COBAS TaqMan HBV Test HBV HPS

Transkrypt

1 COBAS TaqMan HBV Test For Use With The High Pure System DO STOSOWANIA W DIAGNOSTYCE IN VITRO. COBAS TaqMan HBV Test HBV HPS 48 Tests P/N: High Pure System Viral Nucleic Acid Kit 48 Tests P/N: PRZEZNACZENIE Test COBAS TaqMan HBV, przeznaczony do użytkowania łącznie z zestawem High Pure System (HPS), jest testem in vitro opartym na amplifikacji kwasu nukleinowego w celu ilościowej oceny stężenia DNA wirusa zapalenia wątroby typu B (HBV) w ludzkiej surowicy lub osoczu, z wykorzystaniem zestawu High Pure System Viral Nucleic Acid Kit do ręcznego przygotowywania próbek oraz analizatora COBAS TaqMan 48 do automatycznej amplifikacji i detekcji. Test COBAS TaqMan HBV nie jest przeznaczony do przesiewowego badania krwi lub produktów krwiopochodnych na obecność HBV, ani w roli testu diagnostycznego potwierdzającego obecność zakażenia wirusem HBV. PODSUMOWANIE ORAZ OBJAŚNIENIE TESTU Wirus zapalenia wątroby typu B (HBV) jest jednym z szeregu wirusów o znanej zdolności wywoływania wirusowego zapalenia wątroby. Przeszło 2 miliardy ludzi na całym świecie uległo zakażeniu wirusem HBV, zaś spośród nich ponad 350 milionów osób to przewlekle zakażeni nosiciele 1. Przewlekli nosiciele wykazują podwyższone ryzyko powikłań odległych zakażenia, w tym przewlekłego zapalenia, marskości oraz pierwotnego raka wątrobowokomórkowego 2,3,4. Markery serologiczne są powszechnie stosowane w roli diagnostycznych i/lub prognostycznych wskaźników ostrego lub przewlekłego zakażenia wirusem HBV. Najczęściej stosowanym markerem zakażenia HBV jest obecność jego antygenu powierzchniowego (HBsAg). Chociaż u nosicieli może dochodzić do eliminacji antygenu HBsAg oraz do wytwarzania przeciwciał skierowanych przeciwko niemu, to jednak HBsAg nadal okazuje się być czynnikiem ryzyka rozwoju w późniejszym okresie życia poważnych powikłań dotyczących wątroby 5,6. Antygen e wirusa HBV (HBeAg) jest generalnie wykorzystywany jako wtórny marker, wskazujący na czynną replikację wirusa HBV związaną z postępującym schorzeniem wątroby. Okazuje się, że niezdolność do eliminacji antygenu HBeAg zwiększa ryzyko wystąpienia krańcowych stadiów rozwoju choroby wątroby 7,8. Różne szczepy wirusa HBV mogą albo wytwarzać antygen HBeAg niemożliwy do wykrycia w surowicy, albo tracić zdolność produkcji HBeAg nawet wówczas, gdy obecna jest czynna infekcja 9. Zatem wykorzystywanie tego markera do monitorowania postępu choroby może mieć ograniczoną użyteczność 10. Według doniesień możliwość wykrycia DNA wirusa HBV w surowicy posiada wartość prognostyczną, umożliwiającą rokowanie co do wyników ostrych i przewlekłych zakażeń wirusem HBV 11,12,13,14. Metoda ta może umożliwić wykrywanie DNA wirusa HBV po eliminacji antygenu HBsAg 15 lub wykrywanie HBV ubogiego w markery serologiczne 16. Jednakże nie ustalono dotąd związku pomiędzy markerami serologicznymi a poziomami DNA wirusa HBV. Skuteczność leczenia antywirusowego, stosowanego u pacjentów zakażonych HBV, również można oceniać na podstawie badania markerów serologicznych lub pomiarów aktywności enzymów wątrobowych. Jednak za najbardziej bezpośredni i rzetelny sposób pomiaru replikacji wirusa uważa się ilościową ocenę stężenia DNA HBV w surowicy lub osoczu 13,17,18,19. Wykazano, że szybki i trwały spadek poziomów DNA wirusa HBV u pacjentów otrzymujących alfa-interferon, lamiwudynę lub gancyklowir jest czynnikiem predykcyjnym korzystnego wyniku leczenia 10,20,21,22,23,24. Monitorowanie poziomów DNA HBV pozwala przewidzieć rozwój oporności na lamiwudynę 25. Zatem ilościowy test służący do pomiaru stężenia DNA wirusa HBV jest cennym narzędziem, które można wykorzystywać w połączeniu z badaniami innych markerów serologicznych podczas leczenia zakażenia HBV. ZASADY PROCEDURY Test COBAS TaqMan HBV oparty jest na dwóch głównych procesach: (1) manualnej obróbce próbki w celu uzyskania DNA wirusa HBV; (2) zautomatyzowanej amplifikacji PCR docelowego DNA z użyciem swoistych dla HBV komplementarnych primerów oraz detekcji rozszczepionych, znakowanych podwójnym barwnikiem fluorescencyjnym detekcyjnych sond oligonukleotydowych, które umożliwiają ilościową ocenę amplifikowanego docelowego produktu HBV (amplikonu) oraz HBV Quantitation Standard DNA, preparatu, który obrabia się, amplifikuje i poddaje detekcji równocześnie z próbką. Odczynnik Master Mix zawiera pary primerów i sondy swoiste zarówno dla DNA HBV, jak i standardowego DNA preparatu HBV Quantitation Standard DNA. Odczynnik Master Mix opracowano w celu zapewnienia równoważnego oznaczenia ilościowego genotypów HBV od A do G. Detekcji amplifikowanego DNA dokonuje się przy użyciu swoistych dla sekwencji docelowych oraz swoistych dla preparatu Quantitation Standard, podwójnie znakowanych sond oligonukleotydowych, pozwalających na niezależną identyfikację amplikonu HBV i amplikonu HBV Quantitation Standard. Część Informacje na temat wersji dokumentu znajduje się na końcu tego dokumentu PL 1

2 Oznaczanie ilościowe DNA wirusa HBV przeprowadza się za pomocą preparatu HBV Quantitation Standard. HBV Quantitation Standard to niezakaźny, linearyzowany plazmid zawierający miejsca wiązania primerów identyczne z posiadanymi przez docelowy DNA HBV, a także charakterystyczne miejsce wiązania sondy, które umożliwia odróżnienie amplikonu HBV Quantitation Standard od docelowego amplikonu HBV. HBV Quantitation Standard wchodzi w skład każdej próbki i kontroli ze znaną liczbą kopii; wraz z docelowym materiałem HBV jest poddawany etapom: przygotowania próbki, amplifikacji PCR oraz detekcji. Analizator COBAS TaqMan 48 oblicza miano DNA HBV w badanej próbce na podstawie porównania sygnału HBV z sygnałem HBV Quantitation Standard w każdej próbce oraz kontroli. HBV Quantitation Standard rekompensuje wpływ hamowania oraz kontroluje proces przygotowywania i amplifikacji, pozwalając uzyskać dokładne oznaczenie ilościowe DNA HBV w każdej próbce. Przygotowanie próbki Test COBAS TaqMan HBV polega na obróbce próbek osocza i surowicy oraz izolacji DNA wirusa HBV w drodze podstawowego przygotowania wykonywanego ręcznie, opartego na wiązaniu kwasu nukleinowego przez włókna szklane. Cząstki wirusa HBV zostają poddane lizie poprzez ich inkubację w podwyższonej temperaturze z proteazą oraz chaotropowym buforem lizującym/wiążącym, który powoduje uwolnienie kwasów nukleinowych i ochronę uwolnionego DNA HBV przed znajdującymi się w osoczu i surowicy cząsteczkami DNazy. Znana liczba cząsteczek DNA preparatu HBV Quantitation Standard DNA jest wprowadzana do każdej próbki wraz z odczynnikiem lizującym. W dalszej kolejności do mieszaniny, w której dokonano lizy, dodaje się izopropanol, po czym mieszaninę wiruje się i przepuszcza przez kolumnę z wkładem filtrującym, zawierającym włókna szklane. W trakcie wirowania cząsteczki DNA wirusa HBV i preparatu HBV Quantitation Standard ulegają związaniu na powierzchni włókien szklanych filtra. Substancje niezwiązane, takie jak sole, białka i inne zanieczyszczenia pochodzenia komórkowego, zostają usunięte w wyniku wirowania. Zaadsorbowany kwas nukleinowy jest wymywany i poddany elucji roztworem wodnym. Materiały jednorazowego użytku umożliwiają równoległą obróbkę 12 próbek lub wielokrotności tej liczby. Poddawana obróbce próbka, zawierająca DNA wirusa HBV oraz preparatu HBV Quantitation Standard, jest następnie dodawana do mieszaniny do amplifikacji/detekcji. Następnie docelowy DNA wirusa HBV oraz preparatu HBV Quantitation Standard zostają poddane amplifikacji i detekcji za pomocą analizatora COBAS TaqMan 48 oraz odczynników do amplifikacji i detekcji, dostarczanych wraz z zestawem testowym. Amplifikacja PCR Wybór sekwencji docelowej Wybór docelowej sekwencji DNA dla HBV zależy od identyfikacji regionów w obrębie genomu HBV, które wykazują największy konserwatyzm sekwencji pośród wszystkich genotypów. Zgodnie z tym, właściwy wybór odcinków primerowych oraz sondy ma kluczowe znaczenie dla zdolności testu do detekcji istotnych klinicznie genotypów HBV. Wykazano, że maksymalnym konserwatyzmem sekwencji DNA pośród genotypów odznacza się kolisty, częściowo jednoniciowy obszar genomu HBV. Test COBAS TaqMan HBV wykorzystuje podczas amplifikacji PCR primery definiujące sekwencję w obrębie wysoce konserwatywnego, przedrdzeniowego/rdzeniowego obszaru genomu HBV. Amplifikacja sekwencji docelowej Poddane obróbce próbki dodaje się do mieszaniny amplifikacyjnej w probówkach do amplifikacji (K-tubes), gdzie zachodzi amplifikacja PCR. Zainstalowany w aparacie COBAS TaqMan 48 termocykler podgrzewa mieszaninę w celu denaturacji dwuniciowego DNA i odsłonięcia sekwencji docelowych swoistych dla primerów w obrębie DNA kolistego fragmentu genomu HBV oraz preparatu HBV Quantitation Standard DNA. Podczas schładzania mieszaniny primery wtapiają się w DNA docelowe. Termostabilna polimeraza DNA Thermus specie Z05 (Z05), w obecności jonów Mn 2+ oraz nadmiaru trójfosforanów dezoksynukleotydów (dntp), w tym dezoksyadenozyny, dezoksyguanozyny, dezoksycytydyny i dezoksyurydyny (zamiast tymidyny), przedłuża przyłączone primery wzdłuż docelowej matrycy, tworząc dwuniciową cząsteczkę DNA zwaną amplikonem. Analizator COBAS TaqMan 48 automatycznie powtarza powyższy proces przez określoną liczbę cykli, w każdym z nich zmierzając do podwojenia ilości amplikonu DNA. Wymagana liczba cykli jest zaprogramowana w analizatorze COBAS TaqMan 48. Amplifikacja zachodzi wyłącznie w regionie genomu wirusa HBV znajdującym się pomiędzy primerami; cały genom HBV nie ulega zwielokrotnieniu. Amplifikacja wybiórcza Amplifikację wybiórczą badanego kwasu nukleinowego z próbki klinicznej przy użyciu testu COBAS TaqMan HBV uzyskuje się dzięki zastosowaniu enzymu AmpErase (uracylo-n-glikozylaza) i trójfosforanu dezoksyurydyny (dutp). Enzym AmpErase rozpoznaje i katalizuje niszczenie nici DNA zawierających dezoksyurydynę 26, lecz nie DNA zawierającego dezoksytymidynę. W DNA występującym w naturze nie stwierdza się dezoksyurydyny, natomiast jest ona zawsze obecna w amplikonie, ze względu na stosowanie trójfosforanu dezoksyurydyny jako jednego spośród trójfosforanów dezoksynukleotydu w odczynniku Master Mix; dlatego też dezoksyurydynę zawiera wyłącznie amplikon. Dezoksyurydyna powoduje wrażliwość zanieczyszczającego amplikonu na rozkład przez enzym AmpErase przed amplifikacją docelowego DNA. Także jakiekolwiek nieswoiste produkty reakcji, powstałe po wstępnej aktywacji odczynnika Master Mix przez jony manganu, pod działaniem enzymu AmpErase ulegają zniszczeniu, co powoduje poprawę czułości i swoistości testu. Enzym AmpErase, zawarty w odczynniku Master Mix, katalizuje rozkład DNA zawierającego dezoksyurydynę w miejscu reszt dezoksyurydynowych przez otwarcie pierścienia dezoksyrybozy w pozycji C1. Podczas ogrzewania w pierwszym cyklu termicznym łańcuch amplikonu DNA pęka w miejscu, PL 2

