Metody identyfikacji leśnego materiału rozmnożeniowego w oparciu o markery molekularne DNA

Transkrypt

1 Konferencja szkoleniowa Metody identyfikacji leśnego materiału rozmnożeniowego w oparciu o markery molekularne DNA Organizatorzy: Uniwersytet Kazimierza Wielkiego, Bydgoszcz Instytut Dendrologii PAN, Kórnik Instytut Badawczy Leśnictwa, Warszawa Instytut Badawczy Leśnictwa, Sękocin Stary r. Konferencja szkoleniowa 1

2 Program konferencji: 8.00 Rejestracja uczestników 8.15 Potrzeba badao identyfikacyjnych leśnego materiału rozmnożeniowego - J. Burczyk 8.30 Uwarunkowania prawne dotyczące obrotu leśnym materiałem rozmnożeniowym J. Matras 8.45 Metodyka zbioru materiałów do badao - J. Kowalczyk 9.00 Markery molekularne podstawowe definicje, opis metod laboratoryjnych - A. Jagielska 9.15 Parametry statystyczne wykorzystywane do opisu zmienności genetycznej populacji, ze szczególnym uwzględnieniem problemów identyfikacji osobniczej - I. Chybicki 9.45 Wizyta w laboratorium analiz genetycznych A. Jagielska przerwa (kawa) Podstawowe wyniki badao zmienności genetycznej wybranych gatunków drzew Zmiennośd genetyczna sosny zwyczajnej (Pinus sylvestris L.) w oparciu o wybrane markery DNA - A. Dzialuk Zmiennośd genetyczna świerka pospolitego (Picea abies [L.] Karst.) w oparciu o wybrane markery DNA - A. Dzialuk Zmiennośd genetyczna rodzimych dębów *Quercus petraea (Lieb.), Quercus robur (L.)] w oparciu o wybrane markery DNA - M. Deging Zmiennośd genetyczna buka zwyczajnego (Fagus sylvatica L.) w oparciu o wybrane markery DNA J. Burczyk Tendencje przestrzennego rozkładu zmienności genetycznej badanych gatunków w skali całego kraju I. Chybicki Obiad Przykłady praktycznych zastosowao markerów molekularnych w badaniach identyfikacyjnych Identyfikacja osobnicza Wykorzystanie chloroplastowych sekwencji mikrosatelitarnych do weryfikacji przynależności szczepów do poszczególnych klonów na przykładzie klonalnej plantacji nasiennej sosny zwyczajnej A. Dzialuk Możliwości wykorzystania chloroplastowych sekwencji mikrosatelitarnych sosny zwyczajnej w celu weryfikacji poprawności zbioru nasion z pojedynczych drzew matecznych - A. Dzialuk Przykład wykorzystania chloroplastowych sekwencji mikrosatelitarnych w celu weryfikacji poprawności zbioru nasion przechowywanych w zasobach LBG, pozyskanych z drzew matecznych sosny zwyczajnej - M. Pałucka Możliwości wykorzystania jądrowych sekwencji mikrosatelitarnych do weryfikacji poprawności zbioru nasion z pojedynczych drzew matecznych dębów J. Burczyk Ocena liczby drzew matecznych Ocena liczby drzew matecznych wykorzystanych do pozyskania materiału rozmnożeniowego u sosny zwyczajnej I. Chybicki Identyfikacja populacyjna Możliwości weryfikacji pochodzenia nasion z drzewostanów dębowych w oparciu o markery cytoplazmatyczne J. Burczyk Identyfikacja pochodzenia świerka pospolitego w oparciu o markery cytoplazmatyczne, na przykładzie Nadleśnictwa Gołdap A. Lewandowski Identyfikacja gatunkowa Możliwości identyfikacji gatunków dębów w oparciu o wybrane jądrowe markery mikrosatelitarne I. Chybicki Dyskusja Zakooczenie konferencji Konferencja szkoleniowa 2

3 Informacje o zespole realizującym projekt badawczy: Uniwersytet Kazimierza Wielkiego, Bydgoszcz (jednostka koordynująca) Prof. dr hab. Jarosław Burczyk (kierownik projektu) Dr Igor Chybicki Dr Artur Dzialuk Dr Magdalena Trojankiewicz Mgr Elżbieta Koralewska Mgr Katarzyna Kowalkowska Mgr Ewa Sztupecka Instytut Badawczy Leśnictwa, Warszawa Dr inż. Jan Kowalczyk (koordynator zespołu IBL) Mgr inż. Jan Matras Dr hab. Justyna Nowakowska Dr Małgorzata Sułkowska Jolanta Bieniek Jerzy Przyborowski Instytut Dendrologii PAN, Kórnik Prof. dr hab. Andrzej Lewandowski (koordynator zespołu ID PAN) Dr Monika Dering Mgr Monika Litkowiec Maria Ratajczak Konferencja szkoleniowa 3

4 Potrzeba badao identyfikacyjnych leśnego materiału rozmnożeniowego Jarosław Burczyk Jednym z podstawowych zadao współczesnego leśnictwa jest utrzymanie funkcji produkcyjnej lasów, a także zapewnienie ich trwałości w kontekście zrównoważonego rozwoju. Trwałośd ekosystemów leśnych uwarunkowana jest m.in. zachowaniem różnorodności genetycznej drzew leśnych. Zasoby genowe drzew leśnych stanowią podstawę hodowli lasu oraz utrzymania zdolności adaptacyjnych gatunków, co ma szczególne znaczenie w obliczu rosnącego popytu na drewno oraz zmian globalnych o charakterze klimatycznym i antropopresyjnym. Ochrona leśnych zasobów genowych wymaga stosowania odpowiednich procedur w zakresie wykorzystania leśnego materiału rozmnożeniowego. Ustawa o leśnym materiale rozmnożeniowym (Dz U. Nr 73, poz. 761) reguluje zasady wykorzystania populacji i drzewostanów, jako źródła pozyskania nasion oraz zasady obrotu leśnym materiałem rozmnożeniowym. Tym niemniej, kontrola produkcji materiału rozmnożeniowego począwszy od zbioru nasion do wysadzenia sadzonek z nich otrzymanych dotyczy głównie kontroli administracyjnej od strony dokumentacji, a za naruszenie przepisów ustawy przewidziane są sankcje. Na skutek świadomych działao lub nieświadomych zaniedbao, niezależnie od prowadzonej kontroli administracyjnej, może dojśd do sytuacji, gdy dokumentacja materiału rozmnożeniowego odbiegad będzie od stanu faktycznego (zbiór nasion z niewłaściwych drzew matecznych, nieadekwatna liczba drzew matecznych wykorzystanych do zbioru nasion, itd). Może to w konsekwencji prowadzid do negatywnych zmian genetycznych populacji drzew leśnych, których skutki doświadczad będziemy za wiele lat. Niewłaściwe pozyskanie i oznakowanie materiału rozmnożeniowego jest szczególnie niekorzystne w wypadku tworzenia leśnych banków genów. Współczesna genetyka drzew leśnych pozwala na wykorzystanie wiedzy dotyczącej zmienności genetycznej (zmiennośd DNA) do identyfikacji i badania tożsamości leśnego materiału rozmnożeniowego. Celem projektu badawczego finansowanego przez Dyrekcję Generalną Lasów Paostwowych było opracowanie metodyki analiz laboratoryjnych w oparciu o polimorfizm markerów molekularnych (markery DNA), oraz metodyki analiz statystycznych umożliwiających identyfikację leśnego materiału rozmnożeniowego. Podstawą badao było wstępne rozpoznanie zmienności genetycznej wybranych gatunków drzew leśnych o dużym znaczeniu lasotwórczym (sosna zwyczajna, świerk pospolity, buk zwyczajny, rodzime dęby) oraz dokonanie optymalizacji procedur umożliwiających identyfikację i ocenę LMR. Przeprowadzono szereg badao pilotażowych, z których częśd zaprezentowana jest w ramach niniejszego szkolenia. Wiedza na temat możliwości i metod identyfikacji leśnego materiału rozmnożeniowego będzie szeroko rozpowszechniana wśród jednostek Lasów Paostwowych oraz wśród instytucji, które z uwagi na zaplecze aparaturowe i dotychczasowe doświadczenia w zakresie badao genetyki drzew leśnych będą mogły stosowad w praktyce metody identyfikacji LMR. Opracowane metody identyfikacyjne po ich udoskonaleniu będą mogły byd powszechnie stosowane do identyfikacji LMR. Konferencja szkoleniowa 1

