(12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) (13) T3 (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego:

Transkrypt

1 PL/EP T3 RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP (13) T3 (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego: (1) Int. Cl. G01N33/68 (06.01) (97) O udzieleniu patentu europejskiego ogłoszono: Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej Europejski Biuletyn Patentowy 09/26 EP B1 (4) Tytuł wynalazku: Sposób określania stężenia asymetrycznej dimetyloargininy (ADMA) () Pierwszeństwo: DE DE (43) Zgłoszenie ogłoszono: Europejski Biuletyn Patentowy 08/08 (4) O złożeniu tłumaczenia patentu ogłoszono: Wiadomości Urzędu Patentowego 12/09 (73) Uprawniony z patentu: ESA Patentverwertungsagentur Sachsen-Anhalt GmbH, Magdeburg, DE Medizinische Fakultät, Magdeburg, DE (72) Twórca (y) wynalazku: BODE-BÖGER Stefanie M., Laatzen, DE MARTENS-LOBENHOFFER Jens, Hamburg, DE (74) Pełnomocnik: Polservice Kancelaria Rzeczników Patentowych Sp. z o.o. rzecz. pat. Kawczyńska Marta Warszawa skr. pocz. 33 Uwaga: W ciągu dziewięciu miesięcy od publikacji informacji o udzieleniu patentu europejskiego, każda osoba może wnieść do Europejsk iego Urzędu Patentowego sprzeciw dotyczący udzielonego patentu europejskiego. Sprzeciw wnosi się w formie uzasadnionego na piśmie oświadczenia. Uważa się go za wniesiony dopiero z chwilą wniesienia opłaty za sprzeciw (Art. 99 (1) Konwencji o udzielaniu patentów europejskich).

2 3 1 2 Wynalazek dotyczy sposobu określania stężenia asymetrycznej dimetyloargininy (ADMA) równocześnie z argininą i symetryczną dimetyloargininą (SDMA) w próbkach biologicznych za pomocą HPLC-MS-MS. Aminokwas arginina służy w układach biologicznych między innymi jako substancja wyjściowa do syntezy substancji-informatora monotlenku azotu (NO) przez enzymy grupy monooksygenaz azotowych (NOS). Wystarczająca dostępność tej substancji-informatora jest między innymi warunkiem funkcji fizjologicznej komórek śródbłonkowych w układzie sercowonaczyniowym, z drugiej strony niedobór NO jest związany z dysfunkcją śródbłonka i towarzyszącymi temu obrazami klinicznymi choroby, takimi jak arterioskleroza, nadciśnienie tętnicze lub udar mózgu. Arginina wbudowana w białka ulega w organizmie w dalszym szlaku metabolizmu przemianie przez grupę enzymów metylotransferaz białkowych (PRMT) do monometyloargininy wbudowanej w białka (MMA), asymetrycznej dimetyloargininy (ADMA) i symetrycznej dimetyloargininy (SDMA). W przypadku enzymatycznego rozpadu białek te aminokwasy uwalniają się. Tak uwolnione metylowane pochodne argininy MMA i ADMA hamują funkcję NOS i obniżają w ten sposób produkcję NO. MMA odgrywa przy tym jedynie podrzędną rolę, ponieważ jej efektywne stężenie osiąga tylko około % stężenia ADMA. Sama SDMA nie hamuje NOS, jednakże dzieli z ADMA mechanizm transportu przez błony komórkowe i przez to może pośrednio oddziaływać na szybkość produkcji NO.