3 w którym znajduje się dezoksyurydyna, w ten sposób wykluczając dalszą amplifikację DNA. Enzym AmpErase jest nieczynny w temperaturach powyżej 55 C, tj. w czasie trwania całego cyklu termicznego, dlatego też nie niszczy on amplikonu docelowego, powstałego podczas amplifikacji. Detekcja produktów reakcji PCR w teście COBAS TaqMan Test COBAS TaqMan HBV wykorzystuje technologię reakcji PCR czasu rzeczywistego 27,28. Zastosowanie sond podwójnie znakowanych barwnikiem fluorescencyjnym zapewnia ciągłą detekcję gromadzenia się produktu reakcji PCR na podstawie monitorowania intensywności emisji fluorescencyjnych barwników reporterowych, uwalnianych w trakcie procesu amplifikacji. Sondy składają się z oligonukleotydów, swoistych dla HBV i HBV Quantitation Standard, znakowanych barwnikiem reporterowym i wygaszaczem. W teście COBAS TaqMan HBV sondy dla HBV i HBV Quantitation Standard są oznakowane różnymi fluorescencyjnymi barwnikami reporterowymi. Gdy podwójnie oznakowane barwnikami fluorescencyjnymi cząsteczki sond są nienaruszone, fluorescencja reportera jest przytłumiona bliskością wygaszacza, na zasadzie efektu przenoszenia energii typu Förstera. Podczas reakcji PCR sonda ulega hybrydyzacji z sekwencją docelową, a następnie rozszczepieniu pod wpływem posiadanej przez termostabilną polimerazę DNA Z05 aktywności 5' 3' nukleazy. Z chwilą uwolnienia i rozdzielenia reportera i wygaszacza nie zachodzi dłużej zjawisko wygaszania i aktywność fluorescencyjna barwnika reporterowego nasila się. Amplifikację DNA HBV oraz DNA HBV Quantitation Standard mierzy się niezależnie od siebie, wykorzystując różne długości fal. Proces ten powtarza się zgodnie z wyznaczoną ilością cykli, zaś w każdym cyklu następuje efektywne zwiększenie intensywności emisji poszczególnych barwników reporterowych, umożliwiając niezależną identyfikację DNA HBV oraz preparatu HBV Quantitation Standard DNA. Intensywność sygnałów odnosi się do ilości materiału wyjściowego na początku reakcji PCR. Podstawy oceny ilościowej w teście COBAS TaqMan HBV Test COBAS TaqMan HBV zapewnia dokładne wyniki ilościowe w bardzo szerokim przedziale dynamiki, ponieważ monitorowanie amplikonu przeprowadza się w trakcie fazy wykładniczej amplifikacji. Im wyższe jest miano HBV w badanej próbce, tym wcześniej fluorescencja barwnika reporterowego sondy HBV wzrasta powyżej wyjściowego poziomu fluorescencji (patrz Rysunek 1). Ponieważ ilość DNA preparatu HBV Quantitation Standard (QS) jest stała we wszystkich próbkach, fluorescencja barwnika reporterowego sondy HBV QS powinna pojawiać się w każdej próbce w tym samym cyklu (patrz Rysunek 2). W przypadku, gdy na amplifikację i detekcję QS wpłynie obecność inhibitorów lub niska wartość próbki, pojawienie się fluorescencji ulegnie opóźnieniu, pozwalając tym samym na odpowiednią modyfikację obliczonej wartości miana docelowego DNA wirusa HBV. Pojawienie się swoistego sygnału fluorescencyjnego jest rejestrowane jako krytyczna wartość progowa (Ct). Wartość Ct definiuje się jako liczbę cykli cząstkowych, po której fluorescencja barwnika reporterowego przekracza ustaloną wcześniej wartość progową (ustalony poziom fluorescencji) i zapoczątkowuje fazę wykładniczego wzrostu siły sygnału (patrz Rysunek 3). Większa wartość Ct wskazuje na wyższe miano początkowe docelowego DNA wirusa HBV. 2-krotny wzrost miana koreluje ze zmniejszeniem wartości Ct docelowego DNA HBV o 1, zaś 10-krotny wzrost miana koreluje ze zmniejszeniem Ct o 3,3. Rysunek 1 przedstawia krzywe wzrostu docelowego dla serii rozcieńczeń próbek wirusa, obejmującej przedział 5-krotnej wartości log 10. W miarę wzrostu stężenia wirusów krzywe wzrostu przesuwają się w kierunku wcześniejszych cykli. Zatem krzywa wzrostu leżąca najdalej na lewo odzwierciedla najwyższy poziom miana wirusa, zaś krzywa wzrostu leżąca najdalej na prawo oznacza najniższy poziom miana wirusa. Rysunek 1 9,00 8,00 7,00 Normalizowana fluorescencja 6,00 5,00 4,00 3,00 2,00 1,00 0,00 Miano najwyższe Miano najniższe -1, Liczba cykli PL 3

4 Rysunek 2 przedstawia krzywe wzrostu preparatu Quantitation Standard dla próbek z serią rozcieńczeń wirusa, obejmującą przedział 5-krotnej wartości log 10. Ilość preparatu Quantitation Standard dodanego do każdej próbki jest stała dla każdej reakcji. Wartość Ct dla preparatu Quantitation Standard jest podobna niezależnie od miana wirusa. Rysunek 2 35,00 30,00 Miano najniższe Normalizowana fluorescencja 25,00 20,00 15,00 10,00 5,00 Miano najwyższe 0,00-5, Liczba cykli Rysunek 3 przedstawia na przykładzie, w jaki sposób wartości fluorescencji w każdym cyklu są normalizowane dla każdej krzywej wzrostu. Liczbę cykli cząstkowych (Ct) oblicza się w chwili, gdy sygnał fluorescencyjny przekracza ustalony poziom fluorescencji. Rysunek 3 1 0,9 Normalizowana fluorescencja 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 Ustalony poziom fluorescencji Wartość Ct = 27,1 0,1 0-0, Liczba cykli Ocena ilościowa stężenia DNA HBV Test COBAS TaqMan HBV ilościowo oznacza DNA wirusa HBV, wykorzystując drugą sekwencję docelową (HBV Quantitation Standard), którą w znanym stężeniu dodaje się do każdej próbki testowej. Preparat HBV Quantitation Standard jest niezakaźnym, linearyzowanym, plazmidowym konstruktem DNA, zawierającym fragmenty sekwencji HBV z obszarami wiązania primerów, które są identyczne z obszarami wiązania na docelowej sekwencji HBV. Preparat HBV Quantitation Standard wytwarza również produkt amplifikacji o tej samej długości łańcucha i składzie zasad, co docelowy DNA wirusa HBV. Leżący w obrębie sondy detekcyjnej obszar wiązania HBV Quantitation Standard został zmodyfikowany w celu różnicowania amplikonu HBV Quantitation Standard i amplikonu docelowego HBV PL 4

5 Podczas fazy wtapiania reakcji PCR w analizatorze COBAS TaqMan 48, próbki zostają oświetlone przefiltrowanym światłem i wzbudzone, po czym rejestruje się wyniki emisji przefiltrowanej fluorescencji każdej próbki. Odczyty wyniku każdej próbki poddaje się korekcji w celu wyeliminowania zmienności wywołanej działaniem instrumentów. Aparat wprowadza odczyty fluorescencji do programu AMPLILINK i zapisuje w bazie danych. Stosuje się metodę odczytów wstępnych dla określenia, czy DNA HBV oraz DNA HBV Quantitation Standard reprezentują zestawy, które można uznać za ważne; w sytuacji, gdy dane nie mieszczą się w ustalonych granicach, aparat opatruje je odpowiednimi oznaczeniami. Po ukończeniu i pomyślnej ocenie odczytów wstępnych odczyty fluorescencji są następnie przetwarzane w celu obliczenia wartości Ct dla DNA HBV i dla DNA preparatu HBV Quantitation Standard. Tablica stałych, swoistych dla danej serii wartości kalibracji, dołączona do testu COBAS TaqMan HBV, jest wykorzystywana do obliczania wartości miana próbek i kontroli na podstawie wartości Ct DNA HBV oraz DNA preparatu HBV Quantitation Standard. Test COBAS TaqMan HBV jest wystandaryzowany według standardu WHO HBV International Standard for NAT Testing 97/746 29, zaś wyniki mian przedstawiane są w jednostkach międzynarodowych (IU/ml). ODCZYNNIKI High Pure System Viral Nucleic Acid Kit Zestaw High Pure System Viral Nucleic Acid Kit 48 testów (P/N: ) LYS 2 x 25 ml (Bufor do lizy/wiążący) Tris 50% (udział wagowy) chlorowodorek guanidyny < 1% mocznik 19% (udział wagowy) Triton X-100 CAR 2 x 2 mg (RNA, liofilizowany) PK 2 x 100 mg (Proteinaza K, liofilizowana) 64% (udział wagowy) proteinaza K, liofilizowana IRB 1 x 33 ml (Bufor usuwający inhibitor) Tris 65% chlorowodorek guanidyny (dodać 20 ml etanolu) WASH 1 x 20 ml (Bufor do wymywania) Tris NaCl (dodać 80 ml etanolu) ELB 1 x 30 ml (Bufor do elucji) RS 4 x każdy (zestaw statywów High Pure System Viral Nucleic Acid Rack Set) Statyw do przeprowadzania lizy Statyw z rurkami filtracyjnymi z mocowanym statywem na odpady Statyw do elucji Statyw z pokrywkami WR (Statyw na odpady High Pure System Viral Nucleic Acid Waste Rack) 8 x każdy PL 5

