Załącznik nr 2 do wniosku o przeprowadzenie postępowania habilitacyjnego AUTOREFERAT. Małgorzata Kapral

Transkrypt

1 Załącznik nr 2 do wniosku o przeprowadzenie postępowania habilitacyjnego AUTOREFERAT Małgorzata Kapral

2 AUTOREFERAT I. IMIĘ I NAZWISKO: Małgorzata Kapral II. POSIADANE DYPLOMY I STOPNIE NAUKOWE: 1993 r. tytuł technika analityki medycznej, Medyczne Studium Zawodowe w Katowicach 1998 r. tytuł magistra analityki medycznej (dyplom z wyróżnieniem) Wydział Farmaceutyczny z Oddziałem Analityki Medycznej, Śląska Akademia Medyczna w Katowicach Praca magisterska pt.: Identyfikacja genomu cytomegalowirusa we krwi obwodowej chorych z wirusowym zapaleniem wątroby Promotor: dr n. biol. Urszula Mazurek 2004 r. stopień naukowy doktora nauk medycznych w zakresie biologii medycznej, Katedra i Zakład Biologii Molekularnej i Genetyki, Wydział Farmaceutyczny z Oddziałem Medycyny Laboratoryjnej, Śląska Akademia Medyczna w Katowicach Rozprawa doktorska pt.: Aktywność transkrypcyjna genów BCL-2 i BAX w nowotworach złośliwych regionu głowy i szyi (wyróżnienie) Promotor: prof. zw. dr hab. n. przyr. Tadeusz Wilczok III. INFORMACJE O DOTYCHCZASOWYM ZATRUDNIENIU W JEDNOSTKACH NAUKOWYCH Od ukończenia studiów do chwili obecnej jestem pracownikiem Wydziału Farmaceutycznego z Oddziałem Medycyny Laboratoryjnej w Sosnowcu, Śląskiego Uniwersytetu Medycznego w Katowicach (do 2007 r. Śląska Akademia Medyczna) r r. Asystent w Zakładzie Biochemii Katedry Biologii Molekularnej, Biochemii i Biofarmacji, a po reorganizacji Wydziału w 2003 r., w Katedrze i Zakładzie Biochemii r. nadal Adiunkt w Katedrze i Zakładzie Biochemii Wydziału Farmaceutycznego z Oddziałem Medycyny Laboratoryjnej w Sosnowcu Śląskiego Uniwersytetu Medycznego w Katowicach. 2

3 IV. OSIĄGNIĘCIE NAUKOWE, WYNIKAJĄCE Z ART. 16 UST. 2 USTAWY Z DNIA 14 MARCA 2003 R. O STOPNIACH NAUKOWYCH I TYTULE NAUKOWYM ORAZ O STOPNIACH I TYTULE W ZAKRESIE SZTUKI (DZ. U. NR 65, POZ. 595 ZE ZM.): A) Tytuł osiągnięcia naukowego HEKSAFOSFORAN INOZYTOLU JAKO POTENCJALNY CZYNNIK PRZECIWNOWOTWOROWY I PRZECIWZAPALNY JELITA GRUBEGO BADANIA IN VITRO Osiągnięcie naukowe będące podstawą do wnioskowania o stopień naukowy doktora habilitowanego obejmuje cykl 10 publikacji o sumarycznym wskaźniku Impact Factor: ; liczbie punktów MNiSW: 193 B) Wykaz publikacji wchodzących w skład osiągnięcia naukowego (oświadczenia współautorów określające indywidualny wkład każdego z nich w powstanie poszczególnych publikacji znajdują się w Załączniku nr 5) 1. Kapral M, Parfiniewicz B, Strzałka-Mrozik B, Zachacz A, Węglarz L. Evaluation of the expression of transcriptional factor NF-κB induced by phytic acid in colon cancer cells. Acta Pol. Pharm.-Drug Res. 2008; 65(6): IF: 0.0; MNiSW: 9 Mój wkład w powstanie pracy polegał na opracowaniu koncepcji pracy, metodologii badań, zaplanowaniu i wykonaniu doświadczeń, izolacji ekstraktów całkowitego RNA z badanych komórek, wyznaczeniu liczby kopii mrna wybranych genów z wykorzystaniem techniki RT-qPCR w czasie rzeczywistym, opracowaniu i interpretacji uzyskanych wyników, przygotowaniu manuskryptu. Mój udział procentowy szacuję na 75%. 2. Kapral M, Wawszczyk J, Jurzak M, Dymitruk D, Węglarz L. Evaluation of the expression of metalloproteinases 2 and 9 and their tissue inhibitors in colon cancer cells treated with phytic acid. Acta Pol. Pharm.-Drug Res. 2010; 67(6): IF: 0.465, MNiSW: 9 Mój wkład w powstanie pracy polegał na opracowaniu koncepcji pracy, metodologii badań, zaplanowaniu i wykonaniu doświadczeń polegających na wyizolowaniu ekstraktów RNA z badanych komórek, ich jakościowej i ilościowej ocenie, wyznaczeniu liczby kopii mrna wybranych genów z wykorzystaniem techniki RT-qPCR w czasie 3

4 rzeczywistym, statystycznym opracowaniu i interpretacji uzyskanych wyników, przygotowaniu manuskryptu. Mój udział procentowy szacuję na 80%. 3. Wawszczyk J, Kapral M, Hollek A, Węglarz L. The effect of phytic acid on the expression of NF-κB, IL-6 and IL-8 in IL-1β-stimulated human colonic epithelial cells. Acta Pol. Pharm.-Drug Res. 2012; 69(6): IF: 0.665, MNiSW: 15 Mój wkład w powstanie pracy polegał na opracowaniu metodologii badań molekularnych, wyizolowaniu ekstraktów RNA z komórek nowotworowych jelita grubego, wyznaczeniu liczby kopii mrna wybranych genów z wykorzystaniem techniki RT-qPCR w czasie rzeczywistym i interpretacji uzyskanych wyników. Mój udział procentowy szacuję na 40%. 4. Kapral M, Wawszczyk J, Jurzak M, Hollek A, Węglarz L. The effect of inositol hexaphosphate on the expression of selected metalloproteinases and their tissue inhibitors in IL-1β-stimulated colon cancer cells. Int. J. Colorectal Dis. 2012; 27(11): IF: 2.238, MNiSW: 30 Mój wkład w powstanie pracy polegał na opracowaniu koncepcji pracy, metodologii badań, zaplanowaniu i wykonaniu doświadczeń polegających na wyizolowaniu ekstraktów RNA z badanych komórek, ich jakościowej i ilościowej ocenie, wyznaczeniu liczby kopii mrna wybranych genów z wykorzystaniem techniki RT-qPCR w czasie rzeczywistym, opracowaniu i interpretacji uzyskanych wyników, przygotowaniu manuskryptu. Mój udział procentowy szacuję na 75%. 5. Kapral M, Wawszczyk J, Hollek A, Węglarz L. Induction of the expression of genes encoding TGF-β isoforms and their receptors by inositol hexaphosphate in human colon cancer cells. Acta Pol. Pharm.-Drug Res. 2013a; 70 (2): IF: 0.693, MNiSW: 15 Mój wkład w powstanie pracy polegał na opracowaniu koncepcji pracy, metodologii badań, zaplanowaniu i wykonaniu doświadczeń polegających na wyizolowaniu ekstraktów RNA z badanych komórek, ich jakościowej i ilościowej ocenie, wyznaczeniu liczby kopii mrna wybranych genów z wykorzystaniem techniki RT-qPCR w czasie rzeczywistym, opracowaniu i interpretacji uzyskanych wyników, przygotowaniu manuskryptu. Mój udział procentowy szacuję na 75%. 4

