności dehydrogenazy mitochondrialnej (MTT), pomiar zawartości białka całkowitego, oparty na zdolności wiązania się białek komórkowych z barwnikiem Coommasie Brilliant Blue oraz zdolność badanych związków do indukcji apoptozy w komórkach HeLa. 3.1 Wpływ seleninu sodu i u na żywotność komórek HeLa (test MTT) Toksyczny wpływ u i seleninu sodu na komórki HeLa oceniano stosując test MTT, na podstawie zmian aktywności dehydrogenazy bursztynianowej, enzymu mitochondrialnego obecnego w żywych komórkach. Enzym ten przekształca rozpuszczalną sól tetrazoliową [bromek 3-(4,5-dimetylotiazol-2-yl)-2,5-ddifenylotetrazoliowy] w formę zredukowaną, nierozpuszczalny formazan, który wytrąca się w postaci kryształów rozpuszczalnych w izopropanolu. Wartość absorbancji roztworu izopropanolowego mierzonej przy długości fali ok. 540 nm jest proporcjonalna do liczby żywych komórek w hodowli. Na podstawie uzyskanych wyników oceniano żywotność komórek po inkubacji 24 lub 48 h z badanymi związkami. Z krzywych zależności przeżywalności komórek od stężenia selenu, pochodzącego z badanych związków, wyznaczono stężenie hamujące wzrost komórek, w 50%, czyli wartość IC 50, charakteryzującą aktywność cytotoksyczną badanych związków (rys.1). Rys. 1. Wpływ selenu, pochodzącego z seleninu sodu i u, na przeżywalność komórek HeLa (test MTT) Stwierdzono, że pod wpływem seleninu sodu już po 24 h inkubacji, następuje znaczące zmniejszenie liczby żywych komórek HeLa, zależne od stężenia selenu dodanego do pożywki. W zależności od czasu inkubacji 24 lub 48 h, IC 50 dla tego związku wynosiło odpowiednio około 5,9 µm i 2,6 µm Se. Z danych uzyskanych dla u, po 24 h inkubacji, zmniejszenie przeżywalności komórek do 50% (IC 50 ) stwierdzono dopiero przy stężeniu selenu ok. 216 µm. Z przedstawionego wykresu wynika, że obniżanie się krzywej przeżywalności ma zdecydowanie łagodniejszy charakter i dla najwyższego zastosowanego stężenia: 250 µm Se, liczba żywych komórek po 24 h inkubacji nadal wynosi ok. 45%. Wydłużenie czasu inkubacji do 48 h wpłynęło na zdecydowane przesunięcie się wartości IC 50 w kierunku niższych wartości stężenia selenu w medium, IC 50 ~ 80 µm Se. W badaniu tym nie obserwowano cytotoksycznego wpływu pustych liposomów, stanowiących nośnik dla u. Oznacza to, że same liposomy nie wywołują efektu toksycznego, co pozwala uznać je jako odpowiednią kontrolę dla tego eksperymentu i przyjąć dla niej wartość 100% przeżywalności. Z uwagi na wysoką toksyczność seleninu sodu w dalszych badaniach zrezygnowano z czasu inkubacji 48 h. 3.2 Wpływ badanych związków na zawartość białka całkowitego (metoda Bradforda) Zmniejszenie liczby żywych komórek w hodowlach, obserwowane w teście MTT, zależne od stężenia selenu w pożywce i czasu inkubacji, przełożyło się również na uzyskaną zawartość białka całkowitego. Obniżanie zawartości białka całkowitego, w hodowli komórek inkubowanych przez 24 h z seleninem sodu i 24 lub 48 h z em, w odniesieniu do kontroli, następowało wraz ze wzrostem stężenia selenu (rys. 2). Rys. 2. Wpływ selenu, pochodzącego z seleninu sodu i u, na zawartość białka całkowitego (metoda Bradforda) 106 nr 2/2011 tom 65

3 W przypadku obu związków, w obu czasach inkubacji, tylko przy najniższym zastosowanym stężeniu selenu, 1 µm dla seleninu sodu i 12,5 µm dla u, obserwowano zwiększenie ilości białka w stosunku do kontroli, odpowiednio o ok. 14 i 7%. Porównanie tempa spadku całkowitej ilości białka wraz ze wzrostem stężenia badanych związków w pożywce, pokazuje zdecydowanie większą aktywność w tym względzie seleninu sodu. Dla tego związku istotną różnicę w ilości białka całkowitego, to jest ok. 15% w stosunku do kontroli, obserwuje się już przy zastosowanym stężeniu 3 µm Se. Porównywalny spadek ilości białka występuje w przypadku u dla stężenia przekraczającego 37,5 µm Se, po 24 h inkubacji. W stosunku do kontroli, po 24 h dla stężenia ok. 6 µm Se, w doświadczeniu z seleninem sodu, zaobserwowano 50% obniżenie zawartości białka całkowitego. Dla u, przy najwyższym zastosowanym stężeniu, po 24 h inkubacji zawartość białka wynosiła około 60%. Obniżenie ilości oznaczonego białka całkowitego do 50% stwierdzono dla stężenia ok. 75 µm Se w u, po wydłużeniu czasu ekspozycji do 48 h. Tablica 1 Procentowy rozkład komórek HeLa: żywych (Z), apoptycznych (A) i nekrotycznych (N) w hodowli poddanej działaniu seleninu sodu lub u, w wybranym zakresie stężeń (w przeliczeniu na selen) stężenie Se, µm Selenin sodu % poszczególnych frakcji stężenie Z A N Z A N Z A N Se, µm 24 h 24 h 48 h 0 85,1 14,5 0,4 0 83,9 14,8 1,3 90,0 9,7 0,3 1 85,3 14,1 0,6 6,25 84,0 14,4 1, ,8 13,0 1,2 12,5 84,1 15,0 0,9 86,1 13,4 0,5 6 56,6 42,0 1,4 37,5 81,3 17,8 0, ,5 76,0 2, ,7 16,5 0,8 82,6 17,0 0, ,0 21,3 0, nauka technika 3.3 Proapoptotyczna aktywność seleninu sodu i u (badanie cytometryczne) Zdolność badanych związków do indukowania apoptozy badano po 24 h inkubacji z seleninem sodu oraz 24 i 48 h inkubacji z em, w teście z Aneksyną V i jodkiem propidyny. Uzyskane wyniki wskazują na wyraźną różnicę w aktywności proapoptotycznej obu związków (rys. 3), co koreluje z danymi uzyskanymi w teście MTT i oznaczania zawartości białka całkowitego. Zastosowany układ doświadczalny pozwala na rozróżnienie komórek żywych, apoptotycznych i nekrotycznych ,5 83,6 1, ,1 24,2 3,7 59,7 39,6 0, ,8 30,7 5,5 41,0 57,7 1,3 3.4 Penetracja selenu do komórek HeLa (metoda ICP-MS) Zdolność do penetracji selenu z badanych związków do komórek HeLa oceniano stosując metodę ICP-MS. Po 24 h inkubacji stwierdzono, że występuje wyraźne zróżnicowanie ilości wykrywanego selenu w komórkach, w zależności od zastosowanego związku. Uzyskane dane wskazują, że selen z roztworu seleninu sodu wykazuje większą zdolność do przenikania przez błony komórkowe niż z podanego w postaci liposomów u. Średnie wartości (n=3) oznaczonej zawartości selenu, uzyskane dla obu podawanych związków, znormalizowane o wyniki oznaczania białka całkowitego w komórkach (pkt. 3.2.), w odniesieniu do zadanych stężeń selenu przedstawiono na rysynku 4. Rys. 3. Zależność odsetka apoptycznych komórek HeLa od stężenia selenu podawanego w postaci seleninu sodu lub u (test z Aneksyną V i jodkiem propidyny) Z uzyskanych danych, przedstawionych w tablicy 1 wynika, że w przypadku seleninu sodu wraz ze wzrostem stężenia tego związku, obserwuje się wyraźny wzrost ilości komórek apoptotycznych, osiągający przy najwyższym z zastosowanych stężeń wartość 83,6%. W przypadku u, dla porównywalnego stężenia selenu (12,5 µm), odsetek komórek apoptycznych wynosi tylko 15%. Wydłużenie czasu ekspozycji komórek na do 48 h. istotnie wpłynęło na nasilenie apoptozy przy wyższych stężeniach, tj. powyżej 100 µm Se. Dla najwyższego zastosowanego stężenia 500 µm Se, obserwowano po 48 