cobas 4800 HPV Test DO STOSOWANIA W DIAGNOSTYCE IN VITRO.

Transkrypt

1 cobas 4800 HPV Test DO STOSOWANIA W DIAGNOSTYCE IN VITRO. cobas 4800 System Sample Preparation Kit c4800 SMPL PREP 960 Tests P/N: Tests P/N: cobas 4800 HPV Amplification/Detection Kit c4800 HPV AMP/DET 960 Tests P/N: Tests P/N: cobas 4800 HPV Controls Kit 10 Sets P/N: c4800 HPV CTLS cobas 4800 System Liquid Cytology Preparation Kit c4800 LIQ CYT 960 Tests P/N: Tests P/N: cobas 4800 System Wash Buffer Kit c4800 WB 960 Tests P/N: Tests P/N: UWAGA: Zakup niniejszego produktu umożliwi nabywcy zastosowanie go do amplifikacji i detekcji sekwencji kwasu nukleinowego z zastosowaniem reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) oraz związanych z nią procesów w ramach diagnostyki in vitro z użyciem materiału ludzkiego. Wraz z nabyciem niniejszego produktu nabywca nie otrzymuje żadnego patentu ogólnego ani innej licencji, oprócz prawa do określonego, szczególnego zastosowania produktu. PRZEZNACZENIE Test cobas 4800 Human Papillomavirus (HPV) jest jakościowym testem in vitro służącym do wykrywania wirusa brodawczaka ludzkiego w próbkach pacjentów. Do detekcji 14 typów wirusa HPV o wysokim stopniu ryzyka (ang. high-risk HR) w teście tym, w ramach pojedynczej analizy, wykorzystuje się amplifikację docelowego DNA przez reakcję łańcuchowej polimerazy (PCR) oraz hybrydyzację kwasów nukleinowych. Test pozwala na oznaczenie szczególnie typów wirusa HPV 16 i HPV 18, wykrywając równocześnie pozostałe typy o wysokim stopniu ryzyka (31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66 and 68) i o klinicznie istotnych poziomach zakaźności. Próbki są ograniczone do komórek szyjki macicy pobieranych do pożywki do przechowywania pobranych komórek cobas PCR (Roche Molecular Systems, Inc.), płynnego podłoża PreservCyt (Cytyc Corp.) oraz płynu konserwującego SurePath (BD Diagnostics-TriPath). Wskazania do stosowania testu cobas 4800 HPV są następujące: (a) Test cobas 4800 HPV jest wskazany do użycia u pacjentek, których badanie Pap szyjki macicy wykazało ASC-US (atypowe komórki nabłonka płaskiego szyjki macicy o nieokreślonym znaczeniu, ang. atypical squamous cells of undetermined significance), w celu określenia potrzeby skierowania ich na kolposkopię. Wyniki tego testu nie powinny być powodem rezygnacji z kolposkopii u kobiet. (b) W przypadku kobiet w wieku od 30 lat wzwyż test cobas 4800 HPV może być stosowany w połączeniu z badaniem Pap jako dodatkowa podstawa oceny obecności lub braku typów wirusa HPV o wysokim stopniu ryzyka. Informacja ta, łącznie z oceną lekarza wcześniejszych badań cytologicznych, innych czynników ryzyka i znanych lekarzowi wytycznych, może służyć jako wskazówka do wyboru sposobu leczenia pacjenta. (c) W przypadku kobiet w wieku 30 lat lub starszych test cobas 4800 HPV może być stosowany w połączeniu z badaniem Pap jako dodatkowa podstawa oceny obecności lub braku genotypów 16 i 18 wirusa HPV. Informacja ta, łącznie z oceną lekarza wcześniejszych badań cytologicznych, innych czynników ryzyka i znanych lekarzowi wytycznych, może służyć jako wskazówka do wyboru sposobu leczenia pacjenta. PODSUMOWANIE ORAZ OPIS TESTU Długotrwałe zakażenie wirusem brodawczaka ludzkiego (HPV) jest główną przyczyną raka szyjki macicy oraz jego prekursora neoplazji śródnabłonkowej szyjki macicy (ang. cervical intraepithelial neoplasia CIN) 1-3. Obecność zakażenia wirusem HPV można domniemywać w ponad 99% przypadków raka szyjki macicy na całym świecie 3. HPV jest małym wirusem pozbawionym otoczki, zawierającym dwie nici DNA, którego genom składa się z około 8000 nukleotydów. Istnieje przeszło 118 różnych typów HPV 4,5 i około 40 różnych gatunków wirusa HPV, które mogą zakażać błonę śluzową w okolicy odbytowo-płciowej człowieka 6,7. Jednak tylko część spośród typów od 13 do 18 jest uważana za wirusy wysokiego ryzyka dla rozwinięcia się raka szyjki macicy i jego zmian prekursorowych 3,8-13. W analizie danych wieloośrodkowego badania porównawczego przypadków Międzynarodowej Agencji Badań nad Rakiem (International Agency of Research on Cancer, IARC) iloraz szans (ang. Odds Ratio OR) dla raka płaskonabłonkowego z powodu zakażenia wirusem HPV wynosił 158,2, przy czym analiza była ograniczona do badań z zastosowaniem zatwierdzonych technik detekcji wirusa HPV 12. W badaniu tym iloraz szans dla raka szyjki macicy wynosił od 109 do 276 w badaniach z różnych części świata 12. Chociaż długotrwałe zakażenie wirusem HPV o wysokim stopniu ryzyka (HR) stanowi niezbędny czynnik powstania raka szyjki macicy i jego zmian prekursorowych, bardzo niewielki procent tych zakażeń prowadzi do rozwinięcia się opisanych stanów chorobowych. Zakażenie wirusem HPV przenoszone drogą płciową jest niezwykle częste, przy szacunkowej częstości dochodzącej do 75% wszystkich kobiet narażonych na ekspozycję na wirusa 14. Jednak > 90% zakażonych kobiet rozwinie skuteczną odpowiedź immunologiczną i zwalczy zakażenie w okresie od 6 do 24 miesięcy, bez wystąpienia jakichkolwiek następstw zdrowotnych Zakażenie dowolnym typem wirusa HPV może wywołać neoplazję śródnabłonkową szyjki macicy (CIN), choć po zwalczeniu zakażenia wirusem HPV takie niebezpieczeństwo zwykle także zanika 21. W krajach rozwiniętych, prowadzących przesiewowe programy wykrywania raka szyjki macicy, od połowy lat 50. stosuje się rozmaz Pap jako podstawowe narzędzie wykrywania wczesnych prekursorów raka szyjki macicy. Chociaż badanie to spektakularnie zmniejszyło w tych krajach wskaźniki umieralności z powodu raka szyjki macicy, jednak rozmaz Pap wymaga interpretacji przez bardzo doświadczonego cytopatologa i jest to test o relatywnie niskiej dokładności, z wysokim odsetkiem wyników fałszywie ujemnych. Nieprawidłowe cechy cytologiczne, obserwowane w rozmazie Pap, są wywoływane przede wszystkim przez infekcję wirusem HPV, jednak różnorodne zmiany o podłożu zapalnym bądź związane ze sposobem pobierania próbek mogą skutkować fałszywie dodatnimi wynikami rozmazu Pap. W przypadku nieprawidłowego wyniku rozmazu Pap postępowanie z wyboru obejmuje: powtórzenie badania, kolposkopię oraz biopsję. Histologicznie potwierdzone zmiany wysokiego stopnia wymagają usunięcia chirurgicznego w celu zapobieżenia rozwojowi inwazyjnego raka szyjki macicy. Część Informacje na temat wersji dokumentu znajduje się na końcu tego dokumentu PL 1 Doc Rev. 1.0

