METODY ZAMRAŻANIA CZ.1

Transkrypt

1 METODY PRZECHOWYWANIA I UTRWALANIA BIOPRODUKTÓW METODY ZAMRAŻANIA CZ.1 Opracował: dr S. Wierzba Katedra Biotechnologii i Biologii Molekularnej Uniwersytetu Opolskiego

2 Odporność drobnoustrojów na niskie temperatury jest znacznie większa niż na wysokie temperatury. Redukcja OLB następuje głównie w wyniku przemian fazowych wody: pożywka przechłodzona (-3 0 C) przeżywalność ok.. 97%, pożywka zamrożona (-3 0 C) przeżywalność ok.. 2% bakterie G- bardziej wrażliwe na niskie temperatury niż G+ większa przeżywalność dla drobnoustrojów w fazie stacjonarnej niż logarytmicznej drobnoustroje patogenne i nie patogenne nie wykazują różnic pod względem przeżywalności Clostridium boutilinum nie rozwija się poniżej -3,3 0 C Staphylococcus aureus, Sallmonella sp. poniżej -6,7 0 C dolne granice zdolności rozmnażania: bakterie C drożdże C pleśnie C

3 Temperatury subminimalne niższe od minimalnej temperatury wzrostu (rozmnażanie i większość procesów metabolicznych ulega zahamowaniu), mogą być przyczyną: śmierci, przejścia w stan anabiozy, zaburzeń metabolizmu: subminimalne dodatnie: zimny szok - krzepnięcie lipidów wchodzących w skład biomembran zaburzenia transportu: szczególnie wrażliwe G- w log fazie wzrostu szybkie obniżenie temperatury do C śmierć większości komórek skład pożywki: - bogatszy skład większa wrażliwość - ochronne działanie Mg 2+ i Ca 2+, oraz ATP, kwasów nukleinowych, białek, aminokwasów (przenikających na zewnątrz wskutek utraty szczelności błon ( biologicznych temperatura większa oporność bakterii hodowanych w niższych temperaturach (20 0 C) subminimalne ujemne: spadek liczebności jest wynikiem: mechanicznego uszkodzenia - kryształy lodu szoku osmotycznego wzrost stężenia soli wywołany dehydratacją komórek

4 Pod względem wrażliwości na temperatury subminimalne ujemne drobnoustroje dzielimy na: przeżywające mrożenie i rozmrażanie (przetrwalniki bakterii, zarodniki grzybów), niewrażliwe na zamrażanie, ale wymierające w czasie przechowywania, wrażliwe na zamrażanie i wymierające w czasie przechowywania, nie przeżywające procesu mrożenia niezależnie od warunków (glony, pierwotniaki)

5 Schemat postępowania przy zamrażaniu drobnoustrojów zaabsorbowanych na perełkach szklanych, propylenowych wykorzystywany przy częstym pobieraniu materiału METODY ZAMRAŻANIA

6 Zamrażanie kultur drożdży i grzybów nitkowatych w szklanych lub propylenowych słomkach : a. b. wzrost kultur na podłożu stałym lub płynnym c. sporządzenie zawiesiny w obecności czynników ochronnych d. napełnienie sterylnych słomek propylenowych lub szklanych kapilar e. wzrost grzybni na podłożu agarowym z 5% glicerolem f. g. h. napełnienie kapilar grzybnią i. k. zamrożenie w ciekłym azocie

7 Utrwalanie drobnoustrojów w warunkach beztlenowych konieczność stosowania sterylnego, gazu obojętnego (N 2, CO 2 ) METODY ZAMRAŻANIA