h prawie dwukrotne zwiększenie liczby komórek apoptotycznych w populacji. Z punktu widzenia cytotoksycznego mechanizmu działania badanych związków, stwierdzono niewielki odsetek komórek nekrotycznych, w obu czasach inkubacji. Odsetek komórek nekrotycznych mieścił się pomiędzy 0,4 2,5% i 0,3 5,5%, odpowiednio dla seleninu sodu i u. Rys. 4. Penetracja selenu z seleninu sodu i u do komórek HeLa (ICP-MS) Po 24 h inkubacji komórek HeLa z badanymi związkami, dla najniższych stężeń: 1 µm Se dla seleninu sodu i 12,5 µm Se dla u stwierdzono, że ilość wykrywanego w komórkach selenu jest porównywalna do ilości stwierdzonej w komórkach hodowli kontrolnej. Dla kolejnych stężeń regularny wzrost ilości wykrywanego w komórkach selenu obserwuje się od stężenia 3 µm Se dla seleninu sodu i 37,5 µm Se dla u. W przypadku seleninu sodu przebieg krzywej penetracji, po 24 h inkubacji (rys. 4) ma charakter zbliżony do wykładniczego, a dla u logarytmicznego. Oznacza to, że różnica w krotności penetracji, w obserwowanym zakresie stężeń, zwiększa się wraz ze wzrostem stężenia selenu. Zbliżoną wartość ilości oznaczonego selenu, tj. ok. 0,3 ng Se/µg białka, otrzymano dla wyjściowych stężeń nr 2/2011 tom

4 nauka technika 6 µm Se i 37,5 µm Se, odpowiednio dla seleninu sodu i u. Obliczona różnica w dynamice penetracji wskazuje na ok. 6-krotnie szybsze wchłanianie selenu z roztworu seleninu sodu. Zdecydowanie wyższe stężenia selenu w komórkach po podaniu u obserwowano po wydłużeniu czasu inkubacji do 48 h. W tym przypadku dla stężenia 75 µm Se otrzymano wartość penetracji porównywalną z najwyższą uzyskaną dla seleninu sodu, tj. ok. 0,9 ng Se/µg białka. Po 48 h. bardzo istotnie wzrasta ilość wykrywanego selenu w komórkach dla najwyższego zastosowanego stężenia u (125 µm Se), bo aż 3-krotnie w stosunku do ilości wykrywanej po 24 h. W tablicy 2 podsumowano wyniki uzyskane w teście MTT, w badaniu cytometrycznym i podczas oznaczania białka całkowitego dla podobnej ilości selenu penetrującego do komórek z obu związków, tj. ok. 0,3 ng Se/µg białka, co odpowiada stężeniu wyjściowemu seleninu sodu 6 µm Se i u 37,5 µm Se. Z danych tych wynika, że po 24 h inkubacji selenin sodu ok. 1,7 raza silniej hamuje wzrost komórek, niż. Tablica 2 Porównanie przeżywalności komórek HeLa wyznaczonej trzema metodami, dla porównywalnej penetracji selenu do komórek: 0,3 ng Se/µg białka, oznaczonej po 24 h inkubacji komórek z seleninem sodu, w stężeniu 6,0 µm Se i em, w stężeniu 37,5 µm Se Metoda odsetek żywych komórek, % Tablica 3 przedstawia zestawienie wyników z powyższych badań, dla porównywalnej ilości selenu wykrytego w komórkach, tj. ok. 0,9 ng/µg białka. Jest to wartość uzyskana dla najwyższego użytego stężenia selenu w seleninie sodu (12 µm), po 24 h inkubacji i u zastosowanego w stężeniu 75 µm Se, ale dopiero po 48 h. W przypadku seleninu sodu penetrująca do komórek ilość selenu powodowała istotne przyhamowanie przeżywalności komórek i silną indukcję apoptozy, co odzwierciedlało się w ilości wykrywanego białka całkowitego. W przypadku tej samej ilości selenu oznaczonego po 48 h inkubacji komórek z em, przeżywalność komórek uzyskana w testach MTT i wynikająca z oznaczania białka całkowitego wynosiła ok. 50%, natomiast liczba żywych komórek uzyskanych w teście z aneksyną i jodkiem propidyny wynosiła ok. 80%. Tablica 3 Porównanie przeżywalności komórek HeLa wyznaczonej trzema metodami, dla porównywalnej penetracji selenu do komórek: 0,9 ng Se/µg białka, oznaczonej po 24 h inkubacji komórek z seleninem sodu, w stężeniu 12,0 µm Se i po 48 h inkubacji z em, w stężeniu 37,5 µm Se Metoda odsetek żywych komórek, % Selenin sodu MTT 10,6 52,2 Bradford 25,2 51,6 Test z Aneksyną V i jodkiem propidyny Selenin sodu MTT 44,7 78,0 Bradford 48,4 96,7 Test z Aneksyną V i jodkiem propidyny 56,6 81,3 14,4 82,6 4. Podsumowanie i wnioski Przeprowadzone dotychczas badania z komórkami nowotworowymi HeLa dla dwóch różnych związków selenu: seleninu sodu i u potwierdzają opisywane literaturowo różnice w wykorzystaniu przez komórkę selenu(iv), ze związku nieorganicznego i organicznego [9 11]. Porównując wyniki uzyskane dla obu związków, po 24 i 48 h inkubacji, w teście MTT stwierdzono zdecydowanie wyższą toksyczność seleninu sodu, o czym świadczą wyznaczone wartości IC 50. W obu punktach czasowych 50% zahamowanie żywotności komórek w przypadku seleninu sodu miało miejsce dla stężenia Se ok. 30-krotnie niższego niż dla u. Podobną różnicę w aktywności obu związków uzyskano w badaniu białka całkowitego metodą Bradforda, w którym to oznaczeniu również zaobserwowano, że antyproliferacyjny wpływ seleninu sodu na komórki HeLa był kilkadziesiąt razy większy niż u. W odniesieniu do wyników uzyskanych w badaniu penetracji obu związków do komórek, w hodowli in vitro, należy zwrócić uwagę na istotną różnicę w dynamice przenikania selenu z roztworu seleninu sodu i z zawiesiny liposomów z em. W badaniu ICP-MS wykazano, że mała nieorganiczna cząsteczka seleninu sodu penetruje do komórki dużo szybciej, a jej transport najprawdopodobniej odbywa się biernie, w oparciu o różnicę stężeń. Prawdopodobnie inny jest mechanizm transportu liposomów z em, ponieważ po 24 h inkubacji obserwowano zaledwie niewielki wzrost stężenia selenu, co pozwala przypuszczać, że komórka nie jest w stanie przyjąć, w określonym czasie, więcej związku złożonego w swojej budowie i o dużej masie cząsteczkowej. Wydłużenie czasu inkubacji do 48 h zdecydowanie zmieniło przebieg krzywej, upodabniając ją do krzywej seleninowej. Wynika z tego, że wydłużenie czasu inkubacji komórek z em, poprawia penetrację w stopniu umożliwiającym oznaczenie podobnej ilości selenu w komórkach, jaką obserwowano dla najwyższego użytego stężenia seleninu sodu. Analizując dane zawarte w tablicach 2 i 3 stwierdzono, że w przypadku u, który jest mieszaniną seleninotriglicerydów, podawanego w postaci liposomów, antyproliferacyjny wpływ tego związku nie jest zależny tylko od penetrującego selenu do komórki. Na pojawienie się konkretnego efektu komórkowego wpływ ma również czas potrzebny do uwolnienia selenu ze złożonego związku organicznego. Potwierdzeniem tego są wyniki uzyskane w badaniu MTT i zawartości białka całkowitego, wykonanym po 48 h inkubacji z em. Biorąc pod uwagę zakresy stężeń obu związków, dla których wykonywane były badania, tj µm Se dla seleninu sodu i 6, µm Se dla u i uzyskane wyniki, można wnioskować, że indeks terapeutyczny u prawdopodobnie będzie zdecydowanie wyższy niż seleninu sodu. Dla u wyraźny spadek przeżywalności obserwowany w teście MTT i białka całkowitego, występował w zakresie stężenia 37,5-75 µm Se i 12,5-37,5 µm Se, odpowiednio po 24 h i 48 h inkubacji. Natomiast spadek przeżywalności komórek w hodowli z seleninem sodu pojawiał