5 6. Kapral M, Wawszczyk J, Sośnicki S, Węglarz L. Differential influence of inositol hexaphosphate on the expression of genes encoding TGF-β isoforms and their receptors in intestinal epithelial cells stimulated with proinflammatory agents. Mediators Inflamm. 2013b; Vol.2013, ID , p.1-10, DOI: /2013/ IF: 2.417, MNiSW: 30 Mój wkład w powstanie pracy polegał na opracowaniu metodologii badań, zaplanowaniu i wykonaniu doświadczeń polegających na wyizolowaniu ekstraktów RNA z badanych komórek, ich jakościowej i ilościowej ocenie, wyznaczeniu liczby kopii mrna wybranych genów z wykorzystaniem techniki RT-qPCR w czasie rzeczywistym, statystycznym opracowaniu i interpretacji uzyskanych wyników, przygotowaniu manuskryptu. Mój udział procentowy szacuję na 85%. 7. Kapral M, Sośnicki S, Wawszczyk J, Węglarz L. Influence of inositol hexaphosphate on the expression of selected proliferation markers in IL-1β-stimulated intestinal epithelial cells. Acta Pol. Pharm.-Drug Res. 2014; 71(6): IF: 0.737, MNiSW: 15 Mój wkład w powstanie pracy polegał na opracowaniu metodologii badań, zaplanowaniu i wykonaniu doświadczeń polegających na wyizolowaniu ekstraktów RNA z badanych komórek, ich jakościowej i ilościowej ocenie, wyznaczeniu liczby kopii mrna wybranych genów z wykorzystaniem techniki RT-qPCR w czasie rzeczywistym, statystycznym opracowaniu i interpretacji uzyskanych wyników, przygotowaniu manuskryptu. Mój udział procentowy szacuję na 85%. 8. Kapral M, Wawszczyk J, Sośnicki S, Węglarz L. Down-regulation of inducible nitric oxide synthase expression by inositol hexaphosphate in human colon cancer cells. Acta Pol. Pharm.-Drug Res. 2015; 72(4): IF: 0.877, MNiSW: 15 Mój wkład w powstanie pracy polegał na opracowaniu metodologii badań, zaplanowaniu i wykonaniu doświadczeń polegających na wyizolowaniu ekstraktów RNA z badanych komórek, ich jakościowej i ilościowej ocenie, wyznaczeniu liczby kopii mrna wybranych genów z wykorzystaniem techniki RT-qPCR w czasie rzeczywistym, statystycznym opracowaniu i interpretacji uzyskanych wyników, przygotowaniu manuskryptu. Mój udział procentowy szacuję na 85%. 5

6 9. Kapral M, Wawszczyk J, Sośnicki S, Jesse K, Węglarz L. Modulating effect of inositol hexaphosphate on arachidonic acid-dependent pathways in colon cancer cells. Prostaglandins Other Lipid Mediat. 2017a; 131: IF: 2.640, MNiSW: 25 Mój wkład w powstanie pracy polegał na opracowaniu metodologii badań, zaplanowaniu i wykonaniu doświadczeń polegających na wyizolowaniu ekstraktów RNA z badanych komórek, ich jakościowej i ilościowej ocenie, wyznaczeniu liczby kopii mrna wybranych genów z wykorzystaniem techniki RT-qPCR w czasie rzeczywistym, statystycznym opracowaniu i interpretacji uzyskanych wyników, przygotowaniu manuskryptu. Mój udział procentowy szacuję na 70%. 10. Kapral M, Wawszczyk J, Jesse K, Paul-Samojedny M, Kuśmierz D, Węglarz L. Inositol hexaphosphate inhibits proliferation and induces apoptosis of colon cancer cells by suppressing AKT/mTOR signaling pathway. Molecules 2017b; 22, 1657; doi: /molecules IF: 2.861, MNiSW: 30 Mój wkład w powstanie pracy polegał na opracowaniu metodologii badań, zaplanowaniu i wykonaniu doświadczeń polegających na wyizolowaniu ekstraktów RNA z badanych komórek, ich jakościowej i ilościowej ocenie, wyznaczeniu liczby kopii mrna wybranych genów z wykorzystaniem techniki RT-qPCR w czasie rzeczywistym, przygotowaniu prób do badań z wykorzystaniem cytometru przepływowego, statystycznym opracowaniu i interpretacji uzyskanych wyników, przygotowaniu manuskryptu. Mój udział procentowy szacuję na 75%. C) Omówienie celu naukowego ww. prac i osiągniętych wyników wraz z omówieniem ich ewentualnego wykorzystania: Cel naukowy Rak jelita grubego i odbytu (CRC, ang. colorectal cancer) jest jednym z najczęściej wykrywanych nowotworów zarówno u mężczyzn, jak i u kobiet w rozwiniętych krajach zachodnich. Pomimo zaawansowanych metod diagnozowania CRC i licznych programów badań przesiewowych, zachorowalność i śmiertelność z jego powodu jest nadal wysoka [1]. Złe rokowania spowodowane są wykrywaniem raka dopiero w zaawansowanym stadium, 6

7 z obecnymi przerzutami do węzłów chłonnych i okolicznych narządów. Dane literaturowe wskazują, że tylko 5-10% przypadków nowotworów ma podłoże genetyczne, a w 90-95% do zachorowań dochodzi sporadycznie i jest to spowodowane czynnikami środowiskowymi, wśród których złe nawyki żywieniowe i styl życia należą do najważniejszych [2]. Bardzo istotnym czynnikiem ryzyka zachorowania na raka jelita grubego jest przewlekły stan zapalny i związane z nim nieswoiste choroby zapalne jelit (IBD, ang. inflammatory bowel diseases), do których należą: choroba Leśniewskiego-Crohna i wrzodziejące zapalenie jelita grubego [3]. Uważa się również, że w patogenezie stanów zapalnych ważną rolę może odgrywać jelitowa flora bakteryjna, a zwłaszcza składniki ściany bakterii G(-), tj. lipopolisacharydy (LPS) oraz toksyny bakteryjne. Udowodniono, iż kluczowe mediatory reakcji zapalnej, takie jak IL-1, IL-6, IL-8, TNF-α, tlenek azotu czy eikozanoidy (prostaglandyny, leukotrieny) biorą aktywny udział w kancerogenezie, a obecność tych czynników w mikrośrodowisku guza może przyczyniać się do progresji nowotworów [4]. W ostatnich latach prowadzone są intensywne badania mające na celu opracowanie strategii zapobiegania powstawania CRC i wspomagania jego konwencjonalnego leczenia. Dane epidemiologiczne sugerują, że wzrost spożycia owoców i warzyw oraz produktów o dużej zawartości błonnika w istotny sposób może zmniejszać ryzyko powstawania tego nowotworu i hamować etapy jego rozwoju [5]. Dlatego też dużą uwagę skupia się na wykorzystaniu do celów prewencyjnych tzw. żywności funkcjonalnej, która poza składnikami odżywczymi zawiera również substancje nieodżywcze, wykazujące korzystne prozdrowotne działanie. Te biologicznie aktywne związki, nazywane nutraceutykami, są bezpieczne i nietoksyczne dla prawidłowych komórek, a liczne badania dokumentują hamowanie przy ich udziale wzrostu i proliferacji nieprawidłowych komórek oraz stymulację apoptozy [6]. Z tego powodu mogą one zapobiegać, a niekiedy i wspomagać leczenie wielu schorzeń, w tym również chorób zapalnych układu pokarmowego i nowotworów. Jednym z takich związków jest heksafosforan inozytolu (IP6, kwas fitynowy), występujący w produktach o dużej zawartości włókna pokarmowego, a szczególnie w ziarnach zbóż, nasionach roślin oleistych i strączkowych oraz orzechach. Jest on ufosforylowaną pochodną myo-inozytolu, cyklicznego sześciowęglowego, polihydroksylowego alkoholu. Heksafosforan inozytolu i jego metabolity o niższym stopniu ufosforylowania występują również w większości komórek ssaków [7]. Po doustnym podaniu, IP6 w przewodzie pokarmowym może być defosforylowany do IP5 przy udziale fitaz pochodzenia roślinnego lub flory bakteryjnej, a następnie bardzo szybko absorbowany do komórek jelita, jak również do komórek nowotworowych, na zasadzie 7

8 pinocytozy bądź endocytozy. Wewnątrz komórek kwas fitynowy jest odtwarzany i podlega powtarzającemu się cyklowi fosforylacji i defosforylacji do pochodnych o niższym stopniu ufosforylowania (IP5-IP1), zasilając w ten sposób pulę fosforanów inozytolu [8]. Ocenia się, że wewnątrzkomórkowe stężenia kwasu fitynowego w organizmie człowieka wynoszą od 10 µm do 1 mm [9]. Obecność receptorów i białek wiążących polifosforany inozytolu w komórkach wskazuje na ich znaczący udział w wielu fizjologicznych procesach, takich jak: kontrola funkcji kanałów jonowych, endo- i egzocytoza, transport mrna z jądra do cytoplazmy czy naprawa DNA [7]. Ponadto IP6 jest antyoksydantem, który hamuje powstawanie reaktywnych form tlenu, oraz neurotransmiterem [9]. Spożywanie produktów zawierających kwas fitynowy wpływa również na obniżenie stężenia glukozy, cholesterolu i triacylogliceroli w surowicy krwi [10]. Przeprowadzone w ostatnich latach badania, zarówno in vitro, jak i in vivo wskazują na potencjalne przeciwnowotworowe działanie IP6. Zaobserwowano, iż może on hamować proces kancerogenezy, a nawet wpłynąć na cofnięcie się już powstałych zmian. Ograniczenie wzrostu komórek na skutek działania kwasu fitynowego wykazano na komórkach wielu nowotworowych linii, m.in. sutka, prostaty, trzustki, szyjki macicy, wątroby, jelita grubego, a także białaczek, czerniaka i glejaka. [9, 11-14]. W badaniach in vivo na szczurach rasy Fischer 344 udowodniono, iż kwas fitynowy hamuje powstawanie i rozwój raka jelita grubego indukowanego azoksymetanem, zarówno w fazie preinicjacji, jak i postinicjacji transformacji nowotworowej [15, 16]. Na podstawie tych eksperymentów postulowano, że przeciwnowotworowe właściwości IP6 mogą być uwarunkowane jego zdolnością do regulowania procesów proliferacji i różnicowania nieprawidłowych komórek oraz indukcji ich apoptozy. Doniesienia literaturowe z ostatnich lat dokumentują również wpływ IP6 na aktywność komórek układu immunologicznego i przebieg procesów zapalnych. Jeden z jego kierunków działania może obejmować regulację syntezy i sekrecji cytokin lub chemokin zaangażowanych w kontrolę odpowiedzi immunologicznej. Zaobserwowano, że związek ten znacząco zmniejsza sekrecję IL-10 i nasila produkcję IFN-γ w jednojądrzastych komórkach krwi obwodowej oraz aktywuje komórki NK [17, 18]. Ze względu na obecność kwasu fitynowego w świetle jelita grubego w stężeniu przekraczającym 4 mm [19], przypuszcza się że może on modulować reakcję zapalną w obrębie tej części przewodu pokarmowego. Wykazano, że IP6 może obniżać ekspresję 8

9 prozapalnego czynnika TNF-α oraz jego receptorów TNFRI i TNFRII w komórkach gruczolakoraka jelita grubego [20]. Pomimo licznych badań dotyczących efektów jakie IP6 może wywierać na komórki, dokładny mechanizm jego działania nie został w pełni poznany. Obecnie naukowcy zajmujący się tym tematem proponują kilka teorii wyjaśniających jego biologiczną aktywność. Obecność sześciu reaktywnych grup fosforanowych w cząsteczce kwasu fitynowego warunkuje silną zdolność chelatowania jonów Zn 2+, Ca 2+, Mg 2+, Mn 2+, przez co może on regulować aktywność metaloenzymów kontrolujących różne etapy cyklu komórkowego lub biosyntezy białek, i w ten sposób wpływać na procesy proliferacji i różnicowania. Inny prawdopodobny mechanizm działania IP6 może być związany z inhibicją aktywności kinaz białkowych PI3K, AKT, MAP, PKC oraz czynników transkrypcyjnych AP-1 i NFκB [12-14], przez co kwas fitynowy może wpływać na wiele szlaków sygnalizacyjnych, w których biorą one udział i modulować różne procesy komórkowe. Spekuluje się również, że efekt przeciwnowotworowy IP6 zależy od jego konwersji do pochodnych inozytolowych o niższym stopniu fosforylacji, które odgrywają kluczową rolę w transdukcji sygnału i regulacji procesów komórkowych, a w szczególności IP3 (trifosforan inozytolu), pełniący rolę przekaźnika drugiego rzędu, i IP4 (tetrafosforan inozytolu), wpływający na regulację wewnątrzkomórkowego poziomu jonów wapnia [7]. Biorąc pod uwagę postulowane mechanizmy działania IP6, sugeruje się, że może on równocześnie wpływać na różne procesy komórkowe, a przez to na każdy etap powstawania i rozwoju nowotworu. Celem przedstawionego cyklu prac było wykazanie przeciwnowotworowych i przeciwzapalnych właściwości heksafosforanu inozytolu w odniesieniu do nowotworów jelita grubego i wyjaśnienie mechanizmu jego działania na biologicznie ważne szlaki komórkowe. Powyższy cel został zrealizowany poprzez przeprowadzenie badań, w których można wyróżnić następujące etapy: ocena wpływu IP6 na ekspresję genów kodujących podjednostki czynnika NF-κB, regulującego transkrypcję licznych genów, których białkowe produkty pełnią istotne funkcje w wielu procesach komórkowych, ocena efektów działania IP6 na komponenty szlaku AKT/mTOR w odniesieniu do procesów proliferacji i apoptozy komórek nowotworowych jelita grubego, ocena wpływu IP6 na aktywność transkrypcyjną genów kodujących wybrane metaloproteinazy macierzowe (MMP) i ich tkankowe inhibitory (TIMP), które należą do markerów procesu przerzutowania nowotworów, 9

10 ocena wpływu IP6 na poziom ekspresji i sekrecji wybranych mediatorów procesu zapalnego, tj. IL-6, IL-8, inos, cyklooksygenaz i lipooksygenaz oraz prostaglandyny E2 i leukotrienu B4, ocena efektów działania IP6 na ekspresję genów kodujących markery proliferacji (cykliny D1 i histonu H3) w komórkach stymulowanych IL-1β, ocena wpływu IP6 na ekspresję izoform transformującego czynnika wzrostu β (TGF-β) i ich receptorów w aspekcie procesów nowotworzenia i zapalenia. Materiały i metody W przeprowadzonych badaniach in vitro wykorzystano linię komórkową Caco-2 wyprowadzoną z gruczolakoraka okrężnicy. Komórki te wykazującą morfologiczne, strukturalne i funkcjonalne podobieństwo do enterocytów. W trakcie prowadzenia hodowli wykształcają one silne połączenia międzykomórkowe. Linia ta często stosowana jest jako model in vitro imitujący ludzki nabłonek jelitowy w badaniach toksykologicznych, farmakologicznych czy bromatologicznych, do analiz mechanizmów transportu i metabolizmu różnych związków chemicznych. Dane eksperymentalne sugerują, iż linia komórkowa Caco-2 może być dobrym modelem doświadczalnym do badania regulacji wydzielania cytokin i czynników wzrostu przez ludzkie komórki nabłonka jelit [21, 22]. Stężenia kwasu fitynowego (0,5-5 mm) zastosowane w badaniach in vitro korespondują z fizjologicznym stężeniem tego związku w komórkach człowieka (10 µm-1 mm) i w świetle jelita grubego (ponad 4 mm). W celu zbadania wpływu IP6 na ekspresję i sekrecję mediatorów procesu zapalnego zastosowano model in vitro tego stanu poprzez dodanie do medium hodowlanego prozapalnych cytokin IL-1β i TNF-α oraz endotoksyn bakterii Escherichia coli (serotyp 055:B5) i Salmonella enterica (serotyp typhimurium). Do stymulacji ekspresji genów kodujących MMP i ich tkankowe inhibitory oraz markery proliferacji (CCND1 i histon H3) wykorzystano IL-1β. Aktywność transkrypcyjną badanych genów wyznaczono techniką RT-qPCR w czasie rzeczywistym wykorzystując komercyjnie dostępny barwnik fluorescencyjny SybrGreen i specyficzne dla nich oligonukleotydowe startery. Stężenia białek p21, kaspazy-3, AKT1, p70s6k i ufosforylowanych form p-akt1, p-p70s6k oraz COX-2, 5-LOX w komórkach Caco-2 i wydzielanych przez nie eikozanoidów (PGE2 i LTB4) oznaczono metodami immunoenzymatycznymi. Aktywność proliferacyjną komórek 10