6 COBAS TaqMan HBV Test HBV HPS 48 testów (P/N: ) Odczynniki do przygotowywania próbki i odczynniki kontrolne HBV QS 2 x 1,0 ml (COBAS TaqMan Standard oznaczania HBV) Bufor Tris-HCl EDTA < 0,001% linearyzowany, dwuniciowy, plazmidowy DNA, zawierający wstawkę. Wstawka DNA zawiera sekwencje HBV wiążące primery oraz swoisty obszar wiążący sondę. Barwnik amarantowy < 0,005% Poly ra RNA (syntetyczny) 0,05% azydek sodu HBV H(+)C 2 x 1,0 ml [Kontrola HBV silnie (+)] < 0,001% linearyzowany, dwuniciowy, plazmidowy DNA, zawierający sekwencje HBV. Osocze ludzkie dające wynik ujemny, niereaktywne w testach licencjonowanych przez US FDA w zakresie przeciwciał przeciwko HCV, przeciwciał przeciwko HIV-1/2, antygenu HIV p24 oraz antygenu HBsAg; HIV-1 RNA, HCV RNA oraz HBV DNA niewykrywalnych przy użyciu metod PCR 0,1% substancja konserwująca ProClin 300 HBV L(+)C 2 x 1,0 ml [Kontrola HBV słabo (+)] < 0,001% linearyzowany, dwuniciowy, plazmidowy DNA, zawierający sekwencje HBV. Osocze ludzkie dające wynik ujemny, niereaktywne w testach licencjonowanych przez US FDA w zakresie przeciwciał przeciwko HCV, przeciwciał przeciwko HIV-1/2, antygenu HIV p24 oraz antygenu HBsAg; HIV-1 RNA, HCV RNA oraz HBV DNA niewykrywalnych przy użyciu metod PCR 0,1% substancja konserwująca ProClin 300 CTM ( ) C 4 x 1,0 ml [COBAS TaqMan kontrola ujemna (osocze ludzkie)] Osocze ludzkie dające wynik ujemny, niereaktywne w testach licencjonowanych przez US FDA w zakresie przeciwciał przeciwko HCV, przeciwciał przeciwko HIV-1/2, antygenu HIV p24 oraz antygenu HBsAg; HIV-1 RNA, HCV RNA oraz HBV DNA niewykrywalnych przy użyciu metod PCR 0,1% substancja konserwująca ProClin 300 Odczynniki do amplifikacji i detekcji HBV MMX 2 x 24 testy (Odczynnik COBAS TaqMan HBV Master Mix) 2 x 1,4 ml Bufor Tricine Wodorotlenek potasu Octan potasu Glicerol < 0,001% datp, dctp, dgtp, dutp < 0,001% preparat primerów sensownych i antysensownych przedrdzeniowych/rdzeniowych obszarów HBV < 0,001% preparat znakowanych barwnikami fluorescencyjnymi sond oligonukleotydowych, swoistych dla HBV oraz HBV Quantitation Standard < 0,001% aptamer oligonukleotydowy < 0,05% polimeraza DNA Z05 (bakteryjna) < 0,1% enzym AmpErase (uracylo-n-glikozylaza) (bakteryjny) 0,09% azydek sodu CTM Mn 2+ 2 x 24 testy (COBAS TaqMan roztwór manganu) 2 x 1,0 ml < 1,2% octan manganu Kwas octowy lodowaty 0,09% azydek sodu PL 6

7 OSTRZEŻENIA I ŚRODKI OSTROŻNOŚCI A. DO STOSOWANIA W DIAGNOSTYCE IN VITRO. B. Test ten przeznaczony jest do stosowania z osoczem ludzkim pobranym na antykoagulant EDTA oraz z ludzką surowicą. C. Nie pipetować za pomocą ust. D. Nie jeść, nie pić oraz nie palić w laboratorium, w obszarach roboczych. Przy obchodzeniu się z próbkami i odczynnikami z zestawów stosować jednorazowe rękawice, fartuchy laboratoryjne oraz odpowiednią ochronę oczu. Dokładnie umyć ręce po obchodzeniu się z próbkami i odczynnikami testowymi. E. Przy pobieraniu poszczególnych dawek odczynników z butelek, unikać skażenia bakteryjnego odczynników lub ich zanieczyszczenia rybonukleazą. F. Zaleca się używanie jałowych jednorazowych pipet oraz końcówek pipet wolnych od DNazy. G. Nie mieszać odczynników pochodzących z różnych serii lub różnych butelek tej samej serii. H. Nie mieszać ze sobą odczynników pochodzących z różnych zestawów. I. Wyrzucić wszystkie niezużyte odczynniki, odpady i próbki, postępując zgodnie z przepisami krajowymi, federalnymi, stanowymi i lokalnymi. J. Nie używać zestawu po upływie daty przydatności. K. Karty charakterystyki (ang. Safety Data Sheet, SDS) są dostępne na żądanie w miejscowym przedstawicielstwie firmy Roche. L. Z próbkami należy obchodzić się tak, jak z materiałem zakaźnym, stosując laboratoryjne procedury bezpieczeństwa, takie jak określone w Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories 30 oraz w dokumencie CLSI M29-A3 31. Dokładnie oczyścić i odkazić wszystkie powierzchnie robocze świeżo przygotowanym roztworem 0,5% podchlorynu sodu w wodzie dejonizowanej lub destylowanej. UWAGA: Dostępny w handlu płynny domowy wybielacz zawiera zazwyczaj podchloryn sodu w stężeniu 5,25%. Rozcieńczenie domowego wybielacza w stosunku 1:10 przyniesie 0,5% roztwór podchlorynu sodu. M. PRZESTROGA: Odczynniki: CTM ( ) C, HBV L(+)C oraz HBV H(+)C zawierają ludzkie osocze otrzymane z krwi ludzkiej. Materiał źródłowy badano przy użyciu testów zatwierdzonych przez US FDA i stwierdzono, że jest on niereaktywny pod względem obecności antygenu powierzchniowego wirusa zapalenia wątroby typu B (HBsAg), przeciwciał przeciwko HIV-1/2 oraz HCV, a także antygenu HIV p24 Badanie ujemnego osocza ludzkiego (Negative Human Plasma) przy zastosowaniu metod PCR nie wykazało wykrywalnej obecności RNA wirusa HIV-1, RnA wirusa HCV lub DNA wirusa HBV. Nie ma znanych metod testowych mogących zapewnić całkowitą pewność, że produkty pochodzące krwi ludzkiej nie przenoszą czynników zakaźnych. Dlatego też każdy materiał pochodzenia ludzkiego należy traktować jako potencjalnie zakaźny. Z odczynnikami: CTM ( ) C, HBV L(+)C oraz HBV H(+)C należy obchodzić się tak jak z materiałem zakaźnym, stosując laboratoryjne procedury bezpieczeństwa, takie jak wymienione w wytycznych Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories 30 oraz w dokumencie CLSI M29-A3 31. Dokładnie oczyścić i odkazić wszystkie powierzchnie robocze świeżo przygotowanym roztworem 0,5% podchlorynu sodu w wodzie dejonizowanej lub destylowanej. N. Odczynniki: HBV MMX, HBV QS oraz CTM Mn 2+ zawierają azydek sodu. Azydek sodu może wchodzić w reakcje z instalacjami wodno-kanalizacyjnymi wykonanymi z ołowiu lub miedzi tworząc silnie wybuchowe azydki metali. Usuwając roztwory zawierające azydek sodu do zlewów laboratoryjnych, należy spłukać je dużą ilością wody aby zapobiec nagromadzeniu azydków. O. Podczas pracy z jakimkolwiek odczynnikiem należy używać osłon na oczy, fartuchów laboratoryjnych oraz jednorazowych rękawic. Unikać kontaktu wymienionych materiałów ze skórą, oczami i błonami śluzowymi. Jeżeli dojdzie do kontaktu, natychmiast spłukać dużą objętością wody. Jeżeli nie zostaną podjęte odpowiednie środki może dojść do oparzeń. W razie rozlania powyższych odczynników, przed wytarciem plam należy rozcieńczyć je wodą PL 7