5 Uwarunkowania prawne dotyczące obrotu leśnym materiałem rozmnożeniowym Jan Matras Zasady tworzenia i wykorzystania leśnej bazy nasiennej w Polsce oparte są na dwóch zasadniczych dokumentach: Dyrektywie UE 1999/105/EC o obrocie LMR, Ustawie z dnia 7 czerwca 2001 r. o leśnym materiale rozmnożeniowym. Dyrektywa reguluje obrót leśnym materiałem rozmnożeniowym (LMR) w UE, określa zasady zatwierdzania i selekcji materiału podstawowego oraz produkcji i wprowadzania do obrotu leśnego materiały rozmnożeniowego. Dyrektywa wprowadziła jednolite definicje i klasyfikacje LMR, zobowiązując kraje członkowskie do ich stosowania. W dyrektywie określone zostały rodzaje materiału podstawowego służące do produkcji materiału rozmnożeniowego, a także minimalne wymagania, jakie musi spełniad LMP i LMR. Dyrektywa odnosi się tylko do gatunków, które są wykorzystywane dla celów leśnych. Ponadto Dyrektywa obliguje do wyznaczania regionów pochodzenia (regionów proweniencji) dla materiału podstawowego (LMP) przeznaczonego do produkcji LMR oraz tworzenia map tych regionów w oparciu o granice opisane w prawie. Ustawa z dnia 7 czerwca 2001 r. o leśnym materiale rozmnożeniowym (Dz. U. Nr 73, poz. 761, z 2004 r. Nr 96, poz. 959) oraz przepisy wykonawcze do tej ustawy regulują szczegółowo sprawy związane z pozyskiwaniem, produkcją i obrotem materiału rozmnożeniowego drzew i ich sztucznych krzyżówek, wykorzystywanych w lasach i na gruntach przeznaczonych do zalesienia bez względu na formę ich własności, jej przepisom podlegają osoby fizyczne i prawne oraz jednostki paostwowe nie posiadające osobowości prawnej, prowadzące produkcję w celu wprowadzenia do obrotu i obrót leśnym materiałem rozmnożeniowym. W szczególności ustawa reguluje sprawy: rejestracji leśnego materiału podstawowego, obrotu leśnym materiałem rozmnożeniowym, regionalizacji nasiennej - wyznaczania regionów pochodzenia materiału podstawowego przeznaczonego do produkcji materiału rozmnożeniowego, kontroli leśnego materiału rozmnożeniowego. Przepisów ustawy nie stosuje się do materiału rozmnożeniowego, który nie jest przeznaczony dla leśnictwa, jak również do materiału rozmnożeniowego przeznaczonego na export do paostw nie będących członkami Unii Europejskiej. Obowiązujące w Polsce uregulowania prawne dotyczące zasad funkcjonowania leśnej bazy nasiennej są w pełni zgodne z cytowaną wyżej Dyrektywą UE. Konferencja szkoleniowa 2

6 Metodyka zbioru materiałów do badao Jan Kowalczyk Celem badao było zbadanie zmienności genetycznej najważniejszych gatunków lasotwórczych zarówno iglastych jak i liściastych, a także określenie genotypów badanych drzew. Zgromadzone informacje będą wykorzystane w pracach nad inwentaryzacją genetyczną drzew matecznych i w przyszłości będą mogły byd też wykorzystane w analizie potomstwa drzew matecznych. Do badao jako gatunki modelowe z drzew iglastych wybrano sosnę zwyczajną i świerk pospolity, a z liściastych dęby szypułkowy i bezszypułkowy oraz buk zwyczajny. Wybór ich wynikał z założeo początkowych i celów projektu badawczego. Materiał roślinny do badao zbierano z drzew matecznych (doborowych). Drzewa mateczne są rejestrowane w rejestrze LMP i na trwałe oznaczane w terenie. Służą jak baza do zakładania PN i PUN, a ich wartośd genetyczno hodowlana jest badana w programie testowania. Dla wybranych gatunków na podstawie informacji o rozmieszczeniu bazy nasiennej w Lasach Paostwowych opracowano metodykę zbioru materiału roślinnego do badao. Główne założenia były następujące: Drzewa i ich lokalizacja były dobierane tak, aby odzwierciedlały rozmieszczenie badanego gatunku na terenie Lasów Paostwowych Do zbioru materiału dla sosny, świerka, buka i dębu szypułkowego wyznaczono 200 drzew. Dla dębu bezszypułkowego wyznaczono 100 drzew. Wynikało to z przyjętej metodyki badao i możliwości finansowych projektu. Wybrana liczba drzew zapewniła możliwośd rozpoznania zmienności genetycznej gatunku oraz pozwoliła na optymalizację procedur laboratoryjnych i statystycznych Drzewa wybrano i zbiór prowadzono w porozumieniu z administracją Lasów Paostwowych Z drzew iglastych zbierano 1 lub 2 gałązki o długości od 10 do 15 cm, a z drzew liściastych od 4 do 8 zdrowych liści. Zestrzeliwano je przy użyciu strzelby myśliwskiej Po zbiorze, w czasie transportu do laboratoriom materiał roślinny przechowywano w lodówkach chłodzonych suchym lodem. Dla każdego drzewa mierzono pierśnicę i wysokośd, opisywano jego aktualny stan, i zapisywano adres leśny. Zbiór wykonano w 2007 i 2008 roku. Zebrano 892 próbek. W tym: dla sosny materiały zebrano z 207 drzew, dla świerka z 195, dla buka z 201, dla dębu szypułkowego z 201 drzew, a dla bezszypułkowego z 88. Ustalono lokalizację geograficzną drzew matecznych na podstawie współrzędnych geograficznych odczytanych z leśnych map numerycznych w układzie Współrzędne uśredniono dla oddziałów. Materiał roślinny po zbiorze podzielono na trzy równe części i przechowywano równolegle w trzech laboratoriach IBL, ID PAN i UKW. Konferencja szkoleniowa 3

7 Markery molekularne podstawowe definicje, opis metod laboratoryjnych A. Jagielska Identyfikacja leśnego materiału rozmnożeniowego była wykonana w oparciu o badanie markerów genetycznych. Są to fragmenty DNA, które identyfikują różnice w genomie. Obecnie znanych jest wiele różnych markerów DNA, które umożliwiają badanie zmienności genetycznej osobników i populacji. Markery molekularne znajdują szerokie zastosowanie w identyfikacji różnic genetycznych między drzewami oraz między drzewostanami. W prezentowanych badaniach wykorzystane zostały markery PCR- RFLP oraz mikrosatelity (SSR). Podstawową techniką detekcji markerów DNA jest reakcja łaocuchowa polimerazy (PCR), która umożliwia szybką amplifikację (powielenie) w probówce wystarczającej do badao ilości DNA. Czułośd tej metody jest bardzo wysoka i teoretycznie pozwala na wielokrotne powielenie nawet jednej cząsteczki DNA obecnej w ekstrakcie. W czasie reakcji PCR wybrane odcinki DNA są namnażane w specjalnym urządzeniu (termocyklerze) zaprogramowanym na cykle, których liczba, czas i zakres temperatury dostosowane są do wielkości amplikowanego fragmentu oraz specyfiki gatunku. Powielane fragmenty DNA są następnie identyfikowane poprzez rozdział w żelu agarozowym (elektroforezę), podczas której następuje rozdziału fragmentów DNA według ich wielkości i masy cząsteczkowej. Reakcja PCR może byd łączona z analizą restrykcyjną (PCR- RFLP), podczas której produkty amplifikacji poddaje się działaniu enzymów restrykcyjnych i następnie porównuje wielkośd i wzór powstałych prążków. Oparta na PCR analiza krótkich powtórzeo tandemowych (mikrosatelit, SSR) stanowi obecnie najbardziej precyzyjne narzędzie badawcze stosowane do określenia tożsamości genetycznej badanych osobników. Mikrosatelity składają się z krótkich powtórzonych sekwencji (np. ATC)n (AT)n, (TG)n(AG)n) ułożonych kolejno (tandemowo) w określonym miejscu w chromosomie. Zaletą markerów SSR jest możliwośd szybkich analiz wykonywanych w automatycznym sekwenatorze. Konferencja szkoleniowa 4