się już od stężenia 3 µm Se (rys. 1 i 2). W badaniu aktywności proapoptotycznej obu związków, otrzymane dla seleninu sodu wyniki są podobne do wyników uzyskanych w teście MTT i oznaczania białka całkowitego. Istotny spadek liczby żywych komórek, z jednoczesnym wzrostem liczby komórek w fazie apoptozy, występował po 24 h inkubacji z tym związkiem, w dawkach odpowiadających stężeniu 3-6 µm Se i pogłębiał się wraz z dalszym wzrostem stężenia. Tak wyraźnej tendencji nie zaobserwowano dla u. W przypadku 48 h inkubacji z em w zakresie stężeń, w przeliczeniu na selen, 6, µm nie obserwowano wzrostu aktywności proapoptotycznej. Aktywność ta silnie wzrastała dopiero powyżej 125 µm Se, w sposób istotny obniżając zdolność komórek do przeżycia. Uzyskane wyniki potwierdzają dane literaturowe dotyczące działania seleninu sodu oraz pozwalają wnioskować, że cytotoksyczny mechanizm działania obu związków w komórkach HeLa związany jest miedzy innymi z indukcją apoptozy, co jest prawdopodobnie przyczyną spadku ich przeżywalności [12, 13]. Oznaczenia białka całkowitego w przeprowadzonych eksperymentach potwierdzają doniesienia literaturowe o stymulującym 108 nr 2/2011 tom 65

5 wpływie niskich dawek selenu na wzrost komórek nowotworowych [14]. W przypadku obu badanych związków, dla pierwszego zastosowanego stężenia, tj. 1 µm Se i 6,25 µm Se, odpowiednio dla seleninu sodu i u, zaobserwowano niewielki wzrost zawartości białka całkowitego w stosunku do kontroli. Podsumowując, w przypadku obu związków stwierdzono ich zróżnicowany wpływ toksyczny na komórki nowotworowe HeLa oraz, że efekt ich oddziaływania z komórką nowotworową zależy od budowy chemicznej związku, stężenia i czasu działania. Z przeprowadzonych badań wynika również, że istotna różnica aktywności cytotoksycznej pomiędzy seleninem sodu i em wynika ze zdecydowanie różnej penetracji selenu z obu związków. Przekłada się to na ostrą cytotoksyczność seleninu sodu, w bardzo wąskim przedziale stężeń oraz na obserwowaną w dłuższym czasie łagodną cytotoksyczność u, którego efektywność działania jest związana z powolnym uwalnianiem selenu z olejowej postaci tego związku, po wniknięciu do wnętrza komórki. Biorąc powyższe spostrzeżenia pod uwagę należy stwierdzić, że zastosowanie seleninu sodu w terapii jest ograniczone, z uwagi na toksyczność tego związku. natomiast, wykazuje umiarkowane toksyczne działanie na komórki, działa dłużej i w szerszym zakresie stężeń, co prawdopodobnie wynika z bardziej złożonego mechanizmu oddziaływania na komórki i rokuje nadzieję na zastosowanie go w terapii. Stwierdzone różnice w cytotoksycznej aktywności seleninu sodu i u wymagają potwierdzenia tych wyników z odpowiedzią uzyskaną dla większej ilości linii komórek nowotworowych i prawidłowych. Możliwość wykorzystania u w terapii nowotworów jest w dużej mierze uzależniona od udowodnienia jego selektywnego i toksycznego działania, ograniczonego do komórek zmienionych chorobowo. Badania w tym zakresie są w toku, a uzyskane wyniki będą przedmiotem następnej publikacji. 12. Xiang N., Zhao R., Zhong W.: Sodium selenite induces apoptosis by generation of superoxide via the mitochondrial-dependent pathway in human prostate cancer cells. Cancer Chemotherapy and Pharmacology 2009, 63(2), Zuo L., Li J., Yang Y., Wang X., Shen T., Xu C., Zhang Z.: Sodium selenite induces apoptosis in acute promyelocytic leukemia-derived NB4 cells by a caspase-3-dependent mechanism and a redox pathway different from that of arsenic trioxide. Annals of Hematology 2004, 83(12), Schröterová L., Králová V., Voráčov A., Hašková P., Rudolf E., Červinka M.: Antiproliferative effects of selenium compounds in colon cancer cells: Comparison of different cytotoxicity assays. Toxicology in Vitro 2009; 23 (7): Dr Jadwiga DUDKIEWICZ WILCZYŃSKA studiowała na Wydziale Farmaceutycznym Akademii Medycznej w Warszawie, gdzie w 1982 r., za pracę wykonaną w Zakładzie Farmakodynamiki (promotor prof. S.W. Gumułka), uzyskała tytuł doktora. Jest adiunktem w Narodowym Instytucie Leków, kierownikiem Pracowni Biofarmaceutyków. Specjalność: analiza farmaceutyczna, metody chemiczne i biologiczne, farmakologia, biotechnologia. Współautorka 37. publikacji i 36. doniesień Zjazdowych. Mgr inż. Izabela KSIĄŻEK jest absolwentką Wydziału Chemii, na kierunku Biotechnologii Leków, Politechniki Gdańskiej. Jest asystentem w Narodowym Instytucie Leków. Współautorka 8. publikacji, 16. doniesień Zjazdowych. Mgr. inż. biotechnologii Karolina NOWAK jest absolwentką Wydziału Biotechnologii Wyższej Szkoły Gospodarstwa Wiejskiego w Warszawie (2007). Specjalista ds. analizy farmaceutycznej w Narodowym Instytucie Leków. Współautorka 1 publikacji, 7 doniesień nauka technika Literatura 1. Patterson B., Levander O.: Naturally occurring selenium compounds in cancer chemoprevention trials: a workshop summary. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev.1997, 6, Combs G., Gray Jr. W.: Chemopreventive agents: selenium. Pharmacol. Ther. 1998, 79, Menter D., Sabichi A., Lippman S.: Selenium Effects on Prostate Cell Growth. Cancer Epidemiology. Biomarkers Prev. 2000, 9, Kim T., Jung U., Cho D., Chung A.: Se-Methylselenocysteine induces apoptosis through caspase activation in HL-60 cells. Carcinogenesis 2001, 22(4), Das A., Bortner J., Desai D., Amin S., El-Bayoumy K.: The selenium analog of the chemopreventive compound S,S -(1,4-phenylenebis[1,2-ethanediyl])bisisothiourea is a remarkable inducer of apoptosis and inhibitor of cell growth in human non-small cell lung cancer. Chemico-Biological Interactions 2009, 180, McKenzie R., Rafferty T., Beckett G.: Selenium: an essential element for immune function. Immunol Today 1998, 19, Vadhanavikit S., Ip C, Ganther H.: Metabolites of sodium selenite and methylated selenium compounds administered at cancer chemoprevention levels in the rat. Xenobiotica 1993, 23(7), Fitak B., Grabowski M., Suchocki P.: Pol. Pl (Cl. A61K31/095), 30 June 1999, Appl , 29 June 1994, 1999, p Husbeck B., Bhattacharyya R., Feldman D., Knox S.: Inhibition of androgen receptor signaling by selenite and methylseleninic acid in prostate cancer cells: two distinct mechanisms of action. Mol Cancer Ther 2006, 5, Koka P., Mondal D., Schultz M., Abdel-Mageed A., Agrawal K.: Studies on molecular mechanisms of growth inhibitory effects of thymoquinone against prostate cancer cells: role of reactive oxygen species. Exp. Biol. Med. 2010, 235, Tsavachidou D. et al.: Selenium and Vitamin E: Cell Type and Intervention-Specific Tissue Effects in Prostate Cancer. JNCI J Natl Cancer Inst. 2009, 101, Dr n. farm. Piotr SUCHOCKI - absolwent Wydziału Farmaceutycznego Akademii Medycznej w Warszawie. Jest adiunktem w Zakładzie Bioanalizy i Analizy Leków Warszawskiego Uniwersytetu