8 WYMAGANIA DOTYCZĄCE PRZECHOWYWANIA I OBCHODZENIA SIĘ Odczynniki do przygotowywania próbki A. Po dostarczeniu przechowywać odczynniki z zestawu High Pure System Viral Nucleic Acid Reagents w temperaturze C. B. Przechowywać bufor do elucji (ELB) oraz bufor do lizy/wiążący (LYS) w temperaturze C. Po otwarciu przechowywać odczynniki ELB oraz LYS w temperaturze C. Po otwarciu odczynniki ELB oraz LYS należy zużyć w ciągu 30 dni lub przed upływem daty przydatności, zależnie od tego, która z dat jest wcześniejsza. C. Po dodaniu buforu do elucji (ELB) w celu rozpuszczenia nośnika RNA oraz proteinazy K, przechowywać niezużyty nośnik RNA (CAR) oraz niezużytą proteinazę K (PK) w temperaturze od -15 do -25 C. Po rozpuszczeniu nośnik RNA oraz proteinazę K należy zużyć w ciągu 30 dni lub przed upływem daty przydatności, zależnie od tego, która z dat jest wcześniejsza. D. Po dodaniu etanolu przechowywać bufor usuwający inhibitor (IRB) oraz bufor do wymywania (WASH) w temperaturze C. Wymienione odczynniki robocze zachowują stabilność przez 30 dni (lub do daty przydatności, w zależności od tego, która z dat jest wcześniejsza). E. Roboczy roztwór do lizy/wiążący [bufor do lizy/wiążący w połączeniu z nośnikiem RNA, proteinazą K oraz HBV QS] należy zużyć natychmiast po jego przygotowaniu. Wszelkie jego pozostałości należy wyrzucić. Odczynniki do amplifikacji i detekcji A. Nie zamrażać odczynników ani kontroli. B. Przechowywać odczynniki: HBV MMX, CTM ( ) C, HBV L(+)C, HBV H(+)C, HBV QS oraz CTM Mn 2+ w temperaturze 2 8 C. Przed otwarciem odczynniki te zachowują stabilność do wskazanej daty przydatności. Po otwarciu opakowania w celu pobrania porcji odczynnika wystarczającej na 12 próbek, przechowywać pozostałą ilość odczynników: HBV MMX, HBV L(+)C, HBV H(+)C, HBV QS oraz CTM Mn 2+ w temperaturze 2 8 C. Po otwarciu odczynniki: HBV MMX, HBV L(+)C, HBV H(+)C, HBV QS oraz CTM Mn 2+ zachowują stabilność w temperaturze 2 8 C przez 30 dni lub do upływu daty przydatności, zależnie od tego, która z dat jest wcześniejsza. Po otwarciu opakowania wszelkie niezużyte partie odczynnika CTM ( ) C należy wyrzucić. C. Roboczy odczynnik Master Mix (przygotowany poprzez dodanie odczynnika CTM Mn 2+ do HBV MMX) należy przechowywać w temperaturze 2 8 C w zaciemnionym miejscu. Przygotowane próbki i kontrole należy dodać do roboczego odczynnika Master Mix w ciągu 2 godzin od jego przygotowania. D. Poddane obróbce próbki i kontrole zachowują stabilność do 3 godzin w temperaturze C, do 24 godzin w temperaturze 2 8 C lub do 1 tygodnia w stanie zamrożenia do temperatury -20 C. E. Amplifikację należy rozpocząć w ciągu 3 godzin od chwili dodania przygotowanych próbek badanych i kontrolnych do roboczego odczynnika Master Mix. MATERIAŁY DOSTARCZONE Odczynniki do przygotowania próbki A. High Pure System Viral Nucleic Acid Kit Zestaw High Pure System Viral Nucleic Acid Kit (P/N: ) LYS (Bufor do lizy/wiążący) CAR (Nośnik RNA) PK (Proteinaza K) IRB (Bufor usuwający inhibitor) WASH (Bufor do wymywania) ELB (Bufor do elucji) RS (Zestaw High Pure System Viral Nucleic Acid Rack Set) WR (Statyw na odpady High Pure System Viral Nucleic Acid Waste Rack) PL 8

9 Odczynniki do amplifikacji i detekcji B. COBAS TaqMan HBV Test (P/N: ) HBV QS (COBAS TaqMan Standard oznaczania HBV) HBV H(+)C [Kontrola HBV silnie (+)] HBV L(+)C [Kontrola HBV słabo (+)] CTM ( ) C HBV HPS [COBAS TaqMan ujemna próba kontrolna (osocze ludzkie)] HBV MMX (Odczynnik COBAS TaqMan HBV Master Mix) CTM Mn 2+ (COBAS TaqMan roztwór manganu) MATERIAŁY WYMAGANE, LECZ NIEDOSTARCZANE Przyrządy i oprogramowanie Analizator COBAS TaqMan 48 Oprogramowanie AMPLILINK w wersji serii 3.3 lub 3.4 Jednostka sterująca z oprogramowaniem AMPLILINK Podręczniki obsługi urządzeń i oprogramowania: Instrukcja obsługi analizatora COBAS TaqMan 48 do użytku z oprogramowaniem AMPLILINK w wersji serii 3.3 i 3.4 Podręcznik oprogramowania AMPLILINK w wersji serii 3.3 do użytku z urządzeniem COBAS AmpliPrep, analizatorem COBAS TaqMan, analizatorem COBAS TaqMan 48, analizatorem COBAS AMPLICOR i aparatem cobas p 630 lub - Podręcznik oprogramowania AMPLILINK w wersji serii 3.4 Plik definicji testu (Test Definition File, TDF). Nazwa i numer wersji TDF znajdują się na karcie informacyjnej produktu, dołączonej do opakowania zestawu. Urządzenie do mocowania korka w probówkach K-tube (P/N: ) Narzędzie korkujące do tac K (P/N: ) Zasobnik K do analizatora COBAS TaqMan 48 (P/N: ) Zasobnik na tackę K (P/N: ) Uchwyt zasobnika K (P/N: ) Transporter do zasobników K (P/N: ) Materiały jednorazowe Opakowanie zawierające probówki K 12 x 96 (P/N: ) Opakowanie zawierające tacki K, 24 sztuki (P/N: ) Wymagania dotyczące wirówki Wirówka Sigma 4-15C Benchtop lub odpowiadający jej typ wirówki z płytką mikrotitracyjną, umożliwiający wirowanie z przyspieszeniem 4600 x g Wirnik horyzontalny do wirówki Sigma P/N: (zawiera 2 koszyki P/N: oraz 2 uchwyty do płytek P/N: 17978) bądź ich odpowiedniki PL 9

10 INNE MATERIAŁY WYMAGANE, LECZ NIEDOSTARCZONE Izopropanol (> 99%) odpowiadający specyfikacjom ACS lub lepszy Etanol (96 100%) - odpowiadający specyfikacjom ACS lub lepszy Regulowane pipetory*: (pojemność 250 µl i 1000 µl) z barierą aerozolową lub końcówkami dodatniego wypierania wolnymi od DNazy Rękojeść pomocnicza do pipety: Drummond (P/N: ) bądź odpowiednik Łaźnia wodna o temperaturze 50 C (± 2 C) Suchy blok grzejny o temperaturze 70 C (± 2 C) Jałowe, jednorazowe pipety serologiczne: 5, 10 i 25 ml Jałowe probówki stożkowe z polipropylenu; 15 ml i 50 ml: Corning (P/N: i P/N: ) bądź ich odpowiedniki Jałowe probówki o pojemności 2,0 ml do mikrowirówki: Sarstedt (P/N: ) bądź ich odpowiedniki Mieszadło wibracyjne Statywy do probówek Rękawice jednorazowe bezpudrowe Kalibrowane termometry do łaźni wodnej i suchego bloku grzejnego * Dokładność pipetorów musi wahać się w zakresie 3% podanej objętości. We wskazanych przypadkach używać należy pozbawionych DNazy końcówek do pipet z barierą dla aerozoli lub wyrzutnikiem w celu zapobieżenia skażeniu krzyżowemu między próbką i amplikonem. POBIERANIE, TRANSPORT I PRZECHOWYWANIE PRÓBEK UWAGA: Ze wszystkimi próbkami i kontrolami należy obchodzić się jak z materiałem zdolnym do przenoszenia czynników zakaźnych. A. Pobieranie próbek Test COBAS TaqMan HBV jest przeznaczony wyłącznie do stosowania z próbkami surowicy lub osocza. Krew powinno się pobierać do probówek BD SST Serum Separator Tubes lub do probówek zawierających EDTA (korek lawendowy) jako środek przeciwkrzepliwy. Krew pełną przechowywać w temperaturze 2 25 C nie dłużej niż przez 1 dzień. Użycie osocza pobranego na EDTA lub surowicy przyniesie wyniki testu, które w przybliżeniu będą równoważne. Rysunek 4 przedstawia wpływ rodzaju macierzy na wyniki badania DNA HBV w próbkach pochodzących od pacjenta. Rysunek 4 Porównanie rodzajów próbek: osocze z dodatkiem EDTA i surowica 12,00 10,00 Próbki osocza Średni wynik (Log 10 IU/ml DNA HBV, n=2) 8,00 6,00 4,00 y = 1,0139x - 0,0703 R 2 = 0,9984 2,00 0,00 0,00 2,00 4,00 6,00 8,00 10,00 12,00 Próbki surowicy Średni wynik (Log 10 IU/ml DNA HBV, n = 2) PL 10

11 Oddzielić surowicę lub osocze od pełnej krwi w ciągu 1 dnia od pobrania przez odwirowanie ( x g przez 20 minut) w temperaturze pokojowej. Przenieść surowicę lub osocze do jałowej probówki polipropylenowej. Rysunek 5 przedstawia dane z badań dotyczących pobierania próbek. Rysunek 5 Stabilność HBV w krwi pełnej z dodatkiem EDTA jako antykoagulantu lub w surowicy w probówkach Serum Separator Tubes przed separacją na osocze lub surowicę 4,5 Średni wynik DNA HBV Log IU/ml DNA HBV n=2) 10 4,0 3,5 3,0 2,5 < 1 godzina C 6 godzin C 24 godzin C 48 godzin C 72 godzin C < 1 godzina 2-8 C 6 godzin 2-8 C 24 godzin 2-8 C 48 godzin 2-8 C 72 godzin 2-8 C 2,0 Osocze-1 Osocze-2 Osocze-3 Osocze-4 Osocze-5 Surowica-1Surowica-2 Numer identyfikacyjny (ID) próbki B. Transport próbek Transport krwi pełnej, surowicy lub osocza musi zachodzić zgodnie z przepisami krajowymi, federalnymi, państwowymi i lokalnymi dotyczącymi transportu czynników etiologicznych 32. Krew pełną należy transportować w temperaturze 2 25 C i obrabiać w przeciągu 1 dnia od pobrania. Osocze lub surowica mogą być transportowane w temp. 2 8 C lub zamrożone do temperatury od -20 C do -80 C. C. Przechowywanie próbek Próbki surowicy lub osocza można przechowywać w temperaturze pokojowej do 3 dni, w temperaturze 2 8 C do 7 dni lub zamrożone do temperatury od -20 C do -80 C co najmniej przez 6 tygodni. Zaleca się przechowywanie próbek w objętościach µl w jałowych polipropylenowych probówkach zakręcanych o pojemności 2,0 ml (takich jak Sarstedt P/N: ). Rysunek 6 przedstawia dane z badań dotyczących przechowywania próbek. Rysunek 6 Stabilność HBV w osoczu z dodatkiem EDTA lub surowicy Średni wynik DNA HBV Log 10 IU/ml DNA HBV n=2) 4,5 4,0 3,5 3,0 2,5 2,0 Osocze-1 Osocze-2 Osocze-3 Osocze-4 Osocze-5 Surowica-1 Surowica-2 Czas 0 1 dzień RT 3 dni RT 5 dni RT 7 dni RT 1 dzień 2-8 C 3 dni 2-8 C 5 dni 2-8 C 7 dni 2-8 C 6 tygodni -80 C Numer identyfikacyjny (ID) próbki Próbki surowicy i osocza można zamrażać i rozmrażać do 5 razy bez utraty DNA HBV. Rysunek 7 przedstawia dane z badań dotyczących zamrażania i rozmrażania PL 11

