WYZNACZANIE MAS CZĄSTECZKOWYCH BIAŁEK METODĄ SĄCZENIA ŻELOWEGO ORAZ OCZYSZCZANIE BIAŁEK METODĄ CHORMATOGRAFII JONOWYMIENNEJ

Transkrypt

1 WYZNACZANIE MAS CZĄSTECZKOWYCH BIAŁEK METODĄ SĄCZENIA ŻELOWEGO ORAZ OCZYSZCZANIE BIAŁEK METODĄ CHORMATOGRAFII JONOWYMIENNEJ WPROWADZENIE W oczyszczaniu enzymu z wieloskładnikowej mieszaniny białek można stosować jedną lub kilka stosowanych kolejno technik chromatograficznych: chromatografię jonowymienną, filtrację żelową, chromatografię powinowactwa oraz oddziaływań hydrofobowych. Efektywność każdego z tych sposobów rozdziału zależy od takich parametrów, jak: wielkość i kształt, hydrofobowość, ładunek powierzchniowy, czy powinowactwo. Dokonując wyboru techniki chromatograficznej, należy uwzględnić informacje dotyczące odporności enzymu na warunki projektowanego rozdziału (ph, siła jonowa, potencjał redox) oraz na oddziaływanie stosowanego eluentu. Podczas rozdziału chromatograficznego dla każdego ze składników tworzy się równowaga podziału pomiędzy fazą stacjonarną i ruchomą. Substancje mogą być pomyślnie rozdzielone tylko wtedy, gdy współczynniki rozdziału D składników różnią się znacznie jeden od drugiego. D definiuje się jako stosunek stężeń substancji A w fazie stacjonarnej i ruchomej. Zgodnie z tym substancje o wyższym współczynniku rozdziału D będą zatrzymywane silniej od tych z mniejszym D. Procedura rozdziału chromatograficznego jest pokazana w postaci chromatogramu, w którym sygnał detektora jest zapisany jako funkcja objętości elucji fazy ruchomej lub czasu. Oznacza to, że odpowiada to stężeniu lub profilowi masy w funkcji czasu. Sygnał detektora powinien być proporcjonalny do stężenia analitu przy końcu ścieżki migracji. Ocenę efektywności wybranej techniki chromatograficznej przeprowadza się, określając spowodowaną warunkami procesu stratę ogólnej aktywności materiału wyjściowego oraz porównując aktywności specyficzne frakcji białek przed i po jej oczyszczaniu. Do szybkiego określania zmian zawartości białek we frakcjach wymywanych z kolumny użyteczne są pomiary absorbancji próbek przy długości fali 280 nm.

2 W 1959 roku po raz pierwszy zastosowano usieciowane hydrofilne żele do rozdziału białek. W ciągu kilku następnych lat wykazano zależność szybkości Lucji z kolumny żelowej białek wzorcowych a ich masa cząsteczkową. W oparciu o te obserwacje opracowano metodę wyznaczania mas cząsteczkowych białek. Podczas filtracji żelowej usieciowany nośnik funkcjonuje jako sito molekularne. Próbę nakłada się na cylindryczną kolumnę wypełnioną nośnikiem. Nośnikami są nierozpuszczalne, lecz silnie uwodnione polimery typu dekstran, agaroza lub poliakrylamid. Równie powszechnie stosowane są preparaty handlowe, takie jak Sephadex, Sepharoze, Bio-gel, których ziarna mają określoną średnicę. Białka wystarczająco małe, aby mogły wejść do kanalików ziaren migrują wolniej, natomiast większe, niemieszczące się w kanalikach ziaren, są wymywane jako pierwsze. Dobór średnicy ziaren zależy od wielkości przepuszczanego enzymu. Aby uzyskać najlepsze wyniki rozdzielania należy wybrać taki rodzaj żelu, aby masa cząsteczkowa badanego enzymu znalazła się wewnątrz zakresu jego frakcjonowania. Wyniki sączenia molekularnego w żelach zależą nie tylko od doboru żelu i sposobu jego ułożenia, ale też od szeregu innych czynników, na przykład ilości nałożonego materiału, objętości próbki i sposobu jej wprowadzenia oraz od szybkości elucji. Pierwszym etapem oczyszczania białek jest zwykle chromatografia jonowymienna prowadzona na złożach o charakterze polianionu lub polikationu, które wiążą się z powierzchniowym ładunkiem białek przeciwnego znaku. Energia tych wiązań zależy od ładunku i struktury adsorbowanych cząsteczek i ph środowiska. Wymywanie poszczególnych składników frakcji białek związanej z wymieniaczem jonowym następuje w skutek ich wypierania przez jony pochodzące z soli rozpuszczonej w buforze elucyjnym. Gdy znana jest progowa wartość siły jonowej powodującej desorpcję enzymu, jego oczyszczanie prowadzi się zmieniając skokowo stężenie soli, jeśli natomiast nie jest znana dokładnie wartość siły jonowej potrzebnej do wymycia enzymu wówczas stosuje się elucję gradientową. Oprócz elucji gradientem soli, białka można wymywać zmieniając ph buforu, co powoduje zmianę stanu jonizacji bocznych reszt aminokwasów, a tym samym również ładunku białka. Do rozdziału białek obdarzonych ładunkiem ujemnym stosuje się wymieniacze jonowe zawierające dodatnio naładowane grupy dietyloaminowe (DEAE) np. DEAE- celuloza, DEAE- Sephadex, natomiast do rozdziału białek o ładunku dodatnim stosuje się wymieniacze