2 Wirus brodawczaka ludzkiego jest niezwykle trudny do hodowania in vitro, a nie wszyscy pacjenci zakażeni HPV wykazują możliwą do zaobserwowania reakcję z wytworzeniem przeciwciał. Z tego względu badanie kwasu nukleinowego (DNA) za pomocą reakcji PCR jest czułą i nieinwazyjną metodą stwierdzenia obecności czynnego zakażenia szyjki macicy wirusem HPV. Wprowadzenie badania kwasu nukleinowego w kierunku obecności HPV jest obiecujące z punktu widzenia zwiększenia czułości i opłacalności przesiewowych programów wykrywania raka szyjki macicy z powodu wcześniejszego wykrywania zmian wysokiego ryzyka i zmniejszenia zapotrzebowania na zbędną kolposkopię i leczenie. ZASADY PROCEDURY Test cobas 4800 HPV oparty jest na dwóch głównych procesach: (1) zautomatyzowanym przygotowaniu próbek w celu jednoczesnej ekstrakcji DNA wirusa HPV i DNA komórkowego; (2) amplifikacji 22 PCR docelowych sekwencji DNA z wykorzystaniem zarówno par primerów komplementarnych swoistych dla HPV i β-globiny, jak i detekcji w czasie rzeczywistym oznaczonych fluorescencyjnie, rozszczepionych detekcyjnych sond oligonukleotydowych swoistych dla HPV i β-globiny. Ta jednoczesna ekstrakcja, amplifikacja i detekcja β-globiny w teście cobas 4800 HPV pozwala na kontrolowanie całego procesu oznaczania. Odczynnik Master Mix do testu cobas 4800 HPV zawiera pary primerów i próby swoiste dla DNA 14 typów wirusów HPV wysokiego ryzyka oraz dla DNA β-globiny. Detekcja DNA (amplikonu) poddanego amplifikacji jest przeprowadzana podczas cyklu termicznego z zastosowaniem sond oligonukleotydowych oznaczanych przy użyciu czterech różnych barwników fluorescencyjnych. Poddany amplifikacji sygnał pochodzący od dwunastu typów wirusa HPV wysokiego ryzyka (31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66 i 68) jest wykrywany przy użyciu tego samego barwnika fluorescencyjnego, natomiast każdy z sygnałów pochodzących od wirusa HPV 16, HPV 18 i β-globiny jest wykrywany przy użyciu przypisanego mu barwnika fluorescencyjnego. Przygotowanie próbki Przygotowanie próbek do testu cobas 4800 HPV jest zautomatyzowane za pomocą aparatu cobas x 480. Próbki z szyjki macicy, pobrane do pożywki do przechowywania pobranych komórek cobas PCR, płynnego podłoża PreservCyt lub płynu konserwującego SurePath, są poddawane trawieniu w warunkach denaturujących w podwyższonych temperaturach, a następnie poddawane lizie w obecności odczynnika chaotropowego. Uwolnione kwasy nukleinowe wirusa HPV, razem z DNA β-globiny służącym jako kontrola procesu, są oczyszczane przez ich absorpcję do cząstek szkła magnetycznego, czyszczone i oddzielane od tych cząstek, po czym są gotowe do procesu amplifikacji i detekcji PCR. Amplifikacja PCR Wybór sekwencji docelowej W teście cobas 4800 HPV wykorzystano primery do określenia sekwencji o długości około 200 nukleotydów w obrębie polimorficznego regionu L1 genomu HPV. Pula primerów HPV zawarta w odczynniku Master Mix została zaprojektowana w celu amplifikacji DNA wirusów HPV z grupy 14 typów wysokiego ryzyka (16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66 i 68) 3,8-13,23. Fluorescencyjne sondy oligonukleotydowe wiążą się z polimorficznymi regionami w obrębie sekwencji określonej przez te primery. Dodatkowa para primerów i sonda ukierunkowana na ludzki gen β-globiny (amplikon o długości 330 par zasad) umożliwiają kontrolę procesu. Amplifikacja sekwencji docelowej Polimerazę DNA 24 EagleZ05, chemicznie zmodyfikowaną wersję polimerazy DNA Thermus species Z05 25, wykorzystuje się do wyzwalanej wysoką temperaturą amplifikacji docelowych fragmentów wirusa HPV oraz kontrolnej β-globiny. Mieszanina zawierająca substraty do reakcji PCR jest najpierw podgrzewana w celu uaktywnienia polimerazy DNA EagleZ05, denaturacji DNA wirusa i DNA genomu oraz odsłonięcia docelowych sekwencji dla primerów. W miarę ochładzania się mieszaniny primery sensowne oraz antysensowne hybrydyzują z docelowymi sekwencjami DNA. Polimeraza DNA EagleZ05 w obecności jonu dwuwartościowego metalu oraz nadmiaru dezoksyrybonukleotydów (dntp) wydłuża primer(y) i następuje synteza drugiej nici DNA. Proces ten kończy pierwszy cykl PCR, dostarczając dwuniciowej kopii DNA docelowego regionu genomu HPV oraz genu β-globiny. Polimeraza DNA wydłuża przyłączone primery wzdłuż docelowych matryc, wytwarzając docelowy fragment dwuniciowej cząsteczki DNA wirusa HPV o długości około 200 par zasad lub fragment cząsteczki DNA o długości 330 par zasad, kodujący β-globinę, określany jako amplikon. Proces ten jest powtarzany wielokrotnie, przy czym w każdym z cykli ilość zwielokrotnionego DNA (amplikonu) ulega podwojeniu. Amplifikacja odbywa się wyłącznie w tych obszarach genomu HPV i/lub genu β-globiny, które zawarte są pomiędzy parą odpowiednich primerów. Całość genomu nie ulega amplifikacji. Zautomatyzowana detekcja w czasie rzeczywistym Test cobas 4800 HPV wykorzystuje technologię reakcji PCR w czasie rzeczywistym 27,28. Każda sonda oligonukleotydowa w tej reakcji jest oznaczana barwnikiem fluorescencyjnym, służącym jako reporter, i wygaszaczem wygaszającym emisje fluorescencyjne pochodzące od barwnika w sondzie jako całości. W miarę postępowania procesu sondy komplementarne do amplikonu wiążą się ze swoistymi jednoniciowymi sekwencjami DNA i ulegają rozszczepieniu przez aktywność nukleazy od 5' do 3' polimerazy DNA EagleZ05. Po oddzieleniu się barwnika reporterowego od wygaszacza za sprawą aktywności nukleazy, po wzbudzeniu odpowiednim widmem światła, emituje on promieniowanie fluorescencyjne o charakterystycznej długości fali. Ta długość fali charakterystyczna dla każdego z barwników umożliwia niezależne oznaczanie amplikonu HPV 16, amplikonu HPV 18, innych amplikonów HR (31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66 i 68) oraz kontroli β-globiny, ponieważ swoiste dla tych poszczególnych sekwencji sondy są oznaczane różnymi barwnikami PL 2 Doc Rev. 1.0

