PL B1. Sposób wytwarzania soli heparyny drobnocząsteczkowej z soli heparyny wysokocząsteczkowej

Transkrypt

1 PL B1 RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) OPIS PATENTOWY (19) PL (11) (13) B1 (21) Numer zgłoszenia: (51) Int.Cl. C08B 37/10 ( ) Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (22) Data zgłoszenia: (54) Sposób wytwarzania soli heparyny drobnocząsteczkowej z soli heparyny wysokocząsteczkowej (43) Zgłoszenie ogłoszono: BUP 11/12 (45) O udzieleniu patentu ogłoszono: WUP 08/13 (73) Uprawniony z patentu: INSTYTUT CHEMII PRZEMYSŁOWEJ IM. PROF. IGNACEGO MOŚCICKIEGO, Warszawa, PL (72) Twórca(y) wynalazku: RYSZARD HEROPOLITAŃSKI, Warszawa, PL IRENA GRZYWA-NIKSIŃSKA, Warszawa, PL MAŁGORZATA MACHAŁOWSKA, Warszawa, PL (74) Pełnomocnik: rzecz. pat. Jolanta Rosińska

2 2 PL B1 Opis wynalazku Wynalazek dotyczy sposobu wytwarzania soli heparyny drobnocząsteczkowej z soli heparyny wysokocząsteczkowej. Heparyna jest produktem naturalnym otrzymywanym najczęściej z płuc zwierzęcych lub ze śluzu jelitowego metodą ekstrakcji i dalszego przerobu. Chemicznie jest sulfonowanym mukopolisacharydem o średniej masie cząsteczkowej tysięcy. Cechą charakterystyczną heparyny jest obecność siarki, która występuje jako ugrupowanie sulfoamidowe lub jako ester kwasu siarkowego. Posiada ona silnie ujemny ładunek elektryczny dzięki czemu jest zdolna do tworzenia kompleksów z niektórymi białkami, szczególnie protaminą, czwartorzędowymi solami amoniowymi, aminami alifatycznymi i aromatycznymi. Heparyna znajduje szerokie zastosowanie w lecznictwie, diagnostyce, analizach chemicznych oraz do sztucznej hodowli tkanek. Najważniejszym jej zastosowaniem jest wykorzystywanie właściwości obniżania krzepliwości krwi. Stosowana jest leczniczo i zapobiegawczo w chorobach zakrzepowo-zatorowych, zatorach i zakrzepach tętniczych i żylno-mięśniowych, w stanach przedzawałowych i zawałowych. Działanie heparyny polega głównie na kompleksowaniu antytrombiny III, głównego inhibitora układu krzepnięcia. W mniejszym stopniu kompleksuje także inne proteazy osoczowe układu krzepnięcia. Do niedawna w medycynie stosowana była głównie heparyna wysokocząsteczkowa, wydzielana i oczyszczana z organów zwierzęcych. Heparyna taka wykazuje wszelkie właściwości opisane wyżej. Jej wadą jest to, że można ją aplikować wyłącznie w postaci kroplówek dożylnych. Ostatnio stosuje się coraz częściej heparynę o niskim ciężarze cząsteczkowym tzw. heparynę drobnocząsteczkową. Obecnie dostępna jest heparyna drobnocząsteczkowa o masie cząsteczkowej Heparyna ta, poza właściwościami zwykłej heparyny wysokocząsteczkowej posiada dodatkową zaletę, że można ją aplikować podskórnie lub domięśniowo. Z uwagi na dość niski