11 oceniano na podstawie testu ELISA wykorzystującego 5-bromo-2 -deoksyurydynę, związek wykazujący zdolność do inkorporacji do DNA w trakcie fazy S podziału komórkowego. Metodę cytometrii przepływowej zastosowano do analizy cyklu komórkowego i apoptozy komórek Caco-2 po ekspozycji na działanie IP6. Wyniki i konkluzje Ocena wpływu IP6 na ekspresję genów kodujących podjednostki czynnika transkrypcyjnego NF-κB Czynnik transkrypcyjny NF-κB odgrywa istotną rolę w regulacji ekspresji ok. 500 genów związanych m.in. z kontrolą cyklu komórkowego i proliferacją (CCND1, CDNK1A), apoptozą (BAX, BCL-2, CASP11), angiogenezą i przerzutowaniem (MMP1, MMP3, MMP9, VEGF), a także przebiegiem procesu zapalenia (IL-6, IL-8, COX-2, inos, 12-LOX, 5-LOX). Zaburzenia funkcjonowania tego czynnika mogą być związane z patogenezą różnych chorób, w tym nowotworów i chorób, którym towarzyszy przewlekły stan zapalny. Konstytutywna ekspresja i aktywność NF-κB może powodować nadmierną proliferację nieprawidłowych komórek, zahamowanie ich apoptozy oraz stymulować procesy angiogenezy i przerzutowania [23]. Rodzina białek NF-κB składa się z pięciu różnych podjednostek, tj. c-rel, p50 (NF-κB1), p65 (RelA), p52 (NF-κB2) i RelB, tworzących homo- lub heterodimery, które przyłączając się do specyficznych miejsc w promotorach genów docelowych aktywują ich transkrypcję. Dominującą postacią czynnika jest heterodimer p50/p65 skompleksowany z inhibitorem IκB, który blokuje jego transport do jądra. Do aktywacji szlaku NF-κB dochodzi w wyniku stymulacji komórki przez czynniki zewnątrz- lub wewnątrzkomórkowe, m.in. cytokiny prozapalne, czynniki wzrostu, stres oksydacyjny, endotoksyny bakteryjne, promieniowanie jonizujące i chemioterapeutyki. W efekcie czego następuje fosforylacja IκB i jego odłączenie od dimerów, które mogą przemieszczać się do jądra komórkowego [24]. Zdolność NF-κB do kontrolowania wielu genów, których produkty translacji uczestniczą w różnych procesach komórkowych, czyni go potencjalnym celem terapii przeciwnowotworowej. W przeprowadzonych przeze mnie badaniach określałam wpływ kwasu fitynowego na aktywność transkrypcyjną genów kodujących podjednostki p50 i p65 czynnika NF-κB oraz jego inhibitor IκBα w komórkach nowotworowych jelita grubego. 11

12 Linia Caco-2 charakteryzuje się konstytutywną ekspresją badanych genów, na co wskazują otrzymane wyniki stężenia ich transkryptów. Rezultaty eksperymentu wykazały wpływ IP6 na ekspresję p65 i I Bα w komórkach raka okrężnicy, a zmiany poziomu transkrypcji genów uzależnione były od stężenia i czasu jego działania. Traktowanie komórek IP6 powodowało już po godzinie spadek liczby kopii mrna p65 w porównaniu do komórek kontrolnych, podczas gdy transkrypcja genu IκBα utrzymywała się na tym samym poziomie. Po 6 godzinach działania IP6 na komórki zaobserwowano wzrost aktywności transkrypcyjnej obu genów, przy czym poziom mrna IκBα wzrastał proporcjonalnie do stężenia IP6. Długotrwała inkubacja (24 h) Caco-2 z kwasem fitynowym skutkowała obniżeniem ekspresji genu p65 i silną aktywacją genu IκBα przez 5 mm IP6. IP6, we wszystkich stosowanych stężeniach (1; 2,5; 5 mm), nie powodował zmian ekspresji genu kodującego podjednostkę p50 w hodowlach prowadzonych w warunkach standardowych [Kapral i wsp., 2008]. Natomiast w komórkach hodowanych w obecności prozapalnej cytokiny (IL-1β), IP6 nie powodował zmian ekspresji p65, ale hamował transkrypcję p50. Efekt ten był widoczny tylko po 3 godzinach działania 2,5 mm IP6 na komórki. Po 6 godzinach inkubacji Caco-2 z IP6 zaobserwowano wzrost aktywności transkrypcyjnej IκBα [Wawszczyk i wsp., 2012]. Przeprowadzone badania sugerują, że biologiczna aktywność heksafosforanu inozytolu może wynikać głównie z jego wpływu na wzrost ekspresji genu kodującego inhibitor IκBα, co może skutkować jego zwiększonym stężeniem w cytoplazmie komórek i hamowaniem aktywności p50/p65, a w konsekwencji hamowaniem transkrypcji genów zależnych od czynnika NF-κB. Ocena efektów działania IP6 na ekspresję komponentów szlaku AKT/mTOR w odniesieniu do procesów proliferacji i apoptozy komórek nowotworowych jelita grubego Niekontrolowana proliferacja i hamowanie procesu apoptozy należą do najważniejszych cech komórek nowotworowych. Dlatego głównym celem strategii zapobiegania i leczenia nowotworów jest hamowanie wzrostu i proliferacji komórek nowotworowych oraz indukowanie ich śmierci. Serynowo-treoninowa kinaza AKT (kinaza białkowa B, PKB) jest kluczowym elementem sygnalizacji wewnątrzkomórkowej, a jej aktywacja uważana jest za niezbędną do przeżycia komórek i ograniczenia procesu apoptozy. AKT, jako główny efektor kinazy PI3K, fosforyluje i reguluje aktywność 12

13 licznych białek, m.in. enzymów, czynników transkrypcyjnych i innych cząsteczek regulatorowych [25]. Wykazano, że AKT hamuje apoptozę przez fosforylację i inaktywację niektórych białek proapoptotycznych, w tym kaspazy-9. CASP9, w dalszym etapie procesu, aktywuje efektorową kaspazę-3 (CASP3), co w konsekwencji prowadzi do śmierci komórek [26l. Ponadto AKT wpływa na progresję cyklu komórkowego poprzez hamowanie inhibitorów kinaz zależnych od cyklin, takich jak CDKN1A (p21) i CDKN1B (p27). Zarówno p21, jak i p27 regulują progresję cyklu komórkowego w fazie G0/G1, a nadekspresja tych białek blokuje przejście cyklu z G1 do S [27]. Dlatego też, zahamowanie aktywności AKT może mieć bezpośredni wpływ na indukcję procesu apoptozy i supresję proliferacji. AKT poprzez kinazy mtor i p70s6k, również pośrednio reguluje wzrost komórek, ich proliferację oraz syntezę białek [28]. Substancje hamujące komponenty szlaku AKT/mTOR mogą zatem znaleźć zastosowanie w leczeniu nowotworów jelita grubego, w których szlak ten jest konstytutywnie aktywowany [29]. Uzyskane wyniki badań wskazują, że IP6, zależnie od czasu działania, wpływa na obniżenie ekspresji AKT1 i hamuje aktywność tej kinazy w komórkach Caco-2. Po 12 godzinach traktowania kolonocytów kwasem fitynowym w stężeniach 2,5 mm i 5 mm zaobserwowano znacząco niższą liczbę transkryptów w porównaniu do hodowli kontrolnych i traktowanych 1mM IP6. Natomiast wydłużenie czasu działania nutraceutyku do 24 godzin spowodowało niezależnie od jego stężenia redukcję ekspresji AKT1. Kwas fitynowy wpływał również na obniżenie aktywności transkrypcyjnej genu kodującego S6K i inhibicję kinazy p70s6k1. Uzyskane wyniki wykazały, że 12-godzinne traktowanie komórek tylko 5 mm IP6 spowodowało obniżenie ekspresji tego genu. Z kolei długotrwałe działanie (24 h) IP6 we wszystkich stosowanych stężeniach wpłynęło zarówno na obniżenie poziomu mrna S6K1, jak i hamowanie aktywności kinazy p70s6k1 w komórkach Caco-2. Dane literaturowe wskazują, że ufosforylowana postać S6K1 jest biomarkerem aktywności kinazy mtor [30], ponieważ aktywacja S6K odbywa się tylko przy udziale aktywnej formy mtorc1, jednej z podjednostek kompleksu mtor [28]. Zatem należy sądzić, że na skutek działania IP6 zostaje również hamowana aktywność kinazy mtor w komórkach nowotworowych jelita grubego. W efekcie inhibicji szlaku AKT/mTOR przez kwas fitynowy następuje hamowanie proliferacji komórek Caco-2, na co wskazuje obniżona synteza DNA i nasilenie ekspresji genów CDNK1A i CDNK1B, czemu towarzyszy wzrost stężenia białka p21 w komórkach. Jednocześnie IP6 indukował apoptozę komórek nowotworowych, co stwierdzono na podstawie zwiększonej ekspresji CASP9 i CASP3 zarówno na poziomie mrna, jak i białka. Proapoptotyczny efekt działania IP6 13