8 Przegląd parametrów statystycznych wykorzystywanych do opisu zmienności genetycznej populacji, ze szczególnym uwzględnieniem problemów identyfikacji osobniczej Igor Chybicki Celem referatu jest przedstawienie i omówienie podstawowych parametrów wykorzystywanych w ramach niniejszego projektu do opisu zmienności genetycznej. Polimorfizm markerów genetycznych stwarza możliwośd rozróżniania osobników w populacji, przez co umożliwia genetyczną analizę pochodzenia (genealogii) osobnika. Ponadto zmiennośd w obrębie markerów genetycznych pozwala na charakteryzowanie takich właściwości populacji, jak poziom wsobności (efekt kojarzenia krewniaczego), (efektywnej) wielkości populacji rodzicielskiej, a także przynależności populacji do danej linii kolonizacyjnej (np. u dębów, świerka). Im większym polimorfizmem charakteryzują się markery genetyczne, tym więcej informacji dostarczają na temat osobnika czy populacji. Podstawową miarą polimorfizmu jest liczba alleli (A) (różnych wariantów w ramach danego locus markerowego). Do innych miar opisu zmienności należą tzw. efektywna liczba alleli (Ae) oraz różnorodnośd genetyczna (D) mierzona prawdopodobieostwem wylosowania dwóch różnych alleli. Ważna z punktu widzenia opisu struktury genetycznej populacji jest również ocena obecności tzw. alleli zerowych (p 0 ), których definicja, sposób oceny a także konsekwencje dla innych zastosowao markerów genetycznych będą również przedmiotem referatu. Jednym z celów niniejszego projektu była analiza polimorfizmu DNA wybranych gatunków drzew w celu ustalenia unikalności genetycznej drzew, mierzonej za pomocą tzw. prawdopodobieostwa identyczności (PID). Unikalnośd genetyczna przekłada się również na możliwośd identyfikacji drzewa matecznego dla próby nasion (lub siewek). Szansę przypadkowej zgodności (tj. nie wynikającej z pokrewieostwa matka-dziecko) genotypu nasienia i drzewa ocenia się za pomocą prawdopodobieostwa wykluczenia (PE). Odpowiednie definicje oraz interpretacje obu wskaźników zostaną przedstawione. Ponadto, celem referatu będzie również wskazanie różnic w podejściu statystycznym stosowanym podczas analizy markerów jądrowego DNA i cytoplazmatycznego DNA (tj. mitochondrialnego i chloroplastowego). Konferencja szkoleniowa 5

9 Zmiennośd genetyczna sosny zwyczajnej (Pinus sylvestris L.) w oparciu o wybrane markery DNA Artur Dzialuk Badania zmienności genetycznej sosny zwyczajnej przeprowadzono w oparciu o analizę 206 drzew matecznych zlokalizowanych w 17 RDLP na terenie całego kraju. Przeprowadzono je z wykorzystaniem 13 polimorficznych loci mikrosatelitarnych w jądrowym DNA. Średnia liczba alleli w locus dla badanego zestawu loci wynosiła A=20,77, wahając się w zakresie od 4 do 39 alleli, średnia efektywna liczba alleli Ae=4,98 (1,73-20,83), średnia heterozygotycznośd obserwowana Ho=0,666 (0,176-0,930), natomiast współczynnik różnorodności genetycznej (czyli heterozygotycznośd oczekiwana) wynosił średnio D=0,799 (0,422-0,952). Współczynnik wsobności Wrighta wyniósł F=0,166, wahając się dla poszczególnych loci w szerokim zakresie od - 0,021 do 0,584, co miało częściowo związek z występowaniem tzw. alleli zerowych (null), których częstośd wahała się od 0 do 0,266, przy średniej 0,076. Kumulatywny współczynnik prawdopodobieostwa identyczności określającego szansę, że dwa losowo wybrane osobniki będą miały taki sam genotyp dla wszystkich 13 loci wyniósł PID 13 =1,69305E-18, natomiast kumulatywne prawdopodobieostwo wykluczenia rodzicielstwa dla pierwszego rodzica (np. siewkadrzewo mateczne) wyniosło EP 13 =0,9999. W celu zoptymalizowania przyszłych analiz identyfikacyjnych zaprojektowano dwie reakcje multiplex-pcr: (a) dla zestawu 2 loci (PtTX3107 oraz PtTX3116) oraz (b) dla zestawu 3 loci (Spac11.6, Spac12.5 oraz Spag7.14). Dla amplifikacji pozostałych loci stosowano pojedyncze reakcje PCR. Przeprowadzono również badania polimorfizmu dziesięciu chloroplastowych sekwencji mikrosatelitarnych (Pt26081, Pt36480, Pt45002, Pt15169, Pt30204, PCP1289, PCP87314, PCP41131, PCP oraz Pt71936) dziedziczących się u sosny w linii ojcowskiej. Zaobserwowano występowanie średnio 5,6 alleli w locus (A od 4 do 9 alleli), średnia efektywna liczba alleli wyniosła Ae=2,14 (1,11-4,08), średnia różnorodnośd haplotypowa D=0,431 a średnie prawdopodobieostwo identyczności haplotypowej PID=0,569. Te same parametry obliczone dla całej próby drzew doborowych wyniosły odpowiednio: A=154, Ae=113,47, D=0,996 oraz PID=0,004. Wszystkie loci chloroplastowe amplifikowane podczas jednej reakcji multiplex-pcr. Analiza polimorfizmu dwóch loci w genomie mitochodnrialnym (nad1 oraz nad7), który dziedziczony jest u sosny w linii matecznej, wykazała występowanie łącznie 5 haplotypów. Locus nad1 okazało się byd niemalże monomorficzne (odnaleziono zaledwie 1 osobnika w RDLP Lublin posiadającego allel 248 pz), z kolei w locus nad7 zidentyfikowano występowanie 4 alleli. Efektywna liczba haplotypów mitochondrialnych wśród badanych drzew doborowych wyniosła Ae=2,56, różnorodnośd haplotypowa D=0,616 a prawdopodobieostwo identyczności haplotypowej PID=0,387. Dla zestawu wszystkich badanych loci u sosny (genom jądrowy, chloroplastowy oraz mitochondrialny), kumulatywny współczynnik prawdopodobieostwa identyczności wyniósł PID 25 =2,64938E-21, natomiast kumulatywne prawdopodobieostwo wykluczenia rodzicielstwa dla pierwszego rodzica (np. siewka-drzewo mateczne) wyniosło EP 25 = 0, Konferencja szkoleniowa 6

