Stê enie kotyniny i trans-3'-hydroksykotyniny oraz ich glukuronidów w moczu kobiet ciê arnych pal¹cych tytoñ

Transkrypt

1 PRACE ORYGINALNE Hanna KÊDZIORA Ewa FLOREK Wojciech PIEKOSZEWSKI Grzegorz H. BRÊBOROWICZ Andrzej ANHOLCER Ewa GOMÓ KA Maksymilian KULZA Artur STANEK Stê enie kotyniny i trans'hydroksykotyniny oraz ich glukuronidów w moczu kobiet ciê arnych pal¹cych tytoñ Concentration of cotinine and trans'hydroxycotinine and its gucuronides in urine of smoking pregnant women Laboratorium Badañ Œrodowiskowych, Katedra i Zak³ad Toksykologii, Uniwersytet Medyczny im. Karola Marcinkowskiego w Poznaniu. Kierownik: Prof. dr hab. Ewa Florek Zak³ad Chemii Analitycznej, Uniwersytet Jagielloñski w Krakowie Kierownik: Prof. dr hab. Pawe³ Koœcielniak Klinika Perinatologii i Ginekologii, Katedra Perinatologii i Ginekologii, Uniwersytet Medyczny im. Karola Marcinkowskiego w Poznaniu Kierownik: Prof. dr hab. Grzegorz H. Brêborowicz Zak³ad Toksykologii Analitycznej i Terapii Monitorowanej, Collegium Medicum, Uniwersytet Jagielloñski w Krakowie Kierownik: Dr Beata Bystrowska Dodatkowe s³owa kluczowe: tytoñ trans'hydroksykotynina glukuronid ci¹ a Additional key words: tobacco trans'hydroxycotinine glucuronide pregnancy Adres do korespondencji: Prof. dr hab. Ewa Florek Laboratorium Badañ Œrodowiskowych Katedra i Zak³ad Toksykologii Uniwersytet Medyczny im. Karola Marcinkowskiego ul. Dojazd Poznañ Tel. (+) Faks (+) wew. eflorek@amp.edu.pl Do oceny ekspozycji na sk³adniki dymu wykorzystuje siê miêdzy innymi tzw. biomarkery. W wiêkszoœci badañ przeprowadzanych z udzia³em osób pal¹cych oznacza siê kotyninê. Celem pracy by³a ocena przydatnoœci oznaczeñ dwóch metabolitów nikotyny kotyniny i trans hydroksykotyniny (HC) do oceny palenia tytoniu przez kobiety w czasie ci¹ y. Badania przeprowadzono wœród kobiet ciê arnych ( pal¹cych i niepal¹cych), które zg³osi³y siê na Oddzia³ Porodowy do Ginekologiczno Po³o niczego Szpitala Klinicznego Uniwersytetu Medycznego w Poznaniu. Kotyninê i trans hydroksykotyninê oznaczono metod¹ wysokosprawnej chromatografii cieczowej z detekcj¹ spektrofotometryczn¹. W badaniach wykazano, i wystêpuj¹ce w moczu kotynina i trans hydroksykotynina w znacznym stopniu zwi¹zane s¹ z kwasem glukuronowym. Liniowa zale noœæ pomiêdzy stê eniem kotyniny wolnej oraz sprzêgniêtej z kwasem glukuronowym a stê eniem ca³kowitej kotyniny wskazuje na mo liwoœæ stosowania oznaczeñ zarówno kotyniny wolnej, sprzê onej, jak i ca³kowitej jako biomarkerów nara enia na dym tytoniowy. Znaczne wi¹zanie trans'hydroksykotyniny z kwasem glukuronowym (ponad %) i bardzo dobra korelacja stê enia tego koniugatu z ca³kowitym stê eniem trans'hydroksykotyniny wskazuje, e w celu zastosowania HC jako biomarkera nara enia na dym tytoniowy próbkê nale y poddaæ hydrolizie lub oznaczaæ glukuronid trans'hydroksykotyniny. Przeprowadzone badania potwierdzaj¹ obserwacje innych autorów, e iloraz stê eñ trans'hydroksykotyniny i kotyniny mo e byæ stosowany jako miernik ró nic w szybkoœci metabolizmu kotyniny (polimorfizmu). W badaniach wykazano, e stosuj¹c dostêpny obecnie w wiêkszoœci laboratoriów sprzêt analityczny (HPLC) mo na oznaczyæ dwa bardzo przydatne i daj¹ce zró nicowane informacje biomarkery nara enia na dym tytoniowy i to zarówno niezwi¹zane, jak i zwi¹zane z kwasem glukuronowym. To assess the exposure to tobacco smoke constituents, the biomarkers are used. In most studies conducted among active smokers, the cotinine is usually utilised as such a biomarker. The aim of this study was to estimate an application of determining two nicotine metabolites, cotinine and trans hydroxycotinine (HC) in order to assess cigarette smoking among pregnant women. There were patients ( smokers, nonsmokers) admitted to Delivery Ward in Gynecology and Obstetrics Clinical Hospital of the University of Medical Sciences in Poznan. The free and total form of cotinine and trans' hydroxycotinine in urine were determined by the means of high performance liquid chromatography with spectrometry detection. The results of this studies indicated that in urine both cotinine and trans'hydroxycotinine are conjugated with glucoronide acid in the high degree. The linear correlation between free and conjugated form of cotinine and whole cotinine concentration indicates the possibility of application of all three of them as biomarkers of tobacco smoke exposure. The high conjugation of trans'hydroxycotinine with glucuronic acid (over %), and high correlation between glucuronide and total trans'hydroxycotinine concentration proves necessity of having the urine samples hydrolysed or determining the 'hydroxycotinine glucoronide, when application of HC as a biomarker of tobacco smoke exposure is concerned. Our studies confirm other authors observations that division of ' hydroxycotinine and cotinine concentrations might be used as a predictor of differences in cotinine metabolite ratio (polimorphism). The studies shown that using analytical equipment, nowadays available in the most laboratories (HPLC), it is possible to determined two biomarkers which are very useful and give various information, no matter whether they are conjugated with glucuronic acid, or not. Przegl¹d Lekarski / / H. Kêdziora i wsp.