3 4 1 2 Zwiększone poziomy ADMA w osoczu opisano w szeregu obrazach klinicznych chorób, takich jak nadciśnienie tętnicze, hipercholesterolemia, zaburzenia funkcji nerek lub cukrzyca i z dużą pewnością można przyjąć, że zwiększony poziom ADMA w osoczu jest bezpośrednim czynnikiem ryzyka w chorobach sercowonaczyniowych. W celu zbadania tego typu chorób i punktów wyjścia terapii należy oczekiwać stale wzrastającego zapotrzebowania na oznaczenia ADMA w różnych płynach biologicznych, takich jak osocze krwi, mocz lub pożywka hodowli komórkowej. W układach biologicznych ADMA jest zarówno wydzielane przez nerki w niezmienionej postaci lub też ulega enzymatycznemu rozpadowi do cytruliny i dimetyloaminy. Oznacza to, że ADMA i SDMA wzrastają we krwi u pacjentów z niewydolnością nerek. Transplantacja nerek normalizuje poziom SDMA, lecz poziom ADMA spada jedynie w niewielkim stopniu. Jest tak ponieważ głównym szlakiem metabolizmu szczególnie dla ADMA jest enzym dimetyloaminohydrolaza dimetyloargininowa (DDAH) (SDMA nie ulega rozpadowi). Istnieją 2 izoformy: DDAH I znaleziono w tkankach z neuronowym NOS, DDAH II znajduje się w tkankach z śródbłonkowym NOS. Wiele bodźców patologicznych podwyższa stres oksydacyjny, jak np. utleniony cholesterol LDL, cytokiny, hiperhomocysteinemia lub hiperglikemia. Każdy z tych bodźców, przez zwiększone tworzenie rodników tlenowych, prowadzi do osłabienia aktywności DDAH i przez to do zwiększenia stężenia ADMA, jak to zilustrowano na figurze ze stanu techniki. Przez podanie antyutleniaczy

4 1 2 można in vitro ten efekt ponownie znieść i ponownie odtworzyć aktywność DDAH. Aktywność DDAH ma decydujące znaczenie dla stężenia równowagowego ADMA w układach biologicznych. Wiadomo, że na aktywność DDAH wpływają czynniki zewnętrzne, takie jak stres oksydacyjny. Zmniejszona aktywność prowadzi do podwyższonych poziomów ADMA z ich negatywnymi konsekwencjami. Oznaczenie ilościowe ADMA w próbkach biologicznych utrudnia fakt, że oprócz ADMA w takich próbkach zawsze występuje także bardzo duża liczba innych składników, przy czym inne fizjologiczne aminokwasy, a zwłaszcza SDMA podobne co do budowy do ADMA utrudniają ocenę ilościową. Z literatury znanych jest szereg metod oznaczania ADMA w próbkach biologicznych. Najbardziej rozpowszechniona jest metodyka wysokociśnieniowej chromatografii cieczowej z detekcją fluorescencyjną. W tym celu argininę, ADMA, SDMA ewentualnie MMA i wzorzec wewnętrzny ekstrahuje się z próbki biologicznej za pomocą ekstrakcji w fazie stałej z wymianą jonową (SPE), ekstrakt za pomocą aldehydu ortoftalowego i merkaptanu (np. 2-merkaptoetanol, kwas 3- merkaptopropionowy) ulega przemianie w pochodną fluorescencyjną, pochodne wymienionych związków rozdziela się za pomocą HPLC i oznacza ilościowo za pomocą detekcji fluorescencyjnej. Opisano dużą liczbę modyfikacji tej metodyki, przy czym zasada oczywiście stale pozostaje ta sama (patrz np. Chen BM, Xia LW, Zhao RQ. Determination of N(G),N(G)-dimethylarginine in human plasma by high-performance liquid chromatography. J Chromatogr B Biomed Sci Appl 1997; 692: , Meyer

5 6 1 2 J, Richter N, Hecker M. High-performance liquid chromatographic determination of nitric oxide synthaserelated arginine derivatives in vitro and in vivo. Anal Biochem 1997; 247: II-6,Pettersson A, Uggla L, Backman V Determination of dimethylated arginines in human plasma by high- performance liquid chromatography. J Chromatogr B Biomed Sci Appl 1997; 692: 27-62,Pi J, Kumagai Y, Sun G, Shimojo N. Improved method for simultaneous determination of L-arginine and its monoand dimethylated metabolites in biological samples by high-performance liquid chromatography. J Chromatogr B Biomed Sci Appl 00; 742: 199-3, Dobashi Y, Santa T, Nakagomi K, Imai K. An automated analyzer for methylated arginines in rat plasma by high-performance liquid chromatography with post-column fluorescence reaction. Analyst 02; 127: 4-9, Teerlink T, Nijveldt RJ, de Jong S, van Leeuwen PAM. Determination of arginine, asymmetric dimethylarginine, and symmetric dimethylarginine in human plasma and other biological samples by high-performance liquid chromatography. Anal Biochem 02; 3: 131-7, Marra M, Bonfigli AR, Testa R, Testa I, Gambini A, Coppa G. High-performance liquid chromatographic assay of asymmetric dimethylarginine, symmetric dimethylarginine, and arginine in human plasma by derivatization with naphthalene-2,3- dicarboxaldehyde. Anal Biochem 03; 318: 13-7, Heresztyn T, Worthley MI, Horowitz JD. Determination of l-arginine and N(G), N(G)- and N(G),N(G')-dimethyl-larginine in plasma by liquid chromatography as AccQ- Fluor trade mark fluorescent derivatives. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci 04; 80: 32-9 i