14 wyraźnie manifestował się w hodowlach traktowanych związkiem w najwyższym stosowanym stężeniu (5 mm). Badania wykonane techniką cytometrii przepływowej wykazały w tych hodowlach znaczny wzrost populacji komórek w fazie sub-g1 (potencjalnie apoptotycznych) i komórek znajdujących się na wczesnym etapie apoptozie, a także wyraźne obniżenie liczby komórek w fazie S. Ponadto na stymulację apoptozy komórek przez 5 mm IP6 wskazuje wyższa aktywność efektorowej kaspazy-3 i zwiększona ekspresja jej genu w stosunku do hodowli traktowanych kwasem fitynowym o niższych stężeniach. Z kolei, IP6 w stężeniu fizjologicznym (1 mm) powodował hamowanie wzrostu komórek, na co wskazuje ich akumulacja w fazie G0/G1 cyklu komórkowego oraz najwyższa ekspresja genu CDNK1A zarówno na poziomie mrna, jak i białka. W hodowlach traktowanych 2,5 mm IP6 wykazano istotne obniżenie indeksu proliferacyjnego i wzrost indeksu apoptotycznego, co łączyło się ze wzrostem ekspresji genów kodujących p21, p27, CASP3 i CASP9, a to może wskazywać, że kwas fitynowy w tym stężeniu hamował proliferację i stymulował proces apoptozy komórek Caco-2 [Kapral i wsp., 2017b]. Na podstawie przeprowadzonych badań można wnioskować, że heksafosforan inozytolu hamuje proliferację komórek nowotworowych jelita grubego i indukuje ich apoptozę poprzez supresję szlaku sygnalizacyjnego AKT/mTOR i kinazę p70s6k, efektora mtor. Ocena wpływu IP6 na aktywność transkrypcyjną genów kodujących wybrane metaloproteinazy macierzowe i ich tkankowe inhibitory, które należą do markerów procesu przerzutowania nowotworów Metaloproteinazy macierzy pozakomórkowej (MMP) należą do rodziny zależnych od cynku endopeptydaz zdolnych do degradacji składników macierzy pozakomórkowej, które mogą odgrywać istotną rolę w progresji nowotworów, tj. wzroście guza, jego inwazyjności i tworzeniu przerzutów. Na podstawie strukturalnego i funkcjonalnego podobieństwa MMP zostały podzielone na kilka podgrup, wśród których wyróżniamy: kolagenazy (MMP-1, MMP-8, MMP-13, MMP-18), żelatynazy (MMP-2, MMP-9), stomielizyny (MMP-3, MMP-10, MMP-11), matrylizyny (MMP-7, MMP-26), metaloproteinazy błonowe (MMP-14, MMP-15, MMP-16, MMP-17, MMP-24, MMP-25). Aktywność katalityczna MMP jest hamowana przez ich specyficzne tkankowe inhibitory 14

15 (TIMP). Sprawują one podwójną kontrolę, jednocześnie hamując aktywne formy MMP i proces ich aktywacji. Zaburzenie równowagi pomiędzy metaloproteinazami i ich inhibitorami może towarzyszyć wielu stanom patologicznym, w tym procesom nowotworzenia [3]. Wśród MMP, żelatynazy (MMP-2 i MMP-9) są podgrupą najczęściej wykrywaną w różnych typach nowotworów, a poziom ich ekspresji koreluje z agresywnością guza, potencjałem jego przerzutowania i złym rokowaniem. Odgrywają one kluczową rolę w degradacji kolagenu typu IV, który jest głównym składnikiem błony podstawnej, co ułatwia komórkom nowotworowym migrację [32]. Celem jednego z etapów moich badań było sprawdzenie czy kwas fitynowy wpływa na aktywność transkrypcyjną genów kodujących MMP-2 i MMP-9 oraz ich tkankowe inhibitory TIMP-1 i TIMP-2 w komórkach linii Caco-2. Rezultaty tego eksperymentu wykazały, że IP6 moduluje ekspresję genów MMP-2, TIMP-1 i TIMP-2 na poziomie ich transkrypcji, co uzależnione było od jego stężenia i czasu działania. Po godzinie działania 1 mm IP6 indukował wzrost poziomu ekspresji MMP-2, natomiast w wyższych stężeniach (2,5 i 5 mm) spowodował obniżenie ekspresji tego genu. Po 24 godzinach prowadzenia hodowli zaobserwowano zależne od stężenia IP6 obniżenie liczby kopii mrna MMP-2. Zmiany aktywności transkrypcyjnej genów kodujących inhibitory TIMP-1 i TIMP-2 wykazano po 6 i 12 godzinach działania IP6. Traktowanie komórek przez 6 godzin 1 mm i 2,5 mm IP6, wpłynęło na istotny wzrost aktywności transkrypcyjnej TIMP-2 w komórkach Caco-2, czemu towarzyszyło obniżenie ekspresji TIMP-1. Inkubacja przez 12 godzin komórek z 2,5 mm IP6 powodowała silny wzrost ekspresji zarówno TIMP-1, jak i TIMP-2. Gen kodujący MMP-9 nie ulegał ekspresji w komórkach Caco-2, a IP6 nie wykazywał zdolności do indukowania jego ekspresji [Kapral i wsp., 2010]. Celem kolejnego eksperymentu była ocena efektów działania kwasu fitynowego o stężeniu 2,5 mm na ekspresję genów kodujących metaloproteinazy należące do trzech podgrup, tj. kolagenaz (MMP-1, MMP-13), żelatynaz (MMP-2, MMP-9) i stromielizyn (MMP-3, MMP-10), oraz ich inhibitory (TIMP-1, TIMP-2) w komórkach Caco-2 stymulowanych IL-1β. Ekspresja genów MMP w komórkach nowotworowych może być indukowana przez różne zewnątrzkomórkowe czynniki, takie jak cytokiny (IL-1, IL-6, TNF- ) czy czynniki wzrostu [33]. Opublikowane wyniki badań dowodzą, że metaloproteinazy mogą odgrywać istotną rolę w przebudowie tkanek podczas procesów zapalnych toczących się w jelitach [34]. Rezultaty moich eksperymentów potwierdziły znaczący wzrost poziomu transkrypcji genów kodujących MMP i ich inhibitory w komórkach jelita grubego stymulowanych prozapalną cytokiną. Traktowanie kwasem 15