12 Rysunek 7 Wyniki badania HBV po poddaniu próbki maksymalnie 5 cyklom zamrażania-rozmrażania Średni wynik (Log IU/ml DNA HBV, n=2) 10 4,5 4,0 3,5 3,0 2,5 2,0 Osocze-1 Osocze-2 Osocze-3 Osocze-4 Surowica-1 Surowica-2 Próba kontrolna 1 F-T 2 F-T 3 F-T 4 F-T 5 F-T Numer identyfikacyjny (ID) próbki INSTRUKCJA UŻYTKOWANIA UWAGA: Szczegółowe instrukcje obsługi, informacje na temat drukowania wyników oraz interpretacji znaczników, komentarzy i komunikatów o błędach zawierają: (1) Instrukcja obsługi analizatora COBAS TaqMan 48 do użytku z oprogramowaniem AMPLILINK w wersji serii 3.3 i 3.4; (2) Podręcznik oprogramowania AMPLILINK w wersji serii 3.3 do użytku z urządzeniem COBAS AmpliPrep, analizatorem COBAS TaqMan, analizatorem COBAS TaqMan 48, analizatorem COBAS AMPLICOR i aparatem cobas p 630 lub (3) Podręcznik oprogramowania AMPLILINK w wersji serii 3.4. UWAGA: Wszystkie odczynniki do amplifikacji i detekcji przed użyciem muszą być ogrzane do temperatury otoczenia; należy wyjąć je z miejsca przechowywania o temperaturze 2 8 C co najmniej na 30 minut przed użyciem. UWAGA: Próbki surowicy i osocza należy przed użyciem ogrzewać do temperatury otoczenia przez minut. UWAGA: Tam, gdzie jest to wskazane, używać pipetorów z końcówkami z barierą aerozolową lub wyrzutnikiem. Zachować najdalej posuniętą ostrożność aby uniknąć zanieczyszczenia. Wielkość przebiegu: Każdy zestaw zawiera odczynniki wystarczające dla czterech przebiegów po 12 oznaczeń każdy, które wykonywać można oddzielnie lub równocześnie. W każdy z przebiegów testowych, liczących do 24 próbek i kontroli, należy włączyć 1 powtórzenie kontroli: CTM ( ) C, HBV L(+)C oraz HBV H(+)C (patrz rozdział Kontrola jakości). Odczynniki do amplifikacji i detekcji pakowane są do butelek dwukrotnego użytku, wystarczających do wykonania 24 testów. Aby najwydajniej wykorzystać odczynniki, próbki badane i kontrolne należy poddawać obróbce w seriach będących wielokrotnością 12. Przygotowanie próbki i kontroli UWAGA: Jeśli używa się zamrożonych próbek surowicy lub osocza, należy umieścić próbki w temperaturze pokojowej aż do ich całkowitego rozmrożenia, a następnie przed użyciem wytrząsać na mieszadle wibracyjnym przez 5 10 sekund. UWAGA: Przed przystąpieniem do wykonywania testu pozwolić odczynnikom na ogrzanie się do temperatury otoczenia. Przed rozpoczęciem reakcji oczyszczania materiału ogrzać suchy blok grzejny do temperatury 70 C (± 2 C) oraz łaźnię wodną do temperatury 50 C (± 2 C). A. Przygotowanie odczynników UWAGA: Przygotować roboczy roztwór do lizy/wiążący jedynie wówczas, gdy wszystkie próbki i kontrole ogrzały się już do temperatury otoczenia w ciągu minut. 1. Przygotować bufor usuwający inhibitor, przenosząc pipetą 20 ml % etanolu do odczynnika Inhibitor Removal Buffer (bufor usuwający inhibitor) (IRB). Dokładnie wymieszać zawartość odwracając 5 10 razy. Przygotowany w ten sposób bufor usuwający inhibitor stanowi zapas wystarczający na 48 testów PL 12

13 2. Przygotować bufor do wymywania, przenosząc pipetą 80 ml % etanolu do odczynnika bufor do wymywania (WASH). Dokładnie wymieszać zawartość odwracając 5 10 razy. Przygotowany w ten sposób bufor do wymywania stanowi zapas wystarczający na 48 testów. 3. Ogrzać bufor do elucji (ELB) do temperatury 70 C (± 2 C) w 2,0 ml zakręcanej probówce do wirówki. Można w tym celu używać wielu probówek. Objętość elucji na jedną próbkę wynosi 75 µl. Należy ogrzać objętość odczynnika zamieszczoną w poniższej tabeli, zgodnie z liczbą testów. Liczba powtórzeń testów Odczynnik Bufor do elucji (ml) 2,0 4,0 4. Przenieść za pomocą pipety do czystej, jałowej probówki objętość izopropanolu określoną w poniższej tabeli w zależności od ilości testów. Liczba powtórzeń testów Odczynnik Izopropanol (ml) 5,0 10,0 5. Przenieść za pomocą pipety 0,5 ml buforu do elucji (ELB) do nośnika RNA (CAR). Włożyć z powrotem korek, odwrócić fiolkę i wytrząsać ją do chwili pełnego rozpuszczenia się nośnika RNA. Rozpuszczony nośnik RNA wystarczy do wykonania 24 testów. Niezużyte partie rozpuszczonego nośnika RNA można przechowywać w temperaturze od -15 do -25 C do 30 dni lub do zakończenia okresu przydatności, zależnie od tego, która z dat jest wcześniejsza. 6. Przenieść za pomocą pipety 5,0 ml buforu do elucji (ELB) do proteinazy K (PK). Włożyć z powrotem korek, odwrócić fiolkę i wytrząsać ją do chwili pełnego rozpuszczenia się proteinazy K. Rozpuszczona proteinaza K wystarczy do wykonania 24 testów. Niezużyte partie rozpuszczonej proteinazy K można przechowywać w temperaturze od -15 do -25 C do 30 dni lub do zakończenia okresu przydatności, zależnie od tego, która z dat jest wcześniejsza. 7. Przygotować roboczy roztwór do lizy/wiążący w następujący sposób przenieść za pomocą pipety objętości odczynników przedstawionych w poniższej tabeli, zgodne z liczbą próbek i kontroli przeznaczonych do obróbki: Liczba powtórzeń testów Odczynniki Bufor do lizy/wiążący (ml) 7,0 14,0 Nośnik RNA (µl) HBV QS (µl) Proteinaza K (ml) 1,4 2,8 UWAGA: Objętość preparatu HBV QS jest swoista dla testu COBAS TaqMan HBV. UWAGA: Jeśli zamierza się użyć zamrożonego uprzednio, rozpuszczonego nośnika RNA lub proteinazy K, należy je rozmrażać w temperaturze pokojowej, zaś przed użyciem kilkakrotnie wymieszać przez odwracanie fiolki. Dodać wskazaną objętość buforu do lizy/wiążącego do czystej, jałowej probówki o pojemności 50 ml. Dodać do probówki zawierającej bufor do lizy/wiążący wskazaną objętość rozpuszczonego nośnika RNA. Wytrząsać naczynie z preparatem HBV QS przez 3 5 sekund, po czym dodać wskazaną objętość HBV QS do probówki zawierającej bufor do lizy/wiążący oraz rozpuszczony nośnik RNA. Zamknąć probówkę i wymieszać zawartość, odwracając razy. NIE wytrząsać na mieszadle - wytrząsanie spowoduje tworzenie się pęcherzyków w roztworze. Dodać wskazaną objętość rozpuszczonej proteinazy K do probówki zawierającej bufor do lizy/wiążący. Zamknąć probówkę i wymieszać zawartość, odwracając razy. NIE wytrząsać na mieszadle - wytrząsanie spowoduje tworzenie się pęcherzyków w roztworze. Rozpocząć rozdzielanie roboczego roztworu do lizy/wiążącego natychmiast po dodaniu proteinazy K do buforu do lizy/wiążącego i wymieszaniu zawartości. Niezużyte partie buforu do lizy/wiążącego (LYS) można przechowywać w temperaturze C do 30 dni lub do zakończenia okresu przydatności, zależnie od tego, która z dat jest wcześniejsza. Niezużyte partie roboczego roztworu do lizy/wiążącego należy wyrzucić PL 13

