DIAGNOSTYKA MOLEKULARNA PADACZEK / ZESPOŁÓW PADACZKOWYCH. Dr hab. n. med. Dorota Hoffman-Zacharska prof. IMiD Zakład Genetyki Medycznej IMiD

Transkrypt

1 DIAGNOSTYKA MOLEKULARNA PADACZEK / ZESPOŁÓW PADACZKOWYCH Dr hab. n. med. Dorota Hoffman-Zacharska prof. IMiD Zakład Genetyki Medycznej IMiD Padaczka i inne stany napadowe u dzieci CMPK

2

3 Przyczyny napadów i padaczki w zależności od wieku Nieprawidłowości wrodzone Zaburzenia migracji neuronalnej Choroby spichrzeniowe Choroby zwyrodnieniowe Uraz okołoporodowy Krwawienie śródczaszkowe Padaczki o podłożu genetycznym Zakażenia Guzy mózgu Wewnątrzczaszkowe urazy głowy Napady gorączkowe Hipoksja Hipoglikemia Hipokalcemia Leki Alkohol Choroby naczyń mózgowych Choroby zwyrodnieniowe % przyp. zachorowań poniżej 20 r.ż. wiek (lata) wg. Chadwik D. I wsp., 1989

4 Rodzaje napadów Ogniskowe Uogólnione Nieokreślone Etiologia Strukturalne choroby współistniejące Ogniskowe Rodzaje padaczek Uogólnione Mieszane uogólnione i ogniskowe Nieokreślone Genetyczne Infekcyjne Metaboliczne Immunologiczne Zespoły padaczkowe Nieokreślone

5 William Gordon Lennox lata 50-siąte XX w. Badania bliźniąt Badania zgodności/niezgodności dla danej cechy: - cecha taka sama u bliźniąt zgodne po względem tej cechy - różnica niezgodne pod względem cechy Różnica w częstości występowania cech zgodnych i niezgodnych między bliźniętami MZ i DZ brana jest jako miara lub wskaźnik składnika genetycznego. Analiza statystyczna Udział czynnika genetycznego w rozwoju padaczek/zespołów padaczkowych przyjmuje się 40 60%

6 Etiologia (podłoże genetyczne): penetracja wysoka choroby mendlowskie średnia rzadkie warianty o średniej penetracji warianty identyfikowane w badaniach asocjacyjnych niska bardzo rzadkie rzadkie częste częstość alleli choroby rzadkie < 1/ osób

7 GENETYCZNE Padaczka to wynik znanego defektu genetycznego. Napady są podstawowym objawem choroby. [udowodnione badaniami molekularnymi i/lub o charakterze rodzinnym czynniki genetyczne nie wykluczają udziału czynników środowiskowych] choroby monogenowe, których padaczka jest głównym lub jedynym objawem stanowią niewielki odsetek zespołów padaczkowych (~10%) STRUKTURALNO- METABOLICZNE Padaczka związana z występowaniem innego zaburzenia strukturalnego (zaburzenia rozwojowe kory mózgowej, stwardnienie guzowate) lub metabolicznego padaczka jako jeden z współwystępujących objawów choroby opisywana jest w ponad 200 chorobach o dziedziczeniu mendlowskim O NIEZNANYM PODŁOŻU Padaczki, których przyczyna/podłoże nie zostało jeszcze poznane

8 Postęp w zrozumieniu etiologii padaczki 1976 vs Thomas, R. H. & Berkovic, S. F. Nat. Rev. Neurol. 10, (2014);

9 Choroby monogenowe Mutacje dominujące de novo

10 era NGS era kanałopatii Mutacje dominujące de novo era encefalopatii padaczkowych 1000 USD

