Regulacja ekspresji genów w komórkach drożdży metylotroficznych

Transkrypt

1 Regulacja ekspresji genów w komórkach drożdży metylotroficznych STRESZCZENIE Drożdże metylotroficzne to unikalne organizmy eukariotyczne, które potrafią metabolizować toksyczny, jednowęglowy substrat, jakim jest alkohol metylowy. Znanych jest około 50 gatunków drożdży metylotroficznych, spośród których najlepiej zbadane zostały 4 gatunki: Pichia methanolica, Hansenula polymorpha, Pichia pastoris i Сandida boidinii. Powyższe organizmy, a szczególnie P. pastoris i H. polymorpha są perspektywicznymi producentami białek heterologicznych i obecnie wykorzystuje się je do przemysłowej produkcji niektórych z nich. W niniejszym przeglądzie przedstawiono organizację genomu, sposoby regulacji ekspresji genów oraz zasady wykorzystania promotorów tych gatunków drożdży do konstruowania producentów białek heterologicznych. Analizowano szczególnie prace dotyczące genetycznej kontroli węglowej i azotowej represji katabolicznej u H. polymorpha. Przedstawiono również prace dotyczące identyfikacji metabolitów indukujących represję kataboliczną oraz selektywną autofagię peroksysomów u drożdży Pichia methanolica rosnących na podłożu z etanolem. WPROWADZENIE Drożdże, podobnie jak inne mikroorganizmy, wykorzystują do swojego wzrostu w pierwszej kolejności fermentowalne źródła węgla, takie jak glukoza. W przypadku ich braku lub zużycia, mogą wykorzystywać także niefermentowalne źródła węgla, takie jak glicerol, etanol czy metanol. Drożdże wykorzystujące metanol, jako jedyne źródło węgla i energii, zwane są drożdżami metylotroficznymi. Należą one między innymi do rodzajów: Candida, Pichia, Hansenula. Obecność glukozy w podłożu powoduje u tych organizmów represję szlaku metabolizmu metanolu na drodze glukozowej represji katabolicznej. Z kolei brak glukozy i obecność metanolu w podłożu powoduje indukcję szlaku metylotroficznego. Mechanizm tej regulacji zwany jest również derepresją lub indukcją metanolową. Metanol jest silnym induktorem promotorów genów kodujących enzymy niezbędne dla metabolizmu tego jednowęglowego substratu. W oparciu o te promotory opracowano efektywne systemy ekspresji białek heterologicznych u kilku gatunków drożdży metylotroficznych, takich jak: Pichia pastoris, Hansenula polymorpha, Pichia methanolica i Candida boidinii. Poznanie genomu oraz mechanizmów regulacji ekspresji genów szlaku metylotroficznego jest niezwykle istotne, gdyż w pełni umożliwi wykorzystanie ogromnego potencjału tych gatunków drożdży w różnych procesach biotechnologicznych [1]. Dorota Grabek-Lejko 1 Vladimir Sibirny 1 Andriy Sibirny 1,2, 1 Uniwersytet Rzeszowski, Rzeszów 2 Instytut Biologii Komórki Narodowej Akademii Nauk Ukrainy, Lwów, Ukraina Uniwersytet Rzeszowski, ul. Zelwerowicza 4, Rzeszów, Polska, tel. (17) lub Instytut Biologii Komórki Narodowej Akademii Nauk Ukrainy, ul. Dragomanowa 14/16, Lwów Ukraina, sibirny@yahoo. com Artykuł otrzymano 28 czerwca 2012 r. Artykuł zaakceptowano 6 grudnia 2012 r. Słowa kluczowe: drożdże metylotroficzne, ekspresja genów, Hansenula polymorpha, Pichia pastoris, Pichia methanolica, Candida boidinii Wykaz skrótów: ARS autonomicznie replikujące się sekwencje (ang. autonomously replicating sequence); DAS syntaza dihydroksyacetonu; DHA dihydroksyaceton; DHAP fosforan dihydroksyacetonu; FAD dinukleotyd flawinoadeninowy; GAP aldehyd 3-fosfoglicerynowy; GSH glutation; NAD + / NADH dinukleotyd nikotynamidoadeninowy utleniony/zredukowany METABOLIZM METANOLU U DROŻDŻY Analiza mechanizmów regulacji metabolizmu metanolu u drożdży wymaga przedstawienia szlaku katabolizmu tego jednowęglowego substratu oraz enzymów w nim uczestniczących. Reakcje enzymatyczne zachodzące w szlaku katabolizmu metanolu są analogiczne u wszystkich dotąd zbadanych gatunków drożdży, dlatego też opisano je bez uwzględniania gatunku. Pierwsza część szlaku metylotroficznego przebiega w peroksysomach, natomiast druga w cytosolu. W pierwszym etapie utylizacji zachodzącym w peroksysomach, metanol, w reakcji katalizowanej przez enzym oksydazę alkoholową (EC ), utleniany jest do dwóch toksycznych związków: formaldehydu i nadtlenku wodoru. H 2 O 2 może być rozłożony do tlenu i wody nie tylko przez katalazę (EC ) [2,3], ale również przez białko błony peroksysomalnej, Pmp20 (peroksyredoksynę) [4] (Ryc. 1). Formaldehyd natomiast może być utleniony w kilku kolejnych reakcjach do dwutlenku węgla (szlak dysymilacyjny) lub zostać zasymilowany do wielowęglowych związków poprzez kondensację z ksylulozo-5-fosforanem (szlak asymilacyjny). Oddziaływanie formaldehydu z ksylulozo-5-fosforanem katalizowane jest przez odpowiednią transketolazę, syntazę dihydroksyacetonu (DAS) (EC ) zlokalizowaną w peroksysomach Postępy Biochemii 59 (1)

2 Formaldehyd powstający w peroksysomach w reakcji oksydazy alkoholowej, może być w tych organellach zasymilowany do związków wielowęglowych lub wydzielony do cytosolu, gdzie ulega dysymilacji do CO 2 i H 2 O. W szlaku dysymilacyjnym nie bierze udziału wolny formaldehyd, tylko produkt jego spontanicznej reakcji z glutationem (GSH). Powstały S-hydroksymetyloglutation zostaje utleniony w kolejnych dwóch reakcjach katalizowanych przez zależną od GSH i NAD + dehydrogenazę formaldehydu (EC ) oraz zależną od NAD + dehydrogenazę mrówczanową (EC ). Produktem reakcji katalizowanej przez pierwszą z dehydrogenaz jest S-formyloglutation, natomiast substratem dla drugiej dehydrogenazy jest mrówczan. Przemiana formyloglutationu do mrówczanu zachodzi w dodatkowej reakcji enzymatycznej katalizowanej przez hydrolazę S-formyloglutationu (EC ). U drożdży H. polymorpha hydrolaza S-formyloglutationu związana jest z dehydrogenazą formaldehydu [3]. Przyjmuje się, że NADH, powstały w dwóch kolejnych reakcjach odwodorowania, wykorzystywany jest do produkcji energii w postaci ATP podczas wzrostu drożdży na metanolu [6]. Istnieje również alternatywna hipoteza, według której głównym celem utleniania formaldehydu w cytoplazmie jest jego detoksykacja [7]. Częściowa detoksykacja może zachodzić również w reakcji katalizowanej przez reduktazę formaldehydu, będącej odwrotnością reakcji katalizowanej przez dehydrogenazę alkoholową [2]. Mutanty z defektem dehydrogenazy formaldehydu są znacznie bardziej wrażliwe na egzogenny metanol, niż mutanty z defektem dehydrogenazy mrówczanowej, co świadczy o znacznie wyższej toksyczności formaldehydu w porównaniu do mrówczanu [6-8]. Szlak dysymilacji metanolu odgrywa główną rolę w metabolizmie metylowanych źródeł azotu, takich jak metyloamina czy cholina, gdzie formaldehyd jest produktem ubocznym [9] (Ryc. 1). Hansenula polymorpha Rycina 1. Schemat metabolizmu metanolu u drożdży [64]. 1 oksydaza alkoholowa, 2 katalaza, 3 dehydrogenaza formaldehydu, 4 dehydrogenaza mrówczanowa, 5- syntaza dihydroksyacetonu, 6- kinaza dihydroksyacetonu, 7- aldolaza fruktozo-1,6-bifosforanu, 8 fruktozo-1,6-bifosfataza, 9 reduktaza formaldehydu; rekacje przegrupowania szkieletu węglowego w szlaku pentozofosforanowym. [3]. DAS przekształca formaldehyd i ksylulozo-5-fosforan do dwóch trójwęglowych związków: dihydroksyacetonu (DHA) oraz aldehydu 3-fosfoglicerynowego (GAP), które w kolejnych reakcjach metabolizowane są w cytosolu (Ryc. 1). DHA ulega fosforylacji pod wpływem kinazy dihydroksyacetonu (EC ), tworząc fosforan dihydroksyacetonu (DHAP). DHAP oraz GAP metabolizowane są w szlakach pentozofosforanowym i glikolizy, w których z trzech cząsteczek formaldehydu powstaje netto jedna cząsteczka związku trójwęglowego oraz odtwarzany jest ksylulozo- -5-fosforan. Jedna trzecia powstałych cząsteczek DHAP wykorzystana zostaje natomiast w procesie glukoneogenezy [2,5]. Hansenula polymorpha to gatunek drożdży o niezwyle wysokiej termotolerancji rosnący w rekordowo wysokich temperaturach, do 50 о С [10]. Maksymalna temperatura wzrostu tego organizmu jest najwyższa spośród wszystkich znanych gatunków drożdży oraz tylko o 10 о С niższa od najwyższej temperatury, w jakiej mogą rosnąć znane organizmy eukariotyczne. Gatunek ten jest wykorzystywany na szeroką skalę w badaniach biotechnologicznych oraz w przemyśle i spośród drożdży metylotroficznych ustępuje jedynie drożdżom Pichia pastoris. H. polymorpha, wspólnie z P. pastoris, jest najlepszym obiektem dla badań w zakresie biologii komórki, zwłaszcza biogenezy i degradacji peroksysomów. Ponadto H. polymorpha jest jedynym gatunkiem drożdży metylotroficznych wykorzystywanym do konstruowania producentów bioetanolu z surowców roślinnych oraz gliceryny [11,12]. H. polymorpha jest również konkurencyjnym producentem glutationu w stosunku do innych drożdżowych i bakteryjnych producentów [13]. DOSTĘPNE SZCZEPY Obecnie w badaniach wykorzystywane są trzy szczepy H. polymorpha o różnym pochodzeniu: DL-1, CBS4732 oraz NCYC495. Szczepy CBS4732 i NCYC495 wykazują wysoką homologię w sekwencji nukleotydowej genów. Szczep DL-1 nie krzyżuje się ze szczepami CBS4732 i NCYC495, natomiast te dwa ostatnie można ze sobą krzyżować [14]. W systematyce drożdży miejsce dla szczepów podanych jako H. polymorpha nie jest do końca określone. Rodzaj Hansenula H. i P. Sydow zawiera askosporogenne gatunki o komórkach kształtu kulistego, owalnego, wydłużonego lub cylindrycznego. Worki tych gatunków zawierają od 1 do 4 zarodników. Większość gatunków z rodzaju Hansenula jest heterotallicznych, natomiast H. polymorpha jest również gatunkiem homotallicznym, zdolnym do przejścia z formy haploidalnej do diploidalnej [15]. Komórki drożdży H. polymorpha akumulują trehalozę, jako czynnik ochronny podczas wzrostu w wysokich temperaturach. Termotolerancyjność może być dodatkowo zwiększona poprzez delecję genu ATH1, kodującego enzym kwaśną trehalazę lub poprzez nadekspresję genów HSP16 oraz HSP104 kodujących białka szoku cieplnego [10]. Po analizie reasocjacji DNA/DNA zaproponowano likwidację rodzaju Hansenula i zmianę nazwy H. polymorpha na Pichia angusta, gdyż rodzaj Hansenula różni się od Pichia tylko zdolnością do asymilacji azotanów jako źródła azotu [16]. Wielu czołowych ekspertów w dziedzinie taksonomii drożdży zaakceptowało tę zmianę. Proponowane były również inne nazwy dla tego gatunku: Torulopsis methanothermo, Hansenula angusta i Ogataea polymorpha [17]. Według ostatnich danych, szczepy H. polymorpha CBS4732 i NCYC495 należą do gatunku Ogataea polymorpha a szczep H. polymor- 96

