Markery epigenetyczne w diagnostyce: Metody oceny metylacji DNA

Transkrypt

1 diagnostyka laboratoryjna Journal of Laboratory Diagnostics 2009 Volume 45 Number Praca poglądowa Review Article Markery epigenetyczne w diagnostyce: Metody oceny metylacji DNA Aleksandra Majchrzak, Wanda Baer-Dubowska Katedra Biochemii Farmaceutycznej Uniwersytetu Medycznego im. Karola Marcinkowskiego w Poznaniu Streszczenie Mechanizmy epigenetyczne odgrywają kluczową rolę w prawidłowym rozwoju, starzeniu się i patogenezie wielu chorób. Wykazano, że zmieniona metylacja DNA jest zjawiskiem dosyć powszechnym w przypadku wielu schorzeń, w tym nowotworów. Metylacja cytozyny w pozycji 5 w obrębie wysp CpG nie ma wpływu na sekwencję DNA jako taką, ale ma istotne znaczenie dla regulacji ekspresji genu. Zmieniona metylacja może więc być potencjalnym markerem diagnostycznym. Stało się to przyczyną opracowania wielu technik do oceny metylacji DNA od poziomu genomu do pojedynczych wysp CpG. Ograniczenia każdej z tych technik utrudniają w dużym stopniu interpretację uzyskanych danych. W niniejszym artykule przedstawiono niektóre z aktualnie dostępnych metod oceny metylacji DNA i perspektywę ich zastosowania w laboratorium diagnostycznym. Epigenetic markers in diagnostics: Methods of DNA methylation analysis Summary Epigenetic mechanisms play important roles during normal development, aging and a variety of disease conditions. Numerous studies have implicated aberrant methylation in the etiology of common human disease, including cancer. Methylation of the 5 carbon of cytosine is a form of epigenetic modification that does not affect the primary DNA sequence, but affects secondary interactions that play a critical role in the regulation of gene expression. The possibility of using DNA methylation as a marker for disease has created a strong need for methods to detect and measure DNA methylation. Different techniques provide information on DNA methylation at different levels from genome-wide methylation to single CpG island methylation in specific gene. The limitations of individual techniques strongly affect interpretation of data. This review describes the principle of selected DNA methylation techniques currently in use and perspective of their application to laboratory diagnostics. Słowa kluczowe: epigenetyka, metylacja DNA, MSP, pirosekwencjonowanie, MS-MLPA, metylom, mikromacierze Key words: epigenom, DNA methylation, pyrosequencing, MSP, MS-MLPA, methylome, microarray Wprowadzenie Badania ostatnich lat dostarczyły przekonujących dowodów, że obok zmian genetycznych w patogenezie wielu chorób istotną rolę odgrywają także mechanizmy związane z epigenetyczną kontrolą ekspresji genów. Epigenetyczna kontrola transkrypcji związana jest z metylacją DNA i kowalencyjnymi modyfikacjami histonów, obejmującymi przede wszystkim ich acetylację i metylację. Ocenia się, że 5-metylocytozyna stanowi ok 1% genomu człowieka i w przeciwieństwie do pozostałych czterech zasad nie występuje w stanie wolnym. Rozmieszczenie 5-metylocytozyny w genomie nie jest przypadkowe. Zasadniczo tylko cytozyny poprzedzające guaniny, czyli w tzw. wyspach CpG, mogą być metylowane. Metylacja jest uważana za dominującą modyfikację epigenetyczną DNA w genomie ssaków. Termin ten określa sytuację, w której metylacja może modyfikować informację zawartą w DNA bez zmiany sekwencji nukleotydów. Metylacja nie zmienia struktury i funkcji genów, ale dostarcza informacji gdzie i kiedy gen