8 Ważnym czynnikiem w utrwalaniu drobnoustrojów jest kontrola tempa zamrażania (duża ilość małych kryształków lodu) znanych jest wiele metod kontrolowanego, stopniowego zamrażania: zamrażarki C/minutę, do temperatury kilka stopni powyżej punktu przemiany faz (-20/-30 0 C) ciekły azot bardzo szybkie mrożenie, aż do przekroczenia temperatury przemiany faz ewentualne ponowne wolne ochładzanie 1 0 C/minutę, aż do właściwej temperatury przechowywania W przypadku długotrwałego przechowywania (wartościowych tkanek) stosuje się zamrażanie w ciekłym azocie ( C), oraz witryfikację: jednostopniowe, głębokie zamrażanie w zawiesinie krioochronnej o bardzo dużym ciśnieniu osmotycznym (8 mol/dm 3 ), gwałtowne zamrażanie C/minutę: dehydratacja brak kryształów powstaje jednolita tafla lodu

9 Zamrażanie biopreparatów powszechnie stosowana metoda utrwalania np. kultur starterowych bakterii fermentacji mlekowej, drożdży piekarskich, zarodków zwierzęcych. Zamrażanie biomas mikroorganizmów: zamrażarki mechaniczne od C do C ciekłe gazy (azot C) Przeżywalność mikroorganizmów uzależniona jest od: rodzaju mikroorganizmów np. Lactobacillus acidophilus wolne tempo (stres przedzamrażalniczy) mała przeżywalność gwałtowne zamrożenie z 37 0 C do C mała przezywalność (ok.. 40%) wolne, stopniowe obniżanie temperatury (adaptacja do niższych temperatur wstępna inkubacja 6h 22 0 C, itd..) wysoka przeżywalność (ok.. 75%) oddziaływanie na skład lipidów ścian komórkowych, adaptacja zwiększa udział nienasyconych kwasów tłuszczowych, znacznie poprawia termotolerancyjność komórek warunki hodowli ph(lactococcus sp.) ph < 5,5 znaczne obniżenie krioodporności ph ok.. 6,0 mniejsza podatność komórek na pogorszenie żywotności podwyższone ciśnienie osmotyczne (dehydratacja, bisynteza trehalozy)

10 skład pożywki udział krioprotektantów zewnątrzkomórkowych: manitol, sorbitol, dekstran, metoloceluloza, żelatyna, wnikających do wnętrza komórki: DMSO, alkohole polihydroksylowe wiek kultury najodporniejsze komórki w stacjonarnej fazie wzrostu Reakcja drożdży na stres temperaturowy synteza protektorów czynników ochronnych komórek: białka szoku cieplnego przeciwdziałają agregacji białek o zmienionej termicznie strukturze: glikogen NSR1 warunkujących syntezę mrna w niskich temperaturach TIP1, TIP1/2 regulujących funkcje ściany komórkowej CSF1 umożliwiające aktywność fermentacji w niskich temperaturach trehaloza (disacharyd) najważniejszy metabolit stresowy drożdży (szok temperaturowy, osmotyczny), oddziaływuje na ściany komórkowe drożdży

11 Rozmrażanie bioproduktów proces zmiany stanu zawartej w nich wody i przywrócenie produktom ich własności naturalnych (poprzez doprowadzenie ciepła z zewnątrz): proces przebiega na zasadzie odwróconej krzywej zamrażania, znacznie wolniej (ciepło jest doprowadzane z zewnątrz przez rozmrożoną powierzchnie o niższej przewodności cieplnej, wyższym cieple właściwym, większej gęstości) 3-4 krotnie zmniejszony współczynnik dyfuzyjności cieplnej (mniejsza prędkość i czas wyrównania temperatur) niebezpieczeństwo powierzchniowego przegrzania produktu zbyt intensywne ogrzewanie