3 pha DL-1 do gatunku Ogataea parapolymorpha (G.I. Naumov, informacja ustna). W niniejszym przeglądzie używana jest ogólnie przyjęta nazwa H. polymorpha. METODY GENETYCZNE W doświadczeniach genetycznych wykorzystuje się szczepy CBS4732 i NCYC495 oraz ich pochodne. Szczep NCYC495 okazał się najlepszym pod względem zdolności do koniugacji i sporulacji, jednak wykazuje on słaby wzrost w podłożu z metanolem. Ze szczepu CBS4732 o nieefektywnej sporulacji i koniugacji skonstruowano i wyizolowano szczepy charakteryzujące się efektywną koniugacją i sporulacją oraz zwiększoną zdolnością do tworzenia czterozarodnikowych worków, umożliwiając tym samym analizę tetrad. Spośród tych mutantów wyizolowano następnie 30 mutantów auksotroficznych oraz mutanty innych typów (m.in. o zmienionej morfologii czy też z niezdolnością do asymilacji różnych źródeł węgla). Większość analizowanych w tych szczepach markerów wykazywała typową mendlowską segregację podczas mejozy. Częstotliwość formowania się worków zawierających po 4 spory była w tym przypadku niższa aniżeli u Saccharomyces cerevisiae, co świadczy o niższej częstości rekombinacji w trakcie drugiego podziału mejotycznego [14]. Trzeci z przedstawionych szczepów tj. DL-1 okazał się doskonałym obiektem do prowadzenia badań molekularno-genetycznych. Zalety tego szczepu to najwyższa szybkość wzrostu oraz wysoka częstość rekombinacji homologicznej [18]. Opracowano i adaptowano wiele metod badawczych umożliwiających prowadzenie badań molekularnych u drożdży H. polymorpha. Skonstruowano tzw. kasetę pop-out, z genem HpURA3 jako markerem selekcyjnym, wykorzystywaną do pozytywnej selekcji transformantów z użyciem wektorów ekspresyjnych. Pierwotnie metoda transformacji z wykorzystaniem mutantów ura3 i genu URA3, jako markera selekcyjnego, opracowana została dla szczepu CBS4732 [19]. Do transformacji wykorzystuje się także mutanty leu2 i heterologiczny gen LEU2 z S. cerevisiae jako marker selekcyjny [20]. Dostosowano również metody z wykorzystaniem kilku dominujących markerów oporności do antybiotyków, takich jak genetycyna (G418) oraz zeocyna [11]. Transformację prowadzono różnymi metodami: z wykorzystaniem chlorku litu (LiCl), użyciem protoplastów w obecności glikolu polietylenowego [21] lub elektroporacji [22]. Opracowano również metody dysrupcji genów u H. polymorpha, w tym z wykorzystaniem zmodyfikowanego systemu Cre-loxP [18]. GENOM H. polymorpha Obecnie znane są sekwencje genów omówionych powyżej 3 szczepów H. polymoprha. Całkowity genom szczepu CBS4732 został zbadany [23], ale dostęp do tej informacji nie jest w tej chwili możliwy, ponieważ firma Rhein Biotech GmbH, właściciel sekwencji, utraciła do niej dostęp (M. Piontek, informacja ustna). Z kolei opis genomu szczepu DL-1 jest własnością Koreańskiego Instytutu Badawczego Nauk Biologicznych i Biotechnologii KRIBB (H.A. Kang, informacja ustna). Dane na temat sekwencji nukleotydów w genomie szczepu NCYC495 są efektem niedawno zakończonego projektu badawczego jednego z autorów tego przeglądu (A Sibirny), dotyczącego opracowania kompletnej sekwencji genomu w Joint Genome Institute, US Department of Energy i są to informacje ogólnodostępne (patrz: genome.jgi-psf.org/hanpo1/hanpo1.home.html). Elektroforeza pulsacyjna DNA 9 różnych szczepów H. polymorpha wykazała znaczne różnice w ilości chromosomów u poszczególnych szczepów od 2 do 6. Jednakże na podstawie otrzymanych wyników nie można wnioskować o dokładnej ilości chromosomów u badanych drożdży [24]. Elektroforeza pulsacyjna materiału genetycznego H. polymorpha CBS4732 i DL-1 wykazała, że oba szczepy posiadają po 6 chromosomów o rozmiarach od 0,9 do 1,9 Mb, chociaż obraz elektroforetyczny tych chromosomów u obu szczepów jest zupełnie inny. Identyczność sekwencji otwartych ramek odczytu wybranych genów wahała się od 94,5 do 97,2%, ze średnią 96,6%. Świadczy to o bliskim pokrewieństwie obu szczepów. Różnice w sekwencjach są znacznie bardziej istotne dla 5 i 3 sekwencji nietranslacyjnych, które mogą brać udział w regulacji ekspresji genów. Sekwencjonowanie materiału genetycznego szczepu CBS4732 pozwoliło scharakteryzować 8,733 Mb połączonych w 48 kontigów. Sekwencja ta obejmuje około 90% całego genomu o rozmiarze 9,5 Mb, rozmieszczonego na 6 chromosomach o wielkości od 0,9 do 2,2 Mb. W sekwencjonowanym fragmencie o rozmiarze 8,73 Mb wykazano obecność 5848 otwartych ramek odczytu dla białek o rozmiarach większych niż 80 aminokwasów. Zidentyfikowano 389 otwartych ramek odczytu dla białek zawierających mniej niż 100 aminokwasów otwartych ramek odczytu (81,6%) wykazuje homologię w stosunku do znanych białek. Wykazano, że średnia gęstość rozmieszczenia genu w obrębie genomu, to 1 gen na 1,5 Kb, natomiast białko zawiera średnio 440 aminokwasów. Wykorzystując program GeneWise wykazano obecność 91 intronów w genomie. Zidentyfikowano ponadto 80 różnych trna odpowiadających wszystkim 20 aminokwasom. Analiza funkcjonalna genomu (anotacja) umożliwiła podział genów w zależności od prawdopodobnie pełnionych funkcji: 4% metabolizm energetyczny, 3% przekazywanie sygnałów, komunikacja komórkowa, 6% synteza białek, 4% odpowiedź na stres, obrona komórkowa, 9% transport, 9% cykl komórkowy, 17% obróbka białek, 13% transkrypcja, 19% metabolizm [15]. Genom H. polymorpha (NCYC495 leu1.1) ma rozmiar około 8,97 Mb i zawiera 5162 otwartych ramek odczytu ( genome.jgi-psf.org/hanpo1/hanpo1.home.html). Na podstawie danych sekwencjonowania opracowano system analizy ekspresji RNA. System ten wykorzystywany jest obecnie do analizy regulacji transkrypcji u H. polymorpha, a w szczególności regulacji ekspresji genów w zależności od źródeł węgla [25]. MECHANIZMY INDUKCJI SYNTEZY BIAŁEK U H. polymorpha U H. polymorpha, podobnie jak u innych drożdży metylotroficznych, metanol indukuje syntezę enzymów szlaku metylotroficznego, zlokalizowanych zarówno w cytosolu (dehydrogenaza formaldehydu, dehydrogenaza mrówczanu, kinaza dihydroksyacetonu, fruktozo-1,6-bisfosfataza), jak i w peroksysomach (oksydaza alkoholowa, katalaza, syntaza Postępy Biochemii 59 (1)

4 dihydroksyacetonu), a także indukuje wzrost i proliferację peroksysomów [26]. Przeniesienie komórek z podłoża z metanolem na podłoże z glukozą lub etanolem powoduje represję syntezy tych enzymów oraz jednocześnie autofagiczną degradację peroksysomalnych enzymów katabolizmu metanolu [26,27]. Analiza transkrypcyjna genomu H. polymorpha wykazała, że po 2 godzinach od przeniesienia komórek z podłoża zawierającego glukozę na podłoże z metanolem, 1184 geny z około 6000 znanych (około 20%) wykazywało co najmniej dwukrotnie zwiększony poziom ekpresji, z kolei ekspresja innych 20% genów (1246) uległa dwukrotnemu zmniejszeniu. Najwyższą indukcję ekspresji zaobserwowano dla genów głównego regulatora metabolizmu metanolu MPP1 (394 razy) i FMD, kodującego dehydrogenazę mrówczanową (347 razy). Indukcja ekspresji pozostałych genów metabolizmu metanolu była znacznie słabsza (do 40 razy). Metanol nieznacznie aktywował ekspresję genów PEX, kodujących białka peroksysomalne (do 5 razy), a także niektórych genów ATG uczestniczących w peksofagii (także do 5 razy). Silnie aktywowana była natomiast ekspresja genów kodujących enzymy β-oksydacji kwasów tłuszczowych, szlaku glioksylowego oraz w szczególnym stopniu (111 razy) mitochondrialnego transportera kreatyniny [28]. Produkt genu MPP1 należy do rodziny białek Zn(II) 2 Cys 6 regulatorów transkrypcji. Mutant mрр1 nie wykazywał wzrostu na podłożu z metanolem jako jedynym źródle węgla i energii oraz charakteryzował się silnie obniżonym poziomem białek peroksysomalnych oraz enzymów katabolizmu metanolu, a jednego z nich, syntazy dihydroksyacetonu, nie posiadał w ogóle. Dla mutanta mрр1 obecność metanolu w podłożu nie prowadziła do proliferacji peroksysomów, komórki posiadały tylko po jednym peroksysomie, który nie ulegał degradacji po przeniesieniu tych komórek na podłoże z glukozą. Mechanizm aktywacji trakskrypcji produktem genu MPP1 pozostaje jednak