10 Zmiennośd genetyczna świerka pospolitego (Picea abies [L.] Karst.) w oparciu o wybrane markery DNA Artur Dzialuk Badania zmienności genetycznej świerka pospolitego przeprowadzono w oparciu o analizę 195 drzew doborowych zlokalizowanych w 9 RDLP na obszarze całego zasięgu występowania tego gatunku w Polsce. Przeprowadzono je z wykorzystaniem 9 polimorficznych loci mikrosatelitarnych w jądrowym DNA. Średnia liczba alleli w locus dla badanego zestawu loci wynosiła A=26,56, wahając się w zakresie od 12 do 49 alleli, średnia efektywna liczba alleli Ae=5,81 (2,63-37,04), średnia heterozygotycznośd obserwowana Ho=0,733 (0,508-0,953), natomiast współczynnik różnorodności genetycznej (czyli heterozygotycznośd oczekiwana) wynosił średnio D=0,828 (0,619-0,973). Współczynnik wsobności Wrighta wyniósł F=0,114, wahając się dla poszczególnych loci w szerokim zakresie od -0,025 do 0,374, co miało częściowo związek z występowaniem tzw. alleli zerowych (null), których częstośd wahała się od 0 do 0,163, przy średniej 0,056. Kumulatywny współczynnik prawdopodobieostwa identyczności określającego szansę, że dwa losowo wybrane osobniki będą miały taki sam genotyp dla wszystkich 9 loci wyniósł PID 9 =1,96637E-14, natomiast kumulatywne prawdopodobieostwo wykluczenia rodzicielstwa dla pierwszego rodzica (np. siewka-drzewo mateczne) wyniosło EP 9 =0,9996. Dla amplifikacji wszystkich badanych loci stosowano pojedyncze reakcje PCR. Przeprowadzono również badania polimorfizmu pięciu chloroplastowych sekwencji mikrosatelitarnych (Pt 26081, Pt 71936, Pt 63718, Pt 15169, Pt 30204) dziedziczących się u świerka w linii ojcowskiej. Zaobserwowano występowanie średnio 4,8 alleli w locus (A od 2 do 7 alleli), średnia efektywna liczba alleli wyniosła Ae=1,74 (1,01-2,41), średnia różnorodnośd haplotypowa D=0,360 a średnie prawdopodobieostwo identyczności haplotypowej PID=0,639. Te same parametry obliczone dla całej próby drzew doborowych świerka wyniosły odpowiednio: A=36, Ae=7,76, D=0,876, PID=0,124 oraz EP 5 =0,876. Wszystkie loci chloroplastowe amplifikowano w pojedynczej reakcji multiplex-pcr. Analiza polimorfizmu dwóch loci w genomie mitochondrialnym (MT15 D02 oraz nad1), który dziedziczony jest u świerka w linii matecznej, wykazała występowanie łącznie 5 haplotypów. W locus MT15 D02 zaobserwowano 3 allele, a w locus nad1 2 allele. Pozostałe parametry przyjęły odpowiednio następujące wartości: efektywna liczba alleli Ae=2,04 i 1,53, różnorodnośd haplotypowa D=0,512 i 0,348 a prawdopodobieostwo identyczności haplotypowej PID=0,488 i prawdopodobieostwo wykluczenia rodzicielstwa dla pierwszego rodzica EP 2 =0,512. Kumulatywny współczynnik prawdopodobieostwa identyczności obliczony dla zestawu wszystkich badanych loci u świerka (genom jądrowy, chloroplastowy oraz mitochondrialny), wyniósł PID 16 =1,19907E-15, natomiast kumulatywne prawdopodobieostwo wykluczenia rodzicielstwa dla pierwszego rodzica (np. siewka-drzewo mateczne) wyniosło EP 16 = 0, Konferencja szkoleniowa 7

11 Zmiennośd genetyczna rodzimych dębów *Quercus petraea (Lieb.), Quercus robur (L.)] w oparciu o wybrane markery DNA. Monika Dering Zmiennośd genetyczna dwóch rodzimych gatunków dębów analizowana była w oparciu o drzewa mateczne dębu szypułkowego i bezszypułkowego zlokalizowane w 13 Regionalnych Dyrekcjach Lasów Paostwowych. Badania nad strukturą genetyczną przeprowadzono wykorzystując trzy rodzaje markerów DNA o różnym wzorcu dziedziczenia. Było to 10 jądrowych loci mikrosatelitarnych (nssr) dziedziczonych po obojgu rodzicach oraz markery chloroplastowego DNA dziedziczone w linii matecznej: 9 loci mikrostarelitarnych (cpssr) oraz 2 rejony niekodujące zlokalizowane między genami trnd i trnt (DT) oraz trnc i trnd (CD) poddane analizie restrykcyjnej enzymem TaqI (PCR-RFLP). Średnia liczba alleli w locus dla analizowanych jądrowych loci mikrosatelitarnych wynosiła dla dębu szypułkowego A=23,7 i A=20 dla dębu bezszypułkowego. Udział w niektórych loci znaczącej liczby alleli o niskiej częstości spowodował, że efektywna liczba alleli była niższa i wynosiła odpowiednio dla dębu szypułkowego i bezszypułkowego A e =7,23 oraz A e =6,66. Średnia heterozygotycznośd obserwowana wynosiła dla dębu szypułkowego i bezszypułkowego odpowiednio H o =0,832 i H o =0,738, natomiast współczynnik różnorodności genetycznej wynosił średnio D=0,862 i D=0,85. U obu gatunków w przypadku niektórych loci stwierdzono istotny statystycznie udział loci zerowych, co bezpośrednio wpływa m. in. na wartości współczynnika wsobności osiągającego wartośd F= 0,034 dla dębu szypułkowego i F=0,132 dla dębu bezszypułkowego. Kumulatywny współczynnik prawdopodobieostwa identyczności określający szansę, że dwa wybrane losowo drzewa będą miały ten sam genotyp wyniósł dla analizowanych 10 loci PID=2,722E-16 dla dębu szypułkowego i PID=1,047E-14 dla dębu bezszypułkowego. Kumulatywne prawdopodobieostwo wykluczenia rodzicielstwa dla pierwszego rodzica wyniosło dla dębu szypułkowego EP1=0,99986 i EP1=0,99962 dla dębu bezszypułkowego. Jakkolwiek nie stwierdzono wyraźniej gatunkowej specyficzności badanych loci nssr, to zaobserwowane istotne statystycznie różnice w częstościach niektórych alleli. Analiza chloroplastowych loci mikrosatelitarnych pozwoliła na wyróżnienie dla obu gatunków 18 haplotypów, przy czym u dębu szypułkowego stwierdzono 16 haplotypów i 8 dla dębu bezszypułkowego. Niższa liczba haplotypów odnotowana u dębu bezszypułkowego najprawdopodobniej ma związek z niskim udziałem tego gatunku w ogólnej puli analizowanych osobników. Ze względu na znacznie niższy polimorfizm loci cpssr w porównaniu do loci nssr, średnia wartośd współczynnika określającego prawdopodobieostwo, że dwa losowe osobniki będą miały ten sam genotyp cpssr wynosił dla dębu szypułkowego PID=0,1905 i PID=0,2265 dla dębu bezszypułkowego. Analiza PCR-RFLP dwóch rejonów cpdna wykazała obecnośd w badanej grupie drzew doborowych 6 haplotypów należących do trzech linii kolonizacyjnych: haplotypy 4, 5 i 7 z linii bałkaoskiej, 1 i 2 z linii apenioskiej oraz haplotyp 12 z linii iberyjskiej. Ten typ markerów charakteryzował się najniższym polimorfizmem, stąd nie może byd wykorzystywany do identyfikacji osobniczej, aczkolwiek może wnosid istotne informacje na temat pochodzenia drzewostanu. Konferencja szkoleniowa 8