6 7 1 2 Zhang WZ, Kaye DM. Simultaneous determination of arginine and seven metabolites in plasma by reversedphase liquid chromatography with a time-controlled ortho-phthaldialdehyde precolumn derivatization. Anal Biochem 04; 326: 87-92). Główną wadą tej metodyki jest ekstrakcja za pomocą SPE, która jest pracochłonna, droga i obarczona błędami. Dalsze chromatograficzne metody rozdziału oparte są na elektroforezie kapilarnej z detekcją fluorescencyjną (patrz np. Causse E, Siri N, Arnal JF, Bayle C, Malatray P, Valdiguie P et al. Determination of asymmetric dimethylarginine by capillary electrophoresis-laser-induced fluorescence. J Chromatogr B Biomed Sci Appl 00; 741: i Trapp G, Sydow K, Dulay MT, Chou T, Cooke JP, Zare RN. Capillary electrophoretic and micellar electrokinetic separations of asymmetrical dimethyl-l-arginine and structurally related amino acids: quantitation in human plasma J Sep Sci 04; 27: ) lub chromatografii gazowej z detekcją metodą spektrometrii masowej po każdorazowo odpowiedniej ekstrakcji i derywatyzacji ADMA i ewentualnie argininy i SDMA (patrz np. Tsikas D, Schubert B, Gutzki FM, Sandmann J, Frolich JC. Quantitative determination of circulating and urinary asymmetric dimethylarginine (ADMA) in humans by gas chromatography-tandem mass spectrometry as methyl ester tri(n-pentafluoropropionyl) derivative. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci 03; 798: i Albsmeier J, Schwedhelm E, Schulze F, Kastner M, Boger RH. Determination of N(G),N(G)-dimethyl-L-arginine, an endogenous NO synthase inhibitor, by gas chromatography-mass spectrometry. J Chromatogr B Analyt

7 8 1 2 Technol Biomed Life Sci 04; 809: 9-6). Opisano również nowsze metody, stosujące technologię HPLC-MS (patrz Huang LF, Guo FQ, Liang YZ, Li BY, Cheng BM (04) Simultaneous determination of L-arginine and its mono- and dimethylated metabolites in human plasma by high-performance liquid chromatography-mass spectrometry. Anal Bioanal Chem 380: , Martens- Lobenhoffer J, Krug O, Bode-Boger SM (04) Determination of arginine and asymmetric dimethylarginine (ADMA) in human plasma by liquid chromatography/mass spectrometry with the isotope dilution technique. J Mass Spectrom 39: , Kirchherr H, Kuhn-Velten WN (0) HPLC-tandem mass spectrometric method for rapid quantification of dimethylarginines in human plasma. Clin Chem 1:249-22, Schwedhelm E, Tan-Andresen J, Maas R, Riederer U, Schulze F, Boger RH (0) Liquid chromatography-tandem mass spectrometry method for the analysis of asymmetric dimethylarginine in human plasma. Clin Chem 1: ). GEHRIG P M ET AL: "Fragmentation pathways of N<G>-methylated and unmodified arginine residues in peptides studied by ESI-MS/MS and MALDI-MS" JOURNAL OF THE AMERICAN SOCIETY FOR MASS SPECTROMETRY, tom 1, nr 2, 04, str VISHWANATHAN K ET AL: "Determination of arginine and methylated arginines in human plasma by liquid chromatography-tandem mass spectrometry" JOURNAL OF CHROMATOGRAPHY. BIOMEDICAL APPLICATIONS, tom 748, nr 1, 1. październik 00 ( ), str SCHWEDHELM EDZARD: "Quantification of ADMA: analytical approaches." VASCULAR MEDICINE (LONDON, ENGLAND) JUL 0, tom supl. 1, ,