niewyjaśniony [29]. Gen MPP1 u H. polymorpha przypomina odkryte w późniejszym terminie czynniki traksrypcyjne innych gatunków drożdży jak MXR1 P. pastoris [30] i TRM1 C. boidinii [31], które także są niezbędne dla ekspresji genów metabolizmu metanolu oraz biogenezy peroksysomów. KONTROLA GENETYCZNA WĘGLOWEJ REPRESJI KATABOLICZNEJ U H. polymorpha Węglowa represja kataboliczna to proces polegający na tym, że obecność łatwo przyswajalnego substratu węglowego, np. glukozy wywołuje represję syntezy enzymów potrzebnych do wykorzystania innych potencjalnych substratów [32]. Zarysy mechanizmów represji katabolicznej poznane są dla drożdży z gatunku S. cerevisiae, jednak praktycznie nie są wyjaśnione dla drożdży metylotroficznych. U S. cerevisiae represja kataboliczna kontrolowana jest na poziomie transkrypcji poprzez represory transkrypcyjne MIG1 oraz MIG2, aktywatory trakskrypcji oraz różne kinazy białkowe [32,33]. Znana jest także istotna rola genu HXK2 (kodującego heksokinazę 2) w represji katabolicznej u S. cerevisiae [32]. U H. polymorpha represja kataboliczna indukowana jest zarówno przez glukozę jak i etanol, przy czym etanol wybiórczo hamuje wyłącznie syntezę enzymów metabolizmu metanolu, podczas gdy glukoza dodatkowo hamuje także syntezę enzymów niezbędnych dla metabolizmu innych alternatywnych substratów węglowych, np. maltozy [34,35]. W przeciwieństwie do H. polymorpha, etanol nie powoduje represji katabolicznej u S. cerevisiae. Mechanizm represji katabolicznej indukowany etanolem nie został zbadany u H. polymorpha, w przeciwieństwie do innego gatunku drożdży metylotroficznych P. methanolica (patrz niżej). U H. polymorpha badano wpływ glukozy na syntezę enzymów katabolizmu metanolu i maltozy. Istnieje wiele doniesień o mutantach H. polymorpha zdolnych do syntezy peroksysomów i enzymów metabolizmu metanolu w podłożu z glukozą, bez metanolu [36-39]. Jednakże właściwości niektórych mutantów nie były do końca zbadane, stąd też nie zostały zidentyfikowane uszkodzone geny [36,38]. U jednego z mutantów z uszkodzoną represją pokazano, że mutacja ta jest recesywna, monogenowa i oznaczono ją jako glr1. Mutacja ta prowadziła do syntezy enzymów metabolizmu metanolu, ekspresji mrna oksydazy alkoholowej oraz syntezy peroksysomów na podłożu z glukozą, ale bez metanolu. Mutacja ta nie wpływała na zmiany w represji enzymów szlaku metylotroficznego przez etanol, co świadczy o istnieniu u H. polymorpha dwóch odrębnych mechanizmów represji katabolicznej indukowanych glukozą i etanolem [37]. W innej pracy dowiedziono, że glukozowa represja kataboliczna enzymów szlaku metylotroficznego (oksydazy alkoholowej i katalazy) była zniesiona u podwójnego mutanta H. polymorpha z defektem heksokinazy i glukokinazy (dwóch enzymów katalizujących fosforylację glukozy). U pojedynczych mutantów, z defektem glukokinazy lub heksokinazy glukoza w dalszym ciągu powodowała represję enzymów metabolizmu metanolu. Dla zniesienia represji katabolicznej indukowanej przez fruktozę wystarczył tylko defekt heksokinazy (enzymu katalizującego fosforylację fruktozy). Można wnioskować, że glukozowa czy fruktozowa represja kataboliczna u H. polymorpha wymaga obecności odpowiednich enzymów katalizujących fosforylację tych cukrów [40]. Wprowadzenie natywnego genu glukokinazy do podwójnego mutanta z blokiem glukokinazy i heksokinazy przywracało zdolność do fosforylacji glukozy i represję kataboliczną w podłożu z tym cukrem [41], a genu heksokinazy, represję w podłożach z glukozą lub fruktozą [42]. Z kolei wprowadzenie genu glukokinazy H. polymorpha do potrójnego mutanta S. cerevisiae z defektem trzech enzymów, dwóch heksokinaz i glukokinazy, nie przywracało represji katabolicznej, co świadczy o różnych rolach enzymów fosforylujących glukozę w represji katabolicznej drożdży metylotroficznych i piekarskich [41]. Otrzymano również mutanta H. polymorpha gcr1 ze zniesioną represją kataboliczną. Mutant ten charakteryzował się plejotropowym uszkodzeniem metabolizmu, zwłaszcza konstytutywną syntezą enzymów peroksysomalnych (oksydazy alkoholowej i katalazy) i konstytutywną proliferacją peroksysomów na podłożu z glukozą (ale nie etanolem); zmniejszeniem puli intermediatów glikolizy przy niezmienionym poziomie enzymów glikolitycznych; naruszeniem represji katabolicznej enzymów cytosolowych tj. dehydrogenaz: formaldehydu i mrówczanu oraz α-glukozydazy. In- 98

5 teresującym jest, że u mutanta gcr1 transport glukozy został uszkodzony, szczególnie przy niskim stężeniu tego cukru, dlatego nie można wykluczyć, ze białko Gcr1 jest transporterem glukozy. Można wywnioskować również, że do represji katabolicznej wymagany jest efektywny transport i fosforylacja cukru. U mutanta gcr1 wykazano zaburzenie represji katabolicznej również przy wysokim stężeniu glukozy w podłożu, chociaż pobieranie tego cukru z podłoża zachodziło porównywalnie do dzikiego szczepu. Sugerowano więc, że białko Gcr1, oprócz funkcji transportowych, uczestniczy w przekazywaniu sygnału regulatorowego w procesie represji katabolicznej. Ponadto mutacja gcr1 nie uszkadzała inicjowanej przez glukozę autofagicznej degradacji peroksysomów (peksofagii). Można wnioskować zatem, że rozpoznawanie glukozy w procesach inicjowanych przez glukozę może odbywać się różnymi sposobami [39]. Zidentyfikowano również dwa nowe geny H. polymorpha HXS1 i HXT1, kodujące receptor heksoz i transporter glukozy. Podobnie do innych sensorów, sensor Hxs1 okazał się niezbędnym do indukcji przez glukozę syntezy transportera glukozy Hxt1. U mutanta z delecją genu HXS1 nie zaobserwowano zaburzeń represji katabolicznej czy autofagicznej degradacji peroksysomów w podłożu z glukozą, natomiast zaburzona była represja w podłożu z fruktozą. Zamiana jednej konserwatywnej reszty aminokwasu w białku Hxs1 (R203K) przekształcała białko do konstytutywnie aktywnej formy. Prowadziło to do zwiększenia oporności wobec antymicyny A, przypuszczalnie jako konsekwencja nadprodukcji transporterów heksoz, w tym łącznie ze zidentyfikowanym Hxt1 [43]. Reasumując, można stwierdzić, że H. polymorpha posiada kilka receptorów i transporterów heksoz. Zidentyfikowane receptory uczestniczą w represji katabolicznej, jednocześnie nie biorą udziału w glukozowej autofagicznej degradacji peroksysomów (peksofagii). Przypuszczalnie rozpoznawanie glukozy w procesach represji katabolicznej i peksofagii zachodzi z udziałem różnych białek. W celu wyjaśnienia innych elementów mechanizmu represji katabolicznej u H. polymorpha, zidentyfikowano homologi represorów transkrypcyjnych S. cerevisiae MIG1, MIG2 i TUP1, które u drożdży piekarskich pełnią istotną funkcję w regulacji represji katabolicznej, oraz wyizolowano odpowiednie mutanty delecyjne. Niespodziewanie okazało się, że u pojedynczego mutanta mig1 oraz podwójnego mutanta mig1 mig2, a także tup1 represja kataboliczna syntezy oksydazy alkoholowej i katalazy w podłożu z glukozą była tylko nieznacznie zaburzona. Jednocześnie powyższe mutacje prowadziły do silnego uszkodzenia peksofagii inicjowanej zarówno glukozą, jak i etanolem. Uzyskane dane wskazują na istotne różnice w mechanizmach represji katabolicznej między drożdżami piekarskimi i metylotroficznymi. U H. polymorpha dla represji katabolicznej ważnym wydaje się prawidłowe funkcjonowanie transporterów, receptorów i enzymów fosforylujących heksozy. Mechanizmy uczestniczące w przenoszeniu sygnału od fosforylowanych heksoz do promotorów genów wrażliwych na kataboliczną represję pozostają niewyjaśnione. Prawdopodobnie represja nie zachodzi z udziałem homologów represorów transkrypcyjnych S. cerevisiae MIG1, MIG2 i TUP1 [44]. Tym sposobem wyjaśnienie molekularnych mechanizmów represji katabolicznej u drożdży metylotroficznych pozostaje wciąż aktualnym wyzwaniem dla naukowców. METABOLIZM AZOTANÓW ORAZ AZOTOWA REPRESJA KATABOLICZNA Asymilacyjna redukcja azotanów jest główną drogą przemiany azotowych związków nieorganicznych do związków organicznych. Tradycyjnie, genetyczne, biochemiczne i molekularne badania asymilacji azotanów prowadzone są na roślinach wyższych, grzybach nitkowatych oraz bakteriach. Asymilacja azotanów u grzybów zachodzi dwuetapowo: azotany redukowane są do azotynów w reakcji katalizowanej przez reduktazę azotanową, następnie azotyny do jonów amonowych w reakcji katalizowanej przez reduktazę azotynową. Reduktaza azotanowa to złożony enzym katalizujący dwuelektronowe przekształcenie azotanów do azotynów, wykorzystujący NAD(P)H jako donor elektronów oraz zawierający FAD, żelazo hemowe i molibdenopterynę jako grupy prostetyczne. Reduktaza azotanowa jest czynnikiem limitującym wzrost wszystkich organizmów asymilujących azotany. Reduktaza azotynowa katalizuje sześcioelektronową redukcję azotynów do jonów amonowych i u grzybów w tym procesie uczestniczy NAD(P)H. Reduktaza azotynowa zawiera dwie grupy prostetyczne: centrum żelazowo-siarkowe, sirohem i dodatkowo u grzybów i bakterii FAD [45]. Wiadomo, że wiele gatunków drożdży potrafi asymilować azotany, jednak do niedawna nie były to organizmy wykorzystywane do badania tego procesu. Jedynym gatunkiem drożdży, który w ostatnich latach stał się obiektem badań molekularnych mechanizmów