Rola mikrorna w regulacji ekspresji cząsteczek związanych z adhezją komórkową w raku nerki typu jasnokomórkowego.

Transkrypt

1 Dr hab. Agnieszka Piekiełko-Witkowska Zakład Biochemii i Biologii Molekularnej Centrum Medyczne Kształcenia Podyplomowego Projekt pracy doktorskiej pt. Rola mikrorna w regulacji ekspresji cząsteczek związanych z adhezją komórkową w raku nerki typu jasnokomórkowego. Projekt będzie realizowany w ramach grantu NCN nr 2012/05/B/NZ5/01541 Cel/hipoteza: Celem projektu jest identyfikacja cząsteczek mikrorna, które mogą regulować ekspresję cząsteczek związanych z adhezją komórkową w raku nerki typu jasnokomórkowego, a przez to mogą wpływać na procesy adhezji, migracji i inwazji w tym typie nowotworu. Szczegółowe cele projektu obejmują: wytypowanie cząsteczek mikrorna potencjalnie regulujących ekspresję cząsteczek adhezyjnych, których ekspresja jest zaburzona w ccrcc (dane o ekspresji cząsteczek adhezyjnych i mikrorna będą uzyskane w wyniku równolegle prowadzonych badań). zbadanie wpływu cząsteczek mikrorna na ekspresję wytypowanych cząsteczek adhezyjnych zbadanie wiązania mikrorna do rejonów 3'UTR wytypowanych cząsteczek adhezyjnych Zbadanie wpływu wybranych cząsteczek mikrorna na adhezję, migrację i inwazję komórek ccrcc Hipoteza projektu: zaburzenia ekspresji mikrorna, które wpływają na ekspresję cząsteczek związanych z adhezją, powodują zmiany we właściwościach adhezyjnych komórek w ccrcc, a także wpływają na procesy adhezji, migracji i inwazji w tym typie nowotworu. 1

2 Obecny stan wiedzy/założenia: 1. Rak nerki typu jasnokomórkowego. Rak nerkowokomórkowy (RCC, ang. renal cell carcinoma) jest najczęstszym typem litych guzów nerki. Przeważająca większość przypadków RCC (około 80%) jest klasyfikowana jako rak nerki typu jasnokomórkowego (ang. clear cell renal cell carcinoma, ccrcc). Zgodnie z danymi epidemiologicznymi w 2000 roku odnotowano w Polsce ponad 2000 przypadków zachorowań na raka nerki u mężczyzn i ponad 1300 u kobiet. Z powodu raka nerki zmarło w 2000 roku 1400 mężczyzn i ponad 800 kobiet (Krzakowski i wsp., 2004). Wśród wszystkich typów raka nerki ccrcc jest formą najbardziej agresywną, charakteryzuje się najszybszym wzrostem i tworzeniem przerzutów (wykrywanych u prawie 25% pacjentów w momencie diagnozy nowotworu, a u kolejnych 50% pojawiających się w okresie obserwacji poszpitalnej). Podstawowym sposobem leczenia jest chirurgiczne usunięcie guza. U mniej niż 10% pacjentów z rozległymi przerzutami immunochemioterapia paliatywna zatrzymuje rozwój choroby, dając średnią przeżycia 5-7 miesięcy. Ponieważ możliwości skutecznego leczenia ccrcc w zaawansowanej postaci są ograniczone, główny nacisk kładzie się na poszukiwanie sposobów wczesnego wykrywania choroby, ze szczególnym uwzględnieniem markerów molekularnych. 2. Cząsteczki adhezyjne w procesie nowotworzenia. Śmiertelność w chorobach nowotworowych jest głównie związana z procesem przerzutowania. Proces ten obejmuje kilka etapów, wśród których wyróżnia się oderwanie się komórek nowotworowych z miejsc pierwotnych zmian nowotworowych, inwazję macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM, ang. extracellular matrix), wnikanie do krwioobiegu, rozsiew poprzez układ krwionośny, wnikanie do odległych narządów i tworzenie zmian wtórnych. Inicjacja procesu przerzutowania jest ściśle związana ze zmianami we właściwościach adhezyjnych komórek nowotworowych. Zmiany te