ulegnie ekspresji [4]. W procesie nowotworzenia zmiany epigenetyczne zachodzą już na najwcześniejszych jego etapach. W komórkach nowotworowych/rakowych obserwuje się obniżenie poziomu metylacji wszystkich cytozyn (genomowa hipometylacja), której towarzyszy hipermetylacja lokalnych wysp CpG. Genomowa hipometylacja może prowadzić zarówno do ogólnej niestabilności genomu, jak i hipometylacji protoonkogenów, czego skutkiem jest ich zwiększona ekspresja/aktywacja. Z drugiej strony metylacja w obrębie wysp CpG promotorów genów supresorowych indukuje ich funkcjonalne wyciszenie naśladujące mutację genetyczną [7, 12]. 167

2 Markery epigenetyczne w diagnostyce: Metody oceny metylacji DNA Kluczowa rola metylacji w utrzymaniu funkcji komórek i stwierdzenie, że zmiany profilu metylacji DNA mogą mieć szerokie implikacje dla zdrowia człowieka stworzyły potrzebę opracowania technik umożliwiających detekcję i pomiar metylacji w DNA pochodzącym z różnych źródeł. Dotyczy to zarówno całego genomu, jak i pojedynczych genów. Metylacja DNA jest chemicznie stosunkowo stabilna, a źródłem DNA do oceny może być nie tylko materiał operacyjny, czy pochodzący z biopsji, ale także ślina, plwocina, popłuczyny oskrzelowe, a także osocze, ponieważ u pacjentów z nowotworami obserwuje się podwyższony poziom krążącego DNA pochodzącego prawdopodobnie z apoptotycznych i nekrotycznych komórek rakowych. Celem tego artykułu jest omówienie i krytyczna ocena niektórych aktualnie dostępnych metod analizy metylacji DNA i perspektywy ich wykorzystania w laboratorium diagnostycznym. Badanie całkowitej metylacji genomowego DNA Całkowitą metylację genomu ocenia się zwykle poprzez określenie stosunku 5-metylocytozyny do cytozyny w analizowanej próbce DNA. Najdłużej do tych celów jest wykorzystywana wysokosprawna chromatografia cieczowa (HPLC) [4, 9], w której przeprowadza się rozdział deoksyrybonukleotydów uzyskanych w wyniku enzymatycznej hydrolizy DNA, a 5-metylocytozynę identyfikuje się za pomocą zewnętrznych standardów. Prostszą i szybszą metodą analizy zawartości 5-metylocytozyn w hydrolizatach DNA jest zastosowana w tym celu po raz pierwszy w 2002 roku wysokosprawna elektroforeza kapilarna (HPCE). Czułość obydwu metod można zwiększyć przez połączenie obydwu technik ze spektrometrią masową [5]. W laboratoriach nie posiadających odpowiedniego wyposażenia alternatywą dla HPLC i HPCE może być chromatografia cienkowarstwowa (TLC) po zastosowaniu enzymu restrykcyjnego MspI rozpoznającego miejsca CCGG i znakowania fosforem 32P [17]. Innym sposobem na uzyskanie informacji o genomowym poziomie metylacji jest użycie bakteryjnej metylotransferazy SssI, która w obecności znakowanej trytem[ 3 H] S-adenozylometioniny (SAM) metyluje wszystkie niezmetylowane cytozyny. Następnie dokonuje się pomiaru radioaktywności pochodzącej od wyznakowanych cytozyn, co umożliwia ocenę niezmetylowanych wysp CpG w całej puli DNA [10]. Problemem w tej metodzie jest jednak stosunkowo duża niestabilność tak SAM, jak i metylotransferazy SssI. Ocena metylacji na poziomie genu Ocena metylacji całego genomu może dostarczyć wstępnej informacji na temat zmian epigenetycznych związanych z metylacją cytozyn w wyspach CpG. Do ostatecznej diagnozy konieczna jest jednak ocena metylacji promotorów specyficznych genów lub ich panelu. W ostatnich latach wraz z rozwojem technik mikromacierzy możliwa stała się analiza metylomu. Badanie stopnia metylacji poszczególnych genów wymaga amplifikacji sekwencji