ciężar cząsteczkowy, a w związku z tym i mniejszą wielkość cząsteczki, łatwo wchłania się i wykazuje szerokie działanie. Heparynę drobnocząsteczkową uzyskuje się z heparyny wielkocząsteczkowej metodą hydrolizy. Obecnie znanych jest kilka metod hydrolizy heparyny. Najczęściej stosowaną jest metoda hydrolizy kwaśnej przy użyciu do tego celu silnych kwasów nieorganicznych, jak siarkowy, solny, azotowy (III), przez ogrzewanie wodnych roztworów heparyny z dodatkiem tych kwasów. Inna metoda polega na prowadzeniu hydrolizy enzymatycznej. Metody te dają pozytywne wyniki jednakże wydajność uzyskania heparyny drobnocząsteczkowej tymi metodami jest niska. Powstaje szereg nieaktywnych produktów ubocznych. Stąd cena rynkowa obecnie produkowanej heparyny drobnocząsteczkowej jest wysoka. Heparyna występuje w obrocie i jest stosowana jako sól, przede wszystkim sodowa, czasem sól wapniowa lub potasowa. W formie soli heparyna ma zablokowane silnie kwaśne grupy SO 3 H. Sposób według wynalazku polega na tym, że wysokocząsteczkową heparynę w formie soli przeprowadza się w wysokocząsteczkową heparynę z wolnymi grupami kwasowymi, uzyskując wolny kwas heparynowy, który, jak stwierdzono, w odpowiednich warunkach ulega autohydrolizie. W wyniku autohydrolizy uzyskuje się heparynę drobnocząsteczkową o dowolnej masie cząsteczkowej od Sposób wytwarzania soli heparyny drobnocząsteczkowej z soli heparyny wysokocząsteczkowej według wynalazku polega na tym, że wysokocząsteczkową sól heparyny po rozpuszczeniu w wodzie zakwasza się silnym kwasem nieorganicznym, zwłaszcza kwasem siarkowym lub solnym, i z roztworu wytrąca się wysokocząsteczkowy kwas heparynowy przez dodanie rozpuszczalnika organicznego z grupy alkoholi alifatycznych C 1 -C 3 lub acetonu, następnie z otrzymanego wysokocząsteczkowego kwasu heparynowego przygotowuje się roztwór wodny, z którego korzystnie przez ogrzewanie do temperatury nie przekraczającej 95 C, uzyskuje się hydrolizat wykazujący spadek lepkości powyżej 30% w stosunku do wyjściowej lepkości roztworu wysokocząsteczkowego kwasu heparynowego, po czym, po jego zalkalizowaniu, wytrąca się frakcje soli heparyny drobnocząsteczkowej o zróżnicowanej masie cząsteczkowej przez dodawanie do hydrolizatu kolejnych porcji rozpuszczalnika organicznego z grupy alkoholi alifatycznych C 1 -C 3 lub acetonu. Korzystnie stosuje się sól sodową, potasową lub wapniową heparyny wysokocząsteczkowej. Korzystnie roztwór wodny soli heparyny wysokocząsteczkowej zakwasza się do ph poniżej 5, najkorzystniej do ph = 1-2. Korzystnie wysokocząsteczkowy kwas heparynowy wytrąca się przez dodanie metanolu lub etanolu. Korzystnie roztwór kwasu heparynowego poddawany hydrolizie ma stężenie powyżej 10% wagowych.