2 Wstêp Nikotyna jest g³ównym czynnikiem odpowiedzialnym za powstanie uzale nienia i trudnoœci zwi¹zane z zaprzestaniem palenia tytoniu. Iloœæ wypalanych papierosów w znacznym stopniu determinowana jest przez szybkoœæ metabolizmu nikotyny wp³ywaj¹ca na jej poziom umo liwiaj¹cy uzyskanie oczekiwanych efektów farmakologicznych [,]. Alkaloid ten po wch³oniêciu do organizmu wraz z dymem tytoniowym ulega przemianie g³ównie przy udziale cytochromu CYP D i CYP A oraz oksydazy alkoholowej, monooksygenaz flawinowych i glukuronidazy [,,]. W wyniku metabolizmu nikotyny powstaj¹ dwa g³ówne metabolity, kotynina (COT) i trans'hydroksykotynina (HC), które w nastêpnym etapie biotransformacji w znacznym stopniu ulegaj¹ sprzêganiu z kwasem glukuronowym. Wiêkszoœæ przeprowadzonych badañ wykaza³o, e profil metaboliczny nikotyny nie zale y od drogi jej podania/nara enia (dym tytoniowy, preparaty nikotynowe), jakkolwiek w niektórych badaniach obserwowano jej szybszy metabolizm u na³ogowych palaczy [,]. Tezê to popieraj¹ wyniki badañ wskazuj¹ce na d³u szy biologiczny okres pó³trwania kotyniny u osób nara onych na ETS (environmental tobaco smoke) ni u palaczy []. Obserwacje te zaprzeczaj¹ wczeœniejszym pogl¹dom o inhibuj¹cym wp³ywie nikotyny na w³asny metabolizm []. Trans hydroksykotynina (HC) powstaje przy udziale cytochromu CYP A z kotyniny i wiele badañ wskazuje, e stanowi ona najwy szy odsetek metabolitów nikotyny w moczu, co przemawia za stosowaniem oznaczania jej w tym materiale biologicznym jako biomarkera nara enia na dym tytoniowy. Badania wskazuj¹, e iloœæ HC w moczu przeciêtnie odpowiada % przyjêtej dawki nikotyny [,]. W moczu, krwi i œlinie wystêpuje zarówno w postaci wolnej, jak i sprzê onej jako Oglukuronid [,,]. Pomiêdzy stê eniem kotyniny i jej g³ównego metabolitu trans'hydroksykotyniny wykazano statystycznie istotna korelacjê [,]. W przypadku przemian metabolicznych nikotyny obserwowane jest zjawisko polimorfizmu, które g³ównie dotyczy cytochromu CYP A. U osób nale ¹cych do grupy tzw. szybkich metabolizerów dominuj¹cym produktem przemian nikotyny jest trans hydroksykotynina, wolni metabolizerzy natomiast charakteryzuj¹ siê przewag¹ kotyniny [,]. Nie w pe³ni rozwiniêty system enzymów metabolizuj¹cych ksenobiotyki u noworodków i dzieci sprawia, e biologiczny okres pó³trwania kotyniny wynosi odpowiednio i godzin, podczas gdy u osób doros³ych oko³o godzin. W wielu badaniach obok pomiaru stê eñ kotyniny i trans'hydroksykotyniny równie stosunek stê eñ trans'hydroksykotyniny do kotyniny wykorzystuje siê do oceny czynnej i biernej ekspozycji na dym tytoniowy, jakkolwiek czêœciej jest on pomocny do oceny aktywnoœci cytochromu CYP A []. Stosunek stê eñ HC/COT obliczany jest najczêœciej dla stê eñ w œlinie i krwi ze wzglêdu na wysok¹ korelacjê z klirensem nikotyny []. Obecnoœæ nikotyny we krwi lub jej metabolitów (kotynina, trans'hydroksykotynina) jest nie tylko markerem aktywnego i biernego palenia tytoniu, ale ich pomiar mo e byæ wykorzystany równie do ustawienia prawid³owego dawkowania preparatów stosowanych w nikotynowej terapii zastêpczej []. Pomimo wielu prób zastosowania pomiarów stê enia trans'hydroksykotyniny jako biomarkera nara enia na dym tytoniowy badania poziomów tego metabolitu nikotyny w p³ynach ustrojowych kobiet ciê arnych s¹ nieliczne [,,]. Celem pracy by³a ocena przydatnoœci oznaczeñ dwóch metabolitów nikotyny kotyniny i trans hydroksykotyniny do oceny palenia tytoniu przez kobiety w czasie ci¹ y. Materia³ i metody Grupa badana W okresie od grudnia roku do lutego roku przeprowadzono badania wœród kobiet ciê arnych, które zg³osi³y siê na Oddzia³ Porodowy do GinekologicznoPo³o niczego Szpitala Klinicznego Uniwersytetu Medycznego im. Karola Marcinkowskiego w Poznaniu. Zgodê na przeprowadzenie badañ wyda³a Komisja Bioetyczna przy Uniwersytecie Medycznym im. Karola Marcinkowskiego w Poznaniu. Wszystkie pacjentki zosta³y poinformowane o celu badania i wyrazi³y zgodê na udzia³. W oparciu o sk³adan¹ deklaracjê pacjentki podzielono na dwie grupy. W grupie pierwszej by³y kobiety niepal¹ce i nienara one na ETS, natomiast w drugiej pal¹ce w czasie ci¹ y. Od wszystkich kobiet pobrano próbkê moczu w iloœci oko³o ml w celu oznaczenia kotyniny, trans hydroksykotyniny i kreatyniny. Do momentu wykonania analizy próbki moczu przechowywano w temperaturze C. Oznaczanie kotyniny i trans'hydrokskotyniny w moczu Próbkê moczu podzielono na dwie czêœci; pierwsz¹ poddano ekstrakcji wczeœniej opisan¹ metod¹, a nastêpnie oznaczaniu metod¹ wysokosprawnej chromatografii cieczowej []. Przed przyst¹pieniem do oznaczeñ metodê zwalidowano