3 Amplifikacja wybiórcza Amplifikację wybiórczą badanego kwasu nukleinowego z próbki klinicznej przy użyciu testu cobas 4800 HPV uzyskuje się dzięki zastosowaniu enzymu AmpErase (uracylo-n-glikozylaza) i trójfosforanu dezoksyurydyny (dutp). Enzym AmpErase rozpoznaje i katalizuje niszczenie nici DNA zawierających dezoksyurydynę 26, lecz nie łańcuchów DNA zawierających dezoksytymidynę. Dezoksyurydyny nie stwierdza się w występującym naturalnie DNA, natomiast jest ona zawsze obecna w amplikonie z uwagi na stosowanie trójfosforanu dezoksyurydyny zamiast trójfosforanu tymidyny jako jednego spośród dntp w odczynniku Master Mix; dlatego jedynie amplikon zawiera dezoksyurydynę. Dezoksyurydyna powoduje wrażliwość zanieczyszczającego amplikonu na rozkład przez enzym AmpErase przed amplifikacją docelowego DNA. Enzym AmpErase, zawarty w odczynniku Master Mix, katalizuje rozszczepienie DNA zawierającego dezoksyurydynę w miejscu reszt dezoksyurydynowych przez otwarcie pierścienia dezoksyrybozy w pozycji C1. Podczas ogrzewania w pierwszym cyklu termicznym łańcuch amplikonu DNA pęka w miejscu, gdzie znajduje się dezoksyurydyna, w ten sposób wykluczając dalszą amplifikację DNA. Enzym AmpErase jest nieczynny w temperaturach powyżej 55 C, tj. w czasie trwania całego cyklu termicznego, dlatego nie niszczy on amplikonu docelowego. Wykazano, że enzym AmpErase w teście cobas 4800 HPV inaktywuje co najmniej 10 3 kopii amplikonu HPV zawierającego dezoksyurydynę na jedną reakcję PCR. ODCZYNNIKI cobas 4800 System Sample Preparation Kit Zestaw do przygotowania próbek systemu cobas 4800 (P/N: ) MGP (Cząsteczki szkła magnetycznego systemu cobas 4800) Cząsteczki szkła magnetycznego 93% izopropanolu Xi 93% (udział wagowy) izopropanolu Produkt drażniący F 93% (udział wagowy) izopropanolu c4800 SMPL PREP 240 testów 10 x 4,5 ml Produkt wysoce łatwopalny R: , S: /25-26 EB (Bufor do elucji systemu cobas 4800) Bufor Tris-HCl 0,09% azydku sodu cobas 4800 System Sample Preparation Kit Zestaw do przygotowania próbek systemu cobas 4800 (P/N: ) MGP (Cząsteczki szkła magnetycznego systemu cobas 4800) Cząsteczki szkła magnetycznego 93% izopropanolu Xi 93% (udział wagowy) izopropanolu c4800 SMPL PREP 10 x 18 ml 960 testów 10 x 13,5 ml Produkt drażniący F 93% (udział wagowy) izopropanolu Produkt wysoce łatwopalny R: , S: /25-26 EB (Bufor do elucji systemu cobas 4800) Bufor Tris-HCl 0,09% azydku sodu cobas 4800 System Wash Buffer Kit Zestaw buforów płuczących systemu cobas 4800 (P/N: ) WB (Bufor płuczący systemu cobas 4800) Dwuwodny cytrynian sodu 0,05% N-metyloizotiazolonu HCl c4800 WB 10 x 18 ml 240 testów 10 x 55 ml PL 3 Doc Rev. 1.0

4 cobas 4800 System Wash Buffer Kit Zestaw buforów płuczących systemu cobas 4800 (P/N: ) WB (Bufor płuczący systemu cobas 4800) Dwuwodny cytrynian sodu 0,05% N-metyloizotiazolonu HCl cobas 4800 System Liquid Cytology Preparation Kit Zestaw do przygotowania płynu do badań cytologicznych systemu cobas 4800 (P/N: ) PK (Proteinaza K cobas 4800) Bufor Tris < 0,05% EDTA Glicerol Chlorek sodu Octan wapnia < 2% proteinazy K Xn < 2% (udział wagowy) proteinazy K c4800 WB c4800 LIQ CYT 960 testów 10 x 200 ml 240 testów 10 x 0,9 ml Produkt szkodliwy SDS (Odczynnik SDS systemu cobas 4800) Bufor Tris-HCl 0,2% odczynnika SDS 0,09% azydku sodu LYS (Bufor do lizy systemu cobas 4800) Bufor Tris-HCl 37% chlorowodorku guanidyny < 5% polidokanolu Xn 37% (udział wagowy) chlorowodorku guanidyny 10 x 3 ml 10 x 10 ml Produkt szkodliwy R: 22-36/38, S: N < 5% (udział wagowy) polidokanolu Produkt niebezpieczny dla środowiska R: , S: cobas 4800 System Liquid Cytology Preparation Kit Zestaw do przygotowania płynu do badań cytologicznych systemu cobas 4800 (P/N: ) PK (Proteinaza K cobas 4800) Bufor Tris < 0,05% EDTA Glicerol Chlorek sodu Octan wapnia < 2% proteinazy K Xn < 2% (udział wagowy) proteinazy K c4800 LIQ CYT 960 testów 20 x 1,2 ml Produkt szkodliwy SDS (Odczynnik SDS systemu cobas 4800) Bufor Tris-HCl 0,2% odczynnika SDS 0,09% azydku sodu 10 x 9 ml PL 4 Doc Rev. 1.0

5 LYS (Bufor do lizy systemu cobas 4800) Bufor Tris-HCl 37% chlorowodorku guanidyny < 5% polidokanolu Xn 37% (udział wagowy) chlorowodorku guanidyny 10 x 36 ml Produkt szkodliwy R: 22-36/38, S: N < 5% (udział wagowy) polidokanolu Produkt niebezpieczny dla środowiska R: , S: cobas 4800 HPV Amplification/Detection Kit Zestaw do amplifikacji/detekcji cobas 4800 (P/N: ) HPV MMX (Odczynnik Master Mix cobas 4800 HPV) Bufor Tricine Octan potasu Wodorotlenek potasu Glicerol < 0,01% datp, dctp, dgtp, dutp < 0,01% sensownych i antysensownych primerów HPV < 0,01% sensownych i antysensownych primerów β-globiny < 0,01% oznaczanych fluorescencyjnie sond HPV < 0,01% oznaczanych fluorescencyjnie sond β-globiny < 0,10% polimerazy DNA EagleZ05 (bakteryjnej) < 0,10% enzymu AmpErase (uracylo-n-glikozylaza) (bakteryjna) 0,09% azydku sodu HPV Mg/Mn (Roztwór Mg/Mn cobas 4800 HPV) Octan magnezu Octan manganu < 0,02% lodowatego kwasu octowego 0,09% azydku sodu cobas 4800 HPV Amplification/Detection Kit Zestaw do amplifikacji/detekcji cobas 4800 (P/N: ) HPV MMX (Odczynnik Master Mix cobas 4800 HPV) Bufor Tricine Octan potasu Wodorotlenek potasu Glicerol < 0,01% datp, dctp, dgtp, dutp < 0,01% sensownych i antysensownych primerów HPV < 0,01% sensownych i antysensownych primerów β-globiny < 0,01% oznaczanych fluorescencyjnie sond HPV < 0,01% oznaczanych fluorescencyjnie sond β-globiny < 0,10% polimerazy DNA EagleZ05 (bakteryjnej) < 0,10% enzymu AmpErase (uracylo-n-glikozylaza) (bakteryjna) 0,09% azydku sodu HPV Mg/Mn (Roztwór Mg/Mn cobas 4800 HPV) Octan magnezu Octan manganu < 0,02% lodowatego kwasu octowego 0,09% azydku sodu c4800 HPV AMP/DET c4800 HPV AMP/DET 240 testów 10 x 0,5 ml 10 x 1,0 ml 960 testów 20 x 1,0 ml 10 x 1,0 ml PL 5 Doc Rev. 1.0

6 cobas 4800 HPV Controls Kit c4800 HPV CTLS 10 zestawów Zestaw kontroli cobas 4800 HPV (P/N: ) HPV (+) C 10 x 0,5 ml (Kontrola dodatnia cobas 4800 HPV Bufor Tris-HCl EDTA 0,05% azydku sodu < 0,002% poly ra RNA (syntetycznego) < 0,001% niezakaźnego plazmidu DNA (bakteryjnego) zawierającego sekwencje 16, 18, 39 HPV < 0,001% niezakaźnego plazmidu DNA (bakteryjnego) zawierającego sekwencje ludzkiej β-globiny ( ) C 10 x 0,5 ml (Kontrola ujemna systemu cobas 4800) Bufor Tris-HCl EDTA 0,05% azydku sodu < 0,002% poly ra RNA (syntetycznego) OSTRZEŻENIA I ŚRODKI OSTROŻNOŚCI A. DO STOSOWANIA W DIAGNOSTYCE IN VITRO. B. Test służy do stosowania z próbkami z szyjki macicy pobranymi przy użyciu pożywki do przechowywania pobranych komórek cobas PCR, płynnego podłoża PreservCyt oraz płynu konserwującego SurePath. C. Nie należy pipetować za pomocą ust. D. Nie wolno jeść, pić ani palić w obszarach roboczych laboratorium. Posługując się próbkami i odczynnikami z zestawów, należy stosować jednorazowe rękawice, fartuchy laboratoryjne oraz odpowiednią ochronę oczu. Należy dokładnie umyć ręce po pracy z próbkami i odczynnikami testowymi. E. Należy unikać zakażenia odczynników: bakteryjnego i przez DNA. F. Należy wyrzucić wszystkie nieużyte odczynniki, postępując zgodnie z przepisami krajowymi, federalnymi, stanowymi i lokalnymi. G. Nie wolno używać odczynników po upływie ich dat przydatności. H. Nie należy poddawać odczynników pulowaniu. I. Karty charakterystyki substancji niebezpiecznych (Material Safety Data Sheets MSDS) są dostępne na żądanie w miejscowym przedstawicielstwie firmy Roche. J. W celu zapobieżenia zanieczyszczeniu konieczne jest noszenie rękawic i ich zmiana przed przystąpieniem do ponownej pracy z próbkami i odczynnikami cobas K. Z próbkami należy obchodzić się tak jak z materiałem zakaźnym, stosując laboratoryjne procedury bezpieczeństwa, takie jak określone w dokumentach Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories 29 oraz CLSI Document M29-A3 30. L. Odczynnik LYS zawiera chlorowodorek guanidyny. Jeśli płyn zawierający wspomniany bufor ulegnie rozlaniu, do czyszczenia należy używać odpowiedniego detergentu laboratoryjnego i wody. W przypadku rozlania płynu zawierającego potencjalne czynniki zakaźne do czyszczenia należy używać najpierw detergentu laboratoryjnego i wody, a następnie 0,5% roztworu podchlorynu sodu. W przypadku rozlania płynu na aparacie cobas x 480 lub analizatorze cobas z 480 należy postępować zgodnie z instrukcjami w Podręczniku użytkownika systemu cobas M. Odczynnik MGP zawiera izopropanol i jest wysoce łatwopalny. Należy przechowywać go z dala od otwartego ognia i potencjalnych źródeł iskier. N. Odczynniki EB, SDS, HPV MMX, HPV Mg/Mn, ( ) C i HPV (+) C zawierają azydek sodu. Azydek sodu może reagować z instalacjami wodno-kanalizacyjnymi wykonanymi z ołowiu lub miedzi, tworząc silnie wybuchowe azydki metali. Usuwając roztwory zawierające azydek sodu do zlewów laboratoryjnych, należy spłukać rury dużą ilością zimnej wody, aby zapobiec nagromadzeniu azydków. O. Podczas pracy z jakimikolwiek odczynnikami należy używać osłon na oczy oraz fartuchów laboratoryjnych i rękawic jednorazowych. Należy unikać kontaktu wymienionych materiałów ze skórą, oczami i błonami śluzowymi. Jeżeli dojdzie do kontaktu, należy natychmiast spłukać dużą ilością wody. Jeżeli nie zostaną podjęte odpowiednie środki, może dojść do oparzeń. W razie rozlania należy przed wytarciem rozcieńczyć wodą. P. Wszystkie przedmioty jednorazowego użytku są przeznaczone do jednokrotnego użycia. Nie należy ich używać powtórnie. Q. Do czyszczenia aparatu cobas x 480 lub analizatora cobas z 480 nie wolno używać roztworu podchlorynu sodu (utleniacza). Czyszczenia aparatu cobas x 480 lub analizatora cobas z 480 należy dokonywać zgodnie z procedurami opisanymi w Podręczniku użytkownika systemu cobas R. Dodatkowe ostrzeżenia, środki ostrożności oraz procedury mające na celu zredukowanie ryzyka zakażenia, dotyczące aparatu cobas x 480 lub analizatora cobas z 480, można znaleźć w Podręczniku użytkownika systemu cobas WYMAGANIA DOTYCZĄCE PRZECHOWYWANIA I UŻYTKOWANIA A. Nie należy zamrażać odczynników. B. Odczynniki MGP, EB, PK, SDS, LYS, HPV MMX, HPV Mg/Mn, HPV (+) C i ( ) C należy przechowywać w temperaturze 2 8 C. Odczynniki te zachowują stabilność do podanej daty przydatności. C. Odczynnik WB należy przechowywać w temperaturze C. Odczynnik zachowuje stabilność do podanej daty przydatności PL 6 Doc Rev. 1.0

7 DOSTARCZONE MATERIAŁY A. cobas 4800 System Sample Preparation Kit c4800 SMPL PREP 240 testów Zestaw do przygotowania próbek systemu cobas 4800 (P/N: ) MGP (Cząsteczki szkła magnetycznego systemu cobas 4800) EB (Bufor do elucji systemu cobas 4800) B. cobas 4800 System Sample Preparation Kit c4800 SMPL PREP 960 testów Zestaw do przygotowania próbek systemu cobas 4800 (P/N: ) MGP (Cząsteczki szkła magnetycznego systemu cobas 4800) EB (Bufor do elucji systemu cobas 4800) C. cobas c4800 WB 4800 System Wash Buffer Kit 240 testów Zestaw buforów płuczących systemu cobas 4800 (P/N: ) WB (Bufor płuczący systemu cobas 4800) c4800 WB D. cobas 4800 System Wash Buffer Kit 960 testów Zestaw buforów płuczących systemu cobas 4800 (P/N: ) WB (Bufor płuczący systemu cobas 4800) E. cobas 4800 HPV Amplification/Detection Kit c4800 HPV AMP/DET 240 testów Zestaw do amplifikacji/detekcji cobas 4800 HPV (P/N: ) HPV MMX (Odczynnik Master Mix cobas 4800 HPV) HPV Mg/Mn (Roztwór Mg/Mn cobas 4800 HPV) F. cobas c4800 HPV AMP/DET 4800 HPV Amplification/Detection Kit 960 testów Zestaw do amplifikacji/detekcji cobas 4800 HPV (P/N: ) HPV MMX (Odczynnik Master Mix cobas 4800 HPV) HPV Mg/Mn (Roztwór Mg/Mn cobas 4800 HPV) G. cobas 4800 System Liquid Cytology Preparation Kit c4800 LIQ CYT 240 testów Zestaw do przygotowania płynu do badań cytologicznych systemu cobas 4800 (P/N: ) PK (Proteinaza K cobas 4800) SDS (Odczynnik SDS systemu cobas 4800) LYS (Bufor do lizy systemu cobas 4800) H. cobas c4800 LIQ CYT 4800 System Liquid Cytology Preparation Kit 960 testów Zestaw do przygotowania płynu do badań cytologicznych systemu cobas 4800 (P/N: ) PK (Proteinaza K cobas 4800) SDS (Odczynnik SDS systemu cobas 4800) LYS (Bufor do lizy systemu cobas 4800) PL 7 Doc Rev. 1.0

8 I. cobas 4800 HPV Controls Kit c4800 HPV CTLS 10 zestawów Zestaw kontroli cobas 4800 HPV (P/N: ) HPV (+) C (Kontrola dodatnia cobas 4800 HPV) ( ) C (Kontrola ujemna systemu cobas 4800) MATERIAŁY WYMAGANE, LECZ NIEDOSTARCZANE Obsługa próbek i odczynników Pożywka do przechowywania pobranych komórek cobas PCR (Roche P/N , opcjonalna) Końcówki CO-RE, 1000 µl, statyw 96 (Roche P/N lub Hamilton P/N ) Pojemnik na odczynniki 50 ml (Roche P/N ) Pojemnik na odczynniki 200 ml (Roche P/N ) Płytka do ekstrakcji systemu cobas 4800 (Roche P/N ) Płytka z mikrodołkami i film uszczelniający system cobas 4800 (Roche P/N ) Trwała torba na odpady [Roche P/N (mała) lub (duża)] Plastikowa zsuwnia Hamilton STAR (Roche P/N ) Probówki okrągłodenne 13 ml, (Sarstedt P/N ) do użytku jako wtórne probówki na próbki Korki, kolor naturalny (Sarstedt P/N ), do ponownego zamykania przetworzonych próbek w okrągłodennych probówkach typu Sarstedt 13 ml Rękawice jednorazowe bezpudrowe Przyrządy i oprogramowanie Aparat cobas x 480 Analizator cobas z 480 Jednostka sterująca systemu cobas 4800 z oprogramowaniem systemu w wersji 1.0 lub nowszej cobas 4800 Work Order Editor w wersji lub nowszej Wyposażenie i materiały opcjonalne Pipety: dostarczające do 1000 µl Końcówki z barierą aerozolową bez DNazy: dostarczające do 1000 µl Wirówka laboratoryjna, wyposażona w bęben wirówki o minimalnej wartości RCF równej 1500 Osobna płytka magnetyczna (Roche P/N ) Mieszadło wibracyjne (do mieszania jednej probówki) Mieszadło wibracyjne typu vortexer do mieszania wielu probówek [np. VWR P/N ] POBIERANIE, TRANSPORT I PRZECHOWYWANIE PRÓBEK UWAGA: Ze wszystkimi próbkami należy obchodzić się jak z materiałem potencjalnie zakaźnym. A. Pobieranie próbek Próbki z szyjki macicy, pobrane