12 Zmiennośd genetyczna buka zwyczajnego (Fagus sylvatica L.) w oparciu o wybrane markery DNA. Jarosław Burczyk Badania zmienności genetycznej buka zwyczajnego przeprowadzono w oparciu o 201 drzew doborowych zlokalizowanych w 12 RDLP, odzwierciedlających rozmieszczenie tego gatunku w Polsce. Do wstępnych analiz wybrano 31 markerów mikrosatelitarnych zlokalizowanych w DNA jądrowym. Do badao zmienności genetycznej wytypowano 13 loci polimorficznych, dających wyraźne produkty amplifikacji pozwalające na jednoznaczne określenie genotypu osobnika. Dla tych 13 loci średnia liczba alleli w locus wynosiła A=15,08, wahając się w zakresie od 4 do 30 alleli, średnia efektywna liczba alleli Ae=3,90 (1,39-10,75), średnia heterozygotycznośd obserwowana Ho=0,670 (0,291-0,910), natomiast współczynnik różnorodności genetycznej (czyli heterozygotycznośd oczekiwana) wynosił średnio D=0,743 (0,278-0,907). Współczynnik wsobności Wrighta wyniósł F=0,099, wahając się dla poszczególnych loci w szerokim zakresie od -0,142 do 0,405, co miało częściowo związek z występowaniem tzw. alleli zerowych (null), których częstośd wahała się od 0 do 0,187, przy średniej 0,054. Kumulatywny współczynnik prawdopodobieostwa identyczności określającego szansę, że dwa losowo wybrane osobniki będą miały taki sam genotyp dla wszystkich 13 loci wyniósł PID 13 =3,451E-15, natomiast kumulatywne prawdopodobieostwo wykluczenia rodzicielstwa dla pierwszego rodzica (np. siewka-drzewo mateczne) wyniosło EP 13 =0,9987. W celu zoptymalizowania przyszłych analiz identyfikacyjnych zaprojektowano reakcję multiplex-pcr dla zestawu 9 loci charakteryzujących się optymalnym poziomem zmienności i niską częstością alleli null (CsCAT14, FS1-15, mfc5, sfc0007-2, sfc0018, sfc0036, sfc0161, sfc1063, sfc1143). Dla takiego zestawu 9 loci PID 9 =2.914E-11, natomiast EP 9 = Wysoki poziom polimorfizmu tak zaprojektowanego 9- plexu oraz stabilnośd i powtarzalnośd wyników umożliwiają jego dalsze wykorzystanie do celów identyfikacji osobniczej u buka. Przeprowadzono również badania polimorfizmu chloroplastowych sekwencji mikrosatelitarnych (ccmp4, ccmp7, ccmp10) dziedziczących się u buka w linii matecznej. Loci te okazały się wysoce monomorficzne dając łącznie jedynie 2 haplotypy, przy czym rzadszy haplotyp zidentyfikowano tylko dla jednego drzewa matecznego z RDLP Wrocław. Stwierdzenie niskiego polimorfizmu genomu chloroplastowego buka jest zgodne z innymi badaniami prowadzonymi dla tego gatunku. Konferencja szkoleniowa 9

13 Tendencje przestrzennego rozkładu zmienności genetycznej badanych gatunków w skali całego kraju Igor Chybicki U większości gatunków drzew zmiennośd genetyczna wykazuje tendencje przestrzenne polegające na skupianiu się podobnych genetycznie osobników i populacji. Skupiskowa struktura jest efektem zarówno naturalnych procesów (ograniczone rozprzestrzenianie oraz dobór naturalny) jak również działalności człowieka (np. regionalizacja nasienna). Polimorficzne markery DNA stwarzają możliwośd analizy przestrzennej struktury genetycznej. Ze względu na neutralny charakter odzwierciedlają one jednak jedynie procesy demograficzne, które nie są związane z dostosowaniem osobnika. W ramach niniejszego projektu przeprowadzono analizy zmienności genetycznej pięciu gatunków drzew w oparciu o drzewa doborowe rozmieszczone na terenie całego kraju. Taki schemat rozmieszczenia stworzył okazję do przeprowadzenia analiz przestrzennej struktury genetycznej. Analizy przestrzennej struktury genetycznej przeprowadzono dla markerów DNA jądrowego (ndna), chloroplastowego (cpdna) i mitochondrialnego (mtdna). Ze względu na typ dziedziczenia markery te można podzielid na dziedziczone oburodzicielsko (rozprzestrzenianie przez pyłek i przez nasiona; ndna wszystkich badanych gatunków), w linii matczynej (rozprzestrzenianie tylko przez nasiona; cpdna i mtdna dębu i buka, ale u sosny i świerka tylko mtdna) i w linii ojcowskiej (rozprzestrzenianie przez pyłek i przez nasiona; cpdna sosny i świerka). Analizy przeprowadzono z wykorzystaniem odpowiednich metod autokorelacji przestrzennej. W przypadku markerów dziedziczonych oburodzicielsko (ndna) najsilniejszą tendencję skupiskową stwierdzono u buka, w drugiej kolejności u dębu szypułkowego. Zdecydowanie słabszą strukturę przestrzenną wykazywały gatunki iglaste. Na uwagę zwraca brak struktury przestrzennej u dębu bezszypułkowego. Prawdopodobną przyczyną może byd zdecydowanie mniejsza próba oraz specyficzne rozmieszczenie drzew. Zgodnie z oczekiwaniami, markery dziedziczone w linii matczynej wykazały najsilniejszą autokorelację. Spośród badanych gatunków, jedynie dla sosny nie zanotowano przestrzennej struktury genetycznej. Dla pozostałych gatunków stwierdzono klinalną zmiennośd przestrzenną wykazującą pewne różnice skali między poszczególnymi gatunkami. Analizy markerów dziedziczonych w linii ojcowskiej wykazały najsłabszą autokorelację przestrzenną. Pomimo tego można było odnotowad istotną statystycznie dodatnią autokorelację przestrzenną u świerka, co może byd odzwierciedleniem mniejszych zdolności do rozprzestrzeniania pyłku u tego gatunku w porównaniu z pyłkiem sosny zwyczajnej. Zestawiając badane gatunki, struktura przestrzenna jest wyraźniejsza wśród gatunków liściastych niż iglastych. Szczególnie interesujące w świetle regionalizacji nasiennej (lub identyfikacji pochodzenia) mogą byd dalsze badania obu gatunków dębu pod kątem zmienności w obrębie markerów dziedziczonych w linii matczynej (cpdna i mtdna). Z drugiej strony, brak jakiejkolwiek struktury przestrzennej w przypadku sosny zwyczajnej uniemożliwia wykorzystanie neutralnych markerów DNA do identyfikacji pochodzenia lub wyznaczania regionów nasiennych u tego gatunku. Konferencja szkoleniowa 10