w czêœci dotycz¹cej trans' hydroksykotyniny (oryginalnie metoda ta zosta³a opracowana wy³¹cznie dla kotyniny). Metoda dla kotyniny by³a liniowa w zakresie stê eñ ng/ml, granica wykrywalnoœci (LOD) wynosi³a ng/ml, a oznaczalnoœci (LOQ) ng/ml. Wspó³czynnik zmiennoœci oznaczeñ kotyniny w stê eniu i ng/ml by³ poni ej %. W przypadku trans'hydroksykotyniny zakres liniowoœci wynosi³ od do ng/ml, LOD ng/ Tabela I Stê enie kotyniny w moczu kobiet deklaruj¹cych niepalenie. Concentration of cotinine in the urine of no smoking women. ml, LOQ ng/ml, a wspó³czynniki zmiennoœci by³y równie poni ej %. Stê enie kotyniny i trans'hydroksykotyniny w moczu przeliczono na mg kreatyniny. Kreatyninê oznaczono metod¹ spektrofotometryczn¹. Drug¹ porcjê moczu poddano hydrolizie alkalicznej w celu uwolnienia kotyniny i trans'hydroksykotyniny z po³¹czeñ z kwasem glukuronowym, a nastêpnie wykonano ekstrakcjê i oznaczenie analogicznie jak w przypadku pierwszej porcji moczu. Takie postêpowanie mia ³o na celu oznaczenie ca³kowitej iloœci metabolitów tych zwi¹zanych i niezwi¹zanych z kwasem glukuronowym. Proces hydrolizy polega³ na ogrzewaniu ml moczu z ml M wodrotlenku sodu przez minut, w temperaturze o C. W wyniku przeprowadzonych analiz uzyskano nastêpuj¹ce czasy retencji: kotynina, min., 'hydroksykotynina, min., norefedryna (wzorzec wewnêtrzny), min. Wyniki Badania przeprowadzono wœród kobiet ciê arnych, które poinformowano o celu przeprowadzanego eksperymentu. Pacjentki podzielono na dwie grupy. Grupê pierwsz¹ () stanowi³y kobiety niepal¹ce tytoniu, natomiast do drugiej grupy () przydzielono osoby aktywnie pal¹ce papierosy. W grupie kobiet ciê arnych pal¹cych tytoñ, % stanowi³y pacjentki, które wypala³y papierosów dziennie. Od do papierosów dziennie wypala³o % kobiet badanych, od do papierosów dziennie wypala³o, % pacjentek. Kobiety ciê arne pal¹ce ponad papierosów dziennie stanowi³y, % badanych. Wœród kobiet ciê arnych, które na podstawie deklaracji zosta³y zakwalifikowane do grupy niepal¹cych, w dwóch przypadkach oznaczono kotyninê niesprzêgniêt¹ z kwasem glukuronowym w moczu, której poziom, i, ng/mg kreatyniny wskazywa³ na bierne palenie tytoniu (tabela I). Przeprowadzona hydroliza wykaza³a dodatkowo obecnoœæ kotyniny sprzê onej z kwasem glukuronowym w stê eniu, i, ng/mg kreatyniny u kolejnych dwóch pacjentek. We wszystkich próbkach moczu kobiet aktywnie pal¹cych tytoñ wykazano obecnoœæ kotyniny, zarówno w postaci wolnej, jak i w stê eniu ca³kowitym suma kotyniny wolnej i sprzê onej z kwasem glukuronowym (tabela II). Wartoœci stê eñ tego metabolitu mieœci³y siê w zakresie od, do, ng/mg kreatyniny w przypadku wolnej formy kotyniny, Nr pacjentki Stê enie kotyniny wolna ca³kowita [%] *,,,, *,,, *,,, *,,,, * Pacjentki biernie nara one na dym tytoniowy Przegl¹d Lekarski / /

3 od, do, ng /mg kreatyniny frakcji sprzê onej z kwasem glukuronowym oraz od, do, ng /mg kreatyniny sumy kotyniny wolnej i sprzê onej z kwasem glukuronowym, czyli ca³kowitej kotyniny (tabela II). Œrednie stê enie wolnej kotyniny wynosi³o,±, ng/mg kreatyniny, sprzê onej,±, ng/mg kreatyniny, natomiast ca³kowitej,±, ng/mg kreatyniny (rycina ). Procent wi¹zania kotyniny z kwasem glukuronowym w grupie kobiet pal¹cych waha³ siê od, do,, a wartoœæ œrednia wynosi³a,% (tabela II). Na podstawie przeprowadzonych badañ dokonano oceny zale noœci pomiêdzy stê eniem kotyniny w formie wolnej w moczu a poziomem sumy kotyniny wolnej i sprzê onej z kwasem glukuronowym. Wspó³czynnik korelacji pomiêdzy stê eniem kotyniny w moczu w formie wolnej a poziomem sumy kotyniny wolnej i sprzê onej z kwasem glukuronowym wynosi³, (rycina ), a pomiêdzy stê eniem kotyniny sprzê onej z kwasem glukuronowym a stê eniem ca³kowitej kotyniny, (rycina ). W grupie kobiet niepal¹cych we wszystkich przypadkach poziom trans hydroksykotyniny, zarówno w postaci wolnej, jak i sprzê onej z kwasem glukuronowym, a tym samym i ca³kowitej by³ równy zeru (rycina ). W próbkach moczu kobiet pal¹cych zakres stê eñ trans hydroksykotyniny w postaci wolnej wyniós³ od, do, ng/ mg kreatyniny, a œrednia wartoœæ równa by³a, ng/mg kreatyniny (tabela III, rycina ). Stê enie glukuronidu trans'hydroksykotyniny waha³o siê od, do, ng/mg kreatyniny przyjmuj¹c wartoœæ œredni¹, ng/mg kreatyniny (tabela III, rycina ). Natomiast stê enie ca³kowitej trans' hydroksykotyniny po hydrolizie mieœci³o siê w granicach od, do, ng/mg kreatyniny. Œrednia wartoœæ hydroksykotyniny wynosi³a, ng /mg kreatyniny (tabela III, rycina ). Trans hydrksykotynina a w % by³a z kwasem glukuronowym. Tabela II Stê enie kotyniny w moczu kobiet pal¹cych tytoñ. Concentration