Acta Haematologica Polonica Original Article 2006, 37, Nr 3 str

Transkrypt

1 PRACA ORYGINALNA Acta Haematologica Polonica Original Article 2006, 37, Nr 3 str KATARZYNA KAPELKO-SŁOWIK 1, EWA SOWIŃSKA 1, DARIUSZ WOŁOWIEC 1, BOŻENA JAŹWIEC 1, MIROSŁAW SŁOWIK 2, DONATA URBANIAK-KUJDA 1, STANISŁAW POTOCZEK 1, LIDIA CISZAK 3, KAZIMIERZ KULICZKOWSKI 1 Ocena surowiczego stężenia rozpuszczalnej E-kadheryny (se-kadheryny) i ekspresji β-kateniny na komórkach białaczkowych u pacjentów z ostrą białaczką szpikową (OBS) Serum concentration of soluble E-cadherin (se-cadherin) and β-catenin expression in leukemic cells in acute myeloblastic leukemia (AML) patients 1 Katedra i Klinika Hematologii, Nowotworów Krwi i Transplantacji Szpiku AM we Wrocławiu Kierownik: Prof. dr hab. med. K. Kuliczkowski 2 Katedra i Klinika Okulistyki Akademii Medycznej we Wrocławiu Kierownik: Prof. dr hab. med. M. Niżankowska 3 Laboratorium Immunopatologii Instytutu Immunologii i Terapii Doświadczalnej PAN we Wrocławiu Kierownik: Prof. dr hab. med. I. Frydecka SŁOWA KLUCZOWE: se-kadheryna β-katenina Ostra białaczka szpikowa KEY WORDS: se cadherin β-catenin Acute myeloblastic leukemia STRESZCZENIE: Transformacja nowotworowa jest między innymi związana z zaburzeniami funkcjonowania struktur wewnątrzkomórkowych, które warunkują zależną od adhezji sygnalizację. Ważną rolę odgrywają tu cząsteczki: E-kadheryna i β-katenina. Celem pracy było zbadanie surowiczego stężenia rozpuszczalnej formy kadheryny E (se-kadheryna) oraz ekspresji β-kateniny w komórkach białaczkowych chorych z OBS i ocena znaczenia rokowniczego tych parametrów. Wykazaliśmy, że stężenie se-kadheryny w surowicy było na początku choroby podwyższone, a odsetek komórek białaczkowych wykazujących ekspresję β-kateniny był wyższy u chorych na OBS, którzy nie osiągnęli remisji całkowitej (CR) niż u pacjentów z CR. Stwierdziliśmy dodatnią korelację między stężeniem se-kadheryny w surowicy a ekspresją β-kateniny w komórkach białaczkowych oraz pomiędzy wiekiem pacjentów a stężeniem se-kadheryny w surowicy. Z naszych badań wynika, że ocena surowiczego stężenia se-kadheryny i ekspresji β-kateniny w komórkach białaczkowych mogą być dodatkowymi czynnikami rokowniczymi w OBS. SUMMARY: A tumour transformation is associated with disorders of intracellular structures function, ivolving adhesion-dependent signalization, in which such particles as E-cadherin and β-catenin play an important role. The aims of our study were examination of soluble E-cadherin (se-cadherin) serum concentrations comparison in acute myeloblastic leukemia patients (AML)

2 96 K. KAPELKO-SŁOWIK i wsp. and in controls, and estimation of se-cadherin serum concentration and β-catenin expression in leukemic cells of AML patients at the time of diagnosis. We found that se-cadherin serum concentration and β-catenin expression in leukemic cells were higher in AML patients with primary resistance to chemotherapy than in AML patients with complete remission. We also observed a positive correlation between se-cadherin serum concentration and β-catenin expression in leukemic cells in AML patients, and between patients age and se-cadherin serum concentration. In conclusion, high se-cadherin serum concentration and increased β-catenin