asymilacyjnej redukcji azotanów jest H. polymorpha. Wykazano, że sposób asymilacji azotanów u H. polymorpha jest taki sam, jak u grzybów nitkowatych Aspergillus nidulans i Neurospora crassa. Wymienione mikroorganizmy potrzebują do tego procesu syntezy transporterów azotanów, reduktazy azotanowej i azotynowej. Do tego czasu zidentyfikowano u H. polymorpha tylko jeden gen YNT1, kodujący białko transporterowe o wysokim powinowactwie do azotanów [45]. Białko Ynt1 jest transporterem azotanów i odgrywa główną rolę w regulacji asymilacji azotanów z udziałem mechanizmu potranslacyjnego. W przypadku braku azotanów powstają koniugaty Ynt1 z ubikwityną, które szybko ulegają degradacji w wakuolach. Ostatnio wykazano, że delecja centralnej domeny hydrofilowej białka Ynt1 (zawierającej sekwencję podobną do PEST) prowadzi do defektu w procesie wchłaniania białka Ynt1 przez wakuole i jego późniejszej degradacji. Degradacja Ynt1 odbywa się w obecności glutaminy i proces ten zachodzi niezależnie od represji białka Ynt1, także wywoływanej glutaminą [46].W warunkach deficytu azotu amonowego zachodzi fosforylacja białka Ynt1, transportera azotanów, która jest niezbędna do indukcji genów metabolizmu azotanów. Fosforylacja chroni białko Ynt1 przed degradacją i umożliwia jego włączenie do błony cytoplazmatycznej komórki. Mechanizmy transportu azotynów, które również mogą być źródłem azotu u H. polymorpha, nie są do końca poznane [47]. Pierwszy etap asymilacji azotanów to ich redukcja do azotynów, katalizowana przez reduktazę azotanową, kodo- Postępy Biochemii 59 (1)

6 waną u H. polymorpha przez gen YNR1. Białko Ynr1 H. polymorpha wykazuje wysoką homologię do reduktazy azotanowej u roślin i innych gatunków grzybów. Reduktaza azotanowa H. polymorpha potrzebuje kilku kofaktorów, m.in. molibdenopteryny, hemu i FAD. W przeciwieństwie do transporterów azotanów Ynt1, reduktaza azotynowa Ynr1 H. polymorpha nie jest inaktywowana przez zredukowane źródła azotu (jony amonu, glutamina). Reduktaza azotynowa u H. polymorpha kodowana jest przez gen YNI1 [48]. Geny H. polymorpha YNR1, YNI1, YNT1, kodujące odpowiednio reduktazę azotanową, reduktazę azotynową i białko transporterowe azotanów, tworzą klaster, ale ich transkrypcja zachodzi niezależnie. Zidentyfikowano również dwa geny regulatorowe YNA1 i YNA2, kodujące białka należące do rodziny Zn(II) 2 Cys 6. Mutacje w genach regulatorowych prowadzą do niezdolności do asymilacji azotanów i indukcji ekspresji genów strukturalnych. Białko Yna1 jest potrzebne do indukcji białka Yna2, podczas gdy Yna2 nie bierze udziału w aktywacji transkrypcji Yna1 [49]. Ostatnie badania wykazały, że u H. polymorpha również Ure2 bierze udział w azotowej represji katabolicznej, podobnie jak u S.cerevisiae. Białko to ulega fosforylacji w obecności preferowanego źródła azotu oraz defosforylacji w przypadku jego braku. Ponadto zidentyfikowano również u H. polymorpha czynniki HpGat1, HpGat2 oraz HpGzf3 o znacznym podobieństwie do czynników GATA u S. cerevisiae. Prawdopodobnie HpUre2 funkcjonuje tak jak u S. cerevisiae, pozostawiając czynniki GATA na zewnątrz jądra komórkowego podczas wzrostu na podłożu zawierającym preferowane źródła azotu i blokując tym samym ekspresję genów związanych z metabolizmem gorszych źródeł azotu, np. azotanów. Wyniki te świadczą o tym, że system regulacji metabolizmu azotanów u drożdży H. polymorpha jest bliższy do S. cerevisiae niż do grzybów nitkowatych A. nidulans i N. crassa [48]. Na podstawie obecnych danych nie można jednak stworzyć modelu mechanizmu regulacji ekspresji genów asymilacji azotanów w zależności od czynników środowiskowych. Z punktu widzenia fizjologii, regulacja syntezy enzymów szlaku asymilacji azotanów przedstawia się bardzo prosto. W celu syntezy białek biorących udział w asymilacji azotanów, niezbędny jest induktor azotan. Azotany są wtórnymi źródłami azotu, podczas gdy jony amonu i glutamina pierwotnymi. W obecności pierwotnych źródeł azotu, enzymy asymilacji azotanów nie powstają, a te istniejące ulegają degradacji. H. polymorpha JAKO SYSTEM produkcji WŁASNYCH I HETEROLOGICZNYCH BIAŁEK H. polymorpha, jak przedstawiono wyżej, jest jednym z dwóch gatunków drożdży metylotroficznych (oprócz P. pastoris) wykorzystywanych jako systemy do syntezy białek heterologicznych (obcych), ale także własnych białek o znaczeniu przemysłowym. Do ekspresji używane są stabilne wektory zdolne do integracji z genomem [3]. Tradycyjnie do transformacji wykorzystywano koliste plazmidy, zawierające autonomicznie replikujące się sekwencje S. cerevisiae (ARS) lub H. polymorpha (HARS), które z reguły włączają się do genomu. Taka integracja może występować w ciągu wielu generacji, w rezultacie czego mogą powstawać transformanty posiadające nawet do 100 kopii plazmidu integracyjnego w postaci powtórzeń tandemowych [3,18]. Prawdopodobnie, przypadkowa integracja nie zachodzi wskutek częstej rekombinacji sekwencji genetycznych wektora i genomowego DNA. Przykładowo w przypadku wykorzystania wektorów z promotorami FMD, MOX, TPS1 (odpowiednio genów dehydrogenazy mrówczanowej, oksydazy alkoholowej i syntazy 6-fosfotrehalozy) rekombinacja zachodziła w odpowiednich genach chromosomalnych [50]. Jednakże wysokokopijność włączonego wektora nie zawsze prowadzi do nadprodukcji docelowego białka, zwłaszcza w przypadku białek sekrecyjnych. Na przykład dla osiągnięcia maksymalnej produkcji glukoamylazy Schwanniomyces occidentalis wystarczającym okazało się wstawienie tylko czterech kopii odpowiedniego genu wchodzącego w skład wektora HARS [3]. Maksymalna produkcja urokinazowego aktywatora plazminogenu człowieka (u-pa) i albuminy surowicy człowieka HSA w szczepie DL-1 osiągnięta została przez włączenie jednej lub dwóch kopii wektora ekspresyjnego do genomu [18]. Ukierunkowana integracja u H. polymorpha wymaga znacznie dłuższych homologicznych sekwencji, niż to opisano dla S. cerevisiae [3]. Wektory, które niosą zestaw składający się z kilku subtelomerowych sekwencji ARS okazały się zdolnymi do homologicznej integracji do genomu, co prowadzi do włączenia pojedynczych lub wielokrotnych powtórzeń tandemowych do odpowiednich telomerowych miejsc genomu [51]. Skonstruowano zestaw wektorów do włączania heterologicznych sekwencji do locus rybosomalnego DNA H. polymorpha. Zidentyfikowano również sekwencje rybosomalnego DNA odpowiedzialne za optymalną integrację i ekspresję. Sekwencje te zawarte są w integracyjnych wektorach ekspresji i wchodzą w skład systemu zwanego Co-Med TM [50]. Pichia pastoris JAKO NAJBARDZIEJ POPULARNY PRODUCENT BIAŁEK HETEROLOGICZNYCH P. pastoris to jeden z najbardziej popularnych organizmów wykorzystywanych do produkcji białek heterologicznych. Efekty ostatnich badań wskazują na możliwość zastosowania drożdżowego systemu ekspresji do syntezy biofarmaceutyków, jako alternatywy dla bakteryjnych systemów ekspresji z wykorzystaniem E. coli. Spośród różnych gatunków drożdży metylotroficznych, P. pastoris jest najczęściej używana jako platforma ekspresji [52]. Do 2007 roku u P. pastoris sklonowano i eksprymowano ponad 600 genów [53]. W bazie PubMed dla hasła P. pastoris pojawia się 3800 odniesień, podczas gdy dla hasła H. polymopha ukazuje się zaledwie 600 źródeł. Dla porównania dla S. cerevisiae istnieje ponad odniesień. Jednak zarówno w przypadku P. pastoris, jak i H. polymorpha większość publikacji dotyczy heterologicznej produkcji białek, natomiast w przypadku drożdży piekarskich prac takich jest niewiele. W niedawno opublikowanych pracach przeglądowych można odnaleźć metody zarówno genetyki klasycznej jak i molekularnej dla P. pastoris, niezbędne dla otrzymania mutantów, hybrydyzacji, analizy segregacji, konstruowania kaset ekspresyjnych i efektywnej produkcji białek heterologicznych [54,55]. Popularność P. pastoris bazuje na kilku zaletach tego organizmu: prostota manipulacji genetycznych, obecność efektywnego systemu wektor-gospodarz, w tym, ściśle regulowanego i silnie indukowanego promotora AOX1 oksydazy alkoholowej, zdolność do tworzenia białek o prawidłowej strukturze przestrzennej, w tym tworzenie wiązań 100