Medycznego i adiunktem w Zakładzie Chemii Farmaceutycznej Narodowego Instytutu Leków. Specjalność: analiza leków, technologia środków leczniczych, w szczególności synteza nowych organicznych pochodnych Se(IV) i Si(IV). Współautor 46. publikacji, 50. doniesień zjazdowych; 1 patent. Dr n. med. Sylwia FLIS jest absolwentką Wydziału Biologii Uniwersytetu Warszawskiego. Stopień dr. n. medycznych nadany w 2005 r. przez Radę Naukową Instytutu Farmakologii PAN w Krakowie. Jest adiunktem w Zakładzie Farmakologii Narodowego Instytutu Leków. Jest współautorką 7. publikacji. Mgr inż. Monika KILIAN jest absolwentką Wyższej Szkoły Ekologii i Zarządzania w Warszawie. Jest specjalistą ds. analizy farmaceutycznej w Zakładzie Chemii Farmaceutycznej Narodowego Instytutu Leków. Prof. n. farm. dr hab. Elżbieta ANUSZEWSKA - kierownik Zakładu Biochemii i Biofarmaceutyków Narodowego Instytutu Leków. Specjalność: analiza farmaceutyczna, biochemia, biologia komórki. Autorka lub współautorka 120. publikacji. Promotor 4. prac doktorskich i licznych prac magisterskich. Przewodnicząca Komisji ds. Działalności Naukowej Rady Naukowej NIL. Ekspert URPLWMiPB oraz Europejskiego Urzędu ds. Bezpieczeństwa Żywności. nr 2/2011 tom

6 science technique Study of the effect of and sodium selenite on HeLa cells in vitro Jadwiga DUDKIEWICZ WILCZYŃSKA, Izabela KSIĄŻEK, Karolina NOWAK, Piotr SUCHOCKI, Sylwia FLIS, Monika KILJAN, Elżbieta ANUSZEWSKA - National Medicines Institute, Warsaw Please cited as: CHEMIK 2011, 65, 2, xxxx 1. Introduction Selenium is of fundamental importance to human health, it participates in many physiological processes and is therefore regarded as one of the microelements essential for the proper functioning of higher organisms [1]. The results of epidemiologic studies suggest that increased risk of tumour formation is accompanied by insufficient selenium supply, whereas clinical and experimental studies indicate clearly that selenium protects against tumour growth [2, 3]. The biological role of selenium was unravelled when it was discovered that this element was a constituent of active sites of many enzymes. The most known example of selenium-dependent enzymes is the family of glutathione peroxidases (GSH-px), the main function of which is protection of the organism against oxidative stress. Selenium deficiency is manifested by strongly reduced level of GSH-px and by increased production of active oxygen compounds. It was also found that it were the selenites in erythrocytes, rather than selenomethionine or selenocysteine that reacted with glutathione, leading to an active form of selenium: selenodiglutathione. Selenodiglutathione, formed in the reaction between glutathione and selenium, the oxidation state of the latter being +4, has strong antioxidative and antitumour properties. It induces apoptosis in human tumour cells [4 7]. In this form it is also specifically built into active sites of enzymes. One of the potential antitumour compounds, over which research is currently conducted to elucidate the mechanism of its action, is 5% a selenium(iv)-containing organic compound, which is a mixture of selenitetriglycerides synthesized from sunflower oil [8]. The basic screening test of a potential medicament is the evaluation of its cytotoxic activity. The methods used in such tests enable the measurement of changes associated with the disturbances of physiological processes of cells induced by the substance under study. The aim of such tests is the determination of the effect of the substance on the survival rate of cells as related to a control sample, which usually is a cell culture in a plain medium or a culture exposed to other medication of known cytotoxicity. The aim of the study described herein was the comparison of the cytotoxic action on HeLa tumour cells of a seleno-organic compound, 5%, with that of sodium selenite, a known inorganic selenium compound. The following methods were used in this study: MTT, Bradford protein assay and flow cytometry using Annexin V and propidium iodide as the dye. ICP-MS was applied to determine penetration of selenium into cells. 2. Experimental 2.1 Compounds studied and reagents used 5% (in the form of liposomes, obtained from the Drug Analysis Department, Warsaw University of Medicine), sodium selenite (Sigma), MTT (Sigma), isopropanol (Labscan), Bradford reagent (Bio-Rad Protein Assay), human albumin (Biomed), FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit I (BD Pharmingen), PBS (buffered salt solution), complete and exclusive of Mg 2+ and Ca 2+ ions (Institute of Immunology and Experimental Therapy), trypsin, EDTA (Lonza), 1 mg/ml Se standard solution for ICP-MS (Inorganic Ventures), internal standard solution: 10 mg/l Co, nitric acid of purity adequate for ICP (Merck), redistilled water additionally purified in Nanopure Deionization System (Barnstead), argon % vol. purity (BOC GAZY, Warsaw). 2.2 Cell culture The cultures of HeLa cells (Human Cervix Carcinoma Cells), cells of human cervical neoplasm (German Collection) was grown in a 5% CO 2 atmosphere at 37 C on an EMEM medium (Eagle s Minimum Essential Medium - Lonza) with an addition of 10% FBS (Fetal bovine serum - Lonza) and 1% of antibiotics (Penicillin, Streptomycin, Amphotericin B - Lonza). The cells were inoculated, depending on the time of incubation with the compounds studied, in an amount of 1 or 1.5 x 10 5 per well in a 6-well plate and 3 or 4.5 x 10 5 per well in a 96-well plate (Nunc, Greiner). 2.3 Incubation with the drug After 24 h incubation of the cells under conditions described above, the medium was replaced with a fresh one containing the compounds studied, at a range of concentrations selected on the basis of pilot tests and a range of sodium selenite concentrations selected on the basis of literature data. The following concentration ranges were used, expressed as selenium concentration: sodium selenite 1 to 12 µm Se, and 6.25 to 500 µm Se. The effect of the compounds studied on HeLa cells was observed after 24 and 48 h of incubation. The control sample was a cell culture grown on a plain medium (in the case sodium selenite) and on a medium with empty liposomes added (in the case of ), in an amount corresponding to the highest concentration of the given compound used in the given test. 2.4 Cell viability assessment - MTT test After 24 or 48 h of incubation with the placebo or the substance studied, the medium was removed from over the cells and each well was washed with 75 µl Ca 2+ /Mg 2+ -free PBS. Then to each well 50 µl of MTT reagent, 0.25 mg/ml (tetrazolium salt solution in Ca 2+ /Mg 2+ -free PBS prepared beforehand) were added. After 4 hours the formed formazan crystals were dissolved by adding to each well 200 µl of 99.7% isopropanol. The absorbance of solutions was measured spectrophotometrically at the wavelength of 540 nm, using a plate reader (Labsystems iems Reader MF). Assuming the cell viability in the control culture as 100%, the viability of cells in samples with the compounds studied were computed on the basis of the absorbance measured. 2.5 Total protein determination Bradford method After 24 or 48 h of incubation with the placebo or the substance studied, the cells in the wells were washed with Ca 2+ /Mg 2+ -free PBS and then removed from the surface of the wells by scraping, then centrifuged for 7 min. at 1500 rpm. The sediment obtained was washed with PBS and centrifuged again. The cells were then suspended in deionized water. In order to determine the total proteins, 0.5 ml of cell suspension was subjected to lysis with 0.5 ml NaOH (1 M). After intimate mixing sunny chemistry 110 nr 2/2011 tom 65