16 fitynowym hodowli przez 6 godzin wpłynęło na obniżenie indukowanej przez IL-1β ekspresji MMP-1, MMP-9 i TIMP-2, natomiast wydłużenie czasu działania IP6 do 12 godzin spowodowało obniżenie nasilonej przez cytokinę transkrypcji MMP-2. Ponadto po dłuższym okresie działania IP6 (12-24 h), zaobserwowano obniżenie aktywności transkrypcyjnej MMP-2, MMP-3, MMP-13 w komórkach Caco-2 niestymulowanych IL-1β [Kapral i wsp., 2012]. Wyniki przeprowadzonych badań sugerują, że kwas fitynowy obniżając ekspresję metaloproteinaz i wpływając na poziom transkrypcji genów kodujących ich inhibitory może zapobiegać inwazyjności komórek nowotworowych i ich migracji. Dzięki tej właściwości IP6 może być wykorzystany nie tylko na etapie promocji, ale również na etapie progresji nowotworów. Ocena wpływu IP6 na poziom ekspresji wybranych mediatorów procesu zapalnego, tj. IL-6, IL-8, inos, cyklooksygenaz i lipooksygenaz oraz sekrecji prostaglandyny E2 i leukotrienu B4 Komórki nabłonkowe jelita, jako integralna część układu odpornościowego, aktywnie uczestniczą w miejscowej odpowiedzi immunologicznej oraz w utrzymaniu tolerancji wobec mikroflory bakteryjnej i antygenów pokarmowych [35]. Podczas zapalenia wykazują one zdolność do syntezy i sekrecji mediatorów tego procesu, tj. interleukin (IL-1, IL-6, IL-8), czynnika martwicy nowotworu (TNF-α), tlenku azotu oraz produktów metabolizmu kwasu arachidonowego (leukotrienów i prostaglandyn). Doniesienia literaturowe wskazują na ich znaczącą rolę w patogenezie IBD, a utrzymujący się długotrwale stan zapalny może prowadzić do zmian dysplastycznych komórek nabłonkowych. Prozapalne cytokiny, NO czy eikozanoidy (PGE2, LTB4) aktywnie uczestniczą w etapach promocji i progresji raka [4]. Jednym ze sposobów zapobiegania powstawania nowotworów jelita grubego może być ograniczenie stanu zapalnego w obrębie błony śluzowej narządu poprzez regulację syntezy i wydzielania molekuł biorących udział w tym procesie. Celem prowadzonych przeze mnie badań było wykazanie przeciwzapalnych właściwości heksafosforanu inozytolu, polegającej na obniżeniu ekspresji i sekrecji wybranych prozapalnych mediatorów. Do najczulszych markerów stanu zapalnego należy IL-6, cytokina konstytutywnie produkowana przez komórki nabłonkowe jelita. Bierze ona udział w prawidłowej 16

17 i indukowanej stanem zapalnym odpowiedzi immunologicznej [36]. Z kolei IL-8 jest cytokiną o działaniu chemotaktycznym, odpowiada za migrację neutrofili i limfocytów do tkanki nabłonkowej jelita i wzmaga ich adhezję do białek macierzy zewnątrzkomórkowej [37]. Przeprowadzone eksperymenty wykazały, że heksafosforan inozytolu wpływał na obniżenie aktywności transkrypcyjnej genów kodujących obie cytokiny w komórkach jelita grubego stymulowanych IL-1β. Obecność mrna IL-6 i IL-8 na niskim poziomie, ale oznaczalnym techniką RT-qPCR, stwierdzono w komórkach Caco-2 hodowanych w warunkach standardowych. Interleukina-1β silnie indukowała transkrypcję obu badanych genów w czasie trwania eksperymentu (3-12 godzin). Traktowanie komórek IP6 w stężeniach 1 i 2,5 mm istotnie wpłynęło na obniżenie ekspresji IL-6 i IL-8 stymulowanej przez IL-1β już po 3 godzinach jego działania. 2,5 mm IP6 obniżał transkrypcję IL-6 również po 6 godzinach prowadzenia hodowli [Wawszczyk i wsp., 2012]. Powstawanie i utrzymanie stanu zapalnego błony śluzowej jelita może być wynikiem podwyższonego poziomu tlenku azotu [38]. Działa on cytotoksycznie na komórki uczestnicząc w peroksydacji lipidów błon komórkowych, co zwiększa ich przepuszczalność. Tlenek azotu może również uszkadzać DNA i hamować aktywność enzymów jego naprawy. Ponadto NO bierze udział w procesach nowotworzenia, stymulując proces proliferacji, wpływając na angiogenezę i migrację komórek nowotworowych. Aktywacja ekspresji genu kodującego izoformę indukowanej syntazy tlenku azotu (inos), enzymu katalizującego jego syntezę, następuje w odpowiedzi na działanie cytokin (IFN-γ, TNF-α, IL-1 i IL-6) oraz lipopolisacharydów bakterii [39]. Dane kliniczne wskazują, że w komórkach jelita grubego występuje nadekspresja inos w chorobach zapalnych i nowotworach [40]. Dlatego hamowanie ekspresji genu, a w konsekwencji syntezy NO może skutecznie obniżać ryzyko rozwoju raka o podłożu zapalnym. W kolejnym etapie badań oceniałam efekt działania heksafosforanu inozytolu na aktywność transkrypcyjną inos w komórkach nowotworowych jelita grubego stymulowanych prozapalnymi czynnikami, tj. LPS (E. coli i S. typhi.) oraz IL-1. W komórkach Caco-2 gen kodujący izoformę inos ulegał konstytutywnej ekspresji, którą istotnie zwiększały prozapalne czynniki w trakcie trwania eksperymentów (3-12 h). Wyniki moich badań wskazują, że IP6 zależnie od czasu, ale niezależnie od stężenia, hamował aktywność transkrypcyjną genu w komórkach niestymulowanych oraz stymulowanych przez endotoksyny i cytokinę. W pierwszym przypadku (warunki standardowe hodowli) efekt ten obserwowano po dłuższym czasie działania kwasu fitynowego (12 h). W komórkach hodowanych w warunkach zapalnych redukcję liczby kopii mrna inos 17

18 wykazano po 6-12 godzinach działania nutraceutyku, przy czym wydłużenie czasu traktowania skutkowało silniejszym hamowaniem ekspresji genu [Kapral i wsp., 2015]. Ważnymi mediatorami stanu zapalnego są eikozanoidy, produkty metabolizmu kwasu arachidonowego. Cyklooksygenaza (COX), kluczowy enzym szlaku syntezy prostaglandyn, występuje w dwóch izoformach, kodowanych przez różne geny. COX-1 ulega konstytutywnej ekspresji w wielu narządach, w tym w komórkach jelita grubego, natomiast COX-2 jest indukowany przez cytokiny, czynniki wzrostu i endotoksyny bakterii. Obie izoformy COX przekształcają kwas arachidonowy do prostanoidów, wśród których prostaglandyna E2 (PGE2) jest głównym metabolitem COX-2. Jej wysokie stężenie stwierdzono w różnych typach nowotworów, również w nowotworach jelita grubego [41]. Kluczowymi enzymami drugiego szlaku metabolizmu kwasu arachidonowego są lipooksygenazy (LOX). W zależności od pozycji tlenu wbudowywanego do arachidonianu, lipooksygenazy zostały sklasyfikowane jako 5-, 8-, 12- i 15-lipooksygenazy. 15-LOX katalizuje powstawanie przeciwzapalnego kwasu 15-hydroksyeikozotetraenowego (15-HETE), podczas gdy 5-LOX i 12-LOX syntetyzują prozapalne mediatory: 5-HETE i 12-HETE. Najważniejszym mediatorem produkowanym w szlaku 5-LOX jest leukotrien B4 (LTB4), który odgrywa również istotną rolę w procesach apoptozy i proliferacji komórek nowotworowych [42]. W przeprowadzonych badaniach oceniałam wpływ heksafosforanu inozytolu na aktywność transkrypcyjną genów kodujących izoformy cyklooksygenazy (COX-1, COX-2) i lipooksygenazy (5-LOX, 12-LOX, 15-LOX) w komórkach nowotworowych jelita grubego stymulowanych oraz niestymulowanych prozapalnymi cytokinami (IL-1β/TNF- ). Ponadto celem moich badań było sprawdzenie czy IP6 wpływa na zmianę stężenia enzymów COX-2 i 5-LOX oraz ich produktów PGE2 i LTB4. Wyniki przeprowadzonych eksperymentów wykazały, że w komórkach nowotworowych jelita grubego linii Caco-2 geny izoform cyklooksygenazy i lipooksygenazy wykazywały stałą ekspresję. Mieszanina prozapalnych czynników (IL-1 /TNF- ) istotnie stymulowała transkrypcję COX-1, COX-2, 5-LOX i 12-LOX, a w przypadku genu 15-LOX, który koduje izoformę enzymu katalizującego powstawanie przeciwzapalnego mediatora, obniżała ekspresję po 12 godzinach działania cytokin na komórki. Wykorzystując metody immunoenzymatyczne wykazano w komórkach linii Caco-2 niskie stężenia białek COX-2 i 5-LOX oraz wydzielanej do medium prostaglandyny E2 po 6 i 24 godzinach prowadzenia hodowli, które znamiennie wzrastały po ekspozycji na działanie IL-1 /TNF-. Natomiast 18