of cotinine in the urine of smoking women. Nr pacjentki wolna Stê enie kotyniny Wœród / pacjentów trans hydroksykotynina zosta³a oznaczona dopiero po poddaniu próbek hydrolizie. W podobnej grupie osób stê enie ca³kowitej trans hydroksykotyniny by³o poni ej czu³oœci metody analitycznej (tabela III). By³o to jedn¹ z przyczyn obok ma³ej iloœci badanych próbek braku korelacji pomiêdzy stê eniem wolnej i ca³kowitej trans hydroksykotyniny w moczu badanych kobiet, r=,. W przeciwieñstwie do tego stê enie glukuronidu trans'hydroksykotyniny by³o silnie skorelowane ze stê eniem ca³kowitej trans'hydroksykotyniny, r=, (rycina ). Oceniaj¹c zale noœæ pomiêdzy stê eniami kotyniny i trans'hydroksykotyniny stwierdzono brak korelacji pomiêdzy stê eniami formy wolnej ich glukuronidów (r=,) i ich stê eniem ca³kowitym (r=,). Innym sposobem oceny zale noœci pomiêdzy stê eniem kotyniny i trans'hydroksykotyniny jest obliczanie ilorazu (stosunku) ich stê eñ. W tabeli IV przedstawiono wartoœci œrednie tego wspó³czynnika (ilorazu) wraz z odchyleniami standardowymi dla formy wolnej i sprzê onej z kwasem glukuronowym oraz stê enia ca³kowitych tych metabolitów. Zale noœæ wspó³czynnika trans'hydroksykotynina/kotynina od stê enia ca³kowitej kotyniny i trans'hydroksykotyniny przedstawiono na rycinach i. W przypadku wspó³czynników obliczonych dla frakcji wolnych tych biomarkerów wykazano wysok¹ ich korelacjê ze stê eniem dla frakcji ca³kowitych, w przypadku kotyniny wspó³czynnik r wynosi³,, natomiast dla trans'hydroksykotyniny,. Dla stê eñ glukuronidów tych metabolitów nikotyny i ich stê eñ ca³kowitych frakcji takiej korelacji nie wykazano. ca³kowita [%],,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,, Stê enie kotyniny w moczu Stê enie kotyniny wolnej Stê enie glukuronidu kotyniny Stêzenie kotyniny ca³kowitej Stê enie wolnej (niesprzêgniêtej) kotyniny w moczu r =, Kobiety niepal¹ce lub nara one na ETS Kobiety pal¹ce Stê enie ca³kowitej kotyniny w moczu Rycina Œrednie stê enie kotyniny w moczu badanych kobiet. Mean concentration of cotinine in the urine of pregnant women. Rycina Zale noœæ pomiêdzy stê eniem kotyniny w moczu w formie wolnej a stê eniem ca³kowitej kotyniny. Relationship between concentration of no conjugated cotinine and the total concentration of cotinine. Przegl¹d Lekarski / / H. Kêdziora i wsp.

4 r =, Stê enie kotyniny wolnej Stê enie glukuronidu kotyniny Stê enie glukuronidu kotyniny w moczu Stê enie trans'hydroksykotyniny w moczu Stêzenie kotyniny ca³kowitej Stê enie ca³kowitej kotyniny w moczu Kobiety niepal¹ce lub nara one na ETS Kobiety pal¹ce Rycina Zale noœæ pomiêdzy stê eniem kotyniny w moczu w formie sprzê onej z kwasem glukuronowym a stê eniem ca³kowitej kotyniny. Relationship between concentration of cotinine glucuronide and the total concentration of cotinine. Tabela III Stê enie trans'hydroksykotyniny w moczu kobiet pal¹cych tytoñ. Concentration of trans'hydoxycotinine in the urine of smoking women. Nr pacjentki Stê enie 'hydroksykotyniny wolna Dyskusja G³ównym celem wspó³czesnej opieki nad kobietami ciê arnymi oraz ich dzieæmi jest zmniejszenie umieralnoœci oko³oporodowej noworodków. WskaŸnik ten œwiadczy o poziomie i rozwoju medycyny w danym kraju. Na umieralnoœæ oko³oporodow¹ istotny wp³yw ma styl ycia przysz³ej matki, na który sk³ada siê m.in. stosowanie u ywek, ekspozycja na promieniowanie jonizuj¹ce, nadu ywanie leków, a tak e nara enie na dym tytoniowy. Regularna ekspozycja kobiet ciê arnych na dym tytoniowy niesie du e ryzyko przedwczesnego porodu lub samoistnego poronienia, powoduje obni enie urodzeniowej masy cia³a noworodka, wyst¹pienia wad wrodzonych u potomstwa i mo e zwiêkszaæ równie ryzyko opóÿnienia rozwoju dziecka []. Tak powa ne skutki zdrowotne nara enia aktywnego, ale równie biernego kobiet ca³kowita Rycina Œrednie stê enia 'hydroksykotyniny w moczu badanych kobiet. Mean concentration of trans'hydroxycotinine in the urine of pregnant women. [%],,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,, ciê arnych na dym tytoniowy jest wskazaniem do monitorowania wielkoœci nara enie tej grupy pacjentek na toksyczne sk³adniki dymu tytoniowego. Ocena nara enia na dym tytoniowy mo e byæ dokonana z wykorzystaniem kwestionariusza ankiety, poprzez indywidualny monitoring i oznaczanie biomarkerów w p³ynach ustrojowych (mocz, krew, krew pêpowinowa, p³yn owodniowy, œlina) []. Najczêœciej wykorzystywaniem biomarkerem nara enia na dym tytoniowy jest kotynina, a znacznie rzadziej jej g³ówny metabolit trans'hydroksykotynina. W przeprowadzonych badaniach sprawdzono przydatnoœæ oznaczeñ dwóch metabolitów nikotyny kotyniny i trans hydroksykotyniny oraz ich glukuronidów do oceny palenia tytoniu przez kobiety w czasie ci¹ y. W niniejszej pracy jako biomarkery palenia tytoniu u yto dwóch metabolitów nikotyny, kotyniny i trans'hydroksykotyniny. Przydatnoœæ tych markerów do oceny nara enia na dym tytoniowy zosta³a wykazana tak e w innych badaniach. Stosuj¹c oznaczenia niesprzêgniêtych form wymienionych metabolitów autorzy wykazali podobne zalety diagnostyczne kotyniny, trans hydroksykotyniny, jak i ca³kowitego stê enia tych metabolitów. Natomiast iloraz HC/COT nie wykazywa³ dobrej korelacji z zawart¹ w powietrzu nikotyn¹ []. W przeprowadzonych badaniach w grupie kobiet deklaruj¹cych nie palenie stwierdzono dwa przypadki biernego nara enia na dym tytoniowy, jednak e tak ma³a liczba wyników nie pozwala na adne wyci¹ganie wniosków. W przypadku wolnej (niesprzêgniêtej z kwasem glukuronowym) kotyniny jej œrednie stê enie w moczu kobiet pal¹cych wynosi³o, ng/mg kreatyniny i by³o wy sze ni stê enia obserwowane w innych badaniach [,,]. Mog³o to byæ spowodowane dwoma czynnikami. Po pierwsze, rzeczywiœcie du ¹ iloœci¹ wypalanych przez kobiety papierosów, ale to nie jest zgodne z deklaracjami z wywiadu lekarskiego. Drugim czynnikiem mog³aby byæ ma³a liczba badanych pacjentek. Zakres obserwowanych stê eñ kotyniny w moczu kobiet by³ szeroki i waha³ siê od, do, ng/mg kreatyniny. Z wartoœci tych wnioskowaæ mo na o ró nym stopniu nara enia na dym tytoniowy badanych pacjentek, wœród których jednak pewien odsetek nie zredukowa³ dziennej dawki wch³anianej nikotyny. W badaniach niektórych autorów wykazywano obni enie stê eñ kotyniny u kobiet ciê arnych. Dempsey i wsp. interpretowali takie wyniki przyspieszonym metabolizmem nikotyny i jej metabolitów w tej populacji []. Wykazano, e w ci¹ y zmianie ulega³y parametry farmakokinetyczne nikotyny i kotyniny. Klirens nikotyny wzrasta³ o %, a kotyniny nawet o %. Okres pó³trwania kotyniny uleg³ skróceniu ponad dwukrotnie i wynosi³, godz. []. Dok³adny mechanizm tych zmian nie jest dot¹d poznany. Opisane przez autorów efekty mog³y byæ wywo³ane zwiêkszonym przep³ywem krwi przez w¹tro Przegl¹d Lekarski / /

5 Stê enie glukuronidu trans'hydroksykotyniny r =, Stosunek stê enia trans'hydroksykotyniny do kotyniny,,,,,, Stê enie wolnej (niesprzêgniêtej) kotyniny i HC r=, Stê enie glukuronidu kotyniny i HC Stê enie ca³kowitej kotyniny i HC, Stê eniej ca³kowite trans'hydroksykotyniny w moczu Stê enie ca³kowitej kotyniny w moczu Rycina Zale noœæ pomiêdzy stê eniem 'hydroksykotyniny w moczu w formie sprzê onej z kwasem glukuronowym a stê eniem ca³kowitej ' hydroksykotyniny. Relationship between concentration of trans'hydroxycotinine glucuronide and the total concentration of trans'hydroxycotinine. Rycina Zale noœæ ilorazu stê eñ trans'hydroksykotyniny i kotyniny od stê enia ca³kowitej kotyniny. Relationship between the trans'hydroxycotinine/cotinine ratio and the total concentration of cotinine. Tabela IV Stosunek stê enia trans'hydroksykotyniny do kotyniny w moczu kobiet pal¹cych. Mean trans'hydroxycotinine to coniine ratio in the urine of smoking women. Parametr Stosunek stê enia trans'hydroksykotyniny do kotyniny wolna bê lub indukcj¹ enzymów w¹trobowych u kobiet ciê arnych. Za przyspieszenie metabolizmu ksenobiotyków móg³ byæ równie odpowiedzialny metabolizm ³o yskowy. Zastanawiaj¹cy jest du o ni szy poziom trans hydroksykotyniny w moczu badanych kobiet, który wynosi³ jedynie, ng/ mg kreatyniny. Inni badacze wskazuj¹, e oko³o % kotyniny ulega metabolizmowi do trans'hydroksykotyniny i jest to g³ówny metabolit wykrywany w moczu [,,]. Tak niskie stê enie trans'hydroksy kotyniny w porównaniu ze stê eniem kotyniny mog³o byæ spowodowane czasem, jaki up³yn¹³ od wypalenia ostatniego papierosa. Kotynina jest pierwotnym metabolitem nikotyny, natomiast trans'hydroksykotynina powstaje dopiero z wytworzonej w organizmie kotyniny i w³aœnie czas, jaki up³yn¹³ od wypalenia papierosa mo e mieæ istotny wp³yw na wzajemny stosunek stê eñ tych metabolitów zarówno we krwi, jak i w moczu. Akiyama i wsp. wykazali, e kotynina powstaje w krótkim czasie od wypalenia papierosa i stosunkowo szybko zanika (biologiczny okres pó³trwania godz.), natomiast trans'hydroksykotynina zaczyna pojawiaæ siê nieco póÿniej i osi¹ga sta³y poziom, który utrzymuje siê przez oko³o godziny []. W metabolizmie kotyniny do trans'hydroksykotyniny obserwowane jest zjawisko polimorfizmu. W ka dej populacji s¹ osoby szybko i wolno metabolizuj¹ce ca³kowita Œrednia,,, ± SD,,, Zakres,,,,,, n Stosunek stê enia trans'hydroksykotyniny do