7 dwusiarczkowych, a także inne potranslacyjne modyfikacje charakterystyczne dla eukariontów. Wykorzystanie promotora AOX1 do syntezy obcych białek u P. pastoris umożliwia osiągnięcie wysokiej biomasy (ponad 130 g suchej masy na litr), prawdopodobnie na skutek niskiego zapotrzebowania energetycznego podczas wzrostu na metanolu [56]. Zdolność do efektywnej sekrecji białek heterologicznych oraz niski poziom wydzielania białek endogennych do podłoża to jeszcze jedna zaleta P. pastoris istotnie ułatwiająca oczyszczanie zrekombinowanego produktu [57]. Na drodze inżynierii genetycznej skonstruowano także szczepy P. pastoris ze zhumanizowanym sposobem glikozylacji heterologicznych białek sekrecyjnych, co zwiększa możliwość wykorzystania P. pastoris do produkcji biofarmaceutyków [58]. Genom P. pastoris został zsekwencjonowany ( integratadgenomics.com/ergo/) [57,59], dzięki czemu możliwe są dalsze udoskonalenia w otrzymywaniu producentów białek z wykorzystaniem metod inżynierii metabolicznej i biologii systemowej. Genom P. pastoris o wielkości 9,43 Mb, zawiera 41,1% par zasad GC, a łączna liczba otwartych ramek odczytu to 5313 [59]. U P. pastoris, po raz pierwszy u drożdży metylotroficznych, zbadano całkowitą sekwencję mitochondrialnego DNA. Kolista cząsteczka mitochondrialnego DNA o wielkości 35,7 kbp zawiera 15 genów kodujących białka, 2 rrna i 25 trna loci [60]. Ze względu na liczne podobieństwa systemów ekspresji P. pastoris i H. polymorpha porównano ich efektywność badając syntezę dwóch heterologicznych białek: fragmentu NK1 (22 kda) czynnika wzrostu hepatocytów człowieka i domeny zewnątrzkomórkowej (28 kda) czynnika tkankowego myszy (MTF). Wykazano istotną przewagę P. pastoris, związaną z wyższą biomasą, większą ilością produktu końcowego, oraz mniejszą degradacją eksprymowanych białek heterologicznych [61]. Ostatnio eksprymowano również gen ((L1/L2 (ChiΔH-L2) syntezujący białko ludzkiego wirusa HPV i w tym przypadku także zaobserwowano wyższe stężenie produktu końcowego przy wykorzystaniu systemu ekspresji P. pastoris w porównaniu do H. polymorpha [62]. Oczywistym jest, że na przykładzie trzech białek nie można wysuwać dalekosiężnych wniosków, można jednak stwierdzić, że z użyciem P. pastoris łatwiej i szybciej udaje się uzyskać efektywnych nadproducentów białek heterologicznych. Ponadto, firma Invitrogen dostarcza zestawy szczepów tzw. biorców (komórek zdolnych do pobrania egzogennego materiału genetycznego) oraz wektory potrzebne do heterologicznej ekspresji u P. pastoris, podczas gdy nie są one dostępne dla H. polymorpha. Niemniej jednak H. polymorpha ma również swoje zalety. Jak przedstawiono powyżej, drożdże te są bardziej termotolerancyjne, co pozwala zwiększyć ekonomiczność procesów, wskutek zmniejszenia kosztów chłodzenia bioreaktorów, a także produkować białka o bardziej stabilnej strukturze [55,61]. Poza tym, heterologiczną ekspresję u dzikiego szczepu H. polymorpha i mutanta gcr1 pod kontrolą promotora MOX można indukować glicerolem, glukozą lub ksylozą, substratami, które w przeciwieństwie do metanolu, nie są toksyczne ani łatwopalne [63]. Pichia methanolica P. methanolica MH4 jest szczepem haploidalnym, zdolnym do diploidyzacji. Diploidalne komórki mogą rozmnażać się wegetatywnie przez dłuższy czas na podłożu minimalnym. Po przeniesieniu komórek do podłoża Rg ułatwiającego sporulację zachodzi obfita sporulacja, w wyniku której powstaje do 90% worków ze sporami, z których większość zawiera po 4 zarodniki. Wegetatywne komórki diploidalne mogą segregować chromosomy w wyniku spontanicznej haploidyzacji. Proces ten indukowany jest promieniowaniem γ i w optymalnych warunkach, do 10% komórek przekształca się w aneuploidy. Powstałe aneuploidy tworzą wolno rosnące kolonie. Cecha ta ułatwia identyfikację aneuploidów i może być wykorzystywana do lokalizacji markerów na chromosomach [54]. CHROMOSOMY, GENY I MARKERY GENETYCZNE Elektroforeza pulsacyjna w systemie CHEF (Countour- Сlamped Homogenous Electrophoresis Field) umożliwiła u szczepów P. methanolica MH4 i NRRL Y-7685 identyfikację 4 fragmentów DNA o rozmiarach 6; 4,2; 3,6 i 3,1 Mb. Mutanty auksotroficzne izolowane ze szczepów MH4 i NRRL Y-7685 łatwo się krzyżują, a powstające diploidy obficie sporulują na podłożu Rg tworząc worki zawierające przeważnie po 4 spory. Grupy genów sprzężonych u P. methanolica zidentyfikowano za pomocą analizy tetrad i indukowanej haploidyzacji. Mapowanie za pomocą analizy tetrad wykonano dla około 30 markerów (mutacje auksotroficzne, mutacje locus, mutacje uszkadzające utylizację związków jedno i dwuwęglowych). W rezultacie zidentyfikowano 4 centromery, co odpowiada czterem chromosomom i jednemu fragmentowi chromosomowemu, prawdopodobnie dystalnej części jednego z chromosomów [64]. Uzyskane tym sposobem dane mapowania genetycznego dobrze korelują z wynikami elektroforezy pulsacyjnej [54]. Mapę genetyczną P. methanolica przedstawiono na Ryc. 2. GENETYCZNA KONTROLA METABOLIZMU METANOLU U P. methanolica występują takie same enzymy metabolizmu metanolu, jak i u innych drożdży metylotroficznych Rycina 2. Mapa genetyczna drożdży Pichia methanolica MH4. Linie ciągłe położenie genów określone na podstawie analizy tetrad; linie przerywane określone na podstawie haploidyzacji indukowanej; koła oznaczają centromery. Postępy Biochemii 59 (1)

8 [2,65,66]. Istnieje ogólny pogląd, że energia potrzebna do wzrostu metylotroficznego powstaje wyłącznie w szlaku utleniania formaldehydu do CO 2 w rekacjach katalizowanych przez dehydrogenazę formaldehydu zależną od NAD i GSH oraz dehydrogenazę mrówczanową zależną od NAD [6]. Dane te nie są zgodne z szeregiem spostrzeżeń dokonanych u P. methanolica i H. polymorpha. Wykazano, że 2-fluorooctan hamuje wzrost dzikiego szczepu P. methanolica, a malonian (inhibitor dehydrogenazy bursztynianowej) blokuje wzrost mutanta P. methanolica icl1 z defektem liazy izocytrynianowej na podłożu agarowym z metanolem, etanolem i glicerolem, ale nie z glukozą. Stwierdzono, że zdolność malonianu do hamowania wzrostu na podłożu z metanolem zależy od obecności markera icl1. Uzyskano również mutanty H. polymorpha z całkowitym brakiem aktywności dehydrogenaz formaldehydu i mrówczanu i wykazano, że mutanty te są zdolne do wzrostu w hodowli ciągłej z metanolem jako jedynym źródłem węgla i energii. Powyższe obserwacje pozwalają na wysnucie hipotezy, że energia potrzebna do wzrostu drożdży metylotroficznych pochodzi głównie z asymilacji formaldehydu w szlaku ksylulozomonofosforanowym oraz w cyklu kwasów trójkarboksylowych [64]. Wiadomo, że metanol silnie indukuje syntezę enzymów katabolizmu metanolu, a glukoza i etanol to korepresory tego procesu, powodujące również kataboliczną inaktywację białek peroksysomalnych metabolizmu metanolu wskutek autofagicznej degradacji peroksysomów (peksofagii) [27]. Drożdże P. methanolica stały się obiektem badań niektórych aspektów regulacji metabolizmu metylotroficznego. Analizowano następujące problemy: identyfikację intermediatów katabolizmu etanolu, powodujących represję kataboliczną oraz autofagiczną degradację enzymów metabolizmu metanolu, identyfikację genów kontrolujących represję kataboliczną. IDENTYFIKACJA INTERMEDIATÓW KATABOLIZMU ETANOLU POWODUJĄCYCH REPRESJĘ KATABOLICZNĄ I INAKTYWACJĘ ENZYMÓW SZLAKU METYLOTROFICZNEGO W celu identyfikacji intermediatów metabolizmu etanolu uzyskano mutanty P. methanolica z defektem poszczególnych etapów katabolizmu tego dwuwęglowego substratu. Izolowano mutanty P. methanolica niezdolne do wzrostu na podłożu z etanolem jako jedynym źródłem węgla. Wszystkie 24 mutanty okazały się także niezdolne do wzrostu na podłożu z octanem, a jednocześnie wzrost na podłożu z metanolem i substratami wielowęglowymi zachodził normalnie. Mutacje te były recesywne i podzielono je na 4 grupy komplementacji. U przedstawicieli poszczególnych grup komplementacji zaobserwowano brak aktywności specyficznych enzymów metabolizmu związków dwuwęglowych: liazy izocytrynianowej, syntazy jabłczanowej, karboksykinazy fosfoenolopirogronianowej i dehydrogenazy jabłczanowej. Otrzymane mutacje opisano odpowiednio jako: icl1, mls1, pck1, mdd1 [64]. W innej serii badań wyizolowano z kolei 106 mutantów opornych na 2-fluorooctan, niezdolnych do utylizacji etanolu i octanu jako jedynych źródeł węgla. Mutacje te okazały się recesywnymi i podzielono je na 3 grupy komplementacji. U przedstawicieli każdej z grup wykazano brak aktywności syntazy acetylo-coa. Mutacje oznaczono jako: acs1, acs2, acs3. Nie znaleziono jednak żadnego sprzężenia między mutacjami tych grup komplementacji [67]. Spośród mutantów P. methanolica opornych na alkohol allilowy zidentyfikowano szczepy z obniżoną krotnie aktywnością dehydrogenazy alkoholowej. Mutacja ta była recesywna, monogenowa i oznaczono ją jako adh1. Z tego szczepu izolowano podwójnego mutanta oznakowanego jako adh1 adh2 z całkowitym brakiem aktywności dehydrogenazy alkoholowej [7]. Ponadto wyizolowano mutanta aldx zdolnego do wzrostu na podłożu z octanem, ale nie etanolem jako jedynym źródłem węgla [64]. Badania nad wpływem etanolu i octanu na represję i inaktywację oksydazy alkoholowej i katalazy u mutantów i dzikich szczepów P. methanolica wykazały, że octan jest bezpośrednim efektorem (korepresorem) wywołującym represję kataboliczną enzymów metabolizmu związków jednowęglowych w podłożu z etanolem, natomiast bezpośrednim efektorem katabolicznej inaktywacji enzymów peroksysomalnych indukowanych etanolem jest kwas glioksalowy [7]. IDENTYFIKACJA GENÓW BIORĄCYCH UDZIAŁ W REPRESJI KATABOLICZNEJ Hodowla na podożu z metanolem pozwoliła na wyizolowanie mutantów P. methanolica opornych na 2-deoksyglukozę (niemetabolizowany analog glukozy), u których została uszkodzona represja kataboliczna. Analiza genetyczna umożliwiła ich podział na 4 grupy: gcr1, gcr2 (mutacje recesywne), GCR3 c i GCR4 c (mutacje dominujące). Zakłada się, że geny GCR1 i GCR2 działają jako negatywne, natomiast geny GCR3 i GCR4, jak pozytywne regulatory syntezy enzymów metabolizmu metanolu. Część zidentyfikowanych mutacji prowadziła do uszkodzenia tylko represji katabolicznej, dlatego do syntezy enzymów szlaku metylotroficznego potrzebny był induktor (metanol), podczas gdy inne mutacje powodowały konstytutywną syntezę enzymów metabolizmu metanolu w podłożu z glukozą bez induktora. Etanol i glukoza powodowały represję syntezy tych enzymów u wszystkich zbadanych mutantów [64,66,68]. W celu izolacji mutantów P. methanolica z defektem represji katabolicznej indukowanej etanolem wykorzystano następujące podejście: etanol powoduje represję syntezy oksydazy alkoholowej u mutanta icl1 pozbawionego liazy izocytrynianowej, dlatego mutant ten nie rośnie na podłożu z mieszaniną metanolu i etanolu. Wyizolowano mutanty icl1 zdolne do wzrostu na mieszaninie tych dwóch alkoholi. Zidentyfikowano u nich recesywną, monogenową mutację oznaczoną jako ecr1. Glukozowa represja kataboliczna u tych mutantów nie była uszkodzona. Inaktywacja kataboliczna oksydazy alkoholowej i katalazy w podłożu z etanolem także nie była zaburzona [64,66]. Represja etanolowa była naruszona także u mutantów adh1 charakteryzująych się krotnie obniżoną aktywnością dehydrogenazy alkoholowej. Represja glukozowa u tych mutantów działała prawidłowo [7]