docelowej. Ponieważ polimerazy DNA stosowane w reakcji polimerazowej reakcji łańcuchowej (PCR) nie odróżniają cytozyny od metylocytozyny, bezpośrednia amplifikacja nie jest możliwa. Konieczne jest więc zastosowanie enzymów restrykcyjnych, specyficznych względem zmetylowanych cytozyn (MSRE) lub związków chemicznych przekształcających niezmetylowane cytozyny np. wodorosiarczanu IV (HSO 3 ), hydrazyny (N 2 H 4 ) lub nadmanganianu (MnO 4 ) w pochodne umożliwiające ich rozróżnienie. Zastosowanie metylospecyficznych restryktaz, jak np. HpaII, powoduje hydrolizę niezmetylowanych sekwencji i uniemożliwia ich amplifikację w reakcji PCR, podczas gdy sekwencje zmetylowane mogą ulec powieleniu. Aby reakcja była wiarygodna i nie dawała fałszywie pozytywnych wyników, warunki reakcji muszą być tak dobrane, by wszystkie niezmetylowane sekwencje uległy degradacji. Użycie metylospecyficznych enzymów restrykcyjnych jest celowe jedynie wtedy, gdy spodziewać się można dużego udziału zmetylowanych alleli w badanym DNA. Z tego też względu restryktazy mogą być przydatne np. w ocenie metylacji na wyciszonym chromosomie X, a już w mniejszym stopniu przy badaniu hipermetylacji promotorów genów supresorowych, w których zawartość zmetylowanych sekwencji jest zwykle mniejsza [19]. Reakcja z użyciem wodorosiarczanu IV sodu, należąca do najczęściej stosowanych, polega na konwersji niezmetylowanych cytozyn do uracylu, podczas gdy zmetylowana cytozyna pozostaje w tej reakcji niezmieniona. Zastosowanie wodorosiarczanu IV ma przewagę nad zastosowaniem restryktaz, gdyż pozwala na konwersję dowolnej sekwencji DNA, podczas gdy restryktazy rozpoznają i trawią tylko konkretne sekwencje nukleotydowe. Warunkiem uzyskania wiarygodnych wyników jest konwersja wszystkich wysp CpG w DNA, co nie zawsze jest osiągane. Ponadto w trakcie reakcji DNA może ulec częściowej degradacji. Inną możliwością wzbogacenia frakcji DNA w zmetylowane sekwencje jest immunoprecypitacja z zastosowaniem specyficznego wobec 5-metylocytozyny przeciwciała (MeDIP) lub wykorzystaniem białek z domeną wiążącą grupę metylową [6]. Metylo-specyficzny PCR- MSP MSP jest obecnie najczęściej stosowaną techniką służącą do badania stanu metylacji. Metoda ta jest szybka, tania, a jej wykonanie jest stosunkowo proste. Reakcję polimerazową poprzedza konwersja niezmetylowanych cytozyn do uracylu, przy użyciu wodorosiarczanu IV sodu, co przedstawione jest na rycinie 1. Następnie przeprowadza się reakcję PCR przy pomocy dwóch par starterów, odpowiednio dla sekwencji zmetylowanych i niezmetylowanych (ryc. 2). Po amplifikacji sekwencji docelowych przeprowadza się ich analizę na drodze elektroforezy na żelu agarozowym zawierającym bromek etydyny, który interkalując z DNA, pozwala na ich uwidocznienie w świetle UV. Jak i w innych metodach, rów- 168

3 A. Majchrzak i W. Baer-Dubowska nież w MSP, uzyskane wyniki porównuje się z DNA całkowicie zmetylowanym (kontrola pozytywna) oraz DNA niezmetylowanym (kontrola negatywna). Interpretacja wyników jest dość prosta, umożliwia jednak jedynie ocenę jakościową. W ostatnich latach pojawiła się możliwość zastąpienia do tych celów klasycznej polimerazowej reakcji łańcuchowej techniką PCR w czasie rzeczywistym (R-T PCR), co pozwala na ocenę ilościową (Q-MSP) [3]. Rycina 1 Modyfikacja DNA przy pomocy wodorosiarczanu IV sodu. Reakcja z wodorosiarczanem IV sodu polega na oksydatywnej deaminacji niezmetylowanych cytozyn, w konsekwencji czego w miejsce cytozyn powstają