kotyniny,,,,,,, Stê enie wolnej (niesprzêgniêtej) kotyniny i HC r=. Stê enie glukuronidu kotyniny i HC Stê enie ca³kowitej kotyniny i HC Stê enie ca³kowitej trans'hydroksykotyniny w moczu Rycina Zale noœæ ilorazu stê eñ 'hydroksykotyniny i kotyniny od stê enia ca³kowitej trans'hydroksykotyniny. Relationship between the trans'hydroxycotinine/cotinine ratio and the total concentration of trans'hydroxycotinine. kotyninê. Brak korelacji pomiêdzy kotynin¹ a trans'hydroksykotynin¹ móg³ wynikaæ równie z faktu, e w grupie badanej znajdowa³y siê osoby o szybkim oraz wolnym profilu metabolicznym, co pozostaje w œcis³ym zwi¹zku z proporcj¹ udzia³u kotyniny i trans'hydroksykotyniny w puli wszystkich metabolitów nikotyny. Dzieje siê tak ze wzglêdu na ró ne rodzaje fenotypu hydroksylacji ksenobiotyków typu sparteina/debryzochina, co oznacza, e u osobników szybko metabolizuj¹cych przewa aj¹cym metabolitem nikotyny jest 'hydroksykotynina, natomiast u tzw. wolnych metabolizerów dominuj¹cym metabolitem jest kotynina []. Jednak e przyczynê niskiego stê enia trans 'hydroksykotyniny i braku wspomnianej korelacji trudno t³umaczyæ polimorfizmem, bo niemo liwym wydaje siê byæ fakt, aby w grupie badanej znalaz³a siê wiêkszoœæ kobiet wolno metabolizuj¹cych kotyninê, gdzie w generalnej populacji stanowi¹ one znacznie mniejszy odsetek ni osoby szybko metabolizuj¹ce. Z wielu badañ wynika, e znaczna czêœæ zarówno kotyniny, jak i trans 'hydroksykotyniny jest sprzê ona z kwasem glukuronowym [,,,]. Dotychczasowe wyniki dotycz¹ce oznaczeñ trans 'hydroksykotyniny nie s¹ jednak jednoznaczne. Obok wspominanych ju wczeœniej badañ wskazuj¹cych na wysokie stê enia trans'hydroksykotyniny w moczu osób pal¹cych tytoñ, jak i nara onych na ETS s¹ doniesienia o niskich stê eniach tego metabolitu. W badaniach tych u niektórych osób stê enie trans hydroksykotyniny by³o nawet krotnie ni sze ni kotyniny []. Z kolei w innych badaniach stê Przegl¹d Lekarski / / H. Kêdziora i wsp.

6 enie trans'hydroksykotyniny by³o tak e niskie i stanowi³o zaledwie % wch³oniêtej nikotyny []. Za³o eniem pracy by³o równie oznaczenie ca³kowitego stê enia obu metabolitów nikotyny. Przeprowadzona hydroliza alkaliczna uwolni³a kotyninê i trans'hydroksykotyninê z powi¹zañ z kwasem glukuronowym, co spowodowa³o znaczny wzrost stê enia obu oznaczanych zwi¹zków. Œrednie stê enie kotyniny po hydrolizie, czyli stê enie ca³kowite wynosi³o, ng/mg kreatyniny, a jej metabolitu trans'hydroksykotyniny, ng/mg kreatyniny. W przypadku kotyniny wzrost ten by³ ponad trzykrotny, a w przypadku trans'hydroksykotyniny a siedmiokrotny. Zastosowana procedura analityczna (hydroliza próbki przed ekstrakcj¹) umo liwi³a nie tylko oznaczenie stê enia formy wolnej i ca³kowitej tych dwóch biomarkerów, ale i ró nicy pomiêdzy nimi stanowi¹cej stê enie ich glukuronidów. W przeprowadzonych badaniach stê enie glukuronidu kotyniny wynosi³o, ng/ mg kreatyniny, a trans'hydroksykotyniny, ng/mg kreatyniny. Wykazane w przypadku kotyniny,%, a dla trans'hydroksykotyniny,% wi¹zanie z kwasem glukuronowym potwierdza wczeœniejsze badania innych autorów wskazuj¹ce na znaczny stopieñ wi¹zania obu metabolitów z tym kwasem [,,,]. Wykazana korelacja zarówno pomiêdzy stê eniem wolnej (r=,) oraz stê eniem glukuronidu (r=,) kotyniny a jej stê eniem ca³kowitym œwiadczy o liniowym wi¹zaniu tego biomarkera z kwasem, glukuronowym, które jest niezale ne od stê enia kotyniny. W badaniach natomiast nie stwierdzono zale noœci pomiêdzy stê eniem formy wolnej a stê eniem ca³kowitym dla drugiego oznaczanego metabolitu nikotyny trans 'hydroksykotyniny. Stwierdzono natomiast bardzo wysok¹ korelacjê pomiêdzy stê eniem jej glukuronidu a stê eniem w formie ca³kowitej (r=,), co mo na t³umaczyæ wystêpowaniem w pewnej iloœci próbek 'hydroksykotyniny wy³¹cznie w formie sprzêgniêtej (stê enie glukuronidu trans'hydroksykotyniny i formy ca³kowitej trans hydroksykotyniny by³y sobie równe). Pomimo, e trans'hydroksykotynina powstaje jako metabolit wy³¹cznie z kotyniny nie stwierdzono statystycznie istotnej zale noœci pomiêdzy ich stê eniami zarówno wystêpuj¹cych jako zwi¹zki wolne, jak i glukuronidy. Na brak tej zale noœci wskazuj¹ tak e obliczone ilorazy stê eñ HC/COT dla zwi¹zków wolnych, glukuronidów i stê enia formy ca³kowitej. Co prawda wspó³czynnik ten dla zwi¹zków sprzê onych jest dwukrotnie wy szy ni dla wolnych, ale znaczna zmiennoœæ wewn¹trz badanych grup powoduje, e ró nice te nie s¹ statystycznie znamienne. Uzyskane w przeprowadzonych badaniach wspó³czynniki stê eñ dla obu metabolitów s¹ znacznie ni sze ni wynika to z danych literaturowych [,, ]. Przyczynê