8 9 1 2 str. S89-S9. Do uzyskania pewnych wyników ilościowych metody te wymagają częściowo derywatyzacji składników oznaczanych przed chromatografią lub wymagają całkowitego rozdziału chromatograficznego ADMA i SDMA. Zasadniczo innym rozwiązaniem w celu oznaczenia ADMA w próbkach biologicznych jest oznaczenie za pomocą reakcji immunologicznych ze specyficznymi przeciwciałami. Dostępne w handlu zestawy odczynników działają według metody ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay). Zasadniczo przy użyciu tej metody można zawsze ilościowo oznaczyć tylko pojedynczy oznaczany składnik, tu zatem ADMA. Równoczesne oznaczenie np. argininy lub SDMA, jak jest to możliwe w przypadku metod chromatograficznych, jest tu wykluczone. Cel wynalazku polega na usunięciu wad w znanych sposobach określania stężenia asymetrycznej dimetyloargininy (ADMA) równocześnie z argininą i symetryczną dimetyloargininą (SDMA) w próbkach biologicznych za pomocą HPLC-MS-MS. Ponadto zadaniem jest opracowanie ekonomicznego sposobu, który pozwala na rutynową obróbkę dużych ilości próbek z uzyskiwaniem dokładnych wyników. Zgodnie z wynalazkiem zadanie to jest rozwiązane przez sposób według zastrz. 1. Decydujący postęp opisanego tu sposobu pomiaru argininy, ADMA i SDMA polega na minimalnym przygotowaniu próbek. Tym samym odpada całkowicie pracochłonna, droga i mało pewna ekstrakcja próbek za pomocą SPE, jak i derywatyzacja składników oznaczanych przed rozdziałem chromatograficznym. Dalszą innowacją

9 1 2 jest chromatograficzne oddzielanie składników oznaczanych od składników matrycy na bardzo ekonomicznej kolumnie do rozdziału w układzie faz normalnych (krzemionka) przy użyciu mieszaniny woda / acetonitryl / kwas propionowy / kwas trifluorooctowy / 90 / 1 / 0,02 jako fazy ruchomej. W tych warunkach skrajnie polarne substancje można rozdzielić szybko i bez uprzedniej derywatyzacji, podczas gdy na typowych kolumnach do rozdziału z odwróconymi fazami praktycznie żadna retencja i tym samym żadne oddzielanie składników matrycy nie jest osiągalne. Całkowity rozdział chromatograficzny ADMA i SDMA nie jest już konieczny, ponieważ przez zastosowanie tandemowego spektrometru masowego jako detektora ADMA i SDMA mogą być całkowicie rozróżnione przez ich widma MS-MS. Detekcja przez spektrometrię masową ma dalszą zaletę względem znanych metod z detekcją fluorescencyjną taką, że wskutek skrajnie wysokiej selektywności praktycznie można wykluczyć interferencje i tym samym błędy oceny ilościowej. Zastosowanie znakowanego izotopowo wzorca wewnętrznego prowadzi do szczególnie wysokiej precyzji i prawidłowej oceny ilościowej, niezależnie od matrycy próbek. Niekontrolowalne błędy systematyczne, które mogą występować przy pomiarze próbek biologicznych metodami konwencjonalnymi, całkiem tu odpadają. Odnosi się to również do oceny ilościowej ADMA przy użyciu zestawów ELISA. Jedyny dostępny w handlu zestaw ADMA- EUSA (DLD-Diagnostika GmbH, Niemcy) należy oddzielnie kalibrować dla każdej matrycy próbek (np. osocze krwi, surowica krwi, pożywka hodowli komórkowej). Wyniki są ponadto, jak wykazały nasze własne pomiary kontrolne,