cząsteczki uracylu. Cytozyny zmetylowane nie ulegają reakcji z NaHSO 3, w związku z czym pozostają po tej reakcji niezmienione. Tak zmodyfikowane DNA może być następnie poddane dalszej analizie przy pomocy MSP czy pirosekwencjonowania. Pirosekwencjonowanie Analiza sekwencji produktów PCR otrzymanych z DNA poddanego reakcji konwersji z udziałem wodorosiarczanu IV jest uważana za ostateczny cel oceny genowo-specyficznej metylacji. W ostatnich latach coraz częściej do tego celu wykorzystuje się pirosekwencjonowanie. Pirosekwencjonowanie jest metodą sekwencjonowania w czasie rzeczywistym, co oznacza, że pozwala na uzyskanie wyników nie tylko jakościowych, ale także ilościowych (procentowy udział poszczególnych wariantów sekwencji). W metodzie wykorzystuje się jednoczesne działanie czterech enzymów polimerazy DNA, sulfurylazy, lucyferazy i apirazy. Główną zasadą metody jest wykorzystanie pirofosforanu uwalnianego podczas syntezy DNA. Proces jest wydajny (podczas jednej analizy możliwa jest ocena 96 próbek), a wyniki uzyskiwane są w krótkim czasie (czas analizy 96 próbek to ok.10 min). Analiza jest w dużym stopniu zautomatyzowana [2, 15], co można jednocześnie ocenić jako ograniczenie, bo wymaga specjalistycznego sprzętu. Metylo-specyficzna amplifikacja multiplex zależna od ligacji sond molekularnych MS-MLPA Amplifikacja multipleks zależna od ligacji sond molekularnych Rycina 2 Przebieg reakcji MSP. Metylo-specyficzny PCR, zwany również MSP, polega na amplifikacji DNA w dwóch równoległych reakcjach, które różnią się rodzajem zastosowanych primerów, tj. w jednej reakcji używany jest primer dla sekwencji zmetylowanej, w drugiej dla sekwencji niezmetylowanej. Produkt amplifikacji uwidaczniany jest na żelu agarozowym, zawierającym bromek etydyny. 169

4 Markery epigenetyczne w diagnostyce: Metody oceny metylacji DNA (MLPA, ang. Multiplex Ligation dependent Probe Amplification) jest techniką opisaną po raz pierwszy w 2002 roku, a MS-MLPA jest jej metylo-specyficzną odmianą. Do analizy 45 różnych sekwencji docelowych potrzebne jest jedynie 20 ng DNA, wyekstrahowanego z krwi, guza, płynu owodniowego lub innego materiału biologicznego. Jest to oparta na reakcji PCR metoda polegająca na amplifikacji sond komplementarnych do odpowiednich sekwencji docelowych. Zestaw sond pozwala na wykrycie 45 różnych sekwencji. Schemat analizy przedstawiono na rycinie 3. Reakcja MS-MLPA rozpoczyna się od denaturacji genomowego DNA, po czym do jednoniciowego DNA dodawany jest zestaw sond molekularnych. Każda sonda składa się z dwóch fragmentów. Po odszukaniu przez poszczególne sondy komplementarnych Rycina 3 Analiza metylacji przy pomocy MS-MLPA. Odpowiednio zaprojektowane sondy oligonukleotydowe wykrywają i hybrydyzują z sekwencją docelową. Każda z sond składa się z dwóch fragmentów, które są następnie łączone za pomocą ligazy. Na tym etapie analiza biegnie dwutorowo, tzn. połowa mieszaniny reakcyjnej poddawana jest działaniu ligazy, natomiast druga połowa ligazy i restryktazy. Enzym restrykcyjny użyty w doświadczeniu rozpoznaje sondy, które zhybrydyzowały do niezmetylowanych sekwencji, i trawi je. Kolejno następująca reakcja PCR amplifikuje: wszystkie sondy (część I) i tylko te sondy, które były przyłączone do sekwencji zmetylowanych (część II). Detekcja sond i porównanie produktów amlifikacji w obu mieszaninach reakcyjnych daje ilościowy i jakościowy obraz metylacji w poszczególnych dinukleotydach CpG. 170