14 Wykorzystanie chloroplastowych sekwencji mikrosatelitarnych do weryfikacji przynależności szczepów do poszczególnych klonów na przykładzie klonalnej plantacji nasiennej sosny zwyczajnej Artur Dzialuk Plantacje nasienne są specjalnym rodzajem upraw leśnych zakładanych w celu produkcji nasion o wysokich wartościach użytkowych. Zamieszanie szczepów mogące nastąpid przy zbiorze zrazów, szczepieniu oraz sadzeniu na plantacji lub wynikające z obecności drzew wyrosłych z podkładek, obok zanieczyszczenia obcym pyłkiem, jest główną przyczyną obniżenia jakości genetycznej nasion produkowanych przez plantacje klonalne. Badania zmienności próby 206 drzew matecznych sosny zwyczajnej zebranych z terenu całej Polski wykazały, że prawdopodobieostwo identyczności dwóch losowo wybranych drzew uzyskane na podstawie analizy 10 markerów mikrosatelitarnych w chloroplastowym DNA (Pt26081, Pt36480, Pt45002, Pt15169, Pt30204, PCP1289, PCP87314, PCP41131, PCP oraz Pt71936) amplifikowanych w pojedynczej reakcji multiplex-pcr jest stosunkowo niskie (PID 10 = 0, ). Oznacza to możliwośd zastosowania tej metody genotypowania do uzyskania unikalnych profili genetycznych, umożliwiających identyfikację osobniczą. Zestaw dziesięciu mikrosatelitów chloroplastowych został wykorzystany do określenia genotypów wszystkich szczepów w jednej z trzech kwater plantacji nasiennej sosny zwyczajnej w Gniewkowie. Uzyskane profile genetyczne porównano z danymi dotyczącymi rozmieszczenia klonów na plantacji dostarczonymi przez Nadleśnictwo Gniewkowo (gospodarza obiektu). Wśród 190 szczepów tworzących badaną kwaterę, stwierdzono występowanie 27 haplotypów (w tym 24 haplotypów unikalnych, tj. występujących tylko u jednego klonu). W przypadku 50 szczepów (26,3%) stwierdzono błędne przypisanie do klonów. Dla 32 szczepów (64% błędnie opisanych) udało się odnaleźd odpowiedni klon i dokonad stosownej korekty w opisie. 18 szczepów (36% błędnie opisanych) nie udało się przyporządkowad do żadnego z klonów. Uzyskane wyniki wskazują, że technika analizy 10 chloroplastowych loci mikrosatelitarnych w pojedynczej reakcji multiplex-pcr, jest metodą umożliwiającą nie tylko identyfikację błędów w opisie przynależności szczepów do klonów, ale także dokonanie stosownych korekt w opisie plantacji oraz wskazanie osobników nieznanego pochodzenia, które powinny byd usunięte podczas najbliższej trzebieży. Jej zastosowanie nie ogranicza się jednak tylko do eliminowania błędów na istniejących plantacjach. Istnieje również możliwośd zapobiegania powstawania błędów przy zakładaniu plantacji poprzez porównanie zgodności haplotypów szczepów z domniemanym źródłem zrazów (drzewem matecznym) oraz dodatkowo podnoszenia wartości genetycznej plantacji poprzez odpowiednie planowanie rozmieszczenia klonów, tak aby zapobiegad wzrostowi wsobności pokolenia potomnego w wyniku samozapłodnienia (kojarzenia pomiędzy szczepami tego samego klonu). Konferencja szkoleniowa 11

15 Możliwości wykorzystania chloroplastowych sekwencji mikrosatelitarnych sosny zwyczajnej w celu weryfikacji poprawności zbioru nasion z pojedynczych drzew matecznych Artur Dzialuk Nasiona sosny zwyczajnej oraz innych drzew iglastych posiadają haploidalną tkankę megagametofitu, której genotyp jest identyczny z genotypem komórki jajowej tworzącej zarodek nasienia. Ponadto, genom cytoplazmatyczny megagametofitu jest identyczny z genomem cytoplazmatycznym drzewa matecznego. Stwarza to możliwośd wykorzystania markerów chloroplastowych w celu weryfikacji poprawności zbioru nasion z pojedynczych drzew matecznych sosny zwyczajnej. Dokonano wyboru 10 polimorficznych loci mikrosatelitów chloroplastowych (Pt26081, Pt36480, Pt45002, Pt15169, Pt30204, PCP1289, PCP87314, PCP41131, PCP oraz Pt71936). Dla tych loci zaprojektowano i zoptymalizowano reakcję multiplex-pcr umożliwiającą przeprowadzenie pojedynczej reakcji PCR dla zestawu 10 markerów genetycznych jednocześnie. Badania zmienności próby 206 drzew matecznych sosny zwyczajnej zebranych z terenu całej Polski wykazały, że chociaż zmiennośd w poszczególnych loci jest umiarkowana (od 4 do 9 alleli), to dla badanego zestawu drzew matecznych otrzymano łącznie aż 154 różne haplotypy rozumiane jako kombinacje alleli w poszczególnych loci. Prawdopodobieostwo identyczności dla tego zestawu loci wynosi PID 10 = 0, , co jest równoważne z prawdopodobieostwem, że dwa losowo wybrane osobniki sosny zwyczajnej mają taki sam haplotyp. Zaproponowano, by weryfikację poprawności zbioru nasion z pojedynczych drzew matecznych sosny prowadzid poprzez porównanie haplotypów megagametofitów pięciu nasion (wybranych losowo z próby deklarowanej, jako pochodzącej z danego drzewa matecznego) z haplotypem drzewa matecznego (DNA wyizolowany z igieł). Analiza pięciu nasion daje prawdopodobieostwo, że w 80% przypadków wykryte będzie zanieczyszczenie próby nasion większe niż 20%, pozwala zatem na wykrycie rażących zanieczyszczeo, tolerując zanieczyszczenie niewielkie. Badania pięciu nasion są jednocześnie wyrazem kompromisu pomiędzy dokładnością analiz, a ich kosztochłonnością. Procedura ta została wdrożona przy gromadzeniu zasobów genowych drzew matecznych sosny zwyczajnej w Leśnym Banku Genów Kostrzyca. Na bazie tej metody opracowano także całościową koncepcję weryfikacji poprawności zbioru nasion z pojedynczych drzew matecznych sosny zwyczajnej prowadzonych przez LBG Kostrzyca. Obejmuje ona nie tylko testowanie już istniejących zasobów nasion, ale także bieżącą kontrolę nasion dostarczanych przez nadleśnictwa pod kątem zgodności genetycznej danej porcji nasion z deklarowanym drzewem matecznym. Taka strategia zapobiega przechowywaniu nasion nieznanego pochodzenia, przyczyniając się przy tym do wydajniejszej ochrony ex-situ zasobów genowych sosny zwyczajnej z terenu całej Polski. Konferencja szkoleniowa 12

16 Przykład wykorzystania chloroplastowych sekwencji mikrosatelitarnych w celu weryfikacji poprawności zbioru nasion przechowywanych w zasobach LBG, pozyskanych z drzew matecznych sosny zwyczajnej. Małgorzata Pałucka W Leśnym Banku Genów Kostrzyca przeprowadzono badania genetyczne, mające na celu sprawdzenie poprawności zbioru nasion z drzew matecznych Pinus sylvestris, dla zasobów genowych pochodzących z terenu czterech południowych Regionalnych Dyrekcji Lasów Paostwowych oraz jednej RDLP z terenu centralnej Polski. Badania polegały na amplifikacji chloroplastowych sekwencji mikrosatelitarnych w DNA izolowanym z tkanki megagametofitu pięciu losowo wybranych nasion z każdego badanego zasobu genowego oraz z igieł pozyskanych przez pracowników LBG podczas wyjazdów terenowych. DNA wyizolowano metodą Doyle and Doyle (1986). Reakcje multipleks PCR prowadzono wykorzystując 9 sekwencji mikrosatelitarnych w chloroplastowym DNA: Pt26081, Pt36480, Pt45002, Pt15169, Pt30204, PCP1289, PCP87314, PCP41131, PCP Dzięki połączeniu dziewięciu markerów mikrosatelitarnych w jedną mieszaninę multipleks (Dzialuk i Burczyk 2004), możliwe było efektywne i precyzyjne określenie haplotypów danej partii nasion sosny zwyczajnej i porównanie ich z haplotypem drzewa matecznego. Wynik zgodny uznawano w tych próbach, w których megagametofity wszystkich 5 nasion posiadały haplotyp chloroplastowy identyczny jak haplotyp drzewa matecznego (igła). W sumie przeprowadzono analizy dla 254 zasobów genowych sosny zwyczajnej. Wyniki, jakie uzyskano były następujące: (62%) zasobów genowych zaklasyfikowano jako zgodne, (11%) zasobów genowych zaklasyfikowano jako niezgodne (od jednego do czterech spośród pięciu badanych megagametofitów posiadało inny haplotyp), (27%) zasobów genowych zaklasyfikowano jako niezgodne (każdy z pięciu badanych megagametofitów posiadał inny haplotyp). W marcu 2009 r. LBG Kostrzyca przesłał do DGLP obszerne sprawozdanie dotyczące otrzymanych wyników badao. W odpowiedzi, Dyrektor Generalny LP wydał decyzję o wycofaniu z LBG Kostrzyca wszystkich zasobów genowych utworzonych z drzew matecznych P.sylvestris, które zostały zaklasyfikowane jako niezgodne oraz polecił nadleśnictwom ponowny, poprawny zbiór w celu odtworzenia zasobów genowych. W LBG Kostrzyca prowadzone są analizy laboratoryjne kolejnych zasobów genowych utworzonych z drzew matecznych P.sylvestris. Konferencja szkoleniowa 13