3 jonowe zawierające ładunek ujemny grup karboksylowych (CM) np. CM- celuloza, CM- Sephadex WYKONANIE A. Wyznaczenie masy cząsteczkowej 1,2-dioksygenazy katecholowej metodą sączenia żelowego Zawiesinę żelu Sephadex G-150 przygotowanego zgodnie z instrukcją producenta wlać ostrożnie (po ściankach) do zamkniętej od dołu kolumny uprzednio zaopatrzonej w adaptor z wężykiem polietylenowym lub teflonowym (o średnicy 1-1,5 mm) i napełnionej od dołu przy pomocy strzykawki 50 mm buforem fosforanowym o ph=7,4 (wysokość słupa cieczy nie powinna przekraczać 2-3 cm). Uwaga! Podczas napełniania należy nie dopuścić do pojawiania się pęcherzyków w żelu. Wolną przestrzeń pomiędzy granicą żelu a szczytem kolumny uzupełnić buforem fosforanowym. Następnie otworzyć wylot dolnego wężyka i poczekać na grawitacyjne wypłynie nadmiar buforu fosforanowego i nastąpi całkowita sedymentacja żelu w kolumnie. Należy uważać, aby nie doszło do wyschnięcia lub przerwania ciągłości żelu. Po sedymentacji zamknąć dolny wypływ kolumny. Nałożyć nakładkę z wężykiem zamocowanym w pompie perystaltycznej. Końcówkę wężyka wprowadzić do zbiorniku z buforem fosforanowym. Otworzyć wylot dolnego wężyka, włączyć pompę perystaltyczną (ustawić przepływ na 0,5-1 ml/min) i przepompować przez kolumnę bufor fosforanowy w 10-krotnej objętości kolumny. Wyłączyć pompę, zatkać wylot dolnego wężyka. Tak przygotowana kolumna jest przygotowana do sączenia molekularnego. Przygotować 40 ponumerowanych probówek typu Eppendorf i wstawić je do kolektora frakcji połączonego z kolumną. Przygotować roztwory białek wzorcowych o zakresie mas molekularnych kda według instrukcji producenta.

4 Na powierzchnię kolumny wprowadzić strzykawką roztwór Blue Dextranu (przygotowanego zgodnie z instrukcją producenta), a następnie rozpocząć jego wypłukiwanie buforem fosforanowym. Równocześnie do cylindra miarowego zbierać eluent do momentu pojawienia się zabarwienia niebieskiego na wysokości 2 cm od dolnego końca kolumny. Podczas kontynuacji wypłukiwanie przełożyć dolny wężyk z cylindra miarowego do kolektora frakcji i zbierać 1 ml frakcje eluentu do momentu odbarwienia się kolumny. W zbieranych frakcjach mierzyć absorbancję przy długości fali 280 nm. Całkowita objętość eluatu podczas wypłukiwania Blue Dextranu stanowi V 0 (objętość elucyjna Blue Dekxtranu). Po całkowitym wypłukaniu Dextranu z żelu, na szczyt żelu nanieść mieszaninę cytochromu c z β-amylazą i ponownie wypłukiwać białka buforem fosforanowym początkowo zbierając eluent do cylindra miarowego (do objętości jaką zbierano podczas wypłukiwania Blue Dextranu). Następnie przenieść wężyk do kolektora frakcji i kontynuować wypłukiwanie zbierając 1 ml frakcje eluentu, w których na bieżąco należy mierzyć absorbancję przy długości fali 280 nm, do momentu pojawienia się dwóch charakterystycznych pików. Identycznie jak dla mieszaniny cytochromu c z β-amylazą, postępować po nałożeniu na żel mieszaniny anhydrozy węglanowej z dehydrogenazą alkoholową oraz po nałożeniu na żel albuminy. Całkowita objętość eluatu podczas wypłukiwania odpowiednich białek stanowi V e (objętość elucyjna białka wzorcowego). W celu określenia masy molekularnej 1,2-dioksygenazy katecholowej szczepu KB2 nałożyć na kolumnę 1 ml frakcji F5 uzyskanej w wyniku izolacji enzymu, a następnie postępować identycznie jak podczas wypłukiwania białek wzorcowych. W otrzymanych pikach przy A 280, oznaczyć aktywność badanego enzymu oraz stężenie białka metodą Bradford a. Całkowita objętość eluatu potrzebna do uzyskania frakcji o maksymalnej aktywności właściwej 1,2-dioksygenazy katecholowej stanowi nieznane V e (objętość elucyjna białka badanego).