są wynikiem zaburzeń w ekspresji i funkcjonowaniu cząsteczek adhezyjnych (CAM, ang. cell adhesion molecules). Cząsteczki CAM są powierzchniowymi białkami komórki, biorącymi udział w oddziaływaniach między komórkami i między komórkami a macierzą zewnątrzkomórkową. Do CAM zaliczane są białka należące do grup kadheryn, integryn, selektyn i immunoglobulin. Cząsteczki te warunkują prawidłową strukturę i działanie komórek i biorą udział w szeregu istotnych procesów, takich jak morfogeneza, embriogeneza, organogeneza, procesy odpornościowe, procesy zapalne. Z uwagi na rolę, jaką CAM pełnią w procesie przerzutowania, wykorzystuje się je jako markery diagnostyczne i cele terapeutyczne w leczeniu różnego typu nowotworów. Kadheryny są glikoproteinami pośredniczącymi w mediowanych przez wapń oddziaływaniach między komórkami należącymi do tego samego typu. Do najintensywniej badanych cząsteczek tej 2

3 rodziny należą kadheryny: E (nabłonkowa, ang. epithelial), N (neuronalna, ang. neural) i P (łożyskowa, ang. placental). Znaczenie kadheryn w regulacji procesów komórkowych wynika również z faktu, że oddziałują one z elementami cytoszkieletu poprzez tzw. kompleks kateninowy, m.in. przez beta-kateninę, która, oprócz oddziaływania z kadherynami, bierze udział w szeregu ważnych szlaków sygnałowych (np. szlaku Wnt, związanego z migracją komórkową i regulacją ekspresji wielu genów, w tym biorących udział w procesie nowotworzenia). W związku z istotną rolą kadheryn w utrzymywaniu homeostazy komórkowej, nieprawidłowości ich ekspresji są powodem poważnych zaburzeń. Przykładowo, utrata ekspresji E-kadheryny lub jej nieprawidłowe działanie prowadzi do utraty polarności komórki i zaburzeń struktury tkanek. W większości nowotworów pochodzenia nabłonkowego obserwuje się zaburzenia oddziaływań komórkowych, w których pośredniczy E- kadheryna, z czym równocześnie związane jest nabywanie przez komórki bardziej agresywnego fenotypu. Wykazano ujemną korelację między poziomem ekspresji E-kadheryny, stopniem zaawansowania nowotworu i przeżywalnością pacjentów. Utrata ekspresji E-kadheryny występuje też w stanach przedrakowych, takich jak przełyk Baretta. W eksperymentach wykonanych na liniach komórkowych wykazano, że przywrócenie ekspresji E-kadheryny powoduje odwrócenie fenotypu z inwazyjnego do łagodnego, co sugeruje potencjalną rolę E-kadheryny jako supresora inwazyjności nowotworowej. Integryny są glikoproteinowymi receptorami powierzchniowymi, zbudowanymi z podjednostek alfa i beta. 18 podjednostek alfa i 8 podjednostek beta łączy się w 24 znane kombinacje tworzące receptory integrynowe. Domena zewnątrzkomórkowa receptorów integrynowych oddziałuje z wieloma białkami ECM (np. fibronektyną, fibrynogenem, witronektyną, lamininą i kolagenem). Integry oddziałują tez z ligandami, takimi jak trombospondyna, czynnik von Willebranda, czynnik X, lub z innymi białkami CAM, takimi jak VCAM-1 (ang. vascular cell adhesion molecule) lub ICAM (ang. intracellular adhesion molecules). Integryny inicjują komórkowe kaskady sygnałowe dzięki oddziaływaniu ich domen cytoplazmatycznych z elementami cytoszkieletu (np. alfa-aktyną) i białkami sygnałowymi (np. kinazami i białkami adaptorowymi: kinazami FAK (ang. focal adhesion kinase), Src, ILK, MAPK i innymi). Dzięki tym złożonym oddziaływaniom, integryny mogą wpływać na ekspresję wielu genów biorących udział w kluczowych procesach komórkowych, takich jak