11 Mutacje dominujące de novo analiza triosów Strategia identyfikacji podłoża w sporadycznych przypadkach NI Wykluczenie patogennych CNV oraz zespołu kruchego chr. X WES mapowanie odczytów, identyfikacja wariantów wykluczenie wariantów nieistotnych (synonimiczne) bioinformatyczna analiza patogenności zidentyfikowanych wariantów wykluczenie wariantów częstych 143 warianty heterozygotyczne nie występujące u rodziców wykluczenie wariantów odziedziczonych 5

12 Podłoże padaczki ewolucja koncepcji Padaczki genetycznie uwarunkowane padaczki dziedziczeniu poligenowym Padaczki nabyte padaczki monogenowe Padaczki objawowe (niedotlenienie, trauma, urazy, malformacje naczyń) Idiopatyczne Symptomatyczne wg. Helbig I Beyond the ion channel; ILAE Blog 2014

13 Wczesna encefalopatia miokloniczna PIGA, SETBP1, SIK1, SLC25A22 Encefalopatie padaczkowe o wczesnym początku KCNQ2 AARS, CACNA2D2, NECAP1, PIGA, QARS, SCN8A Zespół Ohtahara KCNQ2 KCNT1, PIGQ CDKL5 SCN2A STXBP1,GNAO1 ARX, DOCK7, SLC25A22, SLC35A2, WWOX Zespól Dravet SCN1A Zespół (GABRA1, GABRG2, HCN1, KCNA2 SCN1B, STXBP1, PCDH19) Padaczka z napadami zgięciowymi ALG13, DNM1, FOXG1 duplications, GABRA1, GABRB3, GRIN1, GRIN2A, GRIN2B, IQSEC2, KCNT1, MAGI2, MEF2C, NEDDL4, Zespół NDP, NRXN1, PIGA, PLCB1, PTEN, SCA2,SCN1A, SCN2A, SCN8A, SETBP1, SIK1, SLC25A22, SLC35A2, SPTAN1, ST3GAL3, STXBP1, TBC1D24, TCF4 Padaczka z napadami miokloniczno-atonicznymi SLC2A1, Zespół SLC6A1 GABRA1,GBRG2,SCN1A,SCN2A, Zespół Lennoxa-Gastaut ALG1,DNM1,FLNA, Zespół GABRB3,GLI3 HNRNPU,SCN1A,SCN2A, SCN8A, STXBP1 Padaczka z migrującymi napadami ogniskowymi u niemowląt KCNT1, SCN2A, SCN1A PLCB1, QARS, SCN8A, SLC25A22, TBC1D24, SLC12A5 Spektrum padaczki z afazją Zespół GRIN2A Inne zespoły głównie padaczki miokloniczne wiek zach. <1 r. EEF1,MEF2C, SCN1A, SLC2A1, SPTAN1, SYNGAP1, TBC1D24 wiek zach. >1 r. CHD2, MEF2C, SYNGAP1, UBE3A Inne zespoły głównie padaczki wieloogniskowe wiek zach. < 6 m. ARHGEF9, DEPDC5, SCN1A, TBC1D24, PNKP1, SLC2A1 wiek zach m. ARHGEF9, DEPDC5, FOXG1 mut., MBD5, PIGO, SLC13A5 wiek zach. > 1 r. ARHGEF9, DEPDC5, MBD5, PCDH19, POLG, TNK2, ZEB2 0 miesięcy 3 miesiące 6 miesięcy 1 rok 2 lata 4 lata

14 wczesnodziecięce encefalopatie padaczkowe wiekowo specyficzne zespoły katastroficznej padaczki, o szczególnie niekorzystnym rokowaniu charakteryzujące się postępującymi zaburzeniami funkcji poznawczych, czuciowych i/lub motorycznych, występującymi u początkowo prawidłowo rozwijających się dzieci. Objawy encefalopatii padaczkowych są skutkiem napadów padaczkowych oraz podklinicznych wyładowań, które uważa się za czynnik uszkadzający rozwijający się mózg.