5 B. Oczyszczanie 1,2-dioksygenazy katecholowej metodą chromatografii jonowymiennej Kolumnę chromatograficzną z zamkniętym dolnym wężykiem napełnić do ¼ objętości buforem fosforanowym o ph=7,4, a następnie wlać zawiesinę DEAE-celulozy (uprzednio przygotowanej zgodnie z instrukcją producenta) i po 10 minutach otworzyć wypływ kolumny. Stopniowo uzupełniać objętość jonitu do 30 ml. Następnie przemyć kolumnę jedną objętością buforu. Na skondycjonowaną kolumnę nanieść 1 ml frakcji F5 uzyskanej w wyniku izolacji 1,2-dioksygenazy katecholowej, a następnie nałożyć nakładkę z wężykiem zamocowanym w pompie perystaltycznej na kolumnę. Końcówkę wężyka wprowadzić do zbiornika z buforem fosforanowym. Otworzyć wylot dolnego wężyka, włączyć pompę perystaltyczną (ustawić przepływ na 0,5 ml/min) i przemyć kolumnę jedną objętością buforu fosforanowego. Odpływ umieścić w kolektorze frakcji i zbierać 1 ml próby, w których mierzyć absorbancję przy długości fali 280 nm. W próbach o wysokiej koncentracji białka zmierzyć aktywność właściwą 1,2-dioksygenazy katecholowej oraz stężenie białka metodą Bradford a. Przygotować mieszalnik gradientu wlewając do jednej z jego komór 40 ml buforu fosforanowego, a do drugiej 40 ml 1M NaCl w buforze fosforanowym. Połączyć mieszalnik z kolumną i włączyć mieszadło równocześnie zbierając 1 ml frakcje, w których należy oznaczyć absorbancję przy długości fali 280 nm. W próbach o wysokiej koncentracji białka zmierzyć aktywność właściwą 1,2-dioksygenazy katecholowej oraz stężenie białka metodą Bradford a. Frakcję o najwyższej aktywności 1,2-dioksygenazy katecholowej (frakcja F6) zagęścić w koncentratorze białek. C. Oznaczanie aktywności 1,2-dioksygenazy katecholowej Aktywność właściwą 1,2-dioksygenazy katecholowej obliczyć korzystając z wzoru: A wł 6 ( At A0 ) 10 = ε l t biał mg białka w próbie 1 [ U mg ka ]