proliferacja, migracja, różnicowanie, regulacja cyklu komórkowego. W różnych typach nowotworów obserwuje się zaburzenia w poziomie ekspresji integryn. Przykładowo, obniżenie ekspresji integryny alfa5beta1 obserwuje się podczas nowotworowej transformacji fibroblastów gryzoni. Selektyny są transbłonowymi białkami i zalicza się do nich selektynę E (śródbłonkowa, ang. endothelial), L (leukocytarna, ang. leukocyte) i P (płytkowa, ang. platelet). Pośredniczą one w oddziaływaniach między komórkami śródbłonka, leukocytami i trombocytami. Zaburzenia ekspresji selektyn są spotykane w wielu nowotworach, np. w inwazyjnym raku piersi i przerzutach raka jelita 3

4 grubego, gdzie stwierdzono zwiększoną ekspresję selektyny E. Zwiększoną ekspresję selektyny P stwierdzono w raku piersi i żołądka, podczas gdy obniżona ekspresja tego białka jest związana z progresją czerniaka i raka jelita grubego. Cząsteczki CAM, należące do rodziny immunoglobulin (IgCAM), stanowią dużą grupę powierzchniownych glikoprotein. Kilka cząsteczek tej grupy jest związanych z procesem nowotworzenia (np. NCAM, VCAM, ICAM, PECAM, Mad CAM i CEA). Cząsteczki te pośredniczą w oddziaływaniach pomiędzy komórkami tego samego typu, jak i komórkami różnych typów. Zaburzenia ekspresji cząsteczek NCAM są związane z progresją nowotworową i złym prognozowaniem. Zmiany w ekspresji NCAM obserwowano m.in. w nowotworach mózgu, jelita grubego, trzustki, tarczycy, drobnokomórkowego raka płuca. 3. Cząsteczki adhezyjne w raku nerki typu jasnokomórkowego. W nerce opisano ekspresję kilku kadheryn, m. in kadheryny E, N, kadheryny 6, 8 i 16. Ogólnie uważa się, że kadheryna E działa jako supresor inwazji nowotworowej i że jej ekspresja koreluje z przeżywalnością pacjentów w wielu różnych typach nowotworów, m.in. w raku pęcherza moczowego, prostaty, piersi, jelita grubego i żołądka. Również w RCC stwierdzono statystycznie istotną korelację między prawidłową ekspresją E-kadheryny i lepszym prognozowaniem (Katagiri i wsp. 1995). Langner i wsp (2004) wykazali, że ekspresja cząsteczki MUC1 i kadheryny E może stanowić marker diagnostyczny i prognozujący RCC. Stosunek ekspresji genu kodującego metaloproteinazę 9 (MMP9) do kadheryny E stanowi marker prognozujący przerzutowanie w ccrcc (Slaton i wsp., 2001). Jednak w większości przypadków RCC kadheryna E nie ulega ekspresji (wykrywa się ją w zaledwie około 20% analizowanych próbek), co częściowo wynika z faktu, że kanaliki proksymalne, z których wywodzi się RCC, nie wykazują ekspresji kadheryny E. Wydaje się, że lepszym markerem w tym typie nowotworu jest kadheryna 6. Zaburzona ekspresja tej cząsteczki koreluje ze złym prognozowaniem RCC (Paul i wsp., 1997, Shimazui i wsp., 1998). W RCC obserwuje się również zwiększoną ekspresję kadheryny 8, która w prawidłowych kanalikach proksymalnych nie występuje (Blaschke i wsp., 2002). Z kolei kadheryna Ksp wykazuje obniżoną ekspresję w RCC w porównaniu z tkanką prawidłową (Thedieck i wsp., 2005). Ekspresja czasteczki VCAM-1 jest podwyższona w ccrcc i koreluje z lepszym prognozowaniem (Shioi i wsp., 2006). W prawidłowych kanalikach proksymalnych ekspresja tej cząsteczki jest prawie niewykrywalna. Podwyższona ekspresja cząsteczki adhezyjnej L1 (L1-CAM) koreluje z przerzutowaniem w ccrcc (Allory i wsp., 2005), a także z krótszym prognozowanym czasem życia i opornością na chemioterapię (Doberstein i wsp., 2011). 4. Cząsteczki mikrorna i ich rola w procesie nowotworzenia. 4