expression in leukemic cells could be used as additional prognostic markers in AML. WSTĘP Transformacja nowotworowa komórki, a szczególnie rozwój i przerzutowanie nowotworów jest między innymi związana z zaburzeniami adhezji międzykomórkowej i zależnymi od niej zjawiskami przekazywania sygnałów. Istotną rolę w tym procesie odgrywają cząsteczki adhezyjne - kadheryny, uczestniczące w adhezji międzykomórkowej. Jedną z nich jest E-kadheryna, nazywana też uvomoruliną lub Cell-CAM120/80 (1, 2). Jest to białko transbłonowe uczestniczące, na drodze zależnej od jonów wapnia, w adhezji międzykomórkowej nabłonka. Jego rozpuszczalną formę (se-kadheryna), powstającą drogą proteolitycznej degradacji cząsteczek związanych z błoną komórkową, wykrywa się w płynach ustrojowych, m.in. w płynie otrzewnowymi i surowicy. Do najważniejszych regulatorów aktywności kadheryn należy β-katenina, zlokalizowana w cytoplazmie i błonie komórkowej. Została ona po raz pierwszy opisana jako białko związane z domeną wewnątrzkomórkową E-kadheryny. β-katenina jest białkiem uczestniczącym nie tylko w adhezji międzykomórkowej, ale także w regulacji ekspresji wielu genów uczestniczących w proliferacji i przeżyciu komórek, jak cyklina D1 i c-myc (3, 4, 5) W szczególności odgrywa ona kluczową rolę w szlaku przewodzenia sygnałów zapoczątkowanym przez białka WNT (6). Rola E-kadheryny, nazywanej także genem supresorowym przerzutowania, oraz β-kateniny w rozwoju i progresji nowotworów, była przedmiotem licznych badań wykonanych głównie na guzach litych. Pomimo, że obniżenie ekspresji E-kadheryny może być związane z progresją nowotworów pochodzenia nabłonkowego, to wykazano, że w niektórych nowotworach między innymi w raku płuca, żołądka, wątroby i prostaty, wysokie surowicze stężenie jej rozpuszczalnej postaci korelowało ze znacznym zaawansowaniem choroby i krótkim czasem przeżycia (7, 8, 9, 10). W komórkach zwierzęcych nowotworów nabłonkowych stwierdzono też podwyższenie ekspresji β- kateniny (11). Niewiele badań poświęcono roli kadheryny E i β-kateniny w ostrych białaczkach. Wiadomo, że kadheryna E odgrywa rolę nie tylko w adhezji komórek nabłonkowych, ale jest obecna w prawidłowym szpiku kostnym na komórkach macierzystych CD34 +, komórkach prekursorowych erytropoezy oraz na komórkach podścieliska. Jej gen występuje w formie nie metylowanej w prawidłowych komórkach szpiku kostnego oraz w jednojądrzastych komórkach krwi obwodowej, natomiast u części pacjentów z ostrymi białaczkami i przewlekłą białaczką limfocytową dochodzi do jego metylacji z następowym obniżeniem lub całkowitym brakiem ekspresji (12, 13). Podwyższoną eks-

3 Ocena surowiczego se-kadheryny i ekspresji β-kateniny 97 presję β-kateniny stwierdzono natomiast w komórkach kilku linii białaczkowych (Jurkat, K562, Hut-102). Zablokowanie szlaku sygnalizacji jądrowej β-kateniny powodowało obniżenie proliferacji i klonogenności komórek Jurkat i zwiększało ich apoptozę zależną od receptora Fas (14). Pomimo tych danych wskazujących na udział zaburzeń regulacji ekspresji E-kadheryny i β-kateniny w rozrostach układu krwiotwórczego, nie zostało dotychczas zbadane ich znaczenie rokownicze w ostrych białaczkach. W związku z tym celem naszych badań była ocena surowiczego stężenia se-kadheryny oraz