do pożywki do przechowywania pobranych komórek cobas PCR, płynnego podłoża PreservCyt lub płynu konserwującego SurePath, zostały zatwierdzone do użycia z testem cobas 4800 HPV. Próbki z szyjki macicy należy pobierać zgodnie z instrukcjami producenta. B. Transport próbek Próbki z szyjki macicy, pobrane do pożywki do przechowywania pobranych komórek cobas PCR, płynnego podłoża PreservCyt lub płynu konserwującego SurePath, można transportować w temperaturze 2 30 C. Próbki z szyjki macicy, pobrane do płynu konserwującego SurePath, muszą być schładzane przez 24 godziny od momentu pobrania. Próbki zawierające HPV muszą być transportowane zgodnie z przepisami krajowymi, federalnymi, stanowymi i lokalnymi dotyczącymi transportu czynników etiologicznych 31. C. Przechowywanie próbek Próbki z szyjki macicy, pobrane do pożywki do przechowywania pobranych komórek cobas PCR, płynnego podłoża PreservCyt lub płynu konserwującego SurePath, można przechowywać w temperaturze 2 30 C przez okres do 6 miesięcy od daty pobrania. Próbki z szyjki macicy, pobrane na płynne podłoże SurePath, można przechowywać w temperaturze 2 8 C do 4 tygodni od daty pobrania PL 8 Doc Rev. 1.0

9 INSTRUKCJA UŻYTKOWANIA UWAGA: Wszystkie odczynniki oprócz odczynników HPV MMX i HPV Mg/Mn przed załadowaniem do aparatu cobas x 480 muszą znajdować się w temperaturze pokojowej. Odczynniki HPV MMX i HPV Mg/Mn można ładować bezpośrednio z temperatury przechowywania 2 8 C, ponieważ ich temperatura zrównoważy się z temperaturą otoczenia wewnątrz aparatu cobas x 480 podczas procesu ich przetwarzania. UWAGA: Próbki pobrane do pożywki do przechowywania pobranych komórek cobas PCR, płynnego podłoża PreservCyt lub płynu konserwującego SurePath przed ich załadowaniem do aparatu cobas x 480 muszą znajdować się w temperaturze pokojowej. UWAGA: Dokładne instrukcje użytkowania można znaleźć w Podręczniku użytkownika systemu cobas Liczba testów w serii: System cobas 4800 jest przeznaczony do obsługi testu cobas 4800 HPV o liczbie próbek i kontroli od 1 do 22 (do 24 testów w jednym cyklu pracy) i od 1 do 94 próbek i kontroli (do 96 testów w jednym cyklu pracy). Każdy zestaw do przygotowania próbek systemu cobas 4800, zestaw do przygotowania płynu do badań cytologicznych systemu cobas 4800, zestaw buforu płuczącego systemu cobas 4800 i zestaw do amplifikacji/ detekcji cobas 4800 HPV zawiera ilość odczynników wystarczającą na 10 cykli pracy 24 testów (240 testów w zestawie) lub 96 testów (960 testów w zestawie). Zestaw kontroli cobas 4800 HPV zawiera ilość odczynników, wystarczającą na 10 cykli pracy 24 lub 96 testów (10 kompletów w zestawie). Minimalna liczba dla jednego cyklu pracy w systemie cobas 4800 to 1 próbka plus kontrole. Do przeprowadzenia każdego cyklu pracy konieczna jest jedna kopia kontroli ujemnej [( ) C] systemu cobas 4800 i jedna kopia kontroli dodatniej [HPV (+) C] cobas 4800 HPV (patrz część Kontrola jakości ). Przebieg pracy: UWAGA: Chociaż nie stanowi to optymalnego zużycia odczynników, do cyklu pracy 24 próbek można użyć zestawu 960 testów. UWAGA: Aby zwiększyć do maksimum wydajność procesu przetwarzania, całkowita liczba próbek pacjentów plus kontroli powinna być wielokrotnością liczby osiem. Test cobas 4800 HPV można przeprowadzać z zastosowaniem dwóch przebiegów pracy, o nazwach w oprogramowaniu cobas 4800: Full Workflow lub PCR Only Workflow. HPV Full Workflow: HPV Full Workflow obejmuje przygotowanie próbek w aparacie cobas x 480 oraz amplifikację/detekcję w analizatorze cobas z 480. Cykl pracy może obejmować 24 testy (z 1 22 próbkami plus 2 kontrole) lub 96 testów (z 1 94 próbkami plus 2 kontrole). Szczegółowe informacje można znaleźć w części Przeprowadzanie przebiegu pracy Full Workflow, poniżej, oraz w Podręczniku użytkownika systemu cobas HPV PCR Only Workflow: HPV PCR Only Workflow obejmuje amplifikację/detekcję w analizatorze cobas z 480. Cykl pracy może obejmować od 1 do 94 próbek plus 2 kontrole. Szczegółowe informacje można znaleźć w części Przeprowadzanie przebiegu pracy PCR Only poniżej oraz w Podręczniku użytkownika systemu cobas Próbki: Istnieją trzy rodzaje próbek z szyjki macicy, które można poddać oznaczeniu przy użyciu testu cobas 4800 HPV: a) próbki z szyjki macicy w podłożu płynnym PreservCyt, b) próbki z szyjki macicy w podłożu do przechowywania pobranych komórek cobas PCR i c) próbki z szyjki macicy w płynie konserwującym SurePath. Próbki w podłożu płynnym PreservCyt i próbki w podłożu do przechowywania pobranych komórek cobas PCR można przetwarzać w aparacie cobas x 480 bezpośrednio po ich wyjęciu z podstawowego pojemnika o pojemności 20 ml, opatrzonego właściwym kodem kreskowym lub po wyjęciu z opatrzonej właściwym kodem kreskowym okrągłodennej probówki Sarstedt 13 ml. Próbki w płynie konserwującym SurePath muszą zostać przeniesione do opatrzonej właściwym kodem kreskowym okrągłodennej probówki Sarstedt 13 ml w celu ich przetworzenia w aparacie cobas x 480. W celu uzyskania informacji na temat procedur właściwego kodowania kreskowego należy zapoznać się z Podręcznikiem użytkownika systemu cobas 4800 oraz listą kodów kreskowych dopuszczalnych dla systemu cobas Minimalna objętość wypełnienia, jaka musi znajdować się w podstawowych pojemnikach zawierających podłoże do przechowywania pobranych komórek cobas PCR i płynne podłoże PreservCyt, wynosi 3,0 ml. Minimalna objętość wypełnienia dotycząca wszystkich próbek, jaka musi znajdować się we wtórnych okrągłodennych probówkach Sarstedt 13 ml, wynosi 1,0 ml. UWAGA: Do pobierania próbek z szyjki macicy do testu cobas 4800 HPV należy używać wyłącznie podłoża do przechowywania pobranych komórek cobas PCR, płynnego podłoża PreservCyt i płynu konserwującego SurePath. Używanie testu cobas 4800 HPV z innymi przyrządami do pobierania moczu i innymi rodzajami pożywek nie zostało zatwierdzone. Używanie testu cobas 4800 HPV z innymi przyrządami do pobierania próbek i/lub innymi rodzajami pożywek może prowadzić do otrzymania fałszywie ujemnych, fałszywie dodatnich i/lub nieważnych wyników. UWAGA: Może być konieczne podzielenie próbek na alikwoty do opatrzonych właściwym kodem kreskowym okrągłodennych probówek Sarstedt 13 ml w celu ich przetworzenia w aparacie cobas x 480. Do postępowania z próbkami należy używać pipetorów z końcówkami z barierą aerozolową lub dodatnim wypieraniem. Aby zapobiec zakażeniu krzyżowemu przetworzonych próbek, do ponownego zatykania próbek po ich przetworzeniu należy używać dodatkowych korków do tych probówek w innym kolorze (neutralnym). UWAGA: Podczas przenoszenia próbek z podstawowych pojemników do wtórnych, okrągłodennych probówek 13 ml należy zachować ostrożność. Przed przeniesieniem należy zamieszać próbki w mieszadle wibracyjnym. Należy zmieniać końcówki pipet po zakończeniu postępowania z każdą z próbek. UWAGA: Nie należy przetwarzać próbek, które zawierają widoczną krew lub mają ciemnobrązowy kolor PL 9 Doc Rev. 1.0