9 Wpływ różnych źródeł węgla na syntezę oksydazy alkoholowej badano u dzikiego szczepu oraz u mutantów gcr1 (defekt glukozowej represji katabolicznej), oraz ecr1 (defekt etanolowej represji katabolicznej). Substraty węglowe powodujące represję syntezy oksydazy alkoholowej podzielono na 4 grupy. Heksozy i ksyloza tworzą pierwszą grupę, w której represujące działanie tych cukrów naruszone jest tylko u mutanta gcr1. Represja przez substraty (etanol, octan, 2-oksoglutaran) należące do drugiej grupy naruszona była tylko u mutanta ecr1. Represja przez trzecią grupę, do których należy malonian i dihydroksyaceton nie została osłabiona u obu mutantów gcr1 i ecr1. Do czwartej grupy należą związki (L-arabinoza, sorbitol, xylitol, celobioza), których działanie represyjne było częściowo osłabione u mutantów obu grup. Wyciągnięto wniosek o istnieniu u P. methanolica niezależnych mechanizmów represji katabolicznej zależnych od natury korepresora (substratu węglowego) [64]. Na podstawie analizy biochemicznej mutantów gcr1, gcr2, GCR2c, GCR4c i ecr1 wykazano, że fosfofruktokinaza i dehydrogenaza 2-oksoglutaranu uczestniczą odpowiednio w glukozowej i etanolowej represji katabolicznej. Otrzymane dane świadczą także o różnicach genetycznych pomiędzy mechanizmami represji katabolicznej i inaktywacji katabolicznej (peksofagia) enzymów metabolizmu metanolu [66]. Szczegółowe badania właściwości mutanta ecr1 z zaburzoną etanolową represją kataboliczną, nieoczekiwanie wykazały, że u tego mutanta, w przeciwieństwie do szczepu dzikiego, metanol powoduje prawie całkowity blok syntezy indukowanych etanolem glioksysomowych enzymów metabolizmu dwuwęglowego, liazy izocytrynianowej i syntazy jabłczanowej. Podczas hodowli mutanta ecr1 i dzikiego szczepu na podłożu z mieszaniną metanolu i etanolu zaobserwowano wzrost diauksyczny. Szczep dziki najpierw metabolizował etanol i syntetyzował enzymy glioksysomalne biorące udział w metabolizmie substratów dwuwęglowych, podczas gdy mutant ecr1 najpierw metabolizował metanol i syntetyzował peroksysomalne enzymy biorące udział w metabolizmie związków jednowęglowych. Przypuszczono, że kolejność metabolizmu metanolu i etanolu w mieszaninie tych związków i syntezy odpowiednich enzymów zależy od allelicznego stanu genu regulatorowego ECR1. Obecność dzikiego allelu warunkuje w pierwszej kolejności biogenezę mikrociał glioksysomów, podczas gdy u mutanta ecr1 peroksysomów. Mechanizm działania genu ECR1 pozostaje niewyjaśniony. W przeciwieństwie do ecr1, mutacja adh1 (obniżona aktywność dehydrogenazy alkoholowej) umożliwia jednoczesną obecność w komórkach enzymów metabolizmu substratów jedno i dwuwęglowych, dlatego też wzrost mutanta adh1 na podłożu zawierajacym mieszaninę etanolu i metanolu zachodzi bez diauksji. Komórki mutanta, rosnące na podłożu z etanolem, posiadały hybrydowe mikrociała, glioksyperoksysomy, zawierające jednocześnie oksydazę alkoholową i syntazę jabłczanową, co umożliwiało jednoczesną utylizację etanolu i metanolu [67]. Jak widać, P. methanolica posiada skomplikowany system regulacji represji katabolicznej podczas wzrostu na podłożach zawierających różne substraty węglowe, w której uczestniczy kilka genów regulatorowych o zróżnicowanych funkcjach. U P. methanolica odkryto nowe zjawisko metanolowej katabolicznej inaktywacji enzymów metabolizmu substratów dwuwęglowych (liazy izocytrynianowej, syntazy bursztynianowej, dehydrogenazy alkoholowej, dehydrogenazy aldehydu octowego). Dodanie metanolu do hodowli komórek w podłożu z etanolem powodowało gwałtowny spadek aktywności powyższych enzymów. Pełna inaktywacja następowała po 5-7 godzinach po dodaniu metanolu. Formaldehyd i mrówczan także powodował inaktywację enzymów katabolizmu etanolu. Mieszanina etanolu i metanolu nie powodowała inaktywacji liazy izocytrynianowej i dehydrogenazy alkoholowej u dzikiego szczepu, natomiast efektywnie inaktywowała te enzymy u mutanta ecr1 z defektem etanolowej represji katabolicznej. Prawdopodobnie rozpoczęcie procesu rozkładu metanolu jest niezbędne do zainicjowania inaktywacji enzymów metabolizmu dwuwęglowych substratów[64]. KONTROLA GENETYCZNA SYNTEZY ENZYMÓW METABOLIZMU METANOLU P. methanolica posiada dwa geny kodujące oksydazę alkoholową, MOD1 i MOD2. Oba produkty tych genów przypadkowo ze sobą asocjują tworząc aktywny oktamer, co prowadzi do powstania 9 różnych izozymów oksydazy alkoholowej [69]. Na podstawie ekspresji heterologicznego genu kwaśnej fosfatazy drożdży piekarskich S. cerevisiae badano właściwości regulacji ekspresji promotorów genów MOD1 i MOD2. Promotor MOD1 indukowany był nie tylko w podłożu z metanolem ale także z glicerolem, podczas gdy promotor MOD2 indukowany był tylko przez metanol, natomiast dodanie glicerolu do podłoża z metanolem nie powodowało jego represji. Promotor MOD1 najefektywniej był indukowany przy niskim stężeniu metanolu, a promotor MOD2, przy wysokich stężeniach metanolu i tlenu. Świadczy to o tym, że ekspresja obu promotorów oksydazy alkoholowej regulowana jest w zupełnie inny sposób. Wykazane różnice pozwalają na wykorzystanie promotorów genów MOD1 i MOD2 do kontroli ekspresji genów heterologicznych u P. methanolica, a nawet do jednoczesnej regulacji syntezy dwóch różnych białek heterologicznych [70]. Katalaza, zlokalizowana w peroksysomach, kodowana jest przez gen CTA1 [71]. Niedawno odkryto dwa geny DAS1 i DLP1 o wysokim podobieństwie do syntazy dihydroksyacetonu (DAS), peroksysomalnego enzymu metabolizmu metanolu. Heterologiczna ekspresja genu DAS1 u mutanta Candida boidinii das1 przywracała zdolność do utylizacji metanolu, podczas gdy ekspresja genu DLP1 nie. Na tej podstawie stwierdzono, że gen DAS1 koduje syntazę dihydroksyacetonu u P. methanolica, natomiast funkcje genu DLP1 nie są jeszcze poznane [72]. P. methanolica posiada tylko po jednym genie strukturalnym dehydrogenazy formaldehydu i mrówczanu [8]. Candida boidinii Candida boidinii to asporogenny gatunek drożdży metylotroficznych. Podobnie do innych gatunków drożdży metylotroficznych, C. boidinii wykorzystywana jest do konstruowania producentów białek heterologicznych. Sposób Postępy Biochemii 59 (1)

10 regulacji promotora oksydazy alkoholowej C. boidinii AOD1 różni się od H. polymorpha i przypomina P. pastoris: maksymalna ekspresja genu AOD1 wymaga jednoczesnej derepresji glukozowej (braku glukozy lub obecności glicerolu, oleinianu w podłożu) oraz indukcji metanolem (występowania metanolu w podłożu). Oprócz promotora AOD1, sklonowano i scharakteryzowano 5 innych promotorów regulowanych metanolem, wśród których najbardziej silnym okazał się promotor genu syntazy dihydroksyacetonu DAS1. W odróżnieniu od promotora AOD1, który częściowo ulega derepresji w podłożu z glicerolem lub oleinianem, promotor syntazy dihydroksyacetonu DAS1 nie wykazuje wcale derepresji w podłożu z alternatywnymi źródłami węgla bez metanolu i jego ekspresja zachodzi tylko i wyłącznie w podłożu z metanolem, jako induktorem [31]. Jak już wspominano wyżej, u H. polymorpha i P. pastoris, w indukcji ekspresji genów kodujących enzymy metabolizmu metanolu uczestniczą czynniki transkrypcyjne Mpp1p i Mxr1p [29,30]. Metodę mutagenezy insercyjnej wykorzystano do poszukiwania odpowiednich genów regulatorowych u C. boidinii. W wyniku tego zidentyfikowano i scharakteryzowano nowy czynnik transkrypcyjny Trm1p. Białko to należy do klasteru Zn(II) 2 Cys 6, do którego należy wiele regulatorów transkrypcyjnych różnych grzybów. Delecja TRM1 całkowicie blokuje wzrost na metanolu, ale nie wpływa na wzrost na substratach poliwęglowych (glukoza, glicerol, etanol, oleinian), co świadczy o specyficznej roli białka Trm1p w regulacji indukcji przez metanol, a nie derepresji glukozą. Ponadto aktywność transkrypcyjna wszystkich indukowanych przez promotor genów u szczepu trm1 jest całkowicie zahamowana, co świadczy o decydującej roli Trm1p w regulacji ekspresji genów metabolizmu metanolu u C. boidinii. W promotorze DAS1 odkryto dwa elementy MRE1 i MRE2 (methanol response elements). Przypuszczalnie czynnik transkrypcyjny Trm1p jest niezbędny dla zależnej od MRE1 indukcji DAS1 przez metanol. Analiza