ekspresji β-kateniny w komórkach białaczkowych u chorych na ostrą białaczkę szpikową w chwili rozpoznania choroby, ich związek z niektórymi parametrami klinicznymi pacjentów oraz z wynikami leczenia indukującego remisję. MATERIAŁ I METODY Badania przeprowadzono u 48 chorych (21 mężczyzn i 27 kobiet), w wieku od 20 do 79 lat (x = 42, SD=15,08). ze świeżo rozpoznaną ostrą białaczką szpikową (OBS), leczonych w Klinice Hematologii, Nowotworów Krwi i Transplantacji Szpiku Akademii Medycznej we Wrocławiu. Zgodnie z klasyfikacją według French American-British (FAB) 1 chory reprezentował podtyp M0, po 10 pacjentów M1 i M2, 1 pacjent M3, 17 chorych M4, 6 chorych M5 oraz 3 pacjentów M6. Odsetek komórek białaczkowych w szpiku w momencie rozpoznania u pacjentów wahał się od 29 do 97% (x = 67,5, SD = 18,91). W chwili rozpoznania liczba leukocytów (WBC) wahała się od 1,3 do 101,8 G/l (x = 34,7, SD = 27,4), płytek krwi od 7 do 131 G/l (x = 69, SD = 87,6) a stężenie hemoglobiny od 7,2 do 11,3 g/% (x = 9,25, SD = 2,9). Pacjenci byli poddani terapii według programu PALG (Polish Acute Leukemia Group). Remisję całkowitą choroby (CR) uzyskało 16 (33%) pacjentów, a 32 (67%) osoby nie odpowiedziało na leczenie cytostatyczne. Grupę kontrolną stanowiło 12 pacjentów Kliniki Okulistyki Akademii Medycznej we Wrocławiu, którzy wiekiem i płcią odpowiadali badanej populacji, i u których nie występowały zaburzenia hematologiczne, miejscowe lub ogólnoustrojowe choroby zapalne ani choroby nowotworowe. Materiał do badań stanowił szpik kostny i heparynizowane osocze, pobrane przy rozpoznaniu. W grupie kontrolnej nie oceniano szpiku kostnego. Stężenie se-kadheryny w surowicy było oznaczone metodą ELISA (se- Cadherin ELISA kit, R&D) i wyrażone w ng/ml. Wewnątrzkomórkowa ekspresja β-kateniny w komórkach białaczkowych była oceniana na preparatach cytospinowych metodą immunocytochemiczną przy użyciu przeciwciał anty-β-kateninowych i reporterowych. (Santa Cruz i DAKO). Odsetek komórek pozytywnych był oceniany na 200 komórek przy użyciu mikroskopu fluorescencyjnego. Analiza statystyczna została przeprowadzona przy użyciu testu U Manna-Whitneya dla zmiennych niezależnych i test kolejności par Wilcoxona dla zmiennych zależnych. Korelacje cząstkowe między badanymi zmiennymi sprawdzono przez przeprowadzenie testu korelacji rang Spearmana. Ponadto wykreślono korelacyjne wykresy rozrzutu z 95% przedziałem ufności i proste regresji.

4 98 K. KAPELKO-SŁOWIK i wsp. WYNIKI Średnie surowicze stężenie se-kadheryny w grupie wszystkich badanych pacjentów wynosiło 57,9 ± 22,6 ng/ml i nie różniło się istotnie statystycznie od średniego stężenia se-kadheryny w grupie kontrolnej (50,5 ± 8,7ng/ml). W grupie pacjentów, którzy uzyskali CR (n=16) średnie stężenie se-kadheryny było w chwili rozpoznania statystycznie istotnie niższe w porównaniu z pacjentami, którzy nie uzyskali CR (49,8±22,0 ng/ml; 61,9±22,05 ng/ml, p=0,04). Wyniki przedstawiono na rycinie STĘŻENIE S- KADHERYNY E W SUROWICY SERUM S-CADHERIN E CONCENTRATION NON-RESPONDERS COMPLETE REMISSION Odch.standardowe Standard deviation Błąd standardowy Standard error Średnia Mean BADANE GRUPY EXAMINATED GROUPS Ryc. 1. Stężenie se kadheryny w surowicy chorych na ostrą białaczkę szpikową ( OBS ) w momencie rozpoznania