7 of the cells, 20 µl of the lysate were transferred into each well of a 96-well plate in 6 turns. At the same time a standard curve for albumin was plotted within the range of 1 to 10 µg/ml. 180 µl of Bradford reagent were added to each well and absorbance was measured using a 600 nm filter on a Multiscan Plus 314 instrument (Labsystem). Assuming the total protein content in control cells as 100%, the viability rate of cells in tested samples was calculated. 2.6 Cytometric determination of cell apoptosis induction Annexin V and propidium iodide test After 24 or 48 h of incubation with the placebo or the substance studied, the medium from over the cells and the cells, after trypsinizing thereof, were collected into centrifuge test tubes. All this was centrifuged for 7 min. at 1500 rpm. The sediment was washed with PBS and centrifuged again. Upon removing the supernatant, the cells were suspended in a binding buffer (supplied with the kit), in an amount corresponding to the concentration of 1 x 10 6 cells/ml. Afterwards 100 µl portions of the suspension were transferred into cytometric test tubes. 5 µl Annexin V and 5 µl of propidium iodide were added to each test tube. The contents of the test tubes were stirred in darkness for 15 minutes. After that time 400 µl of binding buffer were added and analysis was carried out on a FACS Calibur flow cytometer (Becton Dickinson), using CellQuest software. 2.7 Determination of selenium penetration rate ICP-MS method 0.5 ml of cell suspension, prepared as described in item 2.5 above, were digested in nitric acid, using microwave energy, in a closed 4-stage system. The digested matter was transferred quantitatively to 20-ml measuring flasks. 20 µl of internal standard solution (Co standard, 10 µg/l) were added and made up to the mark with water. Selenium determination was performed on a Thermo Electron X Series II inductively coupled plasma mass spectrometer from Thermo Electron Corporation. The optimum measuring range in the ICP-MS method for this element is µg/l. 3. Discussion of results In order to quantitatively assess the cytotoxic activity of potential chemotherapeutics, various cell tests are applied in vitro cultures, wherein various parameters associated with cell growth (proliferation) are determined. In this study we have used indirect measurement of activity of mitochondrial dehydrogenase (MTT), determination of total protein, based on the ability of cell proteins to bind with Coommasie Brilliant Blue dye and on the ability of the compounds studied to induce apoptosis in HeLa cells. Fig. 1. Effect of selenium in sodium selenite and on the survival rate of HeLa cells (MTT test) It was found that after only 24 h of incubation in the presence of sodium selenite a significant decrease in the number of living HeLa cells was observed, that decrease depending on the concentration of selenium added to the medium. Depending on the time of incubation (24 or 48 h), IC 50 for this compound was 5.9 µm and 2.6 µm Se, respectively. In the case of 24 h incubation with, the decrease of cell survival rate to 50% (IC 50 ) was only observed at selenium concentration of ca. 216 µm. The diagram presented shows that the survival rate curve is much flatter in this case and that for the highest concentration used (250 µm Se) the percentage of living cells after 24 h incubation is still ca. 45%. Extending incubation time to 48 h caused the shifting of IC 50 value towards lower selenium concentrations in the medium, IC 50 ~ 80 µm Se. No cytotoxic effect of empty liposomes, used as the carrier for, has been observed in this study. This means that the liposomes alone have no toxic effect and that they may be assumed to be an appropriate control reference in this experiment and that 100% survival rate may be adopted in this case. In view of the high toxicity of sodium selenite, 48 h incubation was abandoned in further study. 3.2 Effect of the compounds studied on total protein content (Bradford method) The decrease in the number of living cells in the cultures, observed in the MTT test, which depended on the concentration of selenium in the medium and on incubation time, was also reflected in the determined total protein content. The total protein content in cell cultures incubated for 24 h with sodium selenite and for 24 and 48 h with, with regard to the control sample, decreased with increasing selenium concentration (Fig. 2). science technique 3.1 Effect of sodium selenite and on viability of HeLa cells (MTT test) The toxic effect of and sodium selenite on HeLa cells was assessed by means of the MTT test, on the basis of changes in the activity of succinate dehydrogenase, a mitochiondrial enzyme present in living cells. This enzyme transforms a soluble tetrazolium salt [3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide] into its reduced form, insolube formazan, which precipitates as crystals, the latter being soluble in isopropanol. Absorbance of isopraponol solution measured at the wavelength of ca. 540 nm is proportional to the number of living cells in the culture. The results obtained were used to assess the viability of cells in samples with the compounds studied after 24 or 48 h incubation. The concentration of selenium inhibiting cell growth by 50% (IC 50 a measure of cytotoxic activity of substances) was determined from the cell survival rate vs. selenium concentration curves (Fig. 1). Fig. 2. Effect of selenium in sodium selenite and on total protein content (Bradford method) In the case of both compounds, and both incubation times, only at the lowest selenium concentration used (1 µm for sodium selenite and 12.5 µm for ) did the protein content increase as compared to the control sample, by ca. 14 and 7%, respectively. nr 2/2011 tom