12 Przemysłowe metody rozmrażania produktów: ogrzewanie powierzchniowe doprowadzenie ciepła do powierzchni produktu: w powietrzu o temperaturze C (wolne) para wodna powietrze w temperaturze C (szybkie) woda lub solanka w temperaturze C przez zanurzenie w lodzie (bardzo wolne) na gorącej metalowej powierzchni (bardzo szybkie) - kontaktowe ogrzewanie wewnętrzne całej objętości produktu w polu elektrycznym wysokiej częstotliwości: dielektryczne, mikrofalowe, oporowe Ogrzewanie w powietrzu: 1 etap ogrzewanie do temperatury krioskopowej na powierzchni produktu 2 etap właściwe rozmrażanie przemiana fazowa lodu w całej objętości produktu Urządzenia tunelowe (obieg ciepłego, wilgotnego powietrza)

13 Rozmrażanie przez ogrzewanie wewnętrzne produkty o jednolitej strukturze i regularnych kształtach: mikrofalowe fale elektromagnetyczne o częstotliwości 915 i 2450 MHz, fale są absorbowane przez substancje dielektryczne powodując efekt grzejny efekt grzejny zależy od właściwości dielektrycznych produktów (tłuszcz, tkanka mięśniowa) zaletami są duża równomierność nagrzewania, znaczne skrócenie czasu rozmrażania, możliwość kontroli przebiegu procesu i jego automatyzacji dielektryczne, oporowe pole elektryczne jest wytwarzane przez elektrody otaczające produkt, częstotliwość fal MHz duża szybkość, lepsza jakość produktu w porównaniu do innych metod rozmrażania, możliwość rozmrażania wewnątrz opakowań Rozmrażanie drobnoustrojów: łaźnia wodna C powietrze 20 0 C i łaźnia wodna ważne usunięcie, rozcieńczenie krioprotektantów

14 Czynniki chłodnicze Woda środowisko chłodzące stosowane w metodach wstępnego wychładzania produktów: zimna woda wodociągowa woda lodowa temperatura ok C (zraszanie woda wodociągową lodu) Solanki wodne roztwory chlorków sodu, wapnia, magnezu: zakres stosowania jest ograniczony właściwościami fizycznymi (punkt eutektyczny) NaCl MgCl 2 CaCl 2 zamrażanie przez zanurzenie (ograniczenie przenikanie soli do produktu)

15 Amoniak (R717) -33,3 0 C duże instalacje przemysłowe duża wydajność chłodnicza, ciepło parowania mała rozpuszczalność w oleju (pompy olejowe) toksyczność dopuszczalne stężenie 0,01% METODY ZAMRAŻANIA Freony halogenowe związki węglowodorów nasyconych, mają różny potencjał zagrożenia ekologicznego (stopniowo wycofywane z użycia), duża sprawność, rozpuszczają olej: CFC w pełni halogenowe związki węgla (chlorofluorokarbony), wszystkie atomy wodoru zastąpione chlorem i fluorem np.. R12 (CF 2 Cl 2 ) wydajność ok.. 35% mniejsza niż amoniak, duże zagrożenie ekologiczne, wycofany z użycia, HCFC wodorochlorofluorokarbony, nie wszystkie atomy wodoru zastąpione chlorem i fluorem np.. R22 (CHF 2 Cl) wydajność zbliżona do amoniaku, powszechnie stosowany zamiennik R12, HFC wodorofluorokarbony, część atomów wodoru zastąpiona fluorem np. R134a (CH 2 FCF 3 ), nieco mniejsza wydajność w porównaniu do R22, przewidziany jako główny zamiennik R12, FC węglowodory w pełni halogenowe, wszystkie atomy wodoru zastąpione fluorem Ciekły azot (LIN): -195,8 0 C, z uwagi na bardzo niską sprawność procesu (ok.. 10-krotnie mniejsza niż w przypadku amoniaku) stosuje się na małą skalę do celów specjalnych, lub w kombinacji z tradycyjnymi metodami Ciekły dwutlenek węgla (LIC) pod ciśnieniem 2MPa, temperatura -20/-30 0 C, współczynnik wnikania ciepła ok.. 2-krotnie mniejszy niż w LN 2 dłuższy czas zamrażania korzystny pod względem ekonomicznym