19 syntezę i sekrecję leukotrienu B4 zaobserwowano dopiero po 24 godzinach hodowli komórek zarówno w warunkach standardowych, jak i zapalnych, a mieszanina prozapalnych czynników istotnie stymulowała ten proces. W komórkach Caco-2 hodowanych w warunkach standardowych IP6 w stężeniach 2,5 i 5 mm powodował obniżenie aktywności transkrypcyjnej genu COX-2 po 3 i 6 godzinach jego działania, a po wydłużeniu czasu ekspozycji do 12 godzin nie zaobserwowano istotnych zmian. W przypadku COX-1, w czasie trwania eksperymentu, kwas fitynowy nie wpływał na zmianę ekspresji genu kodującego konstytutywną izoformę tego enzymu. Obniżenie w komórkach stężenia COX-2 i wydzielanej przez nie do medium PGE2 stwierdzono po 6 godzinach działania IP6. W komórkach stymulowanych przez prozapalne cytokiny IP6 powodował obniżenie zwiększonej aktywności transkrypcyjnej genów kodujących konstytutywną (po 3 i 6 h) i indukowaną izoformę cyklooksygenazy (po 6 i 12 h). Obniżonej ekspresji genu COX-2 towarzyszyło obniżenie stężenia białka COX-2 po 24 godzinach działania IP6. Kwas fitynowy niezależnie od stężenia i czasu traktowania stymulowanych IL-1β/TNF-α komórek powodował hamowanie syntezy i wydzielania prostaglandyny E2. Wyniki badań wykazały, że po 3 godzinach działania IP6 na komórki stymulowane przez IL-1 /TNF- nie wpływał on na poziom transkrypcji genu COX-2, podczas gdy obniżał zwiększoną przez cytokiny ekspresję 5-LOX. W kolejnych punktach czasowych (6 i 12 godzin) eksperymentu zaobserwowano, że obniżonej aktywności transkrypcyjnej genu COX-2 towarzyszył wzrost ekspresji 5-LOX w komórkach hodowanych zarówno w warunkach standardowych, jak i warunkach zapalnych. Rezultaty przeprowadzonego badania wykazały, że IP6 nie wpływał na obniżenie stężenia enzymu 5-LOX w komórkach stymulowanych przez cytokiny, a co więcej, obserwowano istotny wzrost poziomu białka w porównaniu do kontroli. W komórkach niestymulowanych stwierdzono podobny efekt działania nutraceutyku, ale tylko w hodowlach traktowanych 5 mm IP6. Kwas fitynowy nie wpływał również na zmianę stymulowanej przez IL- /TNF- produkcji i sekrecji LTB4, a komórki traktowane tylko IP6 syntetyzowały i wydzielały do pożywki znamienne wyższe ilości tego mediatora w porównaniu do hodowli kontrolnych. Badania te wykazały, że IP6 wpływa na obniżenie ekspresji genów kodujących cyklooksygenazy i syntezę PGE2. Inhibicja metabolizmu kwasu arachidonowego szlakiem zależnym od COX spowodowała nasilenie jego przemian szlakiem zależnym od lipooksygenazy, co skutkowało wzrostem produkcji leukotrienu. 19

20 W przypadku izoformy 12-LOX, wykazano, że IP6 wypływał na obniżenie aktywności transkrypcyjnej genu w komórkach nowotworowych jelita grubego stymulowanych cytokinami, natomiast w niestymulowanych komórkach nie powodował on istotnych zmian. Jednym ze sposobów ograniczenia procesów zapalnych w nabłonku jelit może być indukcja syntezy czynników o właściwościach przeciwzapalnych lub immunoregulatorowych. Rezultaty badań wskazują, że IP6 powodował wzrost obniżonej przez IL-1β/TNF-α ekspresji genu przeciwzapalnej izoformy 15-LOX oraz indukował jego transkrypcję w komórkach hodowanych w warunkach standardowych [Kapral i wsp., 2017a]. Przeciwzapalne i przeciwnowotworowe działanie heksafosforanu inozytolu może wynikać z jego zdolności do modulowania ekspresji genów kodujących enzymy zaangażowane w szlak metabolizmu kwasu arachidonowego, zarówno na poziomie transkrypcji, jak i translacji oraz poprzez jego wpływ na obniżenie produkcji i sekrecji ich końcowych produktów, w głównej mierze prostaglandyny E2. Biologiczne właściwości tego nutraceutyku mogą być również spowodowane jego wpływem na obniżenie ekspresji IL-6 i IL-8 oraz ograniczeniem szkodliwego działania tlenku azotu na komórki jelit poprzez supresję aktywności transkrypcyjnej genu indukowanej syntazy tlenku azotu. Ocena wpływu IP6 na ekspresję genów kodujących markery proliferacji (cyklinę D1 i histonu H3) w komórkach stymulowanych IL-1β Nasilona proliferacja komórek towarzysząca długotrwałym stanom zapalnym jest istotnym czynnikiem kancerogenezy [43], dlatego hamowanie tego procesu ma kluczowe znaczenie w opracowaniu skutecznych metod zapobiegania powstawania i rozwoju nowotworów jelita grubego o podłożu zapalnym. Ocena poziomu markerów proliferacji może być użytecznym parametrem wykorzystanym do monitorowania odpowiedzi na stosowaną terapię chorób nowotworowych. Dane literaturowe wskazują, że poziom ekspresji cykliny D1 i histonu H3 może zależeć od liczby komórek w fazie S cyklu. Cyklina D1 (CCND1), tworząc kompleksy z kinazami zależnymi od cyklin CDK4 i CDK6, pełni funkcję regulatora progresji cyklu z fazy G1 do fazy S. Wzrost stężenia CCND1 rozpoczyna się w fazie G1 i osiąga najwyższą wartość podczas przejścia G1/S [44]. Poziom produktów ekspresji histonu H3, który jest częścią składową nukleosomu, ściśle wiąże się z progresją cyklu komórkowego. Gdy komórki przechodzą z fazy G1 do fazy S zwiększa 20