5 A. Majchrzak i W. Baer-Dubowska sekwencji następuje hybrydyzacja. W kolejnym etapie mieszanina reakcyjna rozdzielana na dwie części: do pierwszej dodawana jest ligaza, a do drugiej ligaza i enzym restrykcyjny (HhaI lub HhaII). Ligaza ma za zadanie połączyć fragmenty sond w jedną całość, natomiast enzym restrykcyjny hydrolizuje sondy, które przyłączyły się do niezmetylowanych sekwencji. W trakcie następującej po tym etapie reakcji PCR następuje amplifikacja wszystkich sond (część I), bądź tylko tych, które przyłączyły się do zmetylowanych dinukleotydów CpG (część II). Produkty PCR są rozdzielane i identyfikowane na drodze elektroforezy kapilarnej. Opracowanie danych przy pomocy jednego z dostępnych programów komputerowych (np. Coffalyser) umożliwia ilościową ocenę stopnia zmetylowania konkretnego dinukleotydu CpG [8]. Zaletą tej techniki w odniesieniu do materiału operacyjnego jest możliwość wykorzystania DNA wyizolowanego nie tylko z zamrożonej tkanki, ale także zatopionej w parafinie. Ponadto MS-MLPA nie wymaga, w odróżnieniu od wielu innych, powszechnie stosowanych technik (MSP, pirosekwencjonowanie), przeprowadzenia reakcji z wodorosiarczanem IV. Dodatkowym atutem tej metody jest możliwość jednoczesnej analizy wielu różnych dinukleotydów CpG, podczas gdy większość alternatywnych metod dostarcza informację tylko o jednym lub kilku wybranych dinukleotydach CpG. Zaletą MS-MLPA jest jej stosunkowo niski koszt (ok zł za jeden zestaw umożliwiający badanie 100 próbek DNA). Laboratoria, które nie dysponują aparatem do elektroforezy kapilarnej mogą dokonać rozdziału sond metodą elektroforezy żelowej; dotyczy to jednak wybranych, specjalnie przygotowanych zestawów zawierających tylko sond. Aktualnie MRC-Holland, firma, która opracowała MLPA, oferuje ponad 200 różnych zestawów do badań genetycznych i epigenetycznych. Są wśród nich zestawy do badania niewielkich rearanżacji w genach, takich jak BRCA1, BRCA2, MSH2, SMA czy DMD, jak również dużych chromosomowych aberracji, np. w zespole Cri du Chat czy syndromie DiGeorge. Istnieją również zestawy do wykrywania poliploidii autosomów: 13, 18, 21 oraz chromosomów płciowych. Diagnostyka nowotworowa obejmuje mutacje charakterystyczne dla takich schorzeń jak skąpodrzewiak, czerniak czy nowotwory głowy i szyi. Zestawy do MS-MLPA obejmują badanie stopnia metylacji różnych genów supersorowych oraz genów naprawczych, np MGMT, MSH2, MLH1, MLH3 i innych [ Warto również wspomnieć, że istnieje możliwość złożenia zamówienia na konkretny zestaw sond przygotowany na indywidualne zamówienie. Do chwili obecnej opublikowano ponad 100 doniesień naukowych potwierdzających wiarygodność tej metody [11, 13], co rokuje jej coraz szersze wykorzystanie. Badania własne autorów (dane niepublikowane) metylacji promotora metylotransferazy O 6 metyloguaniny w materiale operacyjnym u pacjentów z glejakiem wykazały, że MS-MLPA jest metodą, która ma szansę być wykorzystana w diagnostyce klinicznej. Wyniki uzyskane tą metodą były zasadniczo porównywalne z uzyskanymi metodą MSP i pirosekwencjonowania, ale w odróżnieniu od tej ostatniej były łatwiejsze do uzyskania. Z drugiej strony badania te ujawniły, że każda z tych technik ocenia inne wyspy CpG, co musi być brane pod uwagę przy interpretacji wyników. Mikromacierze badanie metylomu Odkąd w 1995 roku zespół naukowców ze Stanford University opublikował pracę zatytułowaną Quantitative monitoring of gene expression patterns with a complementary DNA microarray [16] technologia