tak obni onych wartoœci mo na upatrywaæ w niskich wartoœciach stê eñ trans'hydroksykotyniny przy wy szych ni prowadzonych w niniejszej pracy stê eniach kotyniny [,,]. Podobnie du ¹ zmiennoœæ wewn¹trzgrupow¹ iloczynu HC/COT oraz wystêpowanie jego bardzo niskich wartoœci (znacznie wy sze stê enia kotyniny ni trans' hydroksykotyniny) stwierdzono równie w badaniach prowadzonych przez innych autorów []. Wyniki przeprowadzonych badañ wskazuj¹ na znaczn¹ korzyœæ, jak¹ daje prosty w wykonaniu, tani i stosunkowo krótki proces hydrolizy metabolitów nikotyny z ich po³¹czeñ z kwasem glukuronowym. Wielokrotny wzrost ich stê enia znacznie u³atwia proces analityczny i umo liwia wykazanie aktywnego palenia lub nara enia na dym tytoniowy w œrodowisku po znacznie d³u szym czasie od jego ustania. Problemem do rozwi¹zania pozostaje jednak ustalenie granic pomiêdzy osobami pal¹cymi, nara onymi na ETS i niepal¹cymi w oparciu o stê enie ca³kowitej kotyniny. Do tej pory wszyscy autorzy stosowali podzia³ na te trzy grupy w oparciu o stê enie niezwi¹zanej z kwasem glukuronowym kotyniny. Z danych z piœmiennictwa wynika, e takie podzia³y w oparciu o ca³kowite stê enie kotyniny nie zosta³y jeszcze opisane. Jeszcze wiêkszy problem stanowi zastosowanie trans'hydroksykotyniny jako indywidualnego biomarkera nara enia na dym tytoniowy. Pomimo niezaprzeczalnych zalet, dotychczasowe badania nie pozwalaj¹ na rutynowe oznaczenia tego zwi¹zku jako biomarkera nara enia na dym tytoniowy. Natomiast w badaniach mo e byæ wykorzystana inna w³aœciwoœæ glukuronidu trans'hydroksykotyniny, czyli fakt, i palenie tytoniu nie przyspiesza jej eliminacji w takim stopniu, jak dzieje siê to chocia by w przypadku kotyniny, której klirens u palaczy jest wy szy ni u osób niepal¹cych. Glukuronid trans hydroksykotyniny mo e byæ oznaczany bezpoœrednio, lecz wymaga to zastosowania zaawansowanych technik analitycznych (np. LC/MS). Mo liwe jest równie oznaczenie stê enia sprzê onej z kwasem glukoronowym trans'hydroksykotyniny tak jak w przeprowadzonych badaniach przez odjêcie od stê enia ca³kowitego (po hydrolizie) stê enia zwi¹zku wolnego (przed hydroliz¹). Rozpatruj¹c przydatnoœæ trans'hydroksykotyniny w badaniach naukowych, nie sposób pomin¹æ jej zastosowania w okreœlaniu aktywnoœci cytochromu CYP A na podstawie stosunku stê eñ HC/COT. Ma to niew¹tpliwe znaczenie w szacowaniu ryzyka zapadalnoœci na choroby odtytoniowe, zale ne od tego cytochromu wœród palaczy, poniewa CYP A jest odpowiedzialny za bioaktywacjê Nnitrozoamin specyficznych dla tytoniu. Inn¹ korzyœci¹ porównywania wartoœci stê eñ trans'hydroksykotyniny i jej zwi¹zku macierzystego, kotyniny, jest ustalenie profilu metabolicznego danej osoby. Piœmiennictwo. Benowitz N.L., Pomerleau O.F., Pomerleau C.: Nicotine metabolite ratio as a predictor of cigarette consumption. Nicotine Tob. Res.,,.. Hukkanen I., Jacob III P., Benowitz N.L.: Metabolism and disposition kinetics of nicotine. Pharmacolog. Rev.,,.. Benowitz B.L., Jacob III P., PerezStable E.: CYPD phenotype and the metabolism of nicotine and cotinine. Pharmacogenetics.,,.. Berkman C.E., Park S.B., Wrighton S.A., Cashman J.R.: In vitroin vivo correlation of human (s)nicotine metabolism. Biochem. Pharmacol.,,.. Carlson T.J., Jones J.P., Petersol L., Castagnoli Jr N., Iyer K.R., Trager W.F.: Stereoselectivity and isotope effects associated with cytochrome P catalized oxidation of (s)nicotine. The possibility of initial hydrogen atom abstraction in the formation of the D', 'nicotinum ion. Drug Matabol. Dispos.,,.. Allena J.Jr, Lawson G.M., Anderson R.: A new gas chromatography mass spectrometry method for simultaneous determination of total and free trans 'hydroxycotinine and cotinine in the urine of subjects receiving transdermal nicotine. Clin. Chem.,,.. Benowitz N.L., Jacob P., Fong I.: Nicotine metabolic profile in man: comparison of cigarette smoking and transdermal nicotine. J. Pharmacol. Exp. Therap.,,.. Ziegler U., Kauczok J., Dietz U.: Clinical correlation between the consumption of nicotine and cotinine concentrations in urine and serum by competitive enzymelinked immunosorbent assay. Pharmacol.,,.. Benowitz N.L., Jacob P.: Effects of cigarette smoking and carbon monoxide on nicotine and cotinine metabolism. Clin. Pharmacol. Therap.,,.. Neurath G.B., Dunger M., Orth D.: Trans hydoxycotinine as a main metabolite in urine of smokers. Int. Arch. Occup. Environ. Health.,,.. Byrd G.D., Chang K.M., Greene J.M.: Evidence for urinary excretion of glucuronide conjugates of nicotine, cotinine and trans hydroxycotinine in smokers. Drug Metab. Dispos.,,.. Grimaldi