10 Pojedynczy przebieg pracy może obejmować różne kombinacje próbek (podłoża do przechowywania pobranych komórek cobas PCR, płynne podłoże PreservCyt i/lub płyn konserwujący SurePath), a każda próbka może zostać poddana oznaczeniu zarówno przy użyciu podtypu testu metodą genotypowania HPV wysokiego ryzyka, jak i HPV wysokiego ryzyka Plus. Przebiegi pracy Przeprowadzanie przebiegu pracy Full Workflow: A. Testowi cobas 4800 HPV można poddawać cykle pracy od 1 do 22 próbek plus jedna kontrola ujemna systemu cobas 4800 i jedna kontrola dodatnia systemu cobas 4800 HPV (obejmujące 24 testy) oraz od 1 do 94 próbek plus jedna kontrola ujemna systemu cobas 4800, a także jedna kontrola dodatnia systemu cobas 4800 HPV (obejmujące 96 testów). B. Uruchom system i wykonaj procedury konserwacyjne, postępując zgodnie z instrukcją opisaną w Podręczniku użytkownika systemu cobas 4800 w części dotyczącej obsługi. C. Utwórz plik harmonogramu pracy dla pełnego cyklu pracy, postępując zgodnie z instrukcją podaną w Podręczniku użytkownika systemu cobas Plik harmonogramu pracy nie jest wymagany w przypadku używania sieci LIS. D. Wybierz rodzaj pożywki dla każdej z próbek. W pliku harmonogramu pracy wybierz PreservCyt dla żądania próbek w płynnym podłożu PreservCyt lub podłożu do przechowywania pobranych komórek cobas PCR. W pliku harmonogramu pracy wybierz SurePath dla żądania próbek w płynie konserwującym SurePath. E. Aby raportować wyniki testu HPV wysokiego ryzyka, wybierz podtyp testu HPV High Risk Panel. F. Aby raportować wyniki testu HPV wysokiego ryzyka, HPV typu 16 i HPV typu 18, wybierz podtyp testu HPV High Risk Panel Plus Genotyping. G. Uruchom nowy cykl pracy, postępując zgodnie ze wskazówkami kreatora konfiguracyjnego oprogramowania. Wybierz rodzaj testu: HPV workflow. H. Postępuj zgodnie ze wskazówkami kreatora konfiguracyjnego oprogramowania, dotyczącymi ładowania próbek i postępowania z plikiem harmonogramu pracy. UWAGA: Próbki można ładować w opatrzonych kodem kreskowym podstawowych lub wtórnych probówkach w dowolnej kolejności, jeśli tylko ich kody kreskowe odpowiadają kodom w harmonogramie pracy. UWAGA: Jeśli podstawowe pojemniki z próbkami zawierające podłoże do przechowywania pobranych komórek cobas PCR lub płynne podłoże PreservCyt są przeznaczone do przetwarzania, przed załadowaniem należy je zamieszać w mieszadle wibracyjnym. I. Postępuj zgodnie ze wskazówkami kreatora konfiguracyjnego oprogramowania, dotyczącymi ładowania wszystkich produktów. J. Postępuj zgodnie ze wskazówkami kreatora konfiguracyjnego oprogramowania, dotyczącymi ładowania wszystkich odczynników. UWAGA: Kontrole [HPV (+) C i ( ) C] nie są ładowane wraz z próbkami. Są one ładowane do nośnika na odczynniki podczas ładowania odczynnika. Kontrolom HPV (+) i ( ) są przydzielone odpowiednio dwie pozycje (A1 i B1) każdej z płytek do ekstrakcji i płytek z mikrodołkami. UWAGA: System cobas 4800 ma wewnętrzny zegar, kontrolujący czas, przez jaki odczynniki znajdują się w systemie. Po zeskanowaniu WB na zakończenie procesu ładowania jest przeznaczona 1 godzina. Następnie należy kliknąć przycisk Start. Na zakładce Workplace wyświetla się zegar odliczający czas. UWAGA: Aby zapewnić właściwe przeniesienie odczynnika MGP, zamieszaj w mieszadle wibracyjnym lub energicznie wstrząśnij butelką MGP przed umieszczeniem jej w pojemniku na odczynniki. K. Załaduj odczynniki do przygotowywania próbek (WB, MGP, EB, SDS i LYS) do pojemników na odczynniki opatrzonych kodem kreskowym, stosując metodę zeskanuj, zeskanuj, włóż, umieść : Zeskanuj kod kreskowy butelki odczynnika. Zeskanuj kod kreskowy pojemnika na odczynniki. Włóż odczynnik do pojemnika. Umieść wypełniony pojemnik na odczynniki w przypisanej mu pozycji w nośniku na odczynniki. L. Pojemniki na odczynniki są dostępne w dwóch rozmiarach: 200 ml i 50 ml. Postępuj zgodnie ze wskazówkami kreatora konfiguracyjnego oprogramowania, dotyczącymi wyboru pojemnika na odczynniki odpowiednich rozmiarów. Kody kreskowe pojemnika na odczynniki muszą znajdować się po prawej stronie nośnika. UWAGA: Odczynniki do amplifikacji/detekcji (HPV MMX i HPV Mg/Mn), kontrole [HPV (+) C i ( ) C] oraz PK są ładowane bezpośrednio do nośnika na odczynniki i automatycznie skanowane przez aparat cobas x 480. UWAGA: Wszystkie odczynniki i pojemniki na odczynniki są opatrzone kodem kreskowym i przeznaczone do jednokrotnego użycia. Oprogramowanie cobas 4800 umożliwia śledzenie użycia odczynników oraz pojemników na odczynniki i odrzucenie wcześniej używanych odczynników lub pojemników na odczynniki. Oprogramowanie weryfikuje także, czy do aparatu załadowano odczynniki z zestawów o odpowiedniej liczbie testów, np. zapobiegając użyciu zestawu 240 testów w cyklu pracy z ponad 22 próbkami pacjentów. M. Rozpocznij przygotowanie próbek, klikając przycisk Start Run. N. Po pomyślnym zakończeniu procesu przygotowania próbek kliknij przycisk ** Unload, aby wyładować nośnik na płytki. ** Stan przygotowania próbki można sprawdzić w tym momencie, przed kliknięciem przycisku Unload. Patrz podręcznik użytkownika systemu cobas cobas PL 10 Doc Rev. 1.0

11 O. Aby uszczelnić płytkę z mikrodołkami, przenieść płytkę do analizatora cobas z 480 i rozpocząć cykl pracy amplifikacji i detekcji, postępuj zgodnie z instrukcją opisaną w Podręczniku użytkownika systemu cobas UWAGA: System cobas 4800 ma wewnętrzny zegar, kontrolujący czas, jaki upływa od momentu dodania przygotowanych próbek do odczynnika Master Mix, będącego w użyciu. Amplifikację i detekcję należy rozpocząć jak najszybciej, jednak nie później niż 90 minut od zakończenia cyklu pracy aparatu cobas x 480. Na zakładce Workplace wyświetla się zegar odliczający czas. P. Po zakończeniu procesu amplifikacji i detekcji wyładuj płytkę z mikrodołkami z analizatora cobas z 480. Q. Aby przeglądać i akceptować poszczególne wyniki, postępuj zgodnie z instrukcją opisaną w Podręczniku użytkownika systemu cobas Przeprowadzanie przebiegu pracy PCR Only: UWAGA: Przebieg pracy PCR Only jest dostępny jako opcja przywracania, w przypadku gdy pełny przebieg pracy nie może zostać