mikromacierzy rozwinęła się na tyle, by znaleźć zastosowanie w badaniach nad ekspresją genów, badaniach polimorfizmów pojedynczego nukleotydu jak również w badaniach epigenetycznych. Istotą technologii produkcji mikromacierzy jest wykorzystanie możliwości umieszczenia na błonach nylonowych albo silikonowych lub szklanych płytkach bardzo wielu fragmentów oligonukleotydowych lub cdna. Zestaw sond przytwierdzony jest do płytki w ściśle określonej lokalizacji. Sondy te syntetyzowane są najczęściej in situ (bezpośrednio na płytce), co zapewnia wysoką gęstość mikromacierzy i umożliwia umieszczenie na niewielkiej powierzchni nawet kilkudziesięciu tysięcy sond. W mikromacierzach przeznaczonych do analizy metylomu dla każdego dinukleotydu CpG tworzone są dwie sondy oligonukleotydowe jedna specyficzna dla sekwencji zmetylowanej, druga niezmetylowanej. Oligonukleotydy są tak skonstruowane, aby były komplementarne do sekwencji DNA po reakcji z wodorosiarczanem IV bądź fragmentów uzyskanych w wyniku trawienia metylospecyficznymi enzymami restrykcyjnymi lub immunoprecypitacji. Analizowany materiał po wyznakowaniu znacznikiem fluorescencyjnym hybrydyzuje z sondami mikromacierzy, a uzyskane sygnały są opracowane przy pomocy specjalistycznych programów bioinformatycznych [18]. Analiza metylomu możliwa jest dzięki zastosowaniu mikromacierzy oferowanych m.in przez firmy Panomics i Illumina. Mikromacierze firmy Panomics (ryc. 4) wykorzystują enzymy restrykcyjne do trawienia genomowego DNA w celu otrzymania fragmentów zawierających wyspy CpG. Do lepkich końców otrzymanych w ten sposób fragmentów dołączane są fragmenty DNA o znanej sekwencji zwane adaptorami. W kolejnym etapie DNA inkubuje się z białkami wiążącymi grupę metylową np. MIRA [14] w wyniku czego tworzone są kompleksy zmetylowane DNA-białko. Po usunięciu białek w kolejnym etapie DNA znakuje się znacznikiem fluorescencyjnym przy pomocy biotynylowanych dctp w reakcji PCR, po czym dokonuje się hybrydyzacji powstałych fragmentów z sondami umieszczonymi na płytce mikromacierzowej. Nieco inna technologia oferowana jest przez firmę Illumina, która do badania metylacji oferuje trzy różne rodzaje mikromacierzy, tj. Infinium Methylation, Goldengate Methylation i Veracode Methylation. We wszystkich DNA poddaje się reakcji z wodorosiarczanem IV. Stopień metylacji poszczególnych wysp CpG, oceniany jest jako stosunek sygnałów fluorescencyjnych pochodzących od zmetylowanych cytozyn, do sumy sygnałów cytozyn zmetylowanych i niezmetylowanych po amplifikacji techniką PCR 171

6 Markery epigenetyczne w diagnostyce: Metody oceny metylacji DNA Rycina 4. Analiza metylacji techniką mikromacierzy. Genomowe DNA jest trawione przy użyciu enzymów restrykcyjnych rozpoznających sekwencję TTAA. Frakcję wzbogaconą w zmetylowane wyspy CpG uzyskuje się na drodze immunoprecypitacji z białkami MBD (methyl binding domains). Po oddzieleniu białek z kompleksu, DNA hybrydyzuje z płytką mikromacierzową. Detekcja i analiza sygnałów od poszczególnych sond użytych do stworzenia mikromacierzy daje informację o metylacji badanego DNA. i hybrydyzacji do tzw. macierzy koralikowej (ang. bead array). Waha się on w granicach od 0 (brak metylacji) do 1 (pełna metylacja). Zestaw Infinium Methylation umożliwia analizę ponad wysp CpG rozlokowanych w obrębie całego genomu, w 12 próbkach jednocześnie. Niewątpliwie imponująca ilość analizowanych loci daje ogrom informacji o badanych próbkach, jednak analiza i interpretacja