III. CHROMATOGRAFIA KOLUMNOWA NA ŻELU SEPHADEX G-75

Transkrypt

1 III. CHROMATOGRAFIA KOLUMNOWA NA ŻELU SEPHADEX G-75 I. WSTĘP Chromatografia na żelu (filtracja żelowa, sączenie molekularne, chromatografia wymiarów wykluczających, ang. size exclusion chromatography) jest techniką umożliwiającą analityczny bądź preparatywny rozdział substancji różniących się masą cząsteczkową. Separacja makrocząsteczek przy zastosowaniu techniki filtracji żelowej polega na wykorzystaniu porowatej struktury ziaren żelu oraz zjawiska dyfuzji, któremu podlegają zarówno molekuły solwentu, jak i separowane makromolekuły. Ziarna żelu mają kształt kulisty, a na ich powierzchni znajdują się pory o odpowiedniej głębokości/wielkości (rys. 1). Rys. 1. Kulki polistyrenowe. Małe makrocząsteczki, o rozmiarach mniejszych od rozmiarów porów, mogą dyfundowad w porowatości złoża. Makrocząsteczki o rozmiarach porównywalnych z rozmiarami porów i większe, przepływają przez kolumnę wraz z solwentem, nie wnikając w porowatości żelu. Im mniejsze są makromolekuły tym głębiej mogą penetrowad porowatości złoża (rys. 2). Próbka (mieszanina makromolekuł) przemieszcza się wzdłuż kolumny wraz z solwentem, a prędkośd przepływu makromolekuł jest mniejsza bądź równa prędkości przepływania solwentu. Te makromolekuły, które są zbyt duże aby wnikad w porowatą strukturę złoża, przemieszczają się równie prędko jak solwent. Pozostałe makromolekuły poruszają się tym wolniej, im są mniejsze. W związku z tym, pierwsze kolumnę opuszczą te makrocząsteczki, które były zbyt duże aby wnikad w porowatości ziaren, a później będą wymywane coraz mniejsze makromolekuły, w porządku podyktowanym ich rozmiarami (rys. 3).

2 Rys. 2. Schemat przedstawiający wnikanie makromolekuł w pory żelu, w zależności od ich wielkości Rys. 3. A) Schemat przedstawiający kolumnę chromatograficzną z upakowanym złożem. B) schemat rozdziału cząsteczek o rożnej masie cząsteczkowej. Ziarna żelu zbudowane są z nierozpuszczalnego lecz silnie uwodnionego polimeru. Ze względu na rodzaj polimeru wyróżnia się (*nazwy żeli wywodzą się od nazw handlowych): Sephadex*- zbudowany z usieciowanego naturalnego polisacharydu dekstranu. Liczba wystepująca w nazwie żelu po literze G (np.. G-75) odpowiada objętości pęcznienia pomnożonej przez 10. Sephacryl* zbudowany z dekstranu usieciowanego N,N -metylenobis-akrylamidem Poliakrylamid Bio-Gel* P zbudowany z akrylamidu usieciowanego N,N -metylenobis-akrylamidem Sepharose* - zbudowany z agarozy Parametry złoża do filtracji żelowej: 1. Granica wykluczania (ang. exlusion limit) dolna granica wielkości masy cząsteczkowej substancji, która nie może dyfundowad do przestrzeni wewnętrznej złoża. Wszystkie cząsteczki o masach większych niż granica wykluczania są wymywane w pierwszej kolejności jako pojedyncze pasmo.