15 DNA genomowy pacjenta fragmentacja odczyt sekwencji milionów fragmentów uliniowienie odczytów (przyrównanie do sekwencji referencyjnej) identyfikacja wariantów sekwencji odbiegających od sekwencji referencyjnej

16 Etapy procedury sekwencjonowania metodą NGS Izolacja DNA Przygotowanie biblioteki Sekwencjonowanie Analiza surowych danych Przyrównanie do sekwencji ref. genomu Identyfikacja wariantów Analiza Priorytyzajcja Interpretacja patogenności wariantów - wyodrębnienie prawdziwych mutacji patogennych z genomic noise

17 Genom Eksom Panel (1% genomu)

18 Badanie w kierunku identyfikacji podłoża molekularnego wczesnodziecięcej encefalopatii padaczkowej Sekwencjonowanie celowane NGS (panel 49 genów związanych z EIEEs) EIEE v.1/2016 Panel ALDH7A1, ALG13, ARX, CACNA1A, CASK, CDKL5, CHD2, DNM1, FOXG1, GABRA1, GABRB3, GABRG2, GNAO1, GRIN1, GRIN2A, GRIN2B, HCN1, HNRNPU, IQSEC2, KCNA2, KCNB1, KCNQ2, KCNQ3, KCNT1, MBD5, MECP2, MEF2C, PCDH19, PNPO, POLG, PRRT2, SCN1A, SCN1B, SCN2A, SCN8A, SCN9A, SIK1, SLC25A22, SLC2A1, SLC35A2, SLC9A6, SPTAN1, STXBP1, SYNGAP1, TBC1D24, TBL1XR1, TCF4, UBE3A, ZEB2

19 SPECYFICZNOŚĆ SEKWENCJONOWANIE EKSOMOWE (WES) GENY W PANELU Liczba wariantów o niejasnej patogennoścji

20 NGS panel / eksom* Rozpoznanie kliniczne Dane kliniczne Zidentyfikowane warianty genowe Wytypowane dla fenotypu warianty genowe Adnotacja wariantów Charakterystyka patogenności Klasyfikacja wariantów Bazy danych HGMD, ClinVar ExAc, dbsnp Lokalne bazy danych (dane własne) Dane opublikowane. Predykcja patogenności in silico PolyPhen, MutationTaster, SIFT Predykcja zaburzeń splicingu Patogenne Potencjalnie patogenne O niejasnej patogenności? Sprawozdanie z analizy DNA Potencjalnie niepatogenny Niepatogenny

21 Elementy diagnostycznego testu genetycznego: 1. Konsultacja przed wykonaniem testu - wstępna diagnoza, skierowanie na badania deklaracja świadomej zgody skierowanie ukierunkowanie badania NGS - szczegółowa charakterystyka kliniczna pacjenta 2. Laboratorium wykonanie zleconego badania na podstawie skierowania 3. NGS - współpraca klinicysta diagnosta; weryfikacja zidentyfikowanych wariantów genetycznych w kontekście fenotypu pacjenta 4.Przekazanie wyniku poradnictwo genetyczne

22 Zespół Dravet Gen SCN1A (MIM ID *182389); locus 2q24 >90% >90% delecje/duplikacje mutacje punktowe

23 Geny zespołu Dravet PCDH19 (EIEE9) SCN1A GABRG2 GABRA1 (EIEE19) Zespół Dravet (fenotyp) SCN1B (EIEE52) SCN2A (EIEE4) HCN1 (EIEE4) CHD2 KCNA2 (EIEE32) STXBP1 (EIEE4) SCN8A (EIEE8)

24 Standardowe postępowanie diagnostyczne EIEEs EIEEs Dane kliniczne wydajność diagnostyczna Dane genetyczne EEG Niska 4% Kariotyp Metabolity 5% <16% Array MRI Niska Niska Sanger 20 30% Panel >30% - 50% WES (WES Trio)