5 Cząsteczki mikrorna są małymi, niekodującymi cząsteczkami RNA, które regulują ekspresję genów wiążąc się do rejonów UTR (ang. UnTranslated Region) docelowych transkryptów i hamując translację bądź indukując degradację mrna. Ekspresja mikrorna jest bardzo często zaburzona w nowotworach, a cząsteczki te są często proponowane jako molekularne markery diagnostyczne. Z drugiej strony, z uwagi na to, że celem działania mikrorna są geny bezpośrednio związane z neogenezą i progresją nowotworową, mikrorna są obiektem badań klinicznych testujących je jako cząsteczki terapeutyczne (Wahid et al., 2010). W ccrcc zaobserwowano zaburzenia mikrorna związane z przerzutowaniem. Przykładowo, wykazano, że wzór ekspresji mir-451, mir-221, mir-30a, mir-10b i mir-29a różni się między chorymi z rozsianą postacią choroby a chorymi bez przerzutów (Heinzelmann i wsp., 2011). Cząsteczki mikrorna mogą też wpływać na procesy inwazji i migracji w ccrcc (Slaby i wsp., 2011). W ccrcc zaobserwowano więc zarówno zaburzenia genów związanych z adhezją komórkową jak i mikrorna. Brakuje jednak badań, który wykazywałyby, że cząsteczki mikrorna, których ekspresja zmienia się w zależności od stopnia inwazyjności nowotworu, wpływają na procesy przerzutowania za pośrednictwem cząsteczek adhezyjnych. Dlatego właśnie celem projektu jest identyfikacja mikrorna wpływających na cząsteczki adhezyjne i elementy ECM w ccrcc. Identyfikacja mikrorna, które hamując ekspresję genów adhezyjnych modulują właściwości adherentne komórek nowotworowych, pozwoli na uzyskanie potencjalnych cząsteczek terapeutycznych wpływających na proces przerzutowania w ccrcc. Metodyka: Ogólny schemat badawczy będzie wyglądał następująco: Na podstawie analizy danych uzyskanych z RT²Profiler PCR Arrays i Real-time Custom Panels zostanie wybranych 3 cząsteczek adhezyjnych, których ekspresja różni się w ccrcc w zależności od stopnia zaawansowania i inwazyjności nowotworu. Na podstawie analizy danych uzyskanych z Pick- &-Mix microrna PCR Panels oraz analizy bioinformatycznej (programy TargetScan, miranda, mirbase i Diana) zostaną wybrane cząsteczki mikrorna potencjalnie wiążące się do rejonów UTR wybranych cząsteczek adhezyjnych. Cząsteczki mikrorna o najwyższym prawdopodobieństwie wiązania zostaną wybrane do weryfikacji: a) ich wiązania z rejonem UTR wytypowanych cząsteczek adhezyjnych (testy w systemie lucyferazowym); b) ich wpływu na ekspresję wytypowanych cząsteczek adhezyjnych (analiza real-time PCR, Western-blot); c) ich wpływu na adhezję, migrację i inwazję komórkową ccrcc (testy na liniach komórkowych) 1. Materiał. Materiał do badań będą stanowiły: a) pobrane za zgoda Komisji Bioetycznej wycinki guzów ccrcc (n=30), scharakteryzowane pod względem histopatologicznym oraz odpowiadające im 5

6 wycinki kontrolne, pobrane z przeciwległego bieguna nerki, nienacieczone nowotworowo; b) nerkowe linie komórkowe (prawidłowe kanaliki proksymalne oraz linie wyprowadzone z ccrcc). 2. Izolacja RNA. Izolacja RNA będzie wykonywana za pomocą zestawów mircury RNA Isolation Kit Tissue (Exiqon), zgodnie z instrukcją producenta. 3. Izolacja białka będzie wykonywana zgodnie z wcześniej opisanym protokołem (Piekiełko- Witkowska i wsp., 2010) lub za pomocą zestawów do frakcjonowania białek (ProteoExtract Subcellular Proteome Extraction Kit, Merck-Chemicals). 