zakończony z powodu okoliczności, na które użytkownik nie ma wpływu (np. wyłączenie zasilania podczas cyklu amplifikacji/detekcji). UWAGA: Tylko próbki, których przetwarzanie w aparacie cobas x 480 zakończyło się pomyślnie, mogą zostać poddane procesowi amplifikacji/detekcji z zastosowaniem cyklu pracy PCR Only. Podczas cyklu pracy PCR Only kontrola systemu dotycząca odczynników i innych produktów jest ograniczona. Podczas przebiegu pracy PCR Only nie zachodzi śledzenie pozycji próbek użytkownik końcowy musi się upewnić, że bieżąca pozycja próbki w płytce z mikrodołkami odpowiada przypisanej jej pozycji w pliku harmonogramu pracy. Podczas przygotowywania płytki z mikrodołkami konieczne jest zachowanie maksymalnej ostrożności, aby zapewnić właściwe przygotowanie reakcji PCR oraz w celu uniknięcia zakażenia. UWAGA: Próbki przetworzone w aparacie cobas x 480 mają ograniczoną stabilność. Muszą one zostać poddane amplifikacji/detekcji w przebiegu pracy PCR Only w ciągu 24 godzin, jeśli są przechowywane w temperaturze od 15 C do 30 C i w ciągu 7 dni, jeśli są przechowywane w temperaturze od 2 C do 8 C. UWAGA: Aby dokonać zmian w kodach kreskowych dodatnich i ujemnych kontroli, postępuj zgodnie z instrukcją opisaną w Podręczniku użytkownika systemu cobas A. Utwórz plik harmonogramu pracy dla przebiegu pracy PCR Only, postępując zgodnie z instrukcją opisaną w Podręczniku użytkownika systemu cobas a. Informacje na temat kodów kreskowych próbek, rodzajów pożywek, podtypów testów oraz pozycji w płytce do ekstrakcji cobas 4800 dla cyklu pracy, wymagającego powtórzenia procesu amplifikacji/detekcji, można znaleźć w pliku wydruku wyniku lub eksportu wyniku. b. W przypadku kontroli dodatnich i ujemnych edytuj ostatnie 4 cyfry, aby określić liczbę ponownych zastosowań kodów kreskowych kontroli dla przebiegu pracy tylko amplifikacji i detekcji, postępując zgodnie z instrukcją opisaną w Podręczniku użytkownika systemu cobas B. Przygotuj odczynnik Master Mix dla testu cobas 4800 HPV: a. Dla cyklu pracy do 24 testów dodaj 240 µl odczynnika HPV Mg/Mn na jedną butelkę odczynnika HPV MMX (butelka 0,5 ml z zestawu 240 testów). b. Dla cyklu pracy do 96 testów dodaj 450 µl odczynnika HPV Mg/Mn na każdą z dwóch butelek odczynnika HPV MMX (butelki 1,0 ml z zestawu 960 testów). UWAGA: Cykl pracy PCR Only musi się rozpocząć w ciągu 90 minut od dodania odczynnika HPV Mg/Mn do HPV MMX. C. Dokładnie zmieszaj odczynnik roboczy Master Mix, ostrożnie odwracając fiolkę(-ki). Nie mieszaj roboczego odczynnika Master Mix w mieszadle wibracyjnym. D. Przenieś 25 µl odczynnika roboczego Master Mix do odpowiednich pozycji w płytce z mikrodołkami. E. Umieść płytkę do ekstrakcji cyklu pracy, który ma zostać powtórzony, na osobną płytkę magnetyczną. F. Ręcznie przenieś 25 µl eluatu z pozycji w płytce do ekstrakcji do odpowiednich pozycji w płytce z mikrodołkami. Upewnij się, że zostały zachowane właściwe pozycje (np. eluat w pozycji A1 płytki do ekstrakcji jest przeniesiony do pozycji A1 płytki z mikrodołkami). Upewnij się, że do płytki z mikrodołkami nie został przeniesiony odczynnik MGP. G. Aby uszczelnić płytkę z mikrodołkami, postępuj zgodnie z instrukcją opisaną w Podręczniku użytkownika systemu cobas H. Odwiruj płytkę z mikrodołkami za pomocą bębna wirówki przez co najmniej 5 sekund przy wartości RCF wynoszącej I. Przenieś płytkę do analizatora cobas z 480 i rozpocznij cykl amplifikacji i detekcji. J. Po zakończeniu procesu amplifikacji i detekcji wyładuj płytkę z mikrodołkami z analizatora cobas z 480. K. Aby przeglądać i akceptować poszczególne wyniki, postępuj zgodnie z instrukcją opisaną w Podręczniku użytkownika systemu cobas PL 11 Doc Rev. 1.0

12 Interpretacja wyników UWAGA: Cały proces walidacji testu i cyklu pracy jest przeprowadzany przez oprogramowanie cobas UWAGA: Ważny cykl pracy może obejmować zarówno ważne, jak i nieważne wyniki próbek. W przypadku prawidłowego cyklu wyniki próbek interpretuje się w sposób przedstawiony w tabelach 1 i 2. Tabela 1 Interpretacja wyników testu cobas 4800 HPV na obecność DNA wirusa HPV cobas 4800 HPV Raport wyniku i jego interpretacja Test Podtyp testu HPV High Risk Panel : Dodatnie HPV wysokiego ryzyka HR HPV POS Wynik próbki jest dodatni dla DNA któregokolwiek lub kombinacji następujących typów wirusa HPV wysokiego ryzyka: 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66, 68. Ujemne HPV wysokiego ryzyka* HR HPV NEG DNA HPV typu 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66 i 68 było niewykrywalne lub poniżej wcześniej ustawionego progu. Nieważne HPV wysokiego ryzyka Invalid Wyniki są nieważne. W celu otrzymania ważnego wyniku ponownie przeprowadź test oryginalnej próbki. Brak wyników dla próbki Instrukcje dotyczące przeglądania znaczników cyklu pracy i zalecanych czynności można znaleźć w Podręczniku Failed użytkownika systemu cobas W celu otrzymania ważnego wyniku ponownie przeprowadź test oryginalnej próbki. Podtyp testu HPV High Risk Panel Plus Genotyping : Other HR HPV POS, HPV16 POS, HPV18 POS Other HR HPV POS, HPV16 POS, HPV18 NEG Other HR HPV POS, HPV16 NEG, HPV18 POS Other HR HPV POS, HPV16 NEG, HPV18 NEG Other HR HPV NEG, HPV16 POS, HPV18 POS Other HR HPV NEG, HPV16 NEG, HPV18 POS Other HR HPV NEG, HPV16 POS, HPV18 NEG Other HR HPV NEG, HPV16 NEG, HPV18 NEG Invalid Failed Dodatni inny typ HPV wysokiego ryzyka, dodatnie HPV16, dodatnie HPV18. Wynik próbki jest dodatni dla DNA HPV typu 16 i 18 oraz DNA któregokolwiek lub kombinacji następujących typów wirusa HPV wysokiego ryzyka: 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66, 68. Dodatni inny typ HPV wysokiego ryzyka, dodatnie HPV16, ujemne HPV18*. Wynik próbki jest dodatni dla DNA HPV typu 16 oraz DNA któregokolwiek lub kombinacji następujących typów wirusa HPV wysokiego ryzyka: 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66, 68. DNA HPV typu 18 było niewykrywalne lub poniżej wcześniej ustawionego progu. Dodatni inny typ HPV wysokiego ryzyka, ujemne HPV16*, dodatnie HPV18. Wynik próbki jest dodatni dla DNA HPV typu 18 oraz DNA któregokolwiek lub kombinacji następujących typów wirusa HPV wysokiego ryzyka: 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66, 68. DNA HPV typu 16 było niewykrywalne lub poniżej wcześniej ustawionego progu. Dodatni inny typ HPV wysokiego ryzyka, ujemne HPV16*, ujemne HPV18*. Wynik próbki jest dodatni dla DNA któregokolwiek lub kombinacji następujących typów wirusa HPV wysokiego ryzyka: 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66, 