wyników nie należą do najłatwiejszych i wymagają zastosowania odpowiednich algorytmów do hierarchizacji danych. Zestaw Goldengate Methylation pozwala na analizę ponad wysp CpG, zlokalizowanych w obrębie 807 genów, w tym onkogenów, genów supresorowych, genów naprawczych, kontrolujących podziały komórkowe czy apoptozę. Zasada, którą wykorzystuje Illumina Goldengate oparta jest na ukierunkowanej amplifikacji wysp CpG metodą PCR przy zastosowaniu starterów odróżniających uracyl od 5-metylocytozyn. Przy jej zastosowaniu możliwa jest ilościowa ocena metylacji stanowiącej zaledwie 2,5% danej sekwencji [1]. Możliwe jest również zamówienie mikromacierzy ze specjalnie dobranymi sondami. Z kolei zestaw Veracode umożliwia analizę większej ilości próbek, ale dla mniejszej (od kilkudziesięciu do kilkuset) ilości wysp CpG. Jak wszystkie mikromacierze, tak i te umożliwiające analizę metylomu, są przede wszystkim narzędziem, które pozwala wyselekcjonować geny, które z powodu zmienionej metylacji mogą być przydatne jako epigenetyczne markery określonych procesów chorobowych. 172

7 A. Majchrzak i W. Baer-Dubowska Perspektywy zastosowania analizy metylacji DNA w diagnostyce Analiza metylacji DNA stała się ważnym narzędziem w badaniu molekularnego podłoża wielu chorób, szczególnie nowotworów i zrozumienia tkankowo-specyficznej ekspresji genów. Jednak uzyskanie wiarygodnych danych w odniesieniu do metylacji DNA nie jest zadaniem prostym. Wiąże się to z jednej strony z heterogennością większości tkanek, co sprawia, że trudno jest przypisać sygnał metylacji specyficznemu typowi komórek, z drugiej zaś z faktu, że żadna z coraz szerszego zestawu metod nie spełnia wszystkich kryteriów pozwalających na uzyskanie jednoznacznych danych na temat metylacji DNA. Jakość i ilość wyjściowego DNA jest czynnikiem ograniczającym analizę. Większość metod wymaga >1 µg wysokiej jakości DNA. Z tego powodu DNA pozyskiwany z bloków parafinowych może dostarczyć raczej tylko ograniczonej informacji. Należy też brać pod uwagę możliwość dalszej degradacji DNA w trakcie najczęściej stosowanej reakcji z wodorosiarczanem IV. W przypadku analizy metylacji pojedynczych genów należy też brać pod uwagę fakt, że różne metody analizy oceniają rożne wyspy CpG, co może utrudniać interpretację uzyskanych danych. Co więcej widać coraz wyraźniej, że poszerzony panel markerów hipermetylacji promotorów genów pozwala na bardziej wiarygodną ocenę zmian genetycznych związanych z określoną jednostką chorobową. Przykładem może być analiza porównawcza kombinacji hipermetylowanych genów w ślinie i surowicy pacjentów z rakami głowy i szyi i osób zdrowych, która wykazała, że analiza pojedynczych genów uniemożliwia prawidłową interpretację różnic obserwowanych w obydwu grupach m.in. dlatego, że profil metylacji niektórych genów komórek prawidłowych i nowotworowych pokrywał się. Ponadto badania te potwierdziły, że markery epigenetyczne mogą być wykrywane w tych płynach ustrojowych [3]. Wydaje się również, że metylację DNA powinno się interpretować w kontekście innych cech epigenetycznych, szczególnie transkrypcji, aby lepiej ocenić skutki jej zakłócenia. Obserwowany w tempie logarytmicznym wzrost nowych technologii pozwala mieć nadzieję, że w niedalekiej przyszłości dostępne będą handlowe mikromacierze/ testy pozwalające na kompleksową analizę markerów epigenetycznych po stosunkowo niskich kosztach. Zanim to jednak nastąpi, jak przy każdej innej analizie, wybierając metodę do oceny