4. Analiza poziomu ekspresji na poziomie RNA/mikroRNA będzie wykonywana za pomocą odpowiednich sond i gotowych zestawów odczynnikowych zawierających polimerazę hot start. Wyniki analizy będą normalizowane względem ekspresji genów referencyjnych wybranych za pomocą NormFinder. 5. Praca z liniami komórkowymi. Linie komórkowe wywodzące się z ccrcc (Caki-2, UOK-171, KIJ-256T, KIJ-308T) będą hodowane zgodnie z zaleceniami dostawcy linii. Wybór konkretnych linii do wyciszania/nadekspresji będzie poprzedzony analizą poziomu ekspresji wybranych genów, celem wyboru linii, których profil natywnej ekspresji pozwoli na uzyskanie najlepszych wyników zmian ekspresji indukowanych transfekcją. Celem indukowania zmian ekspresji wytypowanych mikrorna wykorzystane zostaną mirvana mirna mimic 5nm, mirvana mirna inhibitors, mirvana mirna Inhibitor Negative Control (Life Technologies) i mirna Mimic Negative Control. Transfekcja będzie przeprowadzana za pomocą Lipofectamine 2000 (Life Technologies). Testy adhezji, migracji i inwazji będą przeprowadzane za pomocą ECM Cell Adhesion Array Kit (Millipore), Radius 24 well cell migration assay (Cell Biolabs) i (QCM ECMatrix Cell Invasion Assay (Millipore) na liniach komórkowych transfekowanych z indukowaną zmianą ekspresji wybranych mirna lub kontrolnych prekursorów (tzw. mirna mimic negative controls). 6. Klonowanie wybranych rejonów 3'UTR cząsteczek adhezyjnych będzie prowadzone z wykorzystaniem PCR, wektorów pgemt-easy i pmirglo Dual-Luciferase mirna Target Expression Vector (Promega). Uzyskane konstrukty zostaną wykorzystane w testach wpływu mikrorna na poziom ekspresji w systemie lucyferazowym. 7. Analiza statystyczna: Analiza statystyczna będzie wykonywana z pomocą programu GraphPad Prism 5. Rozkład normalny będzie sprawdzany za pomocą testu D Agostino i Pearsona. W zależności od wyników testu badającego rozkład normalny, będą wykonywane analizy za pomocą testu t bądź testu U Mann-Whitney a. W przypadku analizy par wiązanych będzie wykorzystywany 6

7 test t dla par wiązanych lub test par Wilcoxona (dla danych nieparametrycznych). Analiza korelacji będzie określana za pomocą współczynnika korelacji Pearsona (dla danych z rozkładu normalnego) lub współczynnika korelacji rang Spearmana (dla danych nieparametrycznych). Obserwacje odstające będą identyfikowane za pomocą testu Grubbsa. Wyniki testów lucyferazowych będą analizowane za pomocą testu ANOVA w powiązaniu z testem Dunnetta. p<0.05 będzie uznawane za statystycznie istotne. Spodziewane wyniki i znaczenie projektu: Oczekujemy, że zidentyfikowane zostaną cząsteczki mikrorna: a) wpływające na ekspresję genów związanych z adhezją komórkową, których ekspresja jest zmieniona w ccrcc b) wpływające na adhezję, migrację i inwazję ccrcc Biorąc pod uwagę rolę cząsteczek CAM i ECM w inwazji nowotworowej oraz rolę mikrorna jako potencjalnych cząsteczek terapeutycznych, wyniki projektu będą mogły stanowić podstawę dalszych badań, już o charakterze aplikacyjnym. Wyniki projektu będą też stanowiły podstawę do badań nad rolą zidentyfikowanych cząsteczek mikrorna w innych typach nowotworów. Wyniki projektu będą prezentowane w postaci abstraktów konferencyjnych w Polsce i zagranicą, oraz w formie artykułów naukowych publikowanych w pismach o możliwie najwyższych współczynniku IF. Piśmiennictwo: Allory Y, Matsuoka Y, Bazille C, Christensen EI, Ronco P, Debiec H. Clin Cancer Res Feb 1;11(3): The L1 cell adhesion molecule is induced in renal cancer cells