68. DNA HPV typu 16 i 18 było niewykrywalne lub poniżej wcześniej ustawionego progu. Ujemny inny typ HPV wysokiego ryzyka*, dodatnie HPV16, dodatnie HPV18. DNA HPV typu 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66 i 68 było niewykrywalne lub poniżej wcześniej ustawionego progu. W próbce wykryto obecność DNA HPV typu 16 i 18. Ujemny inny typ HPV wysokiego ryzyka*, ujemne HPV16*, dodatnie HPV18. DNA HPV typu 16, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66 i 68 było niewykrywalne lub poniżej wcześniej ustawionego progu. W próbce wykryto obecność DNA HPV typu 18. Ujemny inny typ HPV wysokiego ryzyka*, dodatnie HPV16, ujemne HPV18*. DNA HPV typu 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66 i 68 było niewykrywalne lub poniżej wcześniej ustawionego progu. W próbce wykryto obecność DNA HPV typu 16. Ujemny inny typ HPV wysokiego ryzyka*, ujemne HPV16*, ujemne HPV18*. DNA HPV typu 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66 i 68 było niewykrywalne lub poniżej wcześniej ustawionego progu. Nieważne. Wyniki są nieważne. W celu otrzymania ważnych wyników ponownie przeprowadź test oryginalnej próbki. Brak wyników dla próbki Instrukcje dotyczące przeglądania znaczników cyklu pracy i zalecanych czynności można znaleźć w Podręczniku użytkownika systemu cobas W celu otrzymania ważnych wyników ponownie przeprowadź test oryginalnej próbki. * Wynik ujemny nie wyklucza obecności zakażenia wirusem HPV, gdyż wyniki zależne są od odpowiedniego pobrania próbki, nieobecności inhibitorów oraz obecności ilości DNA wystarczającej do detekcji PL 12 Doc Rev. 1.0

13 Tabela 2 Interpretacja wyników testu cobas 4800 HPV dla pacjentów z nieprawidłowościami cytologicznymi Wyniki Interpretacja Other HR HPV* NEG, HPV16 NEG, Bardzo małe prawdopodobieństwo dla CIN2. HPV18 NEG Other HR HPV* POS, HPV16 NEG, Zwiększone prawdopodobieństwo, że CIN2 zostanie wykryte HPV18 NEG podczas kolposkopii. Najwyższe prawdopodobieństwo, że CIN2 zostanie wykryte HPV16 POS i/lub HPV18 POS podczas kolposkopii 32, 33. * Inne DNA HR HPV obejmują następujące typy: 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66, 68. UWAGA: Ujemne wyniki HPV nie powinny być powodem rezygnacji z kolposkopii u kobiet. UWAGA: Oprócz wyników wyszczególnionych w tabeli powyżej możliwe są także wyniki nieważne dla jednej lub wielu kombinacji. W razie otrzymania takich wyników, jak na przykład: Other HR HPV NEG, HPV16 POS, HPV18 Invalid Dodatnie i ujemne wyniki powinny być interpretowane w sposób przedstawiony w tabeli 1. W przypadku przedstawionego przykładu wyniki dla HPV typu 18 są nieważne. W celu otrzymania ważnych wyników ponownie przeprowadź test oryginalnej próbki. UWAGA: Ujemne wyniki wskazują, że stężenia DNA HPV są niewykrywalne lub poniżej wcześniej ustawionego progu. UWAGA: Dodatnie wyniki testu wskazują na obecność któregokolwiek lub więcej typów wirusa, jednak ponieważ pacjentki są często współzakażone jego typami niskiego ryzyka, nie wyklucza to obecności typów niskiego ryzyka u pacjentek z zakażeniami mieszanymi. UWAGA: Wyniki tego testu powinny być interpretowane wyłącznie w połączeniu z informacjami pochodzącymi z oceny klinicznej pacjentki i jej historii choroby. KONTROLA JAKOŚCI Każdy cykl pracy obejmuje jeden zestaw kontroli dodatnich i ujemnych testu cobas 4800 HPV. W przypadku każdego cyklu pracy, aby przez oprogramowanie cobas 4800 zostały wyświetlone możliwe do odnotowania wyniki testu cobas 4800 HPV tego cyklu pracy, muszą zostać uzyskane ważne wyniki zarówno dla kontroli dodatniej, jak i ujemnej. Kontrola dodatnia Wynik kontroli HPV (+) musi być oznaczony jako Valid. Jeżeli wyniki kontroli HPV (+) są stale nieważne, skontaktuj się z miejscowym biurem firmy Roche w celu uzyskania pomocy technicznej. Kontrola ujemna Wynik kontroli ( ) musi być oznaczony jako Valid. Jeżeli wyniki kontroli ( ) są stale nieważne, skontaktuj się z miejscowym biurem firmy Roche w celu uzyskania pomocy technicznej. ŚRODKI OSTROŻNOŚCI DOTYCZĄCE PROCEDURY Jak w przypadku każdej procedury testowej, dla prawidłowego przeprowadzenia badania kluczowe znaczenie ma zachowanie zasad dobrej praktyki laboratoryjnej. Z uwagi na wysoką czułość analityczną niniejszego testu należy przedsięwziąć wyjątkową ostrożność, używając odczynników oraz mieszanin do amplifikacji, aby zapobiec kontaminacji. OGRANICZENIA METODY 1. Do badań należy używać tylko określonych rodzajów próbek. Test cobas 4800 HPV został zatwierdzony wyłącznie do użycia z próbkami z szyjki macicy pobranymi do pożywki do przechowywania pobranych komórek cobas PCR, płynnego podłoża PreservCyt i płynu konserwującego SurePath. 2. Detekcja HPV wysokiego ryzyka zależy od liczby jego kopii obecnych w próbce, na którą wpływać mogą metody pobierania próbek, czynniki związane z pacjentem, faza zakażenia i obecność substancji wpływających na detekcję. 3. Test cobas 4800 HPV obejmuje amplifikację i detekcję β-globiny w celu zróżnicowania próbek HPV-ujemnych od tych, które nie wykazują sygnału HPV z powodu niewystarczającej masy komórkowej w próbce. Wszystkie próbki HPV-ujemne muszą mieć ważny sygnał β-globiny, aby mogły zostać określone jako ważne ujemne. 4. Wiarygodność wyników zależy od odpowiedniego pobrania, transportu, przechowywania i przygotowania próbek. Należy postępować zgodnie z procedurami opisanymi w tej ulotce dołączonej do opakowania, ulotce dołączonej do opakowania pożywki do przechowywania pobranych komórek cobas PCR oraz Podręczniku użytkownika systemu cobas Dodanie do odczynnika Master Mix cobas 4800 HPV enzymu AmpErase umożliwia selektywną amplifikację docelowego DNA; jednak aby uniknąć skażenia odczynników, konieczne jest stosowanie dobrej praktyki laboratoryjnej i dokładne przestrzeganie procedur wyszczególnionych w niniejszej instrukcji. 6. Tego produktu mogą używać wyłącznie osoby przeszkolone w zakresie technik PCR i używania systemu cobas Zatwierdzono użycie tego produktu tylko z aparatem cobas x 480 i analizatorem cobas z 480. Z tym produktem nie można stosować żadnych innych urządzeń do przygotowania próbek ani systemów do PCR. 8. Z uwagi na różnice pomiędzy technologiami zaleca się, aby przed zmianą stosowanych metod użytkownik przeprowadził w laboratorium badanie korelacji stosowanych metod w celu określenia różnic występujących pomiędzy nimi. 9. Nie oceniano również wpływu innych potencjalnych zmiennych, takich jak upławy, stosowanie tamponów, irygacje itd., ani zmiennych związanych z pobieraniem wymazu PL 13 Doc Rev. 1.0