metylacji, trzeba wziąć pod uwagę typ, ilość i jakość analizowanego materiału biologicznego, warunków laboratorium i posiadanego specjalistycznego wyposażenia. Piśmiennictwo 1. Bibikova M, Lin Z, Zhou L i wsp. High-throughput DNA methylation profiling using bead arrays. Genome Res 2006; 16: Broszkiewicz A, Szalata M, Bigos A i wsp. Analiza metylacji DNA [w:] Analiza DNA teoria i praktyka. Red. R Słomski. Wydawnictwo Uniwersytetu Przyrodniczego w Poznaniu. Poznań 2008, Carvalho AL, Jeronimo C, Kim MM i wsp. Evaluation of promoter hypermethylation detection in body fluids as a screening/ diagnosis tool for head and neck squamous cell carcinoma. Clin Cancer Res 2008; 14: Dahl C, Guldberg P. DNA metylation analysis techniques. Biogerontology 2003; 4: del Gaudio R, Di Giaimo R, Geraci G i wsp. Genome methylation of the marine annelid worm Chaetopterus variopedatus: methylation of a CpG in an expressed H1 histone gene. FEBS Lett 1997; 417: Down TA, Rakyan VK, Turner DJ i wsp. A bayesian deconvolution strategy for immunoprecipitation-based DNA methylome analysis. Nature Biotech 2008; 26: Gargiulo G, Minucci S. Epigenomic profiling of cancer cells. Int J Biochem Cell Biol 2009; 41: Jeuken JW, Cornelissen SJ, Vriezen M i wsp. MS-MLPA: an attractive alternative laboratory assay for robust, reliable, and semiquantitative detection of MGMT promoter hypermethylation in gliomas. Lab Invest 2007; 87: Kuo KC, McCune RA, Gehrke CW i wsp. Quantitative reversedphase high performance liquid chromatographic determination of major and modified deoxyribonucleosides in DNA. Nucleic Acids Res 1980, 8, Nephew KP, Balch C, Skalnik DG. Methyl group acceptance assay for the determination of global DNA methylation levels. Methods Mol Biol 2009; 507: Nygren AO, Ameziane N, Duarte HM i wsp. Methylation-Specific MLPA (MS-MLPA): simultaneous detection of CpG methylation and copy number changes of up to 40 sequences. Nucleic Acids Res 2005; 33: Paluszczak J, Baer-Dubowska W. Epigenetic diagnostics of cancer the application of DNA methylation markers. J Appl Genet 2006; 47: Priolo M, Sparago A, Mammi C i wsp. MS-MLPA is a specific and sensitive technique for detecting all chromosome 11p15.5 imprinting defects of BWS and SRS in a single-tube experiment. Eur J Hum Genet 2008; 16: Rauch T, Li H, Wu X i wsp. MIRA-assisted microarray analysis, a new technology for determination of DNA methylation patterns identifies frequent methylation of homeodomain-containing genes in lung cancer cells. Cancer Res 2006; 66: Shaw RJ, Hall GL, Lowe D i wsp. The role of pyrosequencing in head and neck cancer epigenetics: correlation of quantitative methylation data with gene expression. Arch Otolaryngol Head Neck Surg 2008; 134: Schena M, Shalon D, Davis RW i wsp. Quantitative monitoring of gene expression patterns with a complementary DNA microarray. Science 1995; 270: Schmitt F, Oakeley E, Jost JP. Antibiotics induce genome-wide hypermethylation in cultured Nicotiana tabacum plants. J Biol Chem 1997; 272: Schumacher A, Kapranov P, Kaminsky Z i wsp. Microarraybased DNA methylation profiling: technology and applications. Nucleic Acids Res 2006; 34: Sulewska A, Niklińska W, Kozłowski M i wsp. Detection of DNA methylation in eucariotic cells. Folia Histochem Cytobiol 2007; 45: Adres Autorów: Katedra Biochemii Farmaceutycznej Uniwersytet Medyczny w Poznaniu ul. Święcickiego Poznań baerw@ump.edu.pl (Praca wpłynęła do Redakcji: ) (Praca przekazana do opublikowania: ) 173