immunoprecypitacji chromatyny wykazała, że Trm1p wiąże się z pięcioma indukowanymi przez metanol promotorami prawdopodobnie przy pomocy dodatkowego, na razie nie zidentyfikowanego, białka. Takim białkiem może być homolog H. polymorpha Mpp1p, którego do tej pory nie zidentyfikowano u C. boidinii [31]. U C. boidinii zidentyfikowano jeszcze jeden gen regulatorowy, oznaczony jako TRM2. Białko Trm2p zawiera dwa motywy cynkowych palców typu C2H2 na N końcu i wykazuje wysoką homologię z wcześniej zidentyfikowanymi czynnikami traksrypcyjnymi Mxr1p u P. pastoris i Adr1p u S. cerevisiae. Trm2p specyficznie wiąże się z promotorami genów AOD1 i DAS1 w komórkach rosnących na podłożu z metanolem lub oleinianem, ale nie przyłącza się do tych promotorów w komórkach rosnących na podłożu z glukozą. W komórkach rosnących na podłożu z metanolem białko to zlokalizowane jest w jądrze komórkowym, natomiast na podłożu z glukozą w cytoplazmie. Mutant trm2 nie rósł na podłożu z metanolem i oleinianem, natomiast rósł na podłożu z glukozą i etanolem. Białko Trm2 jest niezbędne do aktywacji genów indukowanych metanolem [1]. Zidentyfikowano również gen MIG1 kodujący białko homologiczne do represora glukozy Mig1p u S. cerevisiae i wykazano, że białko to uczestniczy w negatywnej regulacji ekspresji genów indukowanych metanolem [73]. Na podstawie badań C. boidinii, skonstruowano wielu producentów heterologicznych i własnych białek cytosolowych (aktynaza adenylowa, α-аntytrypsyna), peroksysomowych (oksydaza kwasów tłuszczowych, oksydaza spermidyny, oksydaza D-aminokwasów) i sekrecyjnych (glukoamylaza, fitaza, katepsyna C i transglutaminaza) [74]. PODSUMOWANIE Reasumując, można stwierdzić, że w ciągu ostatnich dziesięcioleci udało się zbadać główne aspekty regulacji metabolizmu metanolu u drożdży metylotroficznych, szczególnie na poziomie molekularno-genetycznym. Organizmy te stały się również ulubionym obiektem badań biologii komórki, zwłaszcza procesów biogenezy i degradacji peroksysomów. Drożdże te posłużyły do sklonowania silnych regulatorowych i konstytutywnych promotorów, jak również do skonstruowania efektywnych producentów zrekombinowanych białek. Drożdże metylotroficzne pozostaną więc organizmami o dużym znaczeniu w badaniach z zakresu biologii komórki oraz biotechnologii. PIŚMIENNICTWO 1. Sasano Y, Yurimoto H, Kuriyama M, Sakai Y (2010) Trm2p-dependent derepression is essential for methanol-specific gene activation in the methylotrophic yeast Candida boidinii. FEMS Yeast Res 10: Sibirny AA, Titorenko VI, Gonchar MV, Ubiyvovk VM, Ksheminskaya GP, Vitvitskaya OP (1988) Genetic control of methanol utilization in yeasts. J Basic Microbiol 28: Gellissen G (2002) Hansenula polymorpha biology and applications. Wiley VCH, Weinheim 4. Horiguchi H, Yurimoto H, Kato N, Sakai Y (2001) Antioxidant system within yeast peroxisome. Biochemical and physiological characterization of CbPmp20 in the methylotrophic yeast Candida boidinii. J Biol Chem 276: Yurimoto H, Sakai Y, Kato N (2002) Methanol metabolism. W: Gellissen G (red) Hansenula polymorpha biology and applications. Wiley- VCH, Weinheim, Germany, str Lee B, Yurimoto H, Sakai Y, Kato N (2002) Physiological role of the glutathione-dependent formaldehyde dehydrogenase in the methylotrophic yeast Candida boidinii. Microbiol 148: Sibirny AA, Ubiyvovk VM, Gonchar MV, Titorenko VI, Voronovsky AY, Kapultsevich YG, Bliznik KM (1990) Reactions of direct formaldehyde oxidation to CO2 are non-essential for energy supply of yeast methylotrophic growth. Arch Microbiol 154: Nakagawa T, Ito T, Fujimura S, Chikui M, Mizumura T, Miyaji T, Yurimoto H, Kato N, Sakai Y, Tomizuka N (2004) Molecular characterization of the glutathione-dependent formaldehyde dehydrogenase gene FLD1 from the methylotrophic yeast Pichia methanolica. Yeast 21: Veenhuis M, van Dijken JP, Harder W (1983) The significance of peroxisomes in the metabolism of one-carbon compounds in yeasts. Adv Microb Physiol 24: Ishchuk OP, Voronovsky AY, Abbas CA, Sibirny AA (2009) Construction of Hansenula polymorpha strains with improved thermotolerance. Biotechnol Bioeng 104: Dmytruk OV, Dmytruk KV, Abbas CA, Voronovsky AY, Sibirny AA (2008) Engineering of xylose reductase and overexpression of xylitol dehydrogenase and xylulokinase improves xylose alcoholic fermentation in the thermotolerant yeast Hansenula polymorpha. Microb Cell Fact 7: Hong WK, Kim CH, Heo SY, Luo LH, Oh BR, Seo JW (2010) Enhanced production of ethanol from glycerol by engineered Hansenula polymorpha expressing pyruvate decarboxylase and aldehyde dehydrogenase genes from Zymomonas mobilis. Biotechnol Lett 32:

11 13. Ubiyvovk VM, Ananin VM, Malyshev AY, Kang HA, Sibirny AA (2011) Optimization of glutathione production in batch and fed-batch cultures by the wild-type and recombinant strains of the methylotrophic yeast Hansenula polymorpha DL-1. BMC Biotechnol 11: Lahtchev KL, Semenova VD, Tolstorukov II, van der Klei I, Veenhuis M (2002) Isolation and properties of genetically defined strains of the methylotrophic yeast Hansenula polymorpha CBS4732. Arch Microbiol 177: Kunze G, Kang HA, Gellissen G (2009) Hansenula polymorpha (Pichia angusta) Biology and Applications, W: Satyanarayana T, Kunze G (red) Yeast Biotechnology: Diversity and Applications, Springer, str Kurtzman CP, Fell JW (1998) The Yeasts, a Taxonomic Study, 4th edn. Elsevier Science, Amsterdam 17. Suh SO, Zhou JJ (2010) Methylotrophic yeasts near Ogataea (Hansenula) polymorpha: a proposal of Ogataea angusta comb. nov. and Candida parapolymorpha sp. nov. FEMS Yeast Res 10: Kang HA, Kang W, Hong WK, Kim MW, Kim JY, Sohn JH, Choi ES, Choe KB, Rhee SK (2001) Development of expression systems for the production of recombinant human serum albumin using the MOX promoter in Hansenula polymorpha DL-1. Biotechnol Bioeng 76: Merckelbach A, Gödecke S, Janowicz ZA, Hollenberg CP (1993) Cloning and sequencing of the ura3 locus of the methylotrophic yeast Hansenula polymorpha and its use for the generation of a deletion by gene replacement. Appl Microbiol Biotechnol 40: Voronovsky AY, Ryabova OB, Verba OV, Ishchuk OP, Dmytruk KV, Sibirny AA (2005) Expression of xyla genes encoding xylose isomerases from Escherichia coli and Streptomyces coelicolor in the methylotrophic yeast Hansenula polymorpha. FEMS Yeast Res 5: Tikhomirova LP, Ikonomova RN, Kuznetsova EN (1986) Evidence for autonomous replication and stabilization of recombinant plasmids in the transformants of yeast Hansenula polymorpha. Curr Genet 10: Faber KN, Haima P, Harder W, Veenhuis M, AB G (1994) Highly-efficient electrotransformation of the yeast Hansenula polymorpha. Curr Genet 25: Ramezani-Rad M, Hollenberg CP, Lauber J, Wedler H, Griess E, Wagner C, Albermann K, Hani J, Piontek M, Dahlems U, Gellissen G (2003) The Hansenula polymorpha (strain CBS4732) genome sequencing and analysis. FEMS Yeast Res 4: Marri L, Rossolini GM, Satta G (1993) Chromosome polymorphisms among іtrains of Hansenula polymorpha (syn. Pichia angusta). Appl Environ Microbiol 59: Park JN, Sohn MJ, Oh DB, Kwon O, Rhee SK, Hur CG, Lee SY, Gellissen G, Kang HA (2007) Identification of the cadmium-inducible Hansenula polymorpha SEO1 gene promoter by transcriptome analysis and its application to whole-cell heavy-metal detection systems. Appl Environ Microbiol 73: van der Klei IJ, Yurimoto H, Sakai Y, Veenhuis M (2006) The significance of peroxisomes in methanol metabolism in methylotrophic yeast. Biochim Biophys Acta 1763: Dunn WA Jr, Cregg JM, Kiel JA, van der Klei IJ, Oku M, Sakai Y, Sibirny AA, Stasyk OV, Veenhuis M (2005) Pexophagy: the selective autophagy of peroxisomes. Autophagy 1: van Zutphen T, Baerends RJ, Susanna KA, de Jong A, Kuipers OP, Veenhuis M, van der Klei IJ (2010) Adaptation of Hansenula polymorpha to methanol: a transcriptome analysis. BMC Genomics 11: Leao-Helder AN, Krikken AM, van der Klei IJ, Kiel JA, Veenhuis M (2003) Transcriptional down-regulation of peroxisome numbers affects selective peroxisome degradation in Hansenula polymorpha. J Biol Chem 278: Lin-Cereghino GP, Godfrey L, de la Cruz BJ, Johnson S, Khuongsathiene S, Tolstorukov I, Yan M, Lin-Cereghino J, Veenhuis M, Subramani S, Cregg JM (2006) Mxr1p, a key regulator of the methanol utilization pathway and peroxisomal genes in Pichia pastoris. Mol Cell Biol 26: Yurimoto H (2009) Molecular basis of methanol-inducible gene expression and its applications in the methylotrophic yeast Candida boidinii. Biosci Biotechnol Biochem 73: Gancedo JM (2008) The early steps of glucose signalling in yeast. FEMS Microbiol Rev 32: Turcotte B, Liang XB, Robert F, Soontorngun N (2010) Transcriptional regulation of nonfermentable carbon utilization in budding yeast. FEMS Yeast Res 10: Liiv L, Pärn P, Alamäe T (2001) Cloning of maltase gene from a methylotrophic yeast, Hansenula polymorpha. Gene 265: Alamae T, Pärn P, Viigand K, Karp H (2003) Regulation of the Hansenula polymorpha maltase gene promoter in H. polymorpha and Saccharomyces cerevisiae1. FEMS Yeast Res 4: Hodgkins M, Mead D, Ballance DJ, Goodey A, Sudbery P (1993) Expression of the glucose oxidase gene from Aspergillus niger in Hansenula