17 Możliwości wykorzystania jądrowych sekwencji mikrosatelitarnych do weryfikacji poprawności zbioru nasion z pojedynczych drzew matecznych dębów. Jarosław Burczyk Jądrowe markery mikrosatelitarne u rodzimych dębów charakteryzują się stosunkowo wysokim polimorfizmem, co umożliwia ich wykorzystanie w celu prowadzenia analiz identyfikacji osobniczej. U organizmów diploidalnych osobnik potomny w ramach każdego locus posiada jeden allel pochodzący od osobnika matecznego, a drugi allel pochodzący od osobnika ojcowskiego. W związku z tym, osobniki potomne danego drzewa matecznego, w każdym locus powinny posiadad przynajmniej jeden allel obecny u osobnika matecznego. Jeśli chociaż w jednym locus stwierdza się niezgodnośd genetyczną pomiędzy osobnikiem matecznym a domniemanym osobnikiem potomnym (brak wspólnych alleli), oznacza to, że domniemany osobnik potomny pochodzi od innego osobnika matecznego (wykluczenie rodzicielstwa). Przeprowadzono pilotażowe badania, których celem było określenie możliwości wykorzystania jądrowych sekwencji mikrosatelitarnych do weryfikacji poprawności zbioru nasion z pojedynczych drzew matecznych dębów. Badania przeprowadzono w mieszanym drzewostanie nasiennym dębów w Nadleśnictwie Jamy (RDLP Toruo). Genotypy 421 drzew oraz 1280 osobników potomnych (nasiona) pochodzących z 18 drzew matecznych określono dla zestawu 5 loci mikrosatelitarnych tworzących multiplet-pcr (MSQ 4, ssrqpzag 9, ssrqpzag 110, ssrqrzag 7, ssrqrzag 20), który dla przebadanych w projekcie drzew matecznych z terenu całej polski dał PID 5 =1,033E-7 oraz EP 5 =0,983. Do dalszych badao wybrano jedynie nasiona 10 drzew matecznych (czyli 10 rodów z wolnego zapylenia, half-sib), o liczebności ponad 50 nasion/drzewo (od 52 do 232). Wykorzystując metody analizy rodzicielstwa każdy z 10 rodów próbowano przypisad do każdego z 421 drzew oceniając proporcję nasion, dla których nie dokonano wykluczenia rodzicielstwa (czyli proporcję nasion, które można przypisad do danego drzewa matecznego). Sto procent nasion należących do poszczególnych rodów przypisad można było jedynie dla jednego rzeczywistego drzewa matecznego danego rodu. Dla każdego rodu jedno lub więcej nasion było zgodnych genetycznie ze 107 do 177 drzewami obecnymi w drzewostanie nasiennym, jednak proporcja nasion zgodnych genetycznie z tymi drzewami wynosiła średnio zaledwie 0,031 (od 0,016 do 0,049). Tym niemniej, w pojedynczych przypadkach, dla niektórych rodów wartośd ta wynosiła nawet 0,35, co wynikało z podobieostwa pomiędzy genotypem rzeczywistego drzewa matecznego danego rodu, a genotypem drzewa, do którego ród ten próbowano przypisad. Metoda weryfikacji poprawności zbioru nasion z pojedynczych drzew matecznych w oparciu o wysoce polimorficzne markery mikrosatelitarne genomu jądrowego może byd skutecznie stosowana dla wszystkich gatunków drzew pod warunkiem dysponowania odpowiednim zestawem mikrosatelitów. Konferencja szkoleniowa 14

18 Ocena liczby drzew matecznych wykorzystanych do pozyskania materiału rozmnożeniowego u sosny zwyczajnej Igor Chybicki Różnorodnośd genetyczna jest podstawą zachowania zdolności adaptacyjnych populacji. Dla zachowania dużej różnorodności genetycznej populacji zbiór nasion w celu ochrony zasobów genowych metodami ex situ (np. zasoby genowe poszczególnych drzewostanów przechowywane w Leśnym Banku Genów) lub w celu bezpośredniego wykorzystania nasion do odnowieo i zalesieo powinien byd prowadzony w oparciu o stosunkowo dużą liczbę drzew. Ostatnie zalecenia Rady Naukowej Leśnego Banku Genów wskazują, by liczba drzew wykorzystywanych do zbioru nasion nie była mniejsza niż 100 osobników. Tym niemniej, poza możliwością prowadzenia kontroli w trakcie zbioru nasion, nie istnieją obecnie metody badawcze pozwalające na określenie liczby drzew, z których pozyskano daną próbę nasion. U sosny zwyczajnej (oraz innych iglastych) nasiona zbudowane są z makrogametofitu, którego genom chloroplastowy jest identyczny z genomem chloroplastowym gamety żeoskiej (a zatem drzewa matecznego) oraz z zarodka, którego genom chloroplastowy jest identyczny z genomem chloroplastowym gamety męskiej (czyli drzewa ojcowskiego). Dzięki temu, losowa próba nasion może byd poddana analizie genetycznej prowadzącej do ustalenia polimorfizmu genomu chloroplastowego osobno dla puli gamet żeoskich i męskich. Wiatropylnośd, masowa produkcja pyłku oraz krzyżowy system zapłodnienia u sosny sprawiają, że zarodki nasion pochodzących z pojedynczego drzewa matecznego charakteryzują się dużą zmiennością genomu chloroplastowego, porównywalną ze zmiennością całej populacji. Z kolei makrogametofity nasion pochodzących od jednego drzewa posiadają jeden genotyp chloroplastowy. Można wykazad, że przy założeniu losowego kojarzenia, różnica w polimorfizmie między dwoma typami gamet jest funkcją liczby drzew matecznych, od których pochodzi próba nasion. Aby ocenid liczbę drzew matecznych z których pozyskano daną próbę nasion należy porównad różnorodnośd haplotypów cpdna obserwowanych w puli makrogametofitów nasion z różnorodnością haplotypów cpdna obserwowanych w puli zarodków tych nasion. W tym celu opracowano metodę badawczą wykorzystującą polimorfizm chloroplastowych markerów mikrosatelitarnych (cpssr) umożliwiającą ocenę efektywnej liczby drzew matecznych, z których pozyskano nasiona. Właściwości estymatora efektywnej liczby drzew matecznych, a tym samym dokładnośd metody zostały zweryfikowane poprzez serię symulacji komputerowych w oparciu o polimorfizm 10 loci cpssr obserwowany wśród drzew matecznych sosny zwyczajnej zbadanych w ramach niniejszego projektu. Symulacje wykazały dużą dokładnośd oceny efektywnej liczby drzew matecznych, szczególnie w sytuacji, gdy nasiona otrzymane były z niewielkiej liczby drzew. Dokładnośd oceny wzrastała wraz ze zwiększaniem liczebności próby badanych nasion, tym niemniej próba 100 nasion w przypadku sosny zwyczajnej wydaje się wystarczająca do precyzyjnej oceny parametru. Opracowaną metodę zastosowano do oceny efektywnej liczby drzew matecznych wykorzystanych do utworzenia zasobów genowych przechowywanych w Leśnym Banku Genów Kostrzyca, pochodzących z trzech wybranych drzewostanów nasiennych. Efektywna liczba haplotypów cpssr w puli zarodków nasion wyniosła odpowiednio 70,3, 60,7, 62,3 i była znacznie wyższa niż efektywna liczba haplotypów cpssr obserowana w puli megagametofitów (12,9, 6,8, 20,0). Oceny efektywnej liczby drzew matecznych wyniosły odpowiednio 15,6, 7,5 oraz 28,9. Tak niskie oceny efektywnej liczby drzew matecznych, z których pozyskano nasiona mogą wynikad ze zbioru nasion z niewielkiej liczby drzew, bądź z rażących dysproporcji liczby nasion pozyskanych nawet ze znacznej liczby drzew matecznych. Przedstawione wyniki dyskwalifikują badane partie nasion jako zasób genowy danego drzewostanu, który powinien byd przechowywany w Leśnym Banku Genów. Konferencja szkoleniowa 15