14 B. Przygotowanie próbki i kontroli UWAGA: Do wykonania tej procedury zaleca się stosowanie regulowanych pipetorów z końcówkami z barierą aerozolową. UWAGA: Do wykonania czynności z etapów 1, 14, 16, 19 i 22 można używać pipety powtarzalnej z jałowymi końcówkami typu combi-tip odpowiedniego rozmiaru. Należy jednak zachować szczególną ostrożność, aby uniknąć rozpryskiwania się odczynników i zanieczyszczenia krzyżowego próbek. UWAGA: W trakcie całej procedury unikać rozlewania roztworu roboczego do lizy/wiążącego, próbki, kontroli i izopropanolu na uszczelnienie znajdujące się między dołkiem a pokrywką na krawędzi każdego dołka. UWAGA: Stosować dobrze dopasowane do dłoni użytkownika rękawice. Rękawice należy często zmieniać, szczególnie po pracy z kontrolami dodatnimi i po otwieraniu pełnych probówek statywu do przeprowadzania lizy. Nigdy nie dotykać wewnętrznej strony pokrywek (np. podczas otwierania lub zamykania). UWAGA: Podczas pracy z kontrolami zestawu i próbkami klinicznymi należy przed przystąpieniem do ładowania kontroli dodatnich załadować kontrole ujemne. 1. Dodać pipetą 625 µl roboczego roztworu do lizy/wiążącego do każdego dołka statywu do przeprowadzania lizy (I, przezroczysty). Nie dopuścić do powstawania kropelek na uszczelnieniu znajdującym się między dołkiem a pokrywką na krawędzi każdego dołka. Delikatnie wcisnąć pokrywki na miejsce, nakrywając dołki. Nie zamykać zatrzasku. 2. Otwierając pojedynczo każdy dołek, ostrożnie dodawać pipetą do odpowiednich dołków po 500 µl próbki bądź kontroli. Nie dopuścić do powstawania kropelek na uszczelnieniu znajdującym się między dołkiem a pokrywką na krawędzi każdego dołka. Każdorazowo po dodaniu próbki lub kontroli wcisnąć pokrywkę delikatnym ruchem w dół, zaczynając od strony zawiasu; kontynuując, delikatnie nacisnąć środek pokrywki, a następnie zamknąć zatrzask, aby szczelnie zamknąć dołek. 3. Po dodaniu wszystkich próbek i kontroli wymieszać zawartość napełnionego statywu do przeprowadzania lizy, wytrząsając go przez około 10 sekund. Unikać energicznego wytrząsania. Wzrokowo upewnić się, że wytrząsanie przebiega we wszystkich dołkach, a ich zawartość jest dokładnie mieszana. 4. Ostrożnie umieścić statywy do przeprowadzania lizy we wstępnie podgrzanej do temperatury 50 C (±2 C) kąpieli wodnej, unikając rozchlapywania. Inkubować statyw do przeprowadzania lizy przez 10 minut. Podczas inkubacji statyw do przeprowadzania lizy powinien być zanurzony w wodzie, ale nie może w niej pływać. Należy się upewnić, że podczas inkubacji górna powierzchnia statywu do przeprowadzania lizy pomiędzy dołkami pozostanie sucha. Po wyjęciu z kąpieli wodnej ostrożnie wytrzeć do sucha wierzch i spód statywu do przeprowadzania lizy. 5. W wirówce z płytką mikrotitracyjną odwirować statyw do przeprowadzania lizy przez sekund z przyspieszeniem 4600 x g. Wirówka może nie osiągnąć w tym czasie nastawionej prędkości obrotów. Potwierdzić wzrokowo, że nie doszło do wycieku, sprawdzając poziom cieczy we wszystkich dołkach. W razie stwierdzenia wycieku przerwać procedurę. 6. Otwierać każdy dołek pojedynczo, delikatnie naciskając zawias zatrzaskowy, aby zwolnić mechanizm zatrzasku i unieść pokrywkę dołka. Za pomocą pipety dodawać do każdego dołka po 250 µl izopropanolu. Każdorazowo po dodaniu izopropanolu wcisnąć pokrywkę delikatnym ruchem w dół, zaczynając od strony zawiasu; kontynuując, delikatnie nacisnąć środek pokrywki, a następnie zamknąć zatrzask, aby szczelnie zamknąć dołek. UWAGA: Objętość izopropanolu jest swoista dla każdego testu COBAS TaqMan. 7. Wzrokowo upewnić się, że wszystkie statywy są szczelnie zamknięte. Wymieszać próbki, trzykrotnie odwracając statyw, a następnie wytrząsać go na mieszadle wibracyjnym przez około 10 sekund. Unikać energicznego wytrząsania. Wzrokowo upewnić się, że wytrząsanie przebiega we wszystkich dołkach, a ich zawartość jest dokładnie mieszana. 8. W wirówce z płytką mikrotitracyjną odwirować statyw do przeprowadzania lizy przez sekund z przyspieszeniem 4600 x g. Wirówka może nie osiągnąć w tym czasie nastawionej prędkości obrotów. Potwierdzić wzrokowo, że nie doszło do wycieku, sprawdzając poziom cieczy we wszystkich dołkach. W razie stwierdzenia wycieku przerwać procedurę. 9. Otwierać każdy dołek pojedynczo, delikatnie naciskając zawias zatrzaskowy, aby zwolnić mechanizm zatrzasku i unieść pokrywkę dołka. Przenieść 750 µl próbki lub mieszaniny kontrolnej do odpowiednich dołków statywu z rurkami filtracyjnymi (II, żółty) z przymocowanym statywem na odpady (biały). Każdorazowo po dodaniu próbki lub mieszaniny kontrolnej wcisnąć pokrywkę delikatnym ruchem w dół, zaczynając od strony zawiasu; kontynuując, delikatnie nacisnąć środek pokrywki, a następnie zamknąć zatrzask, aby szczelnie zamknąć dołek. 10. Po dodaniu wszystkich próbek lub kontroli wirować zestaw zawierający statyw z rurkami filtracyjnymi przez 2 minuty z przyspieszeniem 4600 x g w wirówce z płytką mikrotitracyjną. Potwierdzić wzrokowo, że nie doszło do wycieku, sprawdzając poziom cieczy we wszystkich dołkach. W razie stwierdzenia wycieku przerwać procedurę PL 14

15 11. Otwierać dołki pojedynczo, delikatnie naciskając zawias zatrzaskowy, aby zwolnić mechanizm zatrzasku i unieść pokrywkę dołka. Przenieść pozostałość próbki lub mieszaniny kontrolnej do odpowiednich dołków statywu z rurkami filtracyjnymi. Każdorazowo po dodaniu próbki lub mieszaniny kontrolnej zamknąć pokrywkę dołka delikatnym ruchem w dół, zaczynając od strony zawiasu; kontynuując, delikatnie nacisnąć środek pokrywki, a następnie zamknąć zatrzask. We właściwy sposób wyrzucić statyw do wykonywania lizy. 12. Wirować zestaw zawierający statyw z rurkami filtracyjnymi przez 2 minuty z przyspieszeniem 4600 x g w wirówce z płytką mikrotitracyjną. Potwierdzić wzrokowo, że nie doszło do wycieku, sprawdzając poziom cieczy we wszystkich dołkach. W razie stwierdzenia wycieku przerwać procedurę. 13. Wyjąć statyw z rurkami filtracyjnymi ze statywu na odpady przyciskając obie spinki na górnej powierzchni statywu z rurkami filtracyjnymi. Wyrzucić w odpowiedni sposób statyw na odpady. Zastąpić zużyty statyw na odpady nowym i przypiąć statyw z rurkami filtracyjnymi do statywu na odpady. 14. Otworzyć wszystkie pokrywki statywu z rurkami filtracyjnymi i dodać pipetą 400 µl buforu usuwającego inhibitor (IRB), wlewając płyn po ściance każdego dołka. Nie dotykać ścianek dołka. Każdorazowo po dodaniu buforu usuwającego inhibitor do dołków wcisnąć pokrywkę delikatnym ruchem w dół, zaczynając od strony zawiasu; kontynuując, delikatnie nacisnąć środek pokrywki, a następnie zamknąć zatrzask, aby szczelnie zamknąć pokrywkę. 15. Wirować zestaw zawierający statyw z rurkami filtracyjnymi przez 2 minuty z przyspieszeniem 4600 x g w wirówce z płytką mikrotitracyjną. Potwierdzić wzrokowo, że nie doszło do wycieku, sprawdzając poziom cieczy we wszystkich dołkach. W razie stwierdzenia wycieku przerwać procedurę. 16. Otworzyć wszystkie pokrywki statywu z rurkami filtracyjnymi i dodać pipetą 700 µl buforu płuczącego (WASH), wlewając płyn po ściance każdego dołka. Nie dotykać ścianek dołka. Każdorazowo po dodaniu buforu płuczącego do wszystkich dołków wcisnąć pokrywkę delikatnym ruchem w dół, zaczynając od strony zawiasu; kontynuując, delikatnie nacisnąć środek pokrywki, a następnie zamknąć zatrzask, aby szczelnie zamknąć pokrywkę. 17. Wirować zestaw zawierający statyw z rurkami filtracyjnymi przez 2 minuty z przyspieszeniem 4600 x g w wirówce z płytką mikrotitracyjną. Potwierdzić wzrokowo, że nie doszło do wycieku, sprawdzając poziom cieczy we wszystkich dołkach. W razie stwierdzenia wycieku przerwać procedurę. 18. Wyjąć statyw z rurkami filtracyjnymi ze statywu na odpady przyciskając obie spinki na górnej powierzchni statywu z rurkami filtracyjnymi. Wyrzucić w odpowiedni sposób statyw na odpady. Zastąpić zużyty statyw na odpady nowym i przypiąć statyw z rurkami filtracyjnymi do statywu na odpady. 19. Otworzyć wszystkie pokrywki statywu z rurkami filtracyjnymi i dodać pipetą 700 µl buforu płuczącego, wlewając płyn po ściance każdego dołka. Nie dotykać ścianek dołka. Każdorazowo po dodaniu buforu płuczącego do wszystkich dołków wcisnąć pokrywkę delikatnym ruchem w dół, zaczynając od strony zawiasu; kontynuując, delikatnie nacisnąć środek pokrywki, a następnie zamknąć zatrzask, aby szczelnie zamknąć pokrywkę. 20. Wirować zestaw zawierający statyw z rurkami filtracyjnymi przez 3 minuty z przyspieszeniem 4600 x g w wirówce z płytką mikrotitracyjną. Potwierdzić wzrokowo, że nie doszło do wycieku, sprawdzając poziom cieczy we wszystkich dołkach. W razie stwierdzenia wycieku przerwać procedurę. 21. Wyjąć statyw z rurkami filtracyjnymi ze statywu na odpady przyciskając obie spinki na górnej powierzchni statywu z rurkami filtracyjnymi. Nałożyć statyw z rurkami filtracyjnymi na statyw do elucji (IIIA, niebieski) i przypiąć statyw z rurkami filtracyjnymi do statywu do elucji. Wyrzucić w odpowiedni sposób statyw na odpady. 22. Otworzyć wszystkie pokrywki statywu z rurkami filtracyjnymi i dodać pipetą 75 µl wstępnie podgrzanego buforu do elucji (ELB) na środek każdego filtra, nie dotykając samego filtra. UWAGA: Nie dodawać buforu do elucji przez wlewanie go po ściance dołka. Każdorazowo po dodaniu buforu do elucji do wszystkich dołków wcisnąć pokrywkę delikatnym ruchem w dół, zaczynając od strony zawiasu; kontynuując, delikatnie nacisnąć środek pokrywki, a następnie zamknąć zatrzask, aby szczelnie zamknąć dołek. 23. Inkubować statyw do elucji w temperaturze pokojowej przez co najmniej 3 minuty od dodania buforu do elucji do ostatniego dołka, wcisnąć pokrywkę delikatnym ruchem w dół, zaczynając od strony zawiasu; kontynuując, delikatnie nacisnąć środek pokrywki, a następnie zamknąć zatrzask, aby szczelnie zamknąć dołek. 24. Wirować zestaw zawierający statyw z rurkami filtracyjnymi przez 3 minuty z przyspieszeniem 4600 x g w wirówce z płytką mikrotitracyjną. Potwierdzić wzrokowo, że nie doszło do wycieku, sprawdzając poziom cieczy we wszystkich dołkach. W razie stwierdzenia wycieku przerwać procedurę. 25. Wyjąć statyw z rurkami filtracyjnymi ze statywu do elucji, przyciskając obie spinki na górnej powierzchni statywu z rurkami filtracyjnymi. Zutylizować statyw z rurkami filtracyjnymi we właściwy sposób. 26. Nałożyć statyw z pokrywkami (IIIB, niebieski) na statyw do elucji (IIIA, niebieski). Docisnąć mocno i zapiąć spinki na statywie do elucji. Wcisnąć pokrywkę delikatnym ruchem w dół, zaczynając od strony zawiasu; kontynuując, delikatnie nacisnąć środek pokrywki, a następnie zamknąć zatrzask, aby szczelnie zamknąć wszystkie pokrywki PL 15