3 PL B1 3 Korzystnie roztwór wodny wysokocząsteczkowego kwasu heparynowego ogrzewa się do temperatury C. Korzystnie hydrolizę wysokocząsteczkowego kwasu heparynowego prowadzi się do uzyskania hydrolizatu wykazującego spadek lepkości powyżej 40% w stosunku do wyjściowej lepkości roztworu wysokocząsteczkowego kwasu heparynowego. Korzystnie roztwór zhydrolizowanego kwasu heparynowego, będącego mieszaniną o masie cząsteczkowej od 6500 do 2100, alkalizuje się do ph = 8-9. Korzystnie frakcje soli drobnocząsteczkowej heparyny wytrąca się przez dodawanie metanolu lub etanolu. Korzystnie frakcje heparyny o masie cząsteczkowej powyżej 6500 zawraca się do procesu hydrolizy. Wynalazek polega na nieoczekiwanym stwierdzeniu, że kwas heparynowy w roztworze wodnym ulega autohydrolizie. Silnie kwaśne cząsteczki działają na siebie wzajemnie powodując degradację cząstek. Utrzymując kwas heparynowy w roztworze wodnym można otrzymać hydrolizat o dowolnie małej cząsteczce, przy czym szybkość procesu autohydrolizy, podobnie jak w przypadku większości reakcji, będzie zależała od temperatury i stężenia roztworu. Stwierdzono jednakże, że przy osiągnięciu temperatury około 100 C następuje wyraźna i silna karmelizacja heparyny, która jest mukopolisacharydem, a więc takiej karmelizacji ulega. Aby uzyskać zamierzone wyniki autohydrolizy należy dobrać odpowiednie stężenie wysokocząsteczkowego kwasu heparynowego oraz odpowiednią temperaturę i czas działania. Parametry autohydrolizy powinny być tak dobrane, aby spełniły warunki produkcji opłacalnej. Wytrącony z soli heparyny wysokocząsteczkowej, w pierwszym etapie procesu, wysokocząsteczkowy kwas heparynowy w postaci lepkiej masy, można przemyć dodatkowo czystym alkoholem uzyskując produkt sproszkowany, który, po ewentualnym wysuszeniu, jest produktem wyjściowym do procesu autohydrolizy. Kwas heparynowy w postaci suchej jest stabilny i może być przechowywany kilka miesięcy. W dalszym etapie sposobu według wynalazku suchy lub wilgotny wysokocząsteczkowy kwas heparynowy rozpuszcza się w wodzie i prowadzi proces autohydrolizy korzystnie ogrzewając roztwór. Po przerwaniu procesu hydrolizy roztwór alkalizuje się, najkorzystniej do ph około 7, i prowadzi wytrącanie uzyskanego hydrolizatu. Wytrącanie prowadzi się rozcieńczając roztwór kolejno, coraz większymi ilościami alkoholu. Po wlaniu pierwszej porcji alkoholu na przykład 1:1 następuje wytrącenie heparyny o najwyższym ciężarze cząsteczkowym. Następne porcje alkoholu wytrącają produkt o coraz mniejszym ciężarze. Z wytrąconych wybiera się takie, które odpowiadają zamierzonemu celowi, a pozostałe o wyższym ciężarze można zawrócić jako produkt wyjściowy do następnego cyklu autohydrolizy. Sposób według wynalazku (autohydroliza heparyny) eliminuje konieczność wprowadzania dodatkowych substancji (katalizatorów) w celu przeprowadzenia hydrolizy heparyny wysokocząsteczkowej. Wynalazek zilustrowano w przykładach realizacji sposobu. P r z y k ł a d 1 W przykładzie użyto sól sodową heparyny uzyskanej metodą ekstrakcji z wieprzowego śluzu jelitowego. Ciężar cząsteczkowy użytej heparyny wynosił 16, Był to produkt suchy o barwie lekko kremowej. 