F., Oddoze C., Viala A.: Determination of nicotine and its main metabolites in urine by high performance liquid chromatography. J. Chromat.,,.. Kim I., Wtsadik A., Choo R. E.: Usefulness of salivary trans hydroxycotinine concentration and trans hydroxycotinine/cotinine ratio as biomarkers of cigarette smoke in pregnant women. J. Anal. Toxicol.,,.. Tuomi T., Johnsson T., Reijula K.: Analysis of nicotine, hydroxycotinine, cotinine and caffeine in urine of passive smokers by HPLC tandem mass spectrometry. Clin. Chem.,,.. Benowitz N.L., PerezStable E., Herrera B.: Ethnic differences in nicotine metabolism: Evidence for lower CYPA activity in Chinese Americans compared to Hispanics or Whites. Clin. Pharmacol. Therap.,,.. Benowitz N.L., Jacob P.: Trans hydroxycotinine: Disposition kinetics, effects and plasma levels during cigarette smoking. Clin. Pharmacol.,,.. Lea R.A., Dickson S., Benowitz N.L.: Withinsubject variation of the salivary HC/COT ratio in regular daily smokers: Prospects for estimating CYPA enzyme activity in largescale surveys of nicotine metabolic rate. J. Anal. Toxicol.,,.. Scherer G., Jarczyk L., Heller W.D.: Pharmacokinetics of nicotine, cotinine and «hydroxycotinine in cigarette smokers. Klin. Wochensch.,,.. Dempsey D.T.P., Tutka P., Jacob III P., et al.: Nicotine metabolism ratio as an index of CYPA metabolic activity. Clin. Pharmacol. Ther.,,.. Lawson G.M., Hurt R.D., Dale L.C., et al.: Application of urine nicotine and cotinine extraction rates to assessment of nicotine replacement in light, moderate and heavy smokers undergoing transdermal therapy. J. Clin. Pharmacol,,.. Kim I., Wtsadik A., Choo R.E., Jones H.E., Huestis M.A.: Usefulness of salivary trans'hydroxycotinine concentration and trans'hydroxycotinine/cotinine ratio as biomarkers of cigarette smoke in pregnant women. J. Anal. Toxicol.,,.. Kohler E., Bretschneider D., Rabsilber A., Weise W., Jorch G.: Assessment of prenatal smoke exposure by determining nicotine and its metabolites in maternal and neonatal urine. Hum. Exp. Toxicol.,,.. Tyrpieñ K., Wielkoszyñski T., Kowalska M., Mañka G., Dobosz C.: Ocena czêstoœci wystêpowania kotyniny i trans'hydroksykotyniny w wybranych Przegl¹d Lekarski / /

7 próbkach p³ynów ustrojowych. Przegl. Lek.,,,.. Florek E., Piekoszewski W., Kornacka M.K., Szmañko A.: Ocena nara enia na wielopierœcieniowe wêglowodory aromatyczne kobiet ciê arnych pal¹cych tytoñ. Przegl. Lek.,,.. Florek E., Adamek R.: Awareness of health consequences of smoking among pregnant women. Interaction,,,.. Hanke W., Kalinka J., Florek E., Sobala W.: Passive smoking and pregnancy outcome in central Poland. Hum. Exp. Toxicol.,,.. Simpson W.J.: A preliminary report on cigarette smoking and the incidence of prematurity. Am. J. Obstet. Gynecol.,,,.. Underwood P., Kesler K., O'Lane J., Callagan D.: Parental smoking empirically related to pregnancy outcome. Obstet. Gynecol.,,.. Piekoszewski W., Florek E.: Markery nara enia na dym tytoniowy. (ed) Akademia Medyczna, Poznañ,.. Matt G.E., Quintana P.J., Liles S., et al.: Evaluation of urinary trans'hydroxycotinine as a biomarker of children s environmental tobacco smoke exposure. Biomarkers.,,.. Florek E., Piekoszewski W., Brêborowicz G.H., Kornacka M.K.: The effect of environmental tobacco smoke on birth parameters of newborn. Arch. Perinat. Med.,,.. Florek E., Piekoszewski W., Rybakowski., Moczko J.: Using the questionnaire and cotinine concentration in urine for study smoking habit and exposure to ETS of pregnant women. Przegl. Lek.,,.. Dempsey D., Jacob P., Benowitz N. L.: Accelerated metabolism of nicotine and cotinine in pregnant smokers. J. Pharmacol. Exp. Ther.,,.. Murphy S.E., Carrie A.L., Joni J., et al.: A Comparison of urinary biomarkers of tobacco and carcinogen exposure in smokers cancer epidemiology. Biomarkers Prevent.,,.. Neurath G.B., Dunger M., Orth D.: Trans hydoxycotinine as a main metabolite in urine of smokers. Int. Arch. Occup. Environ. Health.,,.. Akiyama Y., Arashidani K., Kawano W., Kunugita N.: Urinary nicotine and its metabolites as a biomarker of exposure to environmental tobacco smoke. J UOEH.,,.. Malaiyandi V., Goodz S.D., Sellers E.M., Tyndale R.F.: CYPA genotype, phenotype, and the use of nicotine metabolites as biomarkers during ad libitum smoking. Cancer Epidemiol. Biomarkers Prev.,,.. Ghosheh O.A., Browne D., Rogers T.: A simple high performance liquid chromatographic method for the quantification of total cotinine, total hydroxycotinine and caffeine in the plasma of smokers. J. Pharm. Biomed. Anal.,,. Przegl¹d Lekarski / / H. Kêdziora i wsp.