16 27. Poddawane obróbce próbki i kontrole są stosowane bezpośrednio w reakcji PCR. Do amplifikacji należy użyć po 50 µl poddawanych obróbce próbek i kontroli. Dodać obrabiane próbki i kontrole do roboczego odczynnika Master Mix w ciągu 3 godzin od ukończenia przygotowania próbek i kontroli. Jeśli obrabianych próbek i kontroli nie można wykorzystać w ciągu 3 godzin od ich przygotowania, można przechowywać obrabiane próbki i kontrole w temperaturze 2 8 C do 24 godzin w zamkniętym statywie do elucji bądź zamrożone do temperatury 20 C do 1 tygodnia w jałowych, polipropylenowych, zakręcanych probówkach o pojemności 2,0 ml (takich jak Sarstedt P/N: ). Poddać obrabiane próbki i kontrole amplifikacji w ciągu 3 godzin od ich dodania do roboczego odczynnika Master Mix. Amplifikacja i detekcja UWAGA: Zasobniki K/zasobnik na tackę K i uchwyty zasobnika K/zasobnika na tackę K należy przetrzeć tkaniną niezostawiającą włókien, zwilżoną 70% roztworem izopropanolu. C. Przygotowanie odczynników UWAGA: Odczynniki COBAS TaqMan HBV Master Mix (HBV MMX), roboczy Master Mix (Working MMX) oraz roboczy Master Mix z poddaną obróbce próbką lub kontrolą są wrażliwe na światło. Chronić wymienione odczynniki przed światłem. UWAGA: Odczynniki COBAS TaqMan HBV Master Mix (HBV MMX) oraz roztwór manganu COBAS TaqMan (CTM Mn 2+ ) należy ogrzewać do temperatury otoczenia przez co najmniej 30 minut przed przygotowaniem roboczego odczynnika Master Mix. UWAGA: Przygotować roboczy odczynnik MMX po zakończeniu przygotowywania próbek i kontroli. UWAGA: Roboczy odczynnik MMX należy zużyć w ciągu 2 godzin od jego przygotowania. UWAGA: Po dodaniu poddanych obróbce próbek i kontroli do roboczego odczynnika Master Mix amplifikacja powinna rozpocząć się w ciągu 3 godzin. 1. Ogrzewać jedną fiolkę odczynnika HBV MMX oraz jedną fiolkę odczynnika CTM Mn 2+ do temperatury otoczenia przez co najmniej 30 minut. 2. Umieścić zasobnik K/zasobnik na tacki K w uchwycie zasobnika K/zasobnika na tackę K. 3. Włożyć nowe probówki K lub nową tackę K do zasobnika K/zasobnika na tackę K, nie dotykając bocznych ścianek probówek K. UWAGA: Jeśli do przebiegu testowego mają być włączone mniej niż 24 probówki, należy wypełnić probówkami następujące pozycje zasobnika: 1, 2, 5, 20, 23 i 24, tak aby obciążenie zasobnika K po umieszczeniu w termocyklerze było równomierne. Nie ma potrzeby równoważenia termocyklera podczas stosowania tacki K. 4. Jeśli jest taka potrzeba, zdjąć korki z probówek K za pomocą urządzenia do mocowania korków. Umieścić korki w podręcznym uchwycie na probówki K. 5. Przygotować roboczy odczynnik MMX w następujący sposób: W celu wykonania 24 testów dodać 191 µl odczynnika CTM Mn 2+ do jednej fiolki z odczynnikiem HBV MMX. Zamknąć buteleczkę i dokładnie wymieszać zawartość, odwracając 10 razy. Nie wytrząsać roboczego odczynnika MMX na mieszadle wibracyjnym. Chronić roboczy odczynnik MMX przed światłem i zużyć w ciągu 2 godzin. W celu wykonania 12 testów pobrać 660 µl odczynnika HBV MMX i wlać do 2 ml probówki. Dodać 90 µl odczynnika CTM Mn 2+ do 2 ml probówki zawierającej HBV MMX, zamknąć probówkę korkiem i dokładnie wymieszać zawartość, odwracając probówkę 10 razy. Chronić roboczy odczynnik MMX przed światłem i zużyć w ciągu 2 godzin. Przechowywać niezużyte partie odczynników: HBV MMX i CTM Mn 2+ w oryginalnych fiolkach w temperaturze 2 8 C. Po otwarciu odczynniki HBV MMX i CTM Mn 2+ zachowują stabilność w temperaturze 2 8 C przez 30 dni lub do zakończenia okresu przydatności, zależnie od tego, która z dat jest wcześniejsza. UWAGA: Objętość odczynnika CTM Mn 2+ jest swoista dla testu COBAS TaqMan HBV. 6. Przenieść pipetą 50 µl roboczego odczynnika MMX do każdej probówki K lub do dołka tacki K. UWAGA: Jeżeli poddane obróbce próbki i kontrole przed amplifikacją przechowywano w zamrożeniu, należy je rozmrozić w temperaturze pokojowej przed przystąpieniem do etapu Dodać po 50 µl każdej poddanej obróbce próbki i kontroli do odpowiednich probówek K lub dołków tacki K, zawierających roboczy odczynnik MMX, wykorzystując do tego celu mikropipetor z końcówką z barierą aerozolową lub dodatnim wypieraniem. Ostrożnie wymieszać każdą próbkę i kontrolę, trzy razy nabierając do mikropipetora i wypuszczając ponownie, nie doprowadzając przy tym do tworzenia się pęcherzyków. 8. Powtórzyć czynności z etapu 7 w odniesieniu do każdej próbki i poddawanej obróbce kontroli aż do przeniesienia każdej z nich do probówek K lub dołków tacek K. Do każdej próbki i kontroli użyć nowej końcówki. Sprawdzić wzrokowo probówki w poszukiwaniu pęcherzyków, a w razie konieczności usunąć je. Za pomocą urządzenia do mocowania korków/urządzenia korkującego do tacek K nałożyć korki na probówki K lub tackę K. Sprawdzić wzrokowo, czy dodano odpowiednie objętości próbek PL 16

17 9. Amplifikację należy rozpocząć w ciągu 3 godzin od czasu dodania poddanych obróbce próbek i kontroli do probówek K/tacki K zawierających roboczy odczynnik MMX. D. Ładowanie i obsługa analizatora COBAS TaqMan Włącz komputer stacji roboczej i zaloguj się do systemu operacyjnego Microsoft Windows, używając odpowiedniej nazwy użytkownika i hasła. 2. Włączyć analizator COBAS TaqMan 48. Upewnić się, że urządzenie uruchamia się i jest gotowe do użytku. Jeśli zasobniki K lub zasobniki na tackę K z poprzednich przebiegów testowych znajdują się nadal w którymkolwiek z termocyklerów, należy je wyjąć za pomocą transportera do zasobników K. 3. Uruchomić na komputerze program AMPLILINK. Zalogować się, używając odpowiedniej nazwy użytkownika i hasła. 4. Aby wprowadzić numerację próbek przeznaczonych do analizy w nośniku K lub nośniku na tace K, należy kliknąć ikonę Orders. Wybrać zakładkę Sample, następnie kliknąć przycisk New i za pomocą klawiatury lub czytnika kodów kreskowych wprowadzić numer porządkowy próbki. Wybrać plik definicji testu dla testu COBAS TaqMan HBV. Nazwy i numery wersji plików definicji testu znajdują się na karcie informacyjnej produktu, dołączonej do opakowania zestawu. Powtórzyć opisaną procedurę w odniesieniu do każdej próbki. Kliknąć przycisk Save. UWAGA: Jeśli do przebiegu testowego mają być włączone mniej niż 24 probówki, należy wypełnić probówkami następujące pozycje zasobnika: 1, 2, 5, 20, 23 i 24, tak aby obciążenie zasobnika K po umieszczeniu w termocyklerze było równomierne. 5. Wprowadzić dane dotyczące kontroli jakości, wybierając zakładkę Quality Control w oknie Orders. Kliknąć przycisk New i za pomocą klawiatury lub czytnika kodów kreskowych wprowadzić dane zamieszczone na dostarczonej wraz z zestawem karcie COBAS TaqMan HBV Test Controls Value Card. Wprowadzić w odpowiednich polach: numer serii testu COBAS TaqMan HBV, datę przydatności do użycia, zakresy wartości kontroli Low (+) i High (+) oraz swoiste dla każdej serii współczynniki kalibracji. Kliknąć przycisk OK. 6. Przypisać numer nośnika K/tacy K do przebiegu testowego, klikając zakładkę K-Carrier w oknie Orders. W oknie K-Carrier kliknąć przycisk New. W okienku znajdującym się na prawo od napisu K-Carrier ID wprowadzić za pomocą klawiatury lub czytnika kodów kreskowych numer nośnika K/tacy K zamieszczony na kodzie kreskowym nośnika K/tacy K. W przypadku używania tacy K sprawdzić okno K-Tray poniżej pola K-Carrier ID. Z panelu testowego w dolnej części okna wybrać plik definicji testu dla testu COBAS TaqMan HBV. Nazwy i numery wersji plików definicji testu znajdują się na karcie informacyjnej produktu, dołączonej do opakowania zestawu. UWAGA: Wymagane jest zaakceptowanie wyników poprzedniego przebiegu testowego, dokonanego przy wprowadzonym tym samym numerze identyfikacyjnym zasobnika K. 7. W opcji Worklist wybrać pierwszy wiersz w kolumnie Type (T). Zaznaczyć to pole w celu uzyskania dostępu do menu rozwijanego i wybrać wymagany typ kontroli. Następnie dwukrotnie kliknąć pole z numerem identyfikacyjnym próbki w tym samym wierszu. Wyświetli się okno LookUp Control ze wszystkimi dostępnymi kontrolami. Po wybraniu kontroli w dolnej części po prawej stronie panelu Information wyświetlą się odpowiednie wartości kalibracji i wartości kontrolne. Powtórzyć opisaną procedurę w odniesieniu do wszystkich wymaganych kontroli. 8. W celu wprowadzenia próbek na listę roboczą Worklist dwukrotnie kliknąć pierwszą pozycję (wiersz) okna informacyjnego danej próbki. Spowoduje to wyświetlenie okna Lookup Sample, zawierającego numery przypisane danej próbce. W celu zaznaczenia więcej niż jednego numeru porządkowego użyć klawiszy Shift + strzałka. Upewnić się, że wszystkie polecenia zostały przypisane plikowi definicji testu dla testu COBAS TaqMan HBV. Nazwy i numery wersji plików definicji testu znajdują się na karcie informacyjnej produktu, dołączonej do opakowania zestawu. 9. Kliknąć przycisk Save, aby zapisać zlecenie dla danego zasobnika K/zasobnika na tackę K. UWAGA: Jeśli do przebiegu testowego mają być włączone mniej niż 24 probówki, należy wypełnić probówkami następujące pozycje zasobnika: 1, 2, 5, 20, 23 i 24, tak aby obciążenie zasobnika K po umieszczeniu w termocyklerze było równomierne. Nie ma potrzeby równoważenia termocyklera podczas stosowania tacki K. E. Amplifikacja i detekcja 1. Wybrać ikonę Systems w zakładce System; kliknąć przycisk Open, aby otworzyć termocykler. Gdy w oknie Systems pokrywa termocyklera jest całkowicie uchylona i widoczny jest komunikat Ready to Load, przyciągnąć i przytrzymać pokrywę termocyklera w celu otwarcia urządzenia. Za pomocą transportera zasobników K/zasobników na tackę K umieścić w termocyklerze załadowany zasobnik K/zasobnik na tackę K zawierający zamknięte probówki K/tackę K z roboczym odczynnikiem Master Mix, próbkami i kontrolami. Zamknąć pokrywę termocyklera PL 17