w zależności od odpowiedzi na leczenie cytostatyczne (NON-RESPONDERS pacjenci, którzy nie uzyskali remisji całkowitej, COMPLETE REMISSION pacjenci, którzy uzyskali remisję całkowitą) (p = 0,04) Fig. 1. Serum se cadherin concentrations at the time of diagnosis in acute myeloblastic leukemia (AML) patients according to chemotherapy response ( NON-RESPONDERS patients without complete remission, COMPLETE REMISSION patients with complete remission) (p = 0,04) Średni odsetek komórek białaczkowych wykazujących ekspresję β-kateniny był istotnie statystycznie niższy w grupie chorych, którzy osiągnęli CR w porównaniu z pacjentami, u których leczenie indukujące remisję było nieskuteczne (bez CR) (1,4±1,8%; 8,8 6,2%, p=0,000006). Wyniki przedstawiono na wykresie 2. Nie wykazano istotnych statystycznie różnic zarówno w surowiczym stężeniu se-kadheryny oraz w ekspresji β-kateniny w komórkach białaczkowych pomiędzy poszczególnymi podgrupami OBS wg klasyfikacji FAB oraz w przypadku białaczek wysokiego (HR) oraz standardowego ryzyka (SR). Stężenie se-kadheryny w surowicy dodatnio kore-

5 Ocena surowiczego se-kadheryny i ekspresji β-kateniny 99 EKSPRESJA BETA KATENINY W BLASTACH (%) BETA CATENIN EXPRESSION IN LEUKEMIC CELLS (%) NON-RESPONDERS COMPLETE REMISSION Odch.standardowe Standard deviation Błąd standardowy Standard error Średnia Mean BADANE GRUPY EXAMINATED GROUPS Ryc. 2. Ekspresja beta-kateniny w komórkach białaczkowych w momencie rozpoznania u chorych na ostrą białaczkę szpikową (OBS) w zależności od odpowiedzi na leczenie cytostatyczne (NON-RESPON- DERS pacjenci, którzy nie uzyskali remisji całkowitej, COMPLETE REMISSION pacjenci, którzy uzyskali remisję całkowitą) (p = 0,000006) Fig. 2. Beta-catenin expression in leukemic cells at the time of diagnosis in acute myeloblastic leukemia AML patients according to chemotherapy response (NON-RESPONDERS patients without complete remission, COMPLETE REMISSION patients with complete remission) (p = 0,000006) 26 EKSPRESJA BETA KATENINY W BLASTACH ( % ) BETA CATENIN EXPRESSION IN LEUKEMIC CELLS ( % ) STĘŻENIE S - KADHERYNY E W SUROWICY ( ng/ml) SERUM S-CADHERIN CONCENTRATION ( ng/ml ) Ryc. 3. Korelacja pomiędzy stężeniem se kadheryny w surowicy a ekspresją beta kateniny w komórkach białaczkowych w momencie rozpoznania u chorych na ostrą białaczkę szpikową (OBS) (r = 0,4, p = 0,008). Fig. 3. Correlation between serum se cadherin levels vs beta catenin expression in leukemic cells at the time of diagnosis in acute myeloblastic leukemia (AML) patients (r = 0,4, p = 0,008).

6 100 K. KAPELKO-SŁOWIK i wsp WIEK CHORYCH NA OBS (LATA) AML PATIENTS AGE ( YEARS ) STĘŻENIE S-KADHERYNY E W SUROWICY (ng/ml) W MOMENCIE ROZPOZNANIA SERUM S-CADHERIN E LEVELS (ng/ml ) AT THE TIME OF DIAGNOSIS Ryc. 4. Korelacja pomiędzy stężeniem se kadheryny w surowicy a wiekiem chorych na ostrą białaczkę szpikową (OBS) (r = 0,38, p = 0,007) Fig. 4. Correlation between serum se cadherin levels and acute myeloblastic leukemia (AML) patients age (r = 0,38, p = 0,007) WSTĘPNA LICZBA LEUKOCYTÓW (G/l) WHITE BLOOD CELLS AT THE TIME OF DIAGNOSIS (G/l) EKSPRESJA BETA KATENINY W BLASTACH (%) BETA CATENIN EXPRESSION IN LEUKEMIC CELLS ( % ) Regresja(Regrresion) 95% int.confidence Ryc. 5. Korelacja pomiędzy ekspresją beta-kateniny w komórkach białaczkowych i wstępną leukocytozą u chorych na ostrą białaczkę szpikową (OBS) (r = 0,39, p = 0,006)