21 się szybkość jego transkrypcji, co może skutkować nawet 35-krotnym wzrostem poziomu mrna H3 [45]. Wyniki przeprowadzonych przeze mnie badań w warunkach in vitro wykazały, że IL-1β indukuje transkrypcję genów kodujących cyklinę D1 i histon H3 w komórkach jelita grubego, co wyraźnie potwierdza związek między zapaleniem a nasiloną proliferacją. Kwas fitynowy wpływał na zmianę aktywności transkrypcyjnej genów CCND1 i histonu H3 w zależności od czasu jego działania na komórki. Po 6 godzinach inkubacji Caco-2 z IP6 związek ten zwiększał stymulowany przez IL-1β poziom mrna H3. Efekty były silniejsze w przypadku hodowli traktowanych 1 mm IP6 niż 2,5 mm IP6. Dłuższy czas ekspozycji komórek na działanie kwasu fitynowego (12 h), niezależnie od jego stężenia spowodował znaczne obniżenie poziomu ekspresji genów CCND1 i histonu H3 [Kapral i wsp., 2014]. Uzyskane wyniki wskazują, że zdolność IP6 do hamowania proliferacji komórek nowotworowych jelita grubego może być zależna od obniżenia ekspresji genów kodujących cyklinę D1 i histon H3 na poziomie mrna. Hamujący wpływ IP6 na ich transkrypcję może wiązać się z zatrzymaniem komórek w fazie G0/G1 i obniżeniem liczby komórek w fazie S cyklu komórkowego oraz hamowaniem syntezy DNA [Kapral i wsp., 2017b]. Ocena wpływu IP6 na ekspresję izoform transformującego czynnika wzrostu β (TGF-β) i ich receptorów w aspekcie procesów nowotworzenia i zapalenia Transformujący czynnik wzrostu β (TGF-β) należy do cytokin o plejotropowym działaniu. Hamuje on proliferację komórek, pobudza ich różnicowanie, a także stymuluje syntezę i degradację składników macierzy pozakomórkowej oraz pobudza apoptozę i angiogenezę. Ponadto TGF-β działa immunomodulująco i wykazuje przeciwstawne efekty do prozapalnych cytokin (IL-1, TNF- ). Liczne badania wskazują na jego rolę w rozwoju różnych stanów patologicznych, takich jak nowotwory, choroby autoimmunologiczne i schorzenia związane z włóknieniem narządów [46]. Wpływ TGF-β na rozwój nowotworu jest dwojaki i w początkowej fazie kancerogenezy odgrywa rolę supresora, zaś w późniejszych stadiach cytokina ta wspomaga rozwój guza przez pobudzenie wzrostu nieprawidłowych komórek oraz stymulację angiogenezy i przerzutowania, jak również powoduje wzrost immunosupresji. W komórkach ssaków TGF- występuje w postaci trzech izoform, tj. TGF- 1, TGF- 2, TGF- 3, które kodowane są przez różne geny. Izoformy te oddziałują na komórki łącząc się ze specyficznymi receptorami T RI, T RII, 21

22 T RIII. przez co aktywują drogi transdukcji sygnału i wywołują określone efekty działania [47]. Stymulacja szlaku sygnalizacji komórkowej zależnej od TGF-, poprzez zwiększenie ekspresji izoform cytokiny lub jej receptorów może być dobrą strategią zapobiegania i leczenia nowotworów w początkowym etapie ich powstawania. Wyniki przeprowadzonych badań sugerują, że heksafosforan inozytolu wykazuje zdolność do indukcji procesu transkrypcji zarówno genów kodujących izoformy TGF-, jak i ich receptory w komórkach nowotworowych jelita grubego. IP6 w stężeniach do 1 mm, które odpowiadają jego stężeniu w komórkach, najsilniej stymulował ekspresję TGF- 1 oraz receptorów T RI i T RII po 6 godzinach jego działania. Kwas fitynowy w wyższym stężeniu (2,5 mm) powodował stopniowy wzrost liczby cząsteczek mrna izoform TGF- i ich receptorów do 12 godzin prowadzenia hodowli [Kapral i wsp., 2013a]. Heksafosforan inozytolu stymulując ekspresję TGF-β może hamować na wczesnym etapie powstawanie nowotworu, a wpływając na wzrost ekspresji receptorów TGF-β może zapobiegać jego progresji. TGF-β jest również uważany za kluczową cytokinę biorącą udział w regulacji równowagi układu immunologicznego oraz reakcji zapalnych. Obniżona aktywność transformującego czynnika wzrostu β może być jedną z przyczyn rozwoju nieswoistych chorób zapalnych jelit [48, 49]. Dlatego też celowym wydaje się zbadanie jaki wpływ wywiera heksafosforan inozytolu (2,5 mm) na ekspresję TGF-β1, -β2 i -β3 oraz ich receptorów w komórkach jelita grubego hodowanych w warunkach zapalnych, w obecności lipopolisacharydów bakterii E. coli i S. typhimurium oraz IL-1β. Opublikowane wyniki badań wskazują, że komórki nabłonkowe jelita grubego w odmienny sposób mogą odpowiadać na działanie bakterii komensalnych i enteropatogrnnych produkując i wydzielając różny poziom cytokin [50]. Stymulowanie komórek LPS E. coli powodowało obniżenie poziomu mrna TGF-β2 i TGF-β3 oraz wszystkich typów ich receptorów w komórkach Caco-2. W przypadku TGF-β1, po krótkotrwałej (3 h) inkubacji komórek z LPS następowało obniżenie aktywności transkrypcyjnej genu. Jednakże dłuższa stymulacja komórek endotoksyną wpłynęła na wzrost ekspresji tej izoformy. Kwas fitynowy w stężeniu 2,5 mm wywoływał przeciwny efekt działania do LPS E. coli powodując początkowo wzrost poziomu ekspresji tych genów, a po 12 godzinach działania obniżał stymulowaną przez LPS liczbę transkryptów izoformy 22

23 TGF-β1. Również endotoksyna S. typhi powodowała zmianę profilu ekspresji izoform TGF-β i ich receptorów w sposób zależny od czasu działania lipopolisacharydów na komórki. Traktowanie przez 3 godziny komórek LPS S. typhi. wpłynęło na wzrost aktywności transkrypcyjnej TGF-β2, -β3, TβRI i TβRIII, podczas gdy wydłużenie czasu ich stymulacji do 12 godzin powodowało obniżenie ekspresji genów kodujących TGF-β1 i wszystkie receptory. 2,5 mm IP6 nie wpływał na zmienioną przez LPS S. typhi. ekspresję TGF-β1, a w przypadku izoform TGF-β2 i -β3 zwiększał poziom ich ekspresji stymulowanej przez endotoksynę. Kwas fitynowy po 12 godzinach działania indukował transkrypcję genów TβRI, TβRII i TβRIII, która została obniżona przez LPS. Prozapalne cytokiny, takie jak IL-1, TNF-α i IFN-γ stymulują syntezę i wydzielanie izoform TGF-β przez komórki nabłonkowe jelit. Przeprowadzone eksperymenty wykazały, że ekspozycja komórek Caco-2 na działanie IL-1β skutkowała znaczącym wzrostem aktywności transkrypcyjnej genów kodujących izoformy TGF-β i ich receptory. Traktowanie komórek 2,5 mm IP6 spowodowało obniżenie ekspresji TGF-β1, TβRII i TβRIII po 12 godzinnych jego działania. Natomiast w przypadku TGF-β2 i TGF-β3 zaobserwowano nasilenie ich ekspresji po 3 godzinach inkubacji komórek równocześnie z IL-1β i IP6 [Kapral i wsp., 2013b]. Efektem zwiększonej aktywności transkrypcyjnej genów kodujących te izoformy może być hamowanie proliferacji komórek, ponieważ TGF- 2 i TGF- 3 są inhibitorami tego procesu [49]. Przewlekłe choroby zapalne jelit często skutkują dysfunkcją narządu spowodowaną jego zwłóknieniem. TGF-β, a zwłaszcza izoforma TGF-β1, jest silnym czynnikiem indukującym syntezę kolagenu i regulującym równowagę pomiędzy metaloproteinazami degradującymi składniki macierzy pozakomórkowej a ich inhibitorami. Postuluje się, że związki hamujące aktywność TGF-β mogą ograniczać proces włóknienia jelit [48]. Wyniki moich badań wykazały, że IP6 istotnie obniżał ekspresję TGF-β1, TβRII i TβRIII w komórkach nabłonkowych jelit stymulowanych czynnikami prozapalnymi IL-1β i LPS E. coli, co może nie tylko ograniczać proces zapalny, ale i włóknienia. A ponadto, IP6 obniżając ekspresję zarówno metaloproteinaz, jak i ich inhibitorów w komórkach jelita może dodatkowo wpływać na hamowanie procesu włóknienia [Kapral i wsp., 2012]. Wyniki badań sugerują, że obecny w jelitach kwas fitynowy modulując ekspresję genów kodujących izoformy TGF-β i ich receptory może wywierać działanie immunoregulatorowe na komórki nabłonkowe jelita w chorobach zapalnych tego narządu lub infekcjach wywołanych przez drobnoustroje. 23