19 Możliwości weryfikacji pochodzenia nasion z drzewostanów dębowych w oparciu o markery cytoplazmatyczne Jarosław Burczyk Genom cytoplazmatyczny (zarówno chloroplastowy, jak i mitochondrialny) u dębów dziedziczy się w linii matecznej. Dotychczasowe badania rozkładu zmienności genomu chloroplastowego prowadzone w skali europejskiej oraz fragmentaryczne badania prowadzone na terenie Polski (w tym badania w ramach niniejszego projektu) wykazują na skupiskowe rozmieszczenie haplotypów genomu chloroplastowego. Z uwagi na ograniczony zakres dyspersji nasion, naturalne odnowienie u dębów powinno sprzyjad jednorodności struktury genetycznej genomów cytoplazmatycznych w ramach poszczególnych drzewostanów oraz istnieniu różnic pomiędzy drzewostanami wywodzącymi się z odmiennych linii kolonizacyjnych. Poszczególne chloroplastowe loci mikrosatelitarne (cpssr) wykazują niewielki polimorfizm, tym niemniej, z uwagi na brak rekombinacji genomu chloroplastowego warianty alleliczne poszczególnych loci tworzą specyficzne kombinacje traktowane jako odmienne, odróżnialne haplotypy. Biorąc pod uwagę znaczną różnorodnośd haplotypową stwierdzoną u dębów w ramach niniejszego projektu oraz skupiskowe rozmieszczenie haplotypów w Polsce, przeprowadzono badania zmienności cpssr w 9 wybranych drzewostanach nasiennych. W tym celu wykorzystano 9 loci cpssr (ccmp4, ccmp7, cmcs10, cmcs3, cmcs5, cmcs6, mcd4, mcd5, mdt1), które dla drzew matecznych zbadanych w niniejszym projekcie dały 18 różnych haplotypów. Wśród badanych drzewostanów nasiennych stwierdzono 9 haplotypów znanych wcześniej wśród przebadanych drzew matecznych, ponadto jednak stwierdzono 11 nowych haplotypów występujących głównie w drzewostanie Legnica (4 haplotypy łącznie u 20 drzew) oraz drzewostanie Smolarz (5 haplotypów u 13 drzew). Niektóre drzewostany posiadały wyłącznie jeden rodzaj haplotypu (Kaczory, Krotoszyn), lub zdecydowaną przewagę jednego haplotypu (Dziadów, Scytów). Dwa haplotypy o porównywalnej, przeważającej częstości stwierdzono w drzewostanie Białowieża oraz Legnica, natomiast w drzewostanie Smolarz stwierdzono obecnośd aż 10 haplotypów, przy czym przeważały 3 o podobnej częstości. O różnorodności haplotypowej poszczególnych drzewostanów nasiennych może decydowad ich lokalizacja w stosunku do szlaków migracyjnych dębów, przy czym drzewostany zlokalizowane u zbiegu odmiennych linii migracyjnych mogą wykazywad dużą różnorodnośd haplotypową. Rozkład zmienności haplotypów na terenie Polski oraz ich zróżnicowanie pomiędzy różnymi drzewostanami może byd podstawą do weryfikacji pochodzenia nasion z poszczególnych drzewostanów. W tym celu należy przeprowadzid szczegółowe badania rozkładu zmienności cpssr u dębów w skali całego kraju, co w przyszłości umożliwi określenie rejonów jednorodnych genetycznie uwzględniających szlaki migracyjne dębów. Konferencja szkoleniowa 16

20 Identyfikacja pochodzenia świerka pospolitego w oparciu o markery cytoplazmatyczne, na przykładzie Nadleśnictwa Gołdap. Andrzej Lewandowski Wykorzystując dziedziczący się w linii matecznej, mitochondrialny marker mt15-d02 zweryfikowano pochodzenie świerka pospolitego na terenie Nadleśnictwa Gołdap. Teren Nadleśnictwa leży w krainie Mazursko-Podlaskiej, a jego znaczną częśd obejmuje Puszcza Romincka z bogatymi gatunkowo drzewostanami mieszanymi. Lite drzewostany jednogatunkowe zajmują tylko niecałe 7% powierzchni leśnej, a drzewostany cztero i więcej gatunkowe aż ponad 44%. Podstawowym gatunkiem lasotwórczym na tym terenie jest świerk. Szczególnie cenne są jego lokalne ekotypy charakteryzujące się wysoką jakością i zwiększoną odpornością na szkodniki. Biorąc to pod uwagę teren ten został uznany jako region mateczny (203) dla świerka pospolitego. Badaniami objęto 24 drzewa mateczne oraz 29 populacji rozlokowanych w miarę równomiernie na terenie całego Nadleśnictwa. W skład badanych populacji wchodziły 4 rezerwaty przyrody, 4 wyłączone drzewostany nasienne oraz 21 drzewostanów gospodarczych. W wyniku przeprowadzonych analiz stwierdzono, że 7 drzew matecznych było obcego pochodzenia. Również w 11 na 29 badanych populacjach występowały drzewa obcego pochodzenia, zawierające mitotypy 1 i 2. Skala tego zjawiska jest zróżnicowana, chociaż obejmuje cały region Nadleśnictwa. We wszystkich przypadkach, obok drzew obcego pochodzenia, występowały drzewa posiadające lokalny mitotyp 3. Najlepiej sytuacja wygląda w rezerwatach przyrody. Na cztery badane rezerwaty (łącznie 75 drzew), nie znaleziono ani jednego drzewa z obcym mitotypem. W drzewostanach gospodarczych u 291 na 467 badanych drzew stwierdzono obecnośd obcego mitotypu. W tej grupie 12 przebadanych drzewostanów nie zawierało drzew obcego pochodzenia. Najbardziej niepokojącym zjawiskiem było znalezienie wśród 4 badanych WDN-ów, dwóch ze znacznym udziałem drzew obcego pochodzenia. W drzewostanie z oddziału 35f, skala tego zjawiska nie była bardzo duża. Obcy mitotyp 1 występował u 16% drzew a mitotyp 2 w 11%. Natomiast w WDN-ie z oddziału 170j aż 85% drzew było obcego pochodzenia, odpowiednio 16% i 69% posiadało mitotyp 1 lub 2. Zakrojone na dużą skalę badania na terenie Nadleśnictwa Gołdap wykazały użytecznośd zastosowanego markera genetycznego dla określenia pochodzenia świerka pospolitego, w zależności od jego refugialnej przynależności. Jednoznacznie wykazano niejednorodne pochodzenie świerka w regionie matecznym 203, dlatego wątpliwym wydaje się zasadnośd funkcjonowania tego regionu jako bazy nasiennej. Jednocześnie należy podjąd działania ochronne mające na celu zachowanie ekotypu świerka gołdapskiego. Konferencja szkoleniowa 17