7 Ocena surowiczego se-kadheryny i ekspresji β-kateniny 101 Fig. 5. Correlation between beta-catenin expression in leukemic cells and white blood cells number at the time of diagnosis in acute myeloblastic leukemia (AML) patients (r = 0,39, p = 0,006) lowało z ekspresją β-kateniny w komórkach białaczkowych oraz wiekiem pacjentów chorych na z OBS, odpowiednio: r=0,4, p=0,08 (wykres 3) oraz r=0,38, p=0,007 (wykres 4). Ponadto ekspresja β-kateniny w komórkach białaczkowych dodatnio korelowała z liczbą WBC we krwi obwodowej przy rozpoznaniu: r=0,38, p=0,006 (wykres 5). Nie wykazano korelacji pomiędzy ekspresją β-kateniny w komórkach białaczkowych oraz surowiczym stężeniem se-kadheryny a liczbą komórek białaczkowych w szpiku, stężeniem hemoglobiny i liczbą płytek krwi. OMÓWIENIE WYNIKÓW Zainteresowanie E-kadheryną w chorobach nowotworowych wynika z jej roli w adhezji komórkowej, zjawiska istotnego w progresji nowotworu i jego przerzutowaniu. Z tego też względu dotychczasowe badania skupiły się na guzach litych. Na udział tej cząsteczki adhezyjnej w patogenezie białaczek może wskazywać obserwacja, że jej gen ulega metylacji z następowym unieczynnieniem u niektórych chorych na OBS i przewlekłą białaczkę limfocytową, jednak implikacje kliniczne tych zjawisk nie są znane. Dlatego celem niniejszych badań była ocena znaczenia rokowniczego surowiczego stężenia se-kadheryny i ekspresji β-kateniny w komórkach białaczkowych pacjentów chorych na OBS. Stwierdziliśmy, że pomimo iż surowicze stężenie se-kadheryny nie różni się istotnie u chorych na OBS i w grupie kontrolnej, to jednak jest ono niższe u tych chorych u których uzyskano remisję całkowitą w porównaniu z grupą w której indukcja remisji była nieskuteczna. Podobną współzależność z wynikiem leczenia wykazano dla ekspresji β-kateniny w komórkach białaczkowych. Obserwacje te wskazują, że zarówno surowicze stężenie se-kadheryny jak i komórkowa ekspresja β- kateniny, kluczowego regulatora aktywności tej molekuły adhezyjnej, mają niekorzystne znaczenie rokownicze co do wyniku leczenia indukującego remisję całkowitą w OBS. Przyczyna takiego zróżnicowania surowiczego poziomu se-kadheryny oraz komórkowej ekspresji β-kateniny w grupie badanych pacjentów nie jest jasna, wydaje się jednak możliwe że u jej podłoża leży obniżona ekspresja odpowiednich genów w komórkach białaczkowych, co w przypadku genu dla E-kadheryny było już opisywane przez innych autorów. Nie można co prawda wykluczyć że oceniana przez nas krążąca w surowicy rozpuszczalna postać E-kadheryny (se-kadheryna) pochodzi również z innych komórek niż białaczkowe, na co może wskazywać nieobecność zależności pomiędzy jej stężeniem a odsetkiem blastów w mielogramie. Zwraca jednak uwagę stwierdzona przez nas korelacja pomiędzy poziomem krążącej se-kadheryny a komórkową ekspresją β-kateniny w komórkach białaczkowych szpiku, a więc czynników będących dwoma ogniwami tego samego szlaku przewodzenia sygnałów. Sugeruje to możliwość, że wykazana zaburzona ekspresja β-kateniny w komórkach białaczkowych pozostaje w związku z zaburzeniami syntezy i wydzielania do surowicy także i E-kadheryny.