25 Wyniki analizy panelowej (70 genów) dla pacjentów (Lindy i wsp. 2018) EIEE v.1/2016 Panel ALDH7A1, ALG13, ARX, CACNA1A, CASK, CDKL5, CHD2, DNM1, FOXG1, GABRA1, GABRB3, GABRG2, GNAO1, GRIN1, GRIN2A, GRIN2B, HCN1, HNRNPU, IQSEC2, KCNA2, KCNB1, KCNQ2, KCNQ3, KCNT1, MBD5, MECP2, MEF2C, PCDH19, PNPO, POLG, PRRT2, SCN1A, SCN1B, SCN2A, SCN8A, SCN9A, SIK1, SLC25A22, SLC2A1, SLC35A2, SLC9A6, SPTAN1, STXBP1, SYNGAP1, TBC1D24, TBL1XR1, TCF4, UBE3A, ZEB2

26 Podsumowanie analizy zidentyfikowanych wariantów dla 120 pacjentów skierowanych na badanie z zastosowaniem panelu EIEE v.1/2016 (brak szczegółowej charakterystyki fenotypu) Brak wariantów patogennych Diagnoza molekularna analiza DNA pacjenta 10% 37% 10% zweryfikowane warianty (analiza DNA rodziców) 8% 35% konieczna weryfikacja fenotypu nosicieli w rodzinie konieczna analiza DNA rodziców - dziedziczenie Warianty potencjalnie patogenne

27 Padaczka Sekwencjonowanie celowane - panele genowe Charakterystyka kliniczna Fenotyp/Zespół Encefalopatie Padaczkowe Drgawki Gorączkowe Postępująca padaczka miokloniczna Wady mózgu Znane zespoły genetycznie uwarunkowane Wrodzone Zaburzenia metaboliczne Wiek zachorowania Noworodkowe Niemowlęce Dziecięce Panel wielkość Ukierunkowany 5-50 genów Rozszerzony genów Rozbudowany > 1000 genów Eksom kliniczny Skuteczność diagnostyczna Czas wykonania badania (sekwencjonowanie, analiza danych, weryfikacja) Koszt wykonania badania

28 NBE v.1/2018 ABAT, ALDH7A1, ALG13, ALPL, AMT, ARHGEF9, ARX, BTD, CACNA1A, CASK, CDKL5, CHD2, DNM1, FOLR1, FOXG1, GABRA1, GABRB3, GABRG2, GAMT, GATM, GLDC, GLRA1, GLRB, GNAO1, GPHN, GRIN1, GRIN2A,GRIN2B, HCN1, HNRNPU, IQSEC2, KCNA2, KCNB1, KCNJ10, KCNQ2, KCNQ3, KCNT1,LIAS, MBD5, MECP2, MEF2C, MOCS1, MOCS2, P5CDH, PCDH19, PGAP2, PHGDH, PHOX2B, PIGA, PIGO, PIGV, PMM2, PNPO, POLG, PROSC,PRRT2, PSAT, PSP, SCN1A, SCN1B, SCN2A, SCN8A, SCN9A, SIK1, SLC25A22, SLC2A1, SLC35A2, SLC6A5, SLC6A8, SLC9A6, SPTAN1, STXBP1, SUOX, SYNGAP1, TBC1D24, TBL1XR1,TCF4, TPP1, TSC1, TSC2, UBE3A, ZEB2

29 Choroby Neurorozwojowe (NeuroDevelopmental Disorders) Choroby ze spektrum autyzmu (Autism Spectrum Disorders) Padaczka (Epilepsy) Niepełnosprawność intelektualna/ Opóźnienie rozowojowe (Intelectual Disability/ Developmental Delay) Encefalopatie Padaczkowe NDD EE Zaburzenia Neurorozwojowe + Padaczka Zaburzenia Neurorozwojowe z padaczką NDD UE Zaburzenia Neurorozowjowe z Nieokreśloną Padaczką