100 g tego produktu rozpuszczono w 500 cm 3 wody destylowanej. Po rozpuszczeniu soli sodowej heparyny powstał klarowny roztwór o barwie lekko słomkowej. Do uzyskanego roztworu w trakcie mieszania wkraplano stężony kwas siarkowy do osiągnięcia ph 1,1-1,3. Po zakwaszeniu, do roztworu, również mieszając dodano alkohol metylowy w ilości 1500 cm 3. Po dodaniu alkoholu, na dnie wytrąca się gęsty osad o konsystencji miodu. Ciecz z nad osadu zdekantowano, a osad przemyto kilkakrotnie czystym alkoholem metylowym. Po przemyciu i roztarciu uzyskano produkt w postaci proszku. Powstały produkt wysuszono w temperaturze 70 C. Uzyskano 83 g wysokocząsteczkowego kwasu heparynowego. 30 g tak otrzymanego kwasu heparynowego rozpuszczono w 150 cm 3 wody destylowanej. Roztwór ten wykazywał barwę 74% transmitancji mierzonej przy długości fali λ=600 na spektrofotometrze. Zawartość suchej masy oznaczono w temperaturze 105 C i wynosiła 17,68%, a lepkość w 20 C 17,4 cp (1 cp = 10-3 Pa s), mierzona lepkościomierzem Brookfielda. Roztwór ten wlano do szczelnie zamkniętego naczynia szklanego i wstawiono do termostatu. Termostat ustawiono na stałą temperaturę 70 C. W odstępach co 60 minut naczynie było mieszane. Proces autohydrolizy kontrolowano mierząc lepkość roztworu w temperaturze 20 C. Lep-

4 4 PL B1 kość, jak wiadomo, jest w dużej mierze wykładnikiem średniego ciężaru cząsteczkowego rozpus z- czonej substancji. Po 24 godzinach lepkość spadła do wielkości 12,9 cp. Mierzono również transm i- tancję, która informowała o postępie karmelizacji. Transmitancja po 24 godzinach wynosiła 73,1%. Roztwór ogrzewano dalej w tej samej temperaturze. Pomiary lepkości i transmitancji dokonywano co 12 godzin. W tabeli 1 przedstawiono wyniki pomiarów. próby Czas grzania godz. Lepkość w 20 C cp* T a b e l a 1 Spadek lepkości Transmitancja %T Spadek barwy , ,9 25,8 73,1 1, ,7 32,7 71,6 3, ,5 39,6 69,1 6, ,6 44,8 67,1 9, , ,8 34, ,86 66,3 48,3 34,7 Po 84 godzinach spadek lepkości wynosił około 66%. Ogrzewanie przerwano i ciecz zalkalizowano 50% roztworem wodorotlenku sodu do ph około 7. Po zalkalizowaniu uzyskano 160 cm 3 cieczy. Z roztworu tego wytrącano selektywnie heparynę o wąskim rozrzucie ciężarów cząsteczkowych. Selektywne wytrącanie uzyskano kolejnym dozowaniem do roztworu coraz większych ilości metanolu. Do 160 cm 3 roztworu po autohydrolizie wlewano kolejno określone porcje metanolu. Wytrąconą heparynę przemywano dwukrotnie niewielkimi ilościami czystego metanolu. Uzyskany produkt po wysuszeniu ważono i oznaczano lepkość 3% roztworu w wodzie destylowanej w temperaturze 20 C. Heparyna wyjściowa, wysokocząsteczkową wykazywała w podobnym badaniu lepkość 17,3 cp. W każdej próbce oznaczano również średni ciężar cząsteczkowy. Analizy wykonano z zastosowaniem techniki SEC-HPLC-RI (size exclusion high performance liquid chromatography with refractive index detection). W tabeli 2 podano wyniki wytrącania drobnocząsteczkowej soli heparyny. Ilość dodawanego metanolu w cm 3 T a b e l a 2 Masa wytrąconej heparyny po wysuszeniu w g Lepkość roztworu w cp* Ciężar cząsteczkowy I ,9502 2, II 160 5,0473 1, III 160 1,4635 1, IV Oddestylowano do sucha 2,1020 1, Po dodaniu trzeciej porcji metanolu zawartość suchej masy w przesączu wynosiła 0,35%. Dalsze wytrącanie heparyny metanolem wymagałoby użycia znacznej jego ilości, ze względu na dość znaczną rozpuszczalność heparyny o bardzo małym ciężarze cząsteczkowym. Cały powstały przesącz oddestylowano do sucha, uzyskując 2,1 g, heparyny podaną w tabeli jako IV. W wyniku próby opisanej w przykładzie uzyskano frakcje heparyny o kilku różnych ciężarach cząsteczkowych, co daje możliwość ich wyboru, stosownie do celu w jakim mają być zastosowane. Uzyskany produkt po wyselekcjonowaniu poddano dodatkowemu oczyszczeniu znanymi sposobami.