polymorpha and its use as a reporter gene to isolate regulatory mutations. Yeast 9: Parpinello Parpinello G, Berardi E, Strabbioli R (1998) A regulatory mutant of Hansenula polymorpha exhibiting methanol utilization metabolism and peroxisome proliferation in glucose. J Bacteriol 180: Alamae T, Liiv L (1998) Glucose repression of maltase and methanoloxidizing enzymes in the methylotrophic yeast Hansenula polymorpha: isolation and study of regulatory mutants. Folia Microbiol 43: Stasyk OV, Stasyk OG, Komduur J, Veenhuis M, Cregg JM, Sibirny AA (2004) A hexose transporter homologue controls glucose repression in the methylotrophic yeast Hansenula polymorpha. J Biol Chem 279: Kramarenko T, Karp H, Järviste A, Alamäe T (2000) Sugar repression in the methylotrophic yeast Hansenula polymorpha studied by using hexokinase-negative, glucokinase-negative and double kinase-negative mutants. Folia Microbiol 45: Laht S, Karp H, Kotka P, Järviste A, Alamäe T (2002) Cloning and characterization of glucokinase from a methylotrophic yeast Hansenula polymorpha: different effects on glucose repression in H. polymorpha and Saccharomyces cerevisiae. Gene 296: Karp H, Järviste A, Kriegel TM, Alamäe T (2003) Cloning and biochemical characterization of hexokinase from the methylotrophic yeast Hansenula polymorpha. Curr Genet 44: Stasyk OG, Maidan MM, Stasyk OV, Van Dijck P, Thevelein JM, Sibirny AA (2008) Identification of hexose transporter-like sensor HXS1 and functional hexose transporter HXT1 in the methylotrophic yeast Hansenula polymorpha. Eukaryot Cell 7: Stasyk OG, van Zutphen T, Kang HA, Stasyk OV, Veenhuis M, Sibirny AA (2007) The role of Hansenula polymorpha MIG1 homologues in catabolite repression and pexophagy. FEMS Yeast Res 7: Siverio JM (2002) Assimilation of nitrate by yeasts. FEMS Microbiol Rev 26: Navarro FJ, Machín F, Martín Y, Siverio JM (2006) Down-regulation of eukaryotic nitrate transporter by nitrogen-dependent ubiquitinylation. J Biol Chem 281: Navarro FJ, Martín Y, Siverio JM (2008) Phosphorylation of the yeast nitrate transporter Ynt1 is essential for delivery to the plasma membrane during nitrogen limitation. J Biol Chem 283: Rodriguez C, Tejera P, Medina B, Guillen R, Dominguez A, Ramos J, Siverio JM (2010) Ure2 is involved in nitrogen catabolite repression and salt tolerance via Ca 2+ homeostasis and calcineurin activation in the yeast Hansenula polymorpha. J Biol Chem 285: Avila J, González C, Brito N, Machín F, Pérez MD, Siverio JM (2002) A second Zn(II)(2)Cys(6) transcriptional factor encoded by the YNA2 gene is indispensable for the transcriptional activation of the genes involved in nitrate assimilation in the yeast Hansenula polymorpha. Yeast 19: Steinborn G, Kunze G, Gellissen G (2009) A wide-range integrative expression vector (CoMed) system for yeasts, W: Satyanarayana T, Kunze G (red) Yeast Biotechnology: Diversity and Applications. Springer, str Kim SY, Sohn JH, Bae JH, Pyun YR, Agaphonov MO, Ter-Avanesyan MD, Choi ES (2003) Eficient library construction by in vivo recombina- Postępy Biochemii 59 (1)

12 tion with a telomere-originated autonomously replicating sequence of Hansenula polymorpha. Appl Environ Microbiol 69: Bollok M, Resina D, Valero F, Ferrer P (2009) Recent patents on the Pichia pastoris expression system: expanding the toolbox for recombinant protein production. Recent Pat Biotechnol 3: Zhang AL, Luo JX, Zhang TY, Pan YW, Tan YH, Fu CY, Tu FZ (2009) Recent advances on the GAP promoter derived expression system of Pichia pastoris. Mol Biol Rep 36: Tolstorukov I, Cregg JM (2007) Classical Genetics, W: Cregg JM (red) Methods in Molecular Biology, Humana Press, Totowa NJ, 389: str Cregg JM, Tolstorukov I, Kusari A, Sunga J, Madden K, Chappell T (2008) Expression in the yeast Pichia pastoris. Methods Enzymol 463: Jahic M, Veide A, Charoenrat T, Teeri T, Enfors SO (2006) Process technology for production and recovery of heterologous proteins with Pichia pastoris. Biotechnol Prog 22: De Schutter K, Lin YC, Tiels P, Van Hecke A, Glinka S, Weber-Lehmann J, Rouzé P, Van de Peer Y, Callewaert N (2009) Genome sequence of the recombinant protein production host Pichia pastoris. Nat Biotechnol 27: Hamilton SR, Gerngross TU (2007) Glycosylation engineering in yeast: the advent of fully humanized yeast. Curr Opin Biotechnol 18: Mattanovich D, Callewaert N, Rouzé P, Lin YC, Graf A, Redl A, Tiels P, Gasser B, De Schutter K (2009) Open access to sequence: browsing the Pichia pastoris genome. Microb Cell Fact 8: Küberl A, Schneider J, Thallinger GG, Anderl I, Wibberg D, Hajek T, Jaenicke S, Brinkrolf K, Goesmann A, Szczepanowski R, Pühler A, Schwab H, Glieder A, Pichler H (2011) High-quality genome sequence of Pichia pastoris CBS7435. J Biotechnol 154: Chung BK, Selvarasu S, Andrea C, Ryu J, Lee H, Ahn J, Lee H, Lee DY (2010) Genome-scale metabolic reconstruction and in silico analysis of methylotrophic yeast Pichia pastoris for strain improvement. Microb Cell Fact 9: Smith JJ, Burke A, Bredell H, van Zyl WH, Görgens JF (2012) Comparing cytosolic expression to peroxisomal targeting of the chimeric L1/L2 (ChiΔH-L2) gene from human papillomavirus type 16 in the methylotrophic yeasts Pichia pastoris and Hansenula polymorpha. Yeast 29: Mack M, Wannemacher M, Hobl B, Pietschmann P, Hock B (2009) Comparison of two expression platforms in respect to protein yield and quality: Pichia pastoris versus Pichia angusta. Protein Expr Purif 66: Sibirny AA (1996) Pichia methanolica (Pichia pinus MH4), W: Wolf K (red) Nonconventional Yeasts in Biotechnology. Springer-Verlag, Heidelberg, str Zimmermann M, Fournier P (1996) Electrophoretic karyotyping of yeasts, W: Wolf K (red) Nonconventional Yeasts in Biotechnology. Springer-Verlag, Heidelberg, str Sibirny AA, Titorenko VI, Efremov BD, Tolstorukov II (1987) Multiplicity of mechanisms of carbon catabolite repression involved in the synthesis of alcohol oxidase in the methylotrophic yeast Pichia pinus. Yeast 3: Sibirny AA, Titorenko VI, Teslyar GE, Petrushko VI, Kucher MM (1991) Methanol and ethanol utilization in methylotrophic yeast Pichia pinus wild-type and mutant strains. Arch Microbiol 156: Titorenko VI, Khodursky AB, Teslyar GE, Sibirny AA (1991) Identification of new genes controlling catabolite repression of alcohol oxidase and catalase synthesis in methylotrophic yeasts Pichia pinus. Genetica 27: (w j. rosyjskim) 69. Nakagawa T, Sakai Y, Mukaiyama H, Mizumura T, Miyaji T, Yurimoto H, Kato N, Tomizuka N (2001) Analysis of alcohol oxidase isozymes in gene-disrupted strains of methylotrophic yeast Pichia methanolica. J Biosci Bioeng 91: Nakagawa T, Inagaki A, Ito T, Fujimura S, Miyaji T, Yurimoto H, Kato N, Sakai Y, Tomizuka N (2006) Regulation of two distinct alcohol oxidase promoters in the methylotrophic yeast Pichia methanolica. Yeast 23: Nakagawa T, Yoshida K, Takeuchi A, Ito T, Fujimura S, Matsufuji Y, Tomizuka N, Yurimoto H, Sakai Y, Hayakawa T (2010) The peroxisomal catalase gene in the methylotrophic yeast Pichia methanolica. Biosci Biotechnol Biochem 74: Nakagawa T, Fujimura S, Ito T, Matsufuji Y, Ozawa S, Miyaji T, Nakagawa J, Tomizuka N, Yurimoto H, Sakai Y, Hayakawa T (2010) Molecular characterization of two genes with high similarity to the dihydroxyacetone synthase gene in the methylotrophic yeast Pichia methanolica. Biosci Biotechnol Biochem 74: Zhai Z, Yurimoto H, Sakai Y (2012) Molecular characterization of Candida boidinii MIG1 and its role in the regulation of methanol-inducible gene expression. Yeast 29: Yurimoto H, Sakai Y (2009) Methanol-inducible gene expression and heterologous protein production in the methylotrophic yeast Candida boidinii. Biotechnol Appl Biochem 53: Bazy danych Regulation of gene expression in methylotrophic yeasts Dorota Grabek-Lejko 1, Vladimir Sibirny 1, Andriy Sibirny 1,2, 1 University of Rzeszow, 4 Zelwerowicza St., Rzeszow, Poland 2 Institute of Cell Biology National Academy of Sciences of Ukraine, 14/16 Dragomanowa St., Lviv Ukraine sibirny@yahoo.com Key words: methylotrophic yeasts, Hansenula polymorpha, Pichia pastoris, Pichia methanolica, Candida boidinii, gene expression Abstract Methylotrophic yeasts are unique eukaryotic organisms, that can metabolize toxic one-carbon substrate, methyl alcohol or methanol. About 50 species of methylotrophic yeasts is known, among them 4 species are the best studied: Pichia methanolica, Hansenula polymorpha, Pichia pastoris i Сandida boidinii. These organisms, especially P. pastoris i H. polymorpha appeared to be very perspective overproducers of heterologous proteins and nowadays are used for industrial production of some of them. In this review, we provide information on the organization of the genome, mechanisms of regulation of gene expression and the use of strong promoters of these yeast species to construct the producers of heterologous proteins. In more details, we analyze genetic control of carbon and nitrogen catabolic repression in H. polymorpha and also the identification of metabolites inducing catabolite repression or peroxisome selective autophagy in the medium with ethanol in the Pichia methanolica yeast