8 science technique Comparison between the rates of total protein content decrease caused by increased concentration of the compounds studied in the medium demonstrates much higher activity of sodium selenite in this regard. In the case of this compound, a significant difference in total protein content, that is ca. 15% in relation to the control sample, is already observed at selenium concentration of 3 µm. In the case of Salol, comparable decrease in protein content occurs after 24 h incubation at the concentration of more than 37.5 µm Se. In the experiment with sodium selenite, at the concentration of ca. 6 µm Se, 50% total protein decrease was observed after 24 h. In the case of, at the highest concentration used, protein content after 24 h incubation was about 60%. Total protein content was decreased to 50% in the case of selenium concentration of ca. 75 µm after extending exposition time to 48 h. 3.3 Proapoptotic activity of sodium selenite and (cytometric study) The ability of the compounds studied to induce apoptosis was investigated, after 24 h incubation with sodium selenite and after 24 and 48 h incubation with, in a test with Annexin V and propidium iodide. The results indicate a distinct difference in the proapoptotic activity of the compounds (Fig. 3), which correlates with the data obtained in the MTT test and total protein content determination. The experimental setup used enabled differentiation between living, apoptotic and necrotic cells. apoptotic cells is only 15%. Extending cell exposition time to to 48 h has significantly intensified apoptosis at higher concentrations, i.e. above 100 µm Se. For the highest concentration used (500 µm Se), the number of apoptotic cells has nearly doubled in the population after 48 h. From the viewpoint of cytotoxic mechanism of the action of the compounds studied, only a small percentage of necrotic cells were observed after both incubation times. The percentage of necrotic cells in the case of sodium selenite and varied between % and %, respectively. 3.4 Penetration of selenium into HeLa cells (ICP-MS method) The ability of selenium of the compounds studied to penetrate into HeLa cells was assessed using ICP-MS. After 24 h incubation it was found that there was a distinct differentiation of the amount of selenium detected in cells depending on the compound used. The data obtained indicate that selenium of the sodium selenite solution has a higher ability to permeate through the cell membrane than selenium delivered in the form of in liposomes. The mean values (n=3) of the determined content of selenium derived from both compounds and normalized with regard to the results of total protein determination in cells (item 3.2.), in relation to initial selenium concentrations are shown in Figure 4. Fig. 3. Percentage of apoptotic HeLa cells vs. concentration of selenium supplied in the form of sodium selenite and (Annexin V and propidium iodide test) The data obtained and presented in Table 1 indicate that in the case of sodium selenite, with increasing concentration thereof, a distinct increase of the number of apoptotic cells is observed, which attains the level of 83.6% at the highest concentration used. In the case of, for comparable selenium concentration (12,5 µm), the percentage of Table 1 Percentage of HeLa cells (live (L), apoptic (A) and necrotic (N)) in culture subjected to the action of sodium selenite and in the selected range of selenium concentrations Se conc., µm Percentage Sodium selenite Se conc., L A N L A N L A N µm 24 h 24 h 48 h Fig. 4. Penetration of selenium from sodium selenite and into HeLa cells (ICP-MS) After 24 h incubation of HeLa cells with the compounds studied at the lowest concentrations used (1 µm for sodium selenite and 12.5 µm for ), the amount of selenium determined in cells was comparable to that in the cells of the control sample. Consistent increase of selenium detected in cells was observed with the growing concentration of selenium in the solution, starting from 3 µm Se for sodium selenite and 37.5 µm Se for. In the case of sodium selenite the penetration curve after 24 h incubation (Fig. 4) is close to exponential, whereas in the case of it is close to logarithmic. This means that the difference in penetration rate within the studied range of concentrations increases with increasing selenium concentration. Similar selenium content, i.e. ca. 0.3 ng Se/µg protein, was detected for initial concentrations of 6 µm Se and 37.5 µm Se, for sodium selenite and, respectively. The difference found in penetration rate showed that selenium absorption from sodium selenite solution was 6 times faster. Much higher selenium concentrations in cells after administering were observed when incubation time was extended to 48 h. In this case, with initial selenium concentration of 75 µm, penetration was comparable with the highest value obtained for sodium selenite, i.e. ca. 0.9 ng Se/µg protein. After 48 h the amount of selenium detected in cells for the highest concentration used (125 µm Se) rises significantly: a threefold increase in relation to the amount detected after 24 h. Table 2 summarizes the results of the MTT test, cytometric test and total protein determination for similar amounts of selenium 112 nr 2/2011 tom 65

9 Table 2 Comparison of HeLa cells survival rate determined by three methods for comparable penetration rates of selenium into cells: 0.3 ng Se/µg protein, determined after 24 h incubation of cells with sodium selenite at a concentration of 6.0 µm Se, and with at a concentration of 37.5 µm Se Method Percentage of live cells, % penetrating into the cells from both compounds, i.e. ca. 0,3 ng Se/µg protein, corresponding to initial concentrations of 6 µm Se and 37.5 µm Se for sodium selenite and, respectively. These data indicate that after 24 h incubation, sodium selenite inhibits cell growth ca. 1.7 times stronger than. Table 3 lists the results of the above tests for comparable selenium content determined in cells, i.e. ca. 0.9 ng/µg protein. The values listed were obtained for the highest seleniumconcentration used with sodium selenite (12 µm), after 24 h incubation, and with (75 µm Se) after 48 h incubation. In the case of sodium selenite, the amount of selenium penetrating into the cells caused significant reduction of cell survival rate and strongly induced apoptosis, which was reflected in the amount of total protein determined. In the case of identical quantity of selenium determined after 48 h incubation with, the cell survival rate obtained in MTT tests and resulting from total protein determination was ca. 50%, whereas the number of living cells obtained in the Annexin and propidium iodide test was ca. 