10 zależne od każdorazowego typu choroby przy poza tym jednakowej matrycy próbek. Ponadto metoda ELISA zasadniczo może jedynie oznaczyć pojedynczy składnik oznaczany. Argininę i SDMA należy oznaczać ilościowo również inną metodą, aby przy zastosowaniu dalszych parametrów klinicznych jak np. funkcji śródbłonka móc sporządzić umożliwiający orzeczenie, całościowy obraz stanu NO układu biologicznego. Zaproponowana metoda analizy daje możliwość równoczesnego oznaczania argininy, ADMA oraz SDMA. W celu zbadania chorób sercowonaczyniowych konieczne jest oznaczenie argininy, ADMA i SDMA w osoczu krwi oraz moczu pacjentów i w pożywkach hodowli komórkowej. Liczba prywatnych laboratoriów biochemicznych, które rutynowo oferują tego rodzaju analitykę, stale rośnie. Zainteresowanie ekonomicznymi, mało pracochłonnymi i dokładnymi metodami analitycznymi jest dlatego duże. Opisany tu zgodny z wynalazkiem sposób spełnia te wymagania. Wynalazek poniżej będzie bliżej objaśniony na podstawie przykładu wykonania. Przynależne rysunki pokazują na Figurze 1: Typowy chromatogram osocza krwi i na Figurze 2: Wartości osocza krwi dla argininy, ADMA i SDMA dla normalnych osób badanych oraz dla pacjentów dializowanych. Przygotowanie próbek do analizy ilościowej argininy, ADMA i SDMA obejmuje jedynie dwa szybkie i łatwe do wykonania kroki. Jako pierwszy krok, próbkę

11 12 (osocze krwi, mocz lub pożywka hodowli komórkowej) miesza się z roztworem znakowanego izotopowo (dostępnego w handlu) wzorca wewnętrznego 13 C 6 -argininy i D 6 -ADMA (wytwarzany według: Martens-Lobenhoffer J, Krug O, Bode-Boger SM (04) Determination of arginine and asymmetric dimethylarginine (ADMA) in human plasma by liquid chromatography/ mass spectrometry with the isotope dilution technique. J Mass Spectrom 39: ). W drugim kroku do jednej części tej próbki dodaje się 9 części mieszaniny acetonitrylu / kwasu propionowego / kwasu trifluorooctowego 99 / 1 / 0,02 (części objętościowe). Przy tym białka zawarte w próbce wytrącają się i mogą zostać odwirowane. Ponadto przez to skład próby zbliża się do składu fazy ruchomej 1 (patrz niżej) do rozdziału przez HPLC tak, że na rozdział chromatograficzny nie wpływa negatywnie wstrzykiwanie próbek o sile wymywania różnej od siły wymywania fazy ruchomej. Tak przygotowane próbki bezpośrednio rozdziela się przez HPLC. Następuje to na kolumnie z krzemionką z fazą normalną, przy czym jako fazy ruchomej nie stosuje się typowej fazy ruchomej w układzie faz normalnych (jak np. heksan lub dichlorometan), lecz składa się ona z mieszaniny woda / acetonitryl / kwas propionowy / kwas trifluorooctowy. 2 Stosunek objętościowy wody do acetonitrylu może przy tym wynosić od 2 do 98 do do 70 części objętościowych, przy czym większy udział wody prowadzi do skróconych czasów retencji i obniżonej zdolności rozdziału. Kwas trifluorooctowy przy zawartości 0,01 do 0, części objętościowych w fazie ruchomej prowadzi do ostrych i

12 symetrycznych pików w chromatogramie, podczas gdy równocześnie występujący do 0-krotnie wyższy udział kwasu propionowego w fazie ruchomej ponownie znosi obniżenie wydajności jonizacji w detektorze spektrometrii masowej przez kwas trifluorooctowy. (SHOU ET AL: "Simple means to alleviate sensitivity loss by trifluoroacetic acid (TFA) mobile phases in the hydrophilic interaction chromatography-electrospray tandem mass spectrometric (HILIC-ESI/MS/MS) bioanalysis of basic compounds" JOURNAL OF CHROMATOGRAPHY B: BIOMEDICAL SCIENCES & APPLICATIONS, tom 82, nr 2, , strony ). Zoptymalizowane stosunki objętościowe wody / acetonitrylu / kwasu propionowego / kwasu trifluorooctowego wynoszą / 90 / 1 / 0,02. W tych warunkach uzyskuje się symetryczne i ostre piki, które całkowicie są oddzielone od składników matrycy (Figura 1). Detekcja składników oznaczanych następuje po dodatniej jonizacji w źródle jonów elektrospreju za pomocą tandemowej spektrometrii masowej. Obserwuje się frakcje jonowe 17,2 m/z 70,1 m/z dla argininy, 181,2 m/z 74,1 m/z dla 13 C 6 -argininy, 3,2 m/z 172,1 m/z dla SDMA, 3,2 m/z 46,1 m/z dla ADMA i 9,2 m/z 70,1 m/z D 6 -ADMA. Te ślady jonów są selektywne dla danych składników oznaczanych i w ten sposób można po raz pierwszy zrezygnować z całkowitego rozdziału chromatograficznego ADMA i SDMA. Ocena ilościowa następuje przez stosunek powierzchni składnika oznaczanego do wzorca wewnętrznego. Dla argininy jako wzorzec wewnętrzny służy 13 C 6 -arginina, dla ADMA i SDMA jako wzorzec wewnętrzny służy D 6 -ADMA.