6 gdzie: A wł aktywność właściwa 1,2-dioksygenazy katecholowej, A 0 absorbancja światła w zerowym czasie reakcji enzymatycznej, A t absorbancja światła po czasie t reakcji enzymatycznej, ε molowy współczynnik absorbancji dla kwasu cis,cis-mukonowego ε =16800 dm 3 * mol -1 * cm -1, l grubość warstwy roztworu, cm, t czas pomiaru reakcji enzymatycznej, s mg białka w próbie białko oznaczone metodą Bradford a i przeliczone na objętość próby W celu oznaczenia aktywności 1,2-dioksygenazy katecholowej przygotować mieszaninę reakcyjną o objętości 1 ml, o składzie: 0,97ml 50 mm buforu fosforanowego o ph 7,4; 0,02ml 10 mm pirokatechiny oraz 0,016 ml odpowiedniej frakcji enzymatycznej. Pomiar prowadzić wobec próby ślepej nie zawierającej frakcji enzymatycznej, w temperaturze 30ºC przez 3 minuty od momentu zmieszania reagentów, przy długości fali λ=260 nm, przy użyciu spektrofotometru dwuwiązkowego z wykorzystaniem opcji Time plot. D. Oznaczanie stężenia białka metodą Bradford a W celu oznaczenie stężenia białka w badanym materiale biologicznym pobrać 200 µl próby, dodać 1 ml odczynnika Bradford a i starannie wymieszać. Oznaczyć ekstynkcję przy długości 595 nm. Stężenie białka określić na podstawie krzywej wzorcowe, której współczynnik kierunkowy wynosi 0,0135. Jeśli wartość otrzymanej ekstynkcji przekroczy 1 próbę należy odpowiednio rozcieńczyć. LITERATURA Bradford M.M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem. 72, (1976). Filipkowski P., Grubiak K., Sinkiewicz I., Synowiecki J., Szweda P. Technologia preparatów enzymatycznych pochodzenia mikrobiologiczne. Materiały pomocnicze i ćwiczenia laboratoryjne. Wydawnictwo Politechniki Gdańskiej, Gdańsk Gniot-Szulżycka J., Leźnicki A., Komoszyński M., Jakubowska A., Wojczuk B. Materiały pomocnicze do ćwiczeń z biochemii dla studentów biologii i chemii. Metody ilościowego

7 oznaczania, rozdziału i oczyszczania cz. I białka. Uniwersytet Mikołaja Kopernika w Toruniu, Toruń Gniot-Szulżycka J., Leźnicki A., Komoszyński M., Wojczuk B. Materiały do ćwiczeń z biochemii. Białka. Metody ilościowego oznaczania, rozdziału i oczyszczania. Uniwersytet Mikołaja Kopernika w Toruniu, Toruń Guzik U., Greń I., Hupert-Kocurek K., Wojcieszyńska D. Catechol 1,2-dioxygenase from the new aromatic compounds - degrading Pseudomonas putida strain N6. Int. Biodeter. Biodegr. 65, (2011). Nadaf N.H., Ghosh J.S. Purification and characterization of catechol 1,2-dioxygenase from Rhodococcus sp. NCIM Res. J. Environ. Earth Sciences 3, (2011). Saxena P., Thakur S. Purification and characterization of catechol 1,2-dioxygenase of Pseudomonas fluorescens for degradation of 4-chlorobenzoic acid. Ind. J. Biotechnol. 4, (2005). Witwicki J., Ardelt W. Elementy enzymologii. PWN, Warszawa Wojcieszyńska D., Hupert-Kocurek K., Greń I., Guzik U. Modulation of FAD-dependent monooxygenase activity from aromatic compounds-degrading Stenotrophomonas maltophilia strain KB2. Acta Biochim. Pol. 58, (2011)

8 OPRACOWANIE I DOKUMENTACJA WYNIKÓW Tabela I Wyznaczanie masy molekularnej 1,2-dioksygenazy katecholowej Białko Masa cząsteczkowa MW (kda) Log MW V 0 (ml) V e (ml) V e /V 0 K av Cytochrom c 12,4 Anhydraza węglanowa 29,0 Albumina 66,0 Dehydrogenaza alkoholowa 150,0 β-amylaza 200,0 Blue Dextran 2000,0 1,2-dioksygenaza katecholowa Wyznaczyć objętość całkowitą V t na podstawie wymiarów kolumny (średnica i wysokość w cm). Współczynnik K av obliczyć ze wzoru: K av = (V e - V 0 )/( V t - V 0 ) W oparciu o uzyskane wyniki sporządzić krzywą kalibracyjną zależności V e /V 0 od logarytmu masy cząsteczkowej, a następnie z równania krzywej wyznaczyć masę molekularną 1,2-dioksygenazy katecholowej.

9 Tabela II Aktywność 1,2-dioksygenazy katecholowej i stężenie białka w frakcjach białkowych uzyskanych w wyniku rozdziału na żelu jonowymiennym. Absorbancja Frakcja Czas (s) A B C D E F G H I J A A 595 białka Rozcieńczenie białka Stężenie białka mg/ml Ilość białka w próbie Aktywność właściwa U/mg białka

10 Tabela III Bilans oczyszczania 1,2-dioksygenazy katecholowej. Frakcja Objętość frakcji (ml) Stężenie białka mg/ml Białko całkowite Aktywność właściwa U/mg białka Aktywność całkowita (U) Stopień oczyszczenia Wydajność (%) F6