80%. Table 3 Comparison of HeLa cells survival rate determined by three methods for comparable penetration rates of selenium into cells: 0.9 ng Se/µg protein, determined after 24 h incubation of cells with sodium selenite, at a concentration of 12.0 µm Se, and after 48 h incubation with, at a concentration of 37.5 µm Se Method Percentage of live cells, % Sodium selenite MTT Bradford Annexin V and propidium iodide test Sodium selenite MTT Bradford Annexin V and propidium iodide test Summary and Conclusions The studies made so far on HeLa tumour cells and the two selenium compounds, sodium selenite and, confirm the differences reported in the literature on the utilization by the cell of selenium(iv) from an inorganic and an organic compound [9 11]. When comparing the results obtained for the two compounds after 24 and 48 h incubation, the MTT test demonstrated much higher toxicity of sodium selenite, evidenced by the determined IC 50 values. For both periods of incubation duration, 50% inhibition of cell viability occurred in the case sodium selenite at selenium concentration ca. 30 times lower than in the case of. Similar difference in the activities of both compounds was shown by total protein determination using the Bradford method, whereas it was also observed that the antiproliferation effect produced by sodium selenite on HeLa cells was several dozen times stronger than that of. As regards the results of tests on penetration of the two compounds into cells in an in vitro culture, attention should be drawn to the distinct difference in the penetration rates of selenium from sodium selenite solution and from suspension of -containing liposomes. ICP-MS investigations have shown that the small inorganic molecule of sodium selenite penetrates into the cell much faster, and that it is probably transferred in a passive manner due to concentration differences. The transfer mechanism of liposomes with is presumably different. After 24 h incubation with, only a slight increase of selenium concentration was observed. This indicates that the cell cannot absorb, within a defined period of time, more of the compound of a more complex structure and higher molecular weight. Extending incubation time to 48 h strongly changed the shape of the curve, making it similar to that of sodium selenite. This indicates that extending incubation time of cells with improves penetration to such a degree that the level of selenium determined in cells becomes similar to that obtained with the highest sodium selenite concentration used. Analysis of the data in Tables 2 and 3 leads to the conclusion that in the case of, which is a mixture of selenitetriglycerides, supplied in the form of liposomes, the antiproliferation effect of this compound does not depend solely on selenium penetration into the cell. The final effect in the cell depends also on the time necessary to release selenium from the complex organic compound. This is confirmed by the results obtained in the MTT test and total protein content determination performed after 48 h incubation with. Taking into consideration the concentration ranges of both compounds, as used in the studies, i.e µm Se for sodium selenite and µm Se for, and the results obtained, it may be concluded that the therapeutic index of Salol is probably much higher than that of sodium selenite. In the case of a distinct decrease of survival rate observed in the MTT test and total protein determination occurred within the concentration range of µm Se and µm Se, after 24 and 48 h incubation, respectively. In the case of sodium selenite the decline in cell survival rate appeared already at Se concentration of 3 µm (Figs. 1 and 2). The results obtained for sodium selenite in the study of proapoptotic activity of both compounds are similar to those of the MTT test and total protein determination. Substantial decrease in the number of living cells, accompanied by increase of the number of cells in the apoptosis phase, occurred after 24 h incubation with this compound in doses corresponding to selenium concentration 3 6 µm and was intensified with growing concentration. Such distinct tendency was not observed for. In the case of 48 h incubation with, within the concentration range (in terms of selenium) of µm, increase of proapoptotic activity was not observed. This activity increased strongly only at concentrations above 125 µm Se, significantly reducing cell survival rate. The results obtained confirm literature reports on sodium selenite activity and allow to formulate a conclusion that the cytotoxic mechanism of the action of both compounds on HeLa cells is associated, inter alia, with apoptosis induction, which presumably is the cause of survival rate decrease [12, 13]. Total protein determinations carried out in the experiments confirm the literature reports on the stimulating effect of low selenium doses on the growth of tumour cells [14]. In the case of both compounds studied, for the first concentration used, i.e. 1 µm Se and 6.25 µm Se, for sodium selenite and, respectively, a slight increase of protein content was observed in comparison to the control sample. To summarize, diverse toxic effect on HeLa tumour cells has been identified in the case of both compounds, and the effect of their interaction with the tumour cell depends on the chemical structure, concentration and time of action of the compound. The studies conducted also indicate that the significant difference between the cytotoxic activities of sodium selenite and are the result of different degree of penetration of selenium from these compounds into the cell. This translates into acute cytotoxicity of sodium selenite within a narrow range of concentrations, and mild cytotoxicity over a longer period of time of, the efficacy of the latter being associated with prolonged release of selenium from the oily form of the compound after penetrating into the cell. In view of the above it may be stated that therapeutic application of sodium selenite is limited due to the toxicity of the compound., on the other hand, shows moderate toxic action towards the cells, acts science technique nr 2/2011 tom