13 14 Walidowanie sposobu dla wszystkich opisanych cieczy biologicznych daje dobre wyniki. W tablicy I zestawiono poszczególne dane. Precyzję w serii oznaczono przez - krotne oznaczenie próbki w obrębie jednej zmiany roboczej, precyzję powtórzenia przez 6-krotne oznaczenie próbki w różnych dniach. Tablica 1 Substancja Ośrodek Zakres Precyzja kalibracji w serii [µmol/l] [%] [%] Arginina Osocze krwi 0-4,48 4,66 Mocz 0-0 4,09 4,76 Pożywka hodowli 0-0 komórkowej 4,9 2,92 ADMA Osocze krwi 0-3,2 7,67 Mocz 0-0 2,1,36 Pożywka hodowli 0-3 komórkowej 3,40 7,68 SDMA Osocze krwi 0-4 3,93 4,86 Mocz 0-0 2,93,18 Pożywka hodowli 0-4 komórkowej,8 6,48 Precyzja powtórzenia 1 W badaniu klinicznym oznaczono wartości w osoczu krwi dla argininy, ADMA i SDMA normalnych osób badanych i pacjentów dializowanych (Figura 2). Jak widać, w grupie pacjentów dializowanych wartości dla ADMA i SDMA są bardzo znacząco zwiększone względem grupy kontrolnej, podczas gdy dla argininy nie można stwierdzić znaczącej różnicy. Wartość średnia dla argininy wynosi w grupie kontrolnej 60,6 ± 18,27 µmol/l i w grupie dializowanej 64, ± 13,41 µmol/l. Odpowiednie wartości dla ADMA wynoszą 0,370 ± 0,061 µmol/l względem 0,77 ± 0,16 µmol/l i dla SDMA 0,449 ± 0,0 względem 3,8 ± 1,048 µmol/l.

14 1 1 2 Zastrzeżenia patentowe 1. Sposób określania stężenia asymetrycznej dimetyloargininy (ADMA) równocześnie z argininą i symetryczną dimetyloargininą (SDMA) w próbkach biologicznych za pomocą HPLC-MS-MS, znamienny tym, że przygotowanie próbki składa się wyłącznie z dodania roztworu znakowanych izotopowo wzorców wewnętrznych, w szczególności 13 C 6 -argininy i D 6 -ADMA, i dodania 9 części mieszaniny acetonitrylu/ kwasu propionowego/ kwasu trifluorooctowego w częściach objętościowych 99:1:0,02 do jednej części próbki by wytrącić białka o wysokiej masie cząsteczkowej bez konieczności derywatyzacji lub ekstrakcji składników oznaczanych, rozdział chromatograficzny składników oznaczanych dokonuje się na kolumnie HPLC z krzemionką w układzie faz normalnych przy zastosowaniu fazy ruchomej woda/acetonitryl/kwas propionowy/kwas trifluorooctowy w częściach objętościowych :90:1:0,02, a detekcję oraz ocenę ilościową dokonuje się za pomocą tandemowej spektrometrii masowej, przy czym obserwuje się frakcje 17,2 m/z 70,1 m/z dla argininy, 181,2 m/z 74,1 m/z dla 13 C 6 - argininy, 3,2 m/z 172,1 m/z dla SDMA, 3,2 m/z 46,1 m/z dla ADMA i 9,2 m/z 70,1 m/z dla D 6 -ADMA. 2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że matrycą próbki jest osocze krwi.

15 16 3. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że matrycą próbki jest mocz. 4. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że matrycą próbki jest pożywka hodowli komórkowej. Medizinishe Fakultät dr Otto-von-Guericke-Universität ESA Patentverwertungsagentur Sachsen-Anhalt GmbH Pełnomocnik:

16 17

17 18

18 19