5 PL B1 5 P r z y k ł a d 2 W przykładzie użyto wysokocząsteczkowy kwas heparynowy uzyskany z wysokocząsteczkowej soli sodowej heparyny w sposób identyczny jak w przykładzie 1. Dalej przykład prowadzono również identycznie jak w przykładzie 1, z tą różnicą, że roztwór kwasu heparynowego w wodzie ogrzewano w temperaturze 90 C. W tabeli 3 podano parametry i wyniki autohydrolizy według przykładu 2. próby Czas grzania godz. Lepkość w 20 C cp* T a b e l a 3 Spadek lepkości Transmitancja %T Spadek barwy , ,3 40, , ,65 61, , ,48 62,7 39,8 46, ,88 77,7 18,6 74, ,28 81,1 12,2 83,5 W przykładzie tym uzyskano nieco niższą lepkość, jednakże nastąpiło pogorszenie barwy, co świadczy o karmelizacji, w krótszym czasie. Dalsze oczyszczanie uzyskanego preparatu prowadzono znanym sposobem. W tabeli 4 podano wyniki wytrącania drobnocząsteczkowej soli heparyny z przykładu 2. Ilość dodawanego metanolu w cm 3 T a b e l a 4 Masa wytrąconej heparyny po wysuszeniu w g Lepkość roztworu w cp* Ciężar cząsteczkowy I ,2106 2, II 150 3,6870 1, III 150 1,3652 1, IV Oddestylowano do sucha 2,7372 1, Zastrzeżenia patentowe 1. Sposób wytwarzania soli heparyny drobnocząsteczkowej z soli heparyny wysokocząsteczkowej, znamienny tym, że wysokocząsteczkową sól heparyny po rozpuszczeniu w wodzie zakwasza się silnym kwasem nieorganicznym, zwłaszcza kwasem siarkowym lub solnym, i z roztworu wytrąca się wysokocząsteczkowy kwas heparynowy przez dodanie rozpuszczalnika organicznego z grupy alkoholi alifatycznych C 1 -C 3 lub acetonu, następnie z otrzymanego wysokocząsteczkowego kwasu heparynowego przygotowuje się roztwór wodny, z którego, korzystnie przez ogrzewanie do temperatury nie przekraczającej 95 C, uzyskuje się hydrolizat wykazujący spadek lepkości powyżej 30% w stosunku do wyjściowej lepkości roztworu wysokocząsteczkowego kwasu heparynowego, po czym, po jego zalkalizowaniu wytrąca się frakcje soli heparyny drobnocząsteczkowej o zróżnicowanej masie cząsteczkowej przez dodawanie do hydrolizatu kolejnych 2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się sól sodową, potasową lub wapniową heparyny wysokocząsteczkowej.

6 6 PL B1 3. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że roztwór wodny soli heparyny wysokocząsteczkowej zakwasza się do ph poniżej 5, najkorzystniej do ph = Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że wysokocząsteczkowy kwas heparynowy wytrąca się przez dodanie metanolu lub etanolu. 5. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że roztwór kwasu heparynowego poddawany hydrolizie ma stężenie powyżej 10% wagowych. 6. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że roztwór wodny wysokocząsteczkowego kwasu heparynowego ogrzewa się do temperatury C. 7. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że hydrolizę wysokocząsteczkowego kwasu heparynowego prowadzi się do uzyskania hydrolizatu wykazującego spadek lepkości powyżej 40% w stosunku do lepkości wyjściowego roztworu wysokocząsteczkowego kwasu heparynowego. 8. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że roztwór zhydrolizowanego kwasu heparynowego będącego mieszaniną o masie cząsteczkowej od 6500 do 2100 alkalizuje się do ph = Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że frakcje soli drobnocząsteczkowej heparyny wytrąca się przez dodawanie do hydrolizatu metanolu lub etanolu. 10. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że frakcje heparyny o masie cząsteczkowej powyżej 6500 zawraca się do procesu hydrolizy. Departament Wydawnictw UP RP Cena 2,46 zł (w tym 23% VAT)