and correlates with metastasis in clear cell carcinomas. Blaschke S, Mueller CA, Markovic-Lipkovski J, Puch S, Miosge N, Becker V, Mueller GA, Klein G. Int J Cancer Oct 1;101(4): Expression of cadherin-8 in renal cell carcinoma and fetal kidney. Boguslawska J, Wojcicka A, Piekielko-Witkowska A, Master A, Nauman A. PLoS One. 2011;6(9):e MiR-224 targets the 3'UTR of type 1 5'-iodothyronine deiodinase possibly contributing to tissue hypothyroidism in renal cancer. Doberstein K, Wieland A, Lee SB, Blaheta RA, Wedel S, Moch H, Schraml P, Pfeilschifter J, Kristiansen G, Gutwein P. Carcinogenesis Mar;32(3): Epub 2010 Nov 19. L1-CAM expression in ccrcc correlates with shorter patients survival times and confers chemoresistance in renal cell carcinoma cells. Heinzelmann J, Henning B, Sanjmyatav J, Posorski N, Steiner T, Wunderlich H, Gajda MR, Junker K. World J Urol (3):

8 Katagiri A, Watanabe R, Tomita Y. Br J Cancer Feb;71(2): E-cadherin expression in renal cell cancer and its significance in metastasis and survival. Krzakowski M (ed.). Zalecenia postępowania diagnostyczno-terapeutycznego w nowotworach złożliwych u dorosłych, rozdział "Nowotwory układu moczowo-płciowego", Polska Unia Onkologii, 2004 Langner C, Ratschek M, Rehak P, Schips L, Zigeuner R. Mod Pathol Feb;17(2): Expression of MUC1 (EMA) and E-cadherin in renal cell carcinoma: a systematic immunohistochemical analysis of 188 cases. McSherry EA, Brennan K, Hudson L, Hill AD, Hopkins AM. Breast Cancer Res Mar 23;13(2):R31.Breast cancer cell migration is regulated through junctional adhesion molecule-a-mediated activation of Rap1 GTPase. Okegawa T, Li Y, Pong RC, Hsieh JT. J Urol Apr;167(4): Cell adhesion proteins as tumor suppressors. Paul R, Ewing CM, Robinson JC, Marshall FF, Johnson KR, Wheelock MJ, Isaacs WB. Cancer Res Jul 1;57(13): Cadherin-6, a cell adhesion molecule specifically expressed in the proximal renal tubule and renal cell carcinoma. Piekielko-Witkowska A, Wiszomirska H, Wojcicka A, Poplawski P, Boguslawska J, Tanski Z, Nauman A. Disturbed expression of splicing factors in renal cancer affects alternative splicing of apoptosis regulators, oncogenes, and tumor suppressors. PLoS One Oct 27;5(10):e Shimazui T, Oosterwijk E, Akaza H, Bringuier P, Ruijter E, van Berkel H, Wakka JO, van Bokhoven A, Debruyne FM, Schalken JA. Clin Cancer Res Oct;4(10): Expression of cadherin-6 as a novel diagnostic tool to predict prognosis of patients with E-cadherin-absent renal cell carcinoma. Shioi K, Komiya A, Hattori K, Huang Y, Sano F, Murakami T, Nakaigawa N, Kishida T, Kubota Y, Nagashima Y, Yao M. Vascular cell adhesion molecule 1 predicts cancer-free survival in clear cell renal carcinoma patients. Clin Cancer Res Dec 15;12(24): Slaby O, Redova M, Poprach A, Nekvindova J, Iliev R, Radova L, Lakomy R, Svoboda M, Vyzula R. Genes Chromosomes Cancer (7): Slaton JW, Inoue K, Perrotte P, El-Naggar AK, Swanson DA, Fidler IJ, Dinney CP. Am J Pathol Feb;158(2): Expression levels of genes that regulate metastasis and angiogenesis correlate with advanced pathological stage of renal cell carcinoma. Thedieck C, Kuczyk M, Klingel K, Steiert I, Müller CA, Klein G. Expression of Ksp-cadherin during kidney development and in renal cell carcinoma. Br J Cancer Jun 6;92(11): Wahid F, Shehzad A, Khan T, Kim YY. MicroRNAs: synthesis, mechanism, function, and recent clinical trials. Biochim Biophys Acta. 2010; 1803(11):