18 2. Kliknąć przycisk Start w oknie Systems poniżej ikony TC w celu zamknięcia pokrywy termocyklera i uruchomienia aparatu. 3. Analizator COBAS TaqMan 48 automatycznie wykonuje amplifikację i detekcję. WYNIKI Obliczanie wyników Analizator COBAS TaqMan 48 automatycznie określa miano DNA HBV w próbce i kontroli. Miano DNA HBV wyraża się w jednostkach międzynarodowych (IU)/ml. Współczynnik konwersji pomiędzy stężeniem HBV w kopiach/ml i mianem HBV w jednostkach międzynarodowych/ml wynosi 5,82 kopii/iu według wytycznych WHO HBV International Standard for NAT testing 97/ Analizator COBAS TaqMan 48: Określa wartość progową ilości cykli (Ct) dla DNA wirusa HBV oraz DNA preparatu HBV Quantitation Standard. Określa miano DNA HBV na podstawie wartości Ct dla DNA HBV oraz DNA preparatu HBV Quantitation Standard oraz swoistych dla danej serii współczynników kalibracji. Określa, czy miana obliczone w IU/ml dla kontroli HBV L(+)C i HBV H(+)C mieszczą się w przypisanych im przedziałach. Walidacja przebiegu testowego oprogramowanie AMPLILINK w wersji serii 3.3 i 3.4 Sprawdzić okno wyników programu AMPLILINK lub wydruk w poszukiwaniu oznaczeń i komentarzy świadczących o tym, że dany przebieg testowy jest ważny. Przebieg testowy jest ważny, jeśli żadna z kontroli analizatora COBAS TaqMan HBV nie została opatrzona znacznikiem błędu. Przebieg jest nieważny, jeżeli kontrole testu COBAS TaqMan HBV są opatrzone którymkolwiek z poniższych oznaczeń: Próba kontrolna ujemna: Oznaczenie Wyniki Interpretacja Wynik nieważny albo ważny, lecz NC_INVALID Invalid nie ujemny w kierunku obecności docelowego HBV Próba kontrolna HBV słabo dodatnia: Próba kontrolna HBV silnie dodatnia: Jeśli przebieg testowy jest nieważny, należy powtórzyć go w całości, wraz z przygotowaniem próbek i kontrolą, amplifikacją oraz detekcją. Interpretacja wyników: Aby ocenić ważność przebiegu, należy sprawdzić poszczególne próbki na wydruku z wynikami w poszukiwaniu oznaczeń lub komentarzy. Wyniki należy interpretować następująco: Oznaczenie Wyniki Interpretacja Wynik nieważny lub kontrola poza LPCINVALID Invalid zakresem wartości Oznaczenie Wyniki Interpretacja Wynik nieważny lub kontrola poza HPCINVALID Invalid zakresem wartości Ważny przebieg może zawierać zarówno ważne jak i nieważne wyniki badania próbki, zależnie od tego jakimi znacznikami i/lub komentarzami są one opatrzone PL 18

19 Wyniki badania próbek interpretuje się w następujący sposób: Komentarz Target Not Detected Przyczyna Wartość Ct dla HBV powyżej granicy testu lub brak wartości Ct dla HBV uzyskanej. Podać wynik jako nie wykryto DNA HBV. < 6.00E+00 IU/mL Obliczona wartość w IU/ml jest poniżej zakresu testu. Podać wynik jako wykryto DNA HBV, mniej niż 6 IU/ml DNA HBV. Obliczone wyniki w IU/ml są mniejsze niż dolna wartość graniczna zakresu 6.00E+00 IU/mL i liniowego testu. Wyniki te charakteryzują się wysoką zmiennością i z tego < 2.90E+01 IU/mL względu nie można ich uważać za dokładne. Należy je interpretować z zachowaniem ostrożności. 2.90E+01 IU/mL i Obliczone wyniki o wartości 29 IU/ml lub wyższej albo o wartości 1.10E+08 IU/mL 1,10E+08 IU/ml lub niższej mieszczą się w zakresie liniowym testu. Obliczona ilość w IU/ml jest powyżej zakresu testu. Podać wynik jako wyższy niż 1,10E+08 IU/ml DNA HBV. Jeśli wyniki ilościowe są pożądane, oryginalną > 1.10E+08 IU/mL próbkę powinno się rozcieńczyć HBV-ujemnym ludzkim osoczem lub surowicą, w zależności od macierzy oryginalnej próbki, a następnie powtórzyć test. Otrzymany wynik pomnożyć przez współczynnik rozcieńczenia. UWAGA: Próbki o wynikach powyżej zakresu wartości testu, dające wynik nieważny, opatrzony oznaczeniem QS_INVALID, także nie powinny być opisywane jako > 1,10E+08 IU/ml. Jeśli pożądane są wyniki ilościowe, oryginalną próbkę należy rozcieńczyć HBV-ujemnym ludzkim osoczem lub surowicą w zależności od macierzy oryginalnej próbki, po czym należy powtórzyć test. Otrzymany wynik należy pomnożyć przez współczynnik rozcieńczenia. KONTROLA JAKOŚCI Do każdej serii testów zawierającej maksymalnie 24 próbek i kontroli należy włączyć co najmniej jedno powtórzenie kontroli: CTM ( ) C, HBV L(+)C i HBV H(+)C musi być włączone do każdego przebiegu testu. Tak jak w przypadku każdej nowej procedury laboratoryjnej, nowy operator powinien rozważyć zastosowanie dodatkowych, wewnętrznych kontroli za każdym razem, kiedy przeprowadzany jest test, do czasu osiągnięcia dużego stopnia zaufania dotyczącego poprawności przeprowadzania testu. Nie ma wymagań co do położenia kontroli w zasobniku K/tacce K. Sprawdzić czy w wydruku przebiegu obecne są znaczniki i komentarze. Kontrola ujemna Próba kontrolna CTM ( ) C musi dawać wynik Target Not Detected, tj. wartość Ct dla DNA HBV powyżej granicznej wartości testu lub brak uzyskanej wartości Ct dla DNA HBV, lecz jednocześnie ważny wynik oznaczania wartości Ct dla preparatu HBV Quantitation Standard DNA. Jeżeli próba kontrolna CTM ( ) C nie spełnia tego kryterium, wyniki całego przebiegu są nieważne. Należy powtórzyć cały proces (przygotowanie próbek i kontroli, amplifikację i detekcję). Jeśli wyniki kontroli CTM ( ) C nadal stale są nieważne, należy skontaktować się z miejscowym przedstawicielstwem firmy Roche celem uzyskania pomocy technicznej. Kontrole dodatnie Przypisane zakresy wartości kontroli: HBV L(+)C i HBV H(+)C są swoiste dla każdej serii kontroli i zostały zamieszczone w karcie COBAS TaqMan HBV Test Controls Value Card, dostarczonej łącznie z zestawem. Te zakresy są wprowadzane do jednostki sterującej z oprogramowaniem AMPLILINK. Miano DNA HBV, wyrażone w IU/ml, dla obu kontroli: HBV L(+)C i HBV H(+)C musi mieścić się w przedziale wartości zamieszczonym na karcie COBAS TaqMan HBV Test Controls Value Card, dostarczonej łącznie z zestawem. Jeżeli jedna lub obie dodatnie kontrole nie spełniają tego kryterium, cały przebieg testu jest nieważny. Należy powtórzyć cały proces (przygotowanie próbek i kontroli, amplifikację i detekcję). Jeżeli obliczone miano DNA HBV w jednej lub obu dodatnich próbach kontrolnych stale mieści się poza przypisanym zakresem, należy zwrócić się do regionalnego przedstawicielstwa firmy Roche w celu uzyskania pomocy technicznej PL 19

20 ŚRODKI OSTROŻNOŚCI DOTYCZĄCE PROCEDURY 1. Jak w przypadku każdej procedury testowej, dla prawidłowego przeprowadzenia badania kluczowe znaczenie ma zachowanie zasad dobrej praktyki laboratoryjnej. Z uwagi na wysoką czułość analityczną niniejszego testu, należy przedsięwziąć wyjątkową ostrożność aby zapewnić czystość zestawów odczynników oraz mieszanin do amplifikacji. Należy monitorować czystość wszystkich odczynników. Wyrzucić wszelkie podejrzane odczynniki. OGRANICZENIA PROCEDURALNE 1. Test ten został zatwierdzony do użytku wyłącznie w zastosowaniu z ludzką surowicą lub ludzkim osoczem pobranym na środek antykoagulacyjny EDTA. Badanie innych rodzajów próbek może dawać wyniki nieprawidłowe, fałszywie ujemne lub fałszywie dodatnie. 2. Wiarygodne wyniki uzależnione są od właściwego pobrania próbki, transportu, przechowywania oraz procedur obróbki. 3. Obecność enzymu AmpErase w odczynniku COBAS TaqMan HBV Master Mix zmniejsza ryzyko skażenia amplikonu. Jednak zanieczyszczenia materiałem pochodzącym z HBV-dodatnich kontroli i próbek klinicznych można uniknąć jedynie dzięki stosowaniu zasad dobrej praktyki laboratoryjnej i uważnemu wykonywaniu procedur opisanych w niniejszej ulotce dołączonej do opakowania zestawu. 4. Produktu tego powinny używać wyłącznie osoby wykwalifikowane w technikach PCR. 5. Niniejszego produktu można używać tylko łącznie z analizatorem COBAS TaqMan Detekcja DNA HBV zależy od liczby cząsteczek wirusa obecnych w próbce, na którą wpływać mogą metody pobierania próbek oraz czynniki związane z pacjentem (tj. wiek, obecność objawów i/lub faza zakażenia). 7. Mutacje w obrębie wysoko konserwatywnego regionu genomu wirusa, z którym wiążą się startery i/lub sonda używane w tym teście, chociaż rzadkie, mogą spowodować niedoszacowanie ilości lub niewykrycie wirusa. 8. Z uwagi na różnice pomiędzy technologiami zaleca się, aby przed zmianą stosowanych metod użytkownik przeprowadził w laboratorium badanie korelacji stosowanych metod w celu określenia ilościowych różnic występujących pomiędzy nimi PL 20