8 102 K. KAPELKO-SŁOWIK i wsp. Nie jest również jasne, dlaczego podwyższone stężenie surowicze E-kadheryny, białka określanego również jako gen supresorowy przerzutowania, ma niekorzystne znaczenie rokownicze w ostrych białaczkach, podobnie jak to zostało wykazane również w niektórych guzach litych (7, 8, 9, 10). Obserwacja, że zablokowanie szlaku sygnalizacji jądrowej β-kateniny powoduje obniżenie proliferacji i klonogenności komórek Jurkat i zwiększa ich apoptozę wywołaną za pośrednictwem receptora Fas może sugerować, że zaburzenia szlaku sygnalizacji E-kadheryna - β-katenina wzmacniają działanie leków cytostatycznych kierujących komórki nowotworowe na drogę apoptozy (14). Omawiając zaobserwowane przez nas znaczenie rokownicze stężenia se-kadheryny i ekspresji β-kateniny należy uwzględnić wykazaną równocześnie korelację tych wskaźników odpowiednio z wiekiem pacjentów i liczbą leukocytów przy rozpoznaniu co również może mieć wpływ na wynik leczenia indukującego remisję. Podsumowując, nasze badania wskazują, że zarówno podwyższone surowicze stężenie se- -kadheryny, jak i zwiększona komórkowa ekspresja β-kateniny, zmniejszają prawdopodobieństwo korzystnej odpowiedzi na leczenie indukujące remisję w OBS. Ponadto, dodatnia korelacja pomiędzy tymi parametrami sugeruje, że w ostrych białaczkach może dochodzić do zaburzeń kilku ogniw szlaku przewodzenia sygnałów inicjowanego przez E-kadherynę. Wskazuje to na celowość dalszych badań podstawowych jak i klinicznych nad rolą tych cząsteczek w patogenezie ostrych białaczek i ich znaczeniem klinicznym. PIŚMIENNICTWO 1. Paul R, Ewing CM, Jarrard DF.i wsp.: The cadherin cell cell adhesion patway in prostate cancer progression. Br J Urol. 1997; 79: Wijnhoven BP, Pignatelli M. E-Cadherin catenin : more than a sticky molecular complex. Lancet. 1999; 354: Wheelock MJ, Buch CA, Bechtol KB i wsp.: Soluble 80 kd fragment of cell CAM 120/80 disrupts cell-cell adhesion. J. Cell. Biochem. 1987; 34: Connacci-Sorrell M, Zhurinsky J, Ben-Zeev A. The cadherin-catenin adhesion system in signaling and cancer. J.Clin. Inv. 2002; 109: 8, Polakis P. Wnt signaling and cancer. Genes. Dev. 2000; 14: Willert K, Nusse R. β-catenin: a key mediator of Wnt signaling.current Opinion. Genes. Dev. 1998; 8: Bussemakers MJG, Van Moorselaar RJA, Giroldi LA i wsp.: Decreased expression of E-cadherin in the progression of rat prostatic cancer. Cancer Res. 1992; 52: Shimoyama Y, Hirohashi S, Hirano S. i wsp.: Cadherin cell-adhesion molecules in human epithelial tissues and carcinomas. Cancer Res.1989; 49: Shimoyama Y, Hirohashi S. Expression of E- and P- cadherin in gastric carcinomas. Cancer Res. 1991, 51, Katayama M, Hirai S, Kamihagi K i wsp.: Soluble E-cadherin fragments increased in circulation of cancer patients. Br. J. Cancer. 1994; 69: Morin P.J. β-catenin signaling and cancer. Bioassays. 1999; 21:

9 Ocena surowiczego se-kadheryny i ekspresji β-kateniny Corn P, Smith B, Ruckdeschel E i wsp.: E-cadherin expression is silenced by 5 CpG island methyletion in aute leukemia. Clin. Can. Res. 2000; 6: Melki J, Vincent P, Brown R i wsp.: Hypermethylation of E-cadherin in leukemia. Blood 2000; 95: 10, Chung E, Sang-Gu H, Nguyen P i wsp.: Regulation of leukemic cell adhesion, proliferation and survival by β-catenin. Blood 2002; 100: Praca wpłynęła do Redakcji r. i została zakwalifikowana do druku r. Adres do korespondencji: Dr med. Katarzyna Kapelko-Słowik Katedra i Klinika Hematologii, Nowotworów Krwi i Transplantacji Szpiku Akademii Medycznej we Wrocławiu ul. Pasteura Wrocław tel. (071)