10 science technique longer and within a broader range of concentrations, which is probably due to its more complex mechanism of action on cells, and raises hopes for its successful therapeutic application. The differences found in cytotoxic activity of sodium selenite and require confirmation by tests on a larger number of tumour and healthy cells. Applicability of in tumour therapy depends, to much extent, on the proof of its selective and toxic action limited to pathologically altered cells. The research in this area is pending, and the results obtained will be the subject of a subsequent paper. Literature 1. Patterson B., Levander O.: Naturally occurring selenium compounds in cancer chemoprevention trials: a workshop summary. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev.1997, 6, Combs G., Gray Jr. W.: Chemopreventive agents: selenium. Pharmacol. Ther. 1998, 79, Menter D., Sabichi A., Lippman S.: Selenium Effects on Prostate Cell Growth. Cancer Epidemiology. Biomarkers Prev. 2000, 9, Kim T., Jung U., Cho D., Chung A.: Se-Methylselenocysteine induces apoptosis through caspase activation in HL-60 cells. Carcinogenesis 2001, 22(4), Das A., Bortner J., Desai D., Amin S., El-Bayoumy K.: The selenium analog of the chemopreventive compound S,S -(1,4-phenylenebis[1,2-ethanediyl])bisisothiourea is a remarkable inducer of apoptosis and inhibitor of cell growth in human non-small cell lung cancer. Chemico-Biological Interactions 2009, 180, McKenzie R., Rafferty T., Beckett G.: Selenium: an essential element for immune function. Immunol Today 1998, 19, Vadhanavikit S., Ip C, Ganther H.: Metabolites of sodium selenite and methylated selenium compounds administered at cancer chemoprevention levels in the rat. Xenobiotica 1993, 23(7), Fitak B., Grabowski M., Suchocki P.: Pol. Pl (Cl. A61K31/095), 30 June 1999, Appl , 29 June 1994, 1999, p Husbeck B., Bhattacharyya R., Feldman D., Knox S.: Inhibition of androgen receptor signaling by selenite and methylseleninic acid in prostate cancer cells: two distinct mechanisms of action. Mol Cancer Ther 2006, 5, Koka P., Mondal D., Schultz M., Abdel-Mageed A., Agrawal K.: Studies on molecular mechanisms of growth inhibitory effects of thymoquinone against prostate cancer cells: role of reactive oxygen species. Exp. Biol. Med. 2010, 235, Tsavachidou D. et al.: Selenium and Vitamin E: Cell Type - and Intervention-Specific Tissue Effects in Prostate Cancer. JNCI J Natl Cancer Inst. 2009, 101, Xiang N., Zhao R., Zhong W.: Sodium selenite induces apoptosis by generation of superoxide via the mitochondrial-dependent pathway in human prostate cancer cells. Cancer Chemotherapy and Pharmacology 2009, 63(2), Zuo L., Li J., Yang Y., Wang X., Shen T., Xu C., Zhang Z.: Sodium selenite induces apoptosis in acute promyelocytic leukemia-derived NB4 cells by a caspase-3-dependent mechanism and a redox pathway different from that of arsenic trioxide. Annals of Hematology 2004, 83(12), Schröterová L., Králová V., Voráčov A., Hašková P., Rudolf E., Červinka M.: Antiproliferative effects of selenium compounds in colon cancer cells: Comparison of different cytotoxicity assays.toxicology in Vitro 2009; 23(7) Jadwiga DUDKIEWICZ WILCZYŃSKA PhD., graduated from the Pharmaceutical Faculty of the Medical University of Warsaw, where in 1982 she received her PhD title at the Pharmacodynamics Department (thesis supervisor prof. S. W. Gumułka). She is an adjunct researcher at the National Medicines Institute, head of the Biopharmaceuticals Unit. Specializes in pharmaceutical analysis, chemical and biological methods, pharmacology, biotechnology. Co-author of 36 publications and convention reports. Izabela KSIĄŻEK, M.Sc., is a graduate of the Chemical Faculty, Biotechnology of Drugs, of the Gdańsk University of Technology. She is an assistant researcher at the National Medicines Institute. Co-author of 8 publications and 16 convention reports. Piotr SUCHOCKI PhD., is a graduate of the Pharmaceutical Faculty of the Medical University of Warsaw. He is an adjunct researcher at the Department of Bioanalysis and Drug Analysis of the Medical University of Warsaw and at the Pharmaceutical Chemistry Department of the National Medicines Institute. Specializes in drug analysis, processing of therapeutic agents, in particular synthesis of new Se(IV) and Si(IV) organic derivatives. Co-author of 46 publications, 50 convention reports, 1 patent. Sylwia FLIS PhD., is a graduate of the Faculty of Biology of the University of Warsaw. She received her PhD in Medicine in 2005 from the Scientific Council of the Institute of Pharmacology of the Polish Academy of Sciences (PAN) in Cracow. Adjunct researcher at the Pharmacology Department of the National Medicines Institute. Co-author of 7 publications. Monika KILJAN, M.Sc., is a graduate of the University of Ecology and Management in Warsaw. She is a specialist on pharmaceutical analysis at the Pharmaceutical Chemistry Department of the National Medicines Institute. Karolina NOWAK, M.Sc., is a graduate of the Faculty of Biotechnology of the Warsaw University of Life Sciences (SGGW) (2007). She is a specialist on pharmaceutical analysis at the National Medicines Institute. Co-author of 1 publication and 7 reports. Prof. Elżbieta ANUSZEWSKA is the head of the Department of Biochemistry and Biopharmaceuticals of the National Medicines Institute (NIL). She specializes in pharmaceutical analysis, biochemistry, cell biology. Author or co-author of 120 publications. Supervisor of 4 PhD and numerous MSc theses. Chairman of the Research Committee of the Scientific Council at NIL. Expert of the Polish Office for Registration of Medicinal Products, Medical Devices and Biocidal Products (URPLWMiPB) and of the European Food Safety Authority (EFSA). CHEMIK International Edition CHEMIK - science-technique-market is a magazine for engineers and managing staff in the chemical industry. In the monthly columns, you will find scientific and technical publications and reviews of modern technical and technological solutions in the chemical industry including the functioning of the industry in terms of environmental, legal and organizational issues. The magazine works with outstanding scientists, engineers and managers. 64 years of publishing expertise, CHEMIK has been an excellent journal in the Polish language. Today CHEMIK connects tradition with innovation publishing on Polish market articles in both a Polish and a translated English version. We are the first magazine of this kind in Poland. Along with publishing our works, we hope to become a stronger educational publication. We are going to meet the expectations of the community of Polish chemists, but we also want to show their works to foreign scientists, entrepreneurs and foreign students, who are still becoming increasingly numerous at Polish universities. Among other newspapers on the market, there are many magazines presenting academic works concerning the field of chemistry in Europe and around the world. However, there are just a few that present works with potential implementation, promoting cooperation of science and trade in the field of creation of new technologies and implementation of innovative products. Let s publish with CHEMIK International Edition nr 2/2011 tom 65