3 2. Zakres frakcjonowania zakres mas cząsteczkowych, którego górną granicą jest granica wykluczania. Cząsteczki, których masy znajdują się w zakresie frakcjonowania, są wymywane z kolumny w kolejności malejących mas cząsteczkowych, a objętośd elucji wykazuje liniową zależnośd od logarytmu masy cząsteczkowej. Dolną granicą zakresy frakcjonowania jest największa masa cząsteczkowa wykazująca odchylenie od zależności liniowej. 3. Objętośd pęcznienia i objętośd złoża złożą do filtracji żelowej są często dostępne w postaci odwodnionej i przed użyciem muszą zostad poddane procesowi spęcznienia w rozpuszczalniku (zwykle w wodzie). Masa wody pochłanianej przez 1g suchego żelu to tzw. Objętośd pęcznienia (ang. water regain). Wartośd ta nie obejmuje wody otaczającej mikrogranulki żelu, nie może byd zatem używana do oszacowania koocowej objętości upakowanej kolumny. Dlatego też większośd producentów żeli podaje bardziej przydatną wartośd objętości złoża (ang. bed volume). Jest to koocowa objętośd zajmowana przez 1g żelu spęcznionego w odpowiednim rozpuszczalniku. 4. Kształt i wymiary mikrogranulek żelu idealne mikrogranulki powinny byd sferoidalne, dla utworzenia jednolitego złoża, o maksymalnie możliwej ilości dostępnych porów. Wielkośd mikrogranulek jest określana przez średnicę ziarna. Zastosowanie ziaren o większych wymiarach µm (ang. coarse) daje możliwośd uzyskania dużego natężenia przepływu fazy ruchomej, ale kolumny upakowane takimi żelami charakteryzują się gorszą rozdzielczością. Kolumny upakowane granulkami o bardzo małej średnicy, µm (ang. superfine), z uwagi na możliwośd uzyskania małych wartości natężenia przepływu fazy ruchomej, wykazują wysoką rozdzielczośd ale zazwyczaj są wykorzystywane wyłącznie do celów analitycznych. Najczęściej wykorzystywane są złoża o pośredniej wielkości ziaren, µm (ang. medium lub fine). 5. Objętośd martwa objętośd rozpuszczalnika wokół cząstek żelu w upakowanej kolumnie. Parametr ten jest wielkością charakterystyczną dla konkretnej kolumny. Objętośd martwą można wyznaczyd eksperymentalnie poprzez określenie objętości elucji substancji, która nie podlega zatrzymaniu przez złoże. Powszechnie używa się do tego celu barwnika Blue Dextran, o średniej masie cząsteczkowej 2000 kd. Charakteryzując kolumnę chromatograficzną oraz zachowanie się rozdzielonych substancji, stosuje się następujące pojęcia (rys. 4): objętośd swobodna (zerowa) /V 0 / - objętośd rozpuszczalnika znajdującego się pomiędzy ziarnami żelu objętośd wewnętrzna /V i / - objętośd rozpuszczalnika wypełniającego ziarna żelu objętośd matrycy żelu /V g / objętośd całkowita złoża /V t / V t = V 0 +V i +V g

4 Rys. 4. Objętości charakteryzujące kolumnę chromatograficzną. objętośd elucyjna /V e / - objętośd cieczy jaka wypłynęła z kolumny chromatograficznej od momentu rozpoczęcia procesu chromatografii do momentu osiągnięcia maksymalnego stężenia substancji eluowanej; charakterystyczna dla danej substancji (rys. 5). Rys. 5. Wykres wypływu (elucji) ilustrujący rozdział makromolekuł o różnych rozmiarach cząsteczkowych. Duże cząsteczki nie wnikają do wnętrza ziaren, przepływają przez kolumnę najszybciej i jako pierwsze pojawiają się u wylotu kolumny (np. dekstran 2000 kda). Ich objętośd elucyjna równa się objętości swobodnej V 0. Cząsteczki średniej wielkości, których rozmiar pozwala sporadycznie wniknąd do wnętrza ziaren, wypłyną z kolumny na pozycji pośredniej (np. cytochrom c - 13 kda), a ich objętośd elucyjna równa się V e1. Małe cząsteczki, które wnikają do wnętrza ziaren, zatem mają do pokonania najdłuższą i krętą drogę, wypływają z kolumny jako ostatnie (np. dwuchromian potasu - 0,3 kda), a ich objętośd elucyjna równa się V e2. Rozpatrując sączenie molekularne na żelu jako szczególny przypadek chromatografii podziałowej, stosujemy zależnośd pomiędzy objętością elucyjną substancji (V e ), a charakterystycznym dla danej substancji współczynnikiem podziału między fazę stacjonarną i ruchomą:

5 V e = V 0 + K d V i gdzie: K d - współczynnik podziału V 0 - faza ruchoma V i - faza stacjonarna W chromatografii na żelu stosuje się dwa różne współczynniki podziału, w zależności od zdefiniowania fazy stacjonarnej. Jeżeli jako fazę stacjonarną traktuje się rozpuszczalnik związany z żelem (V i )uzyskujemy zależnośd: K D = (V e V 0 )/V i Ponieważ w praktyce trudno jest ustalid V i, jako fazę stacjonarną przyjmujemy całą fazę żelową (tzn. V i +V g ) i otrzymamy zależnośd: K AV = (V e V 0 )/ (V t -V 0 ) Wartośd K AV (współczynnik dostępności) jest łatwiejsza do wyznaczenia, stąd też częściej jest stosowana w praktyce. Wartośd K AV mieści się w zakresie 0-1. W pracy laboratoryjnej sączenie molekularne wykorzystuje się do: A. celów preparatywnych: - rozdział substancji różniących się masą cząsteczkową, - oczyszczanie substancji o danej masie cząsteczkowej, - odsalanie substancji wielkocząsteczkowych B. celów analitycznych: - wyznaczanie masy cząsteczkowej - ilościowa analiza oddziaływao międzycząsteczkowych II. ZAGADNIENIA DO PRZYGOTOWANIA: 1. Technika chromatografii kolumnowej (formowanie i równoważenie kolumny, nanoszenie próby, rozwijanie chromatogramu, regulacja przepływu rozpuszczalników). 2. Sączenie molekularne: charakterystyka żeli typu Sephadex, inne rodzaje żeli filtracyjnych m.in. Sepharose, Sephacryl; mechanizm sączenia molekularnego, pojęcia charakteryzujące parametry złoża i stosowaną w doświadczeniu kolumnę chromatograficzną oraz zachowanie się rozdzielanych związków (V t, V 0, V i, V g, V e, K), zastosowanie metody sączenia molekularnego. 3. Inne rodzaje metod chromatograficznych (chromatografia jonowymienna, powinowactwa, oddziaływao hydrofobowych i fazy odwróconej). Mechanizm (podstawowe zasady rozdziału substancji) oraz wady i zalety i wykorzystywania danej metody. 4. Budowa związków rozdzielanych w dwiczeniu na żelu Sephadex G-75 (blue dextran, cytochrom c, dwuchromian potasu). 5. Znajomośd części doświadczalnej (+ przeliczanie stężeo).

6 III. APARATURA I SZKŁO LABORATORYJNE 1. Kolumna chromatograficzna firmy Sigma-Aldrich (1 cm x 20 cm) 2. Probówki szklane ze skalą - 20 szt. 3. Mikropipeta nastawna µl (2 szt./grupa) i 1000 µl (1 szt. /grupa) + pudełko z żółtymi i niebieskimi tipsami 4. Pipety pasteurowskie 5. Zlewki (250 ml) 6. Kolba Erlenmayera (500 ml) 7. Markery 8. Bagietka szklana 9. Spektrofotometry 10. Papier milimetrowy 11. Strzykawki (6 szt./ grupa) 12. Cylindry (50 ml) (6 szt./ grupa) IV. ODCZYNNIKI 1. Sephadex G-75 w 90 ml roztworu NaCl (moczony przez 24 godz. i następnie odpowietrzony) % r-r NaCl (500 ml) 3. Próbka do rozdzielenia: 1.5 ml 0.85% r-r NaCl zawierającego: 5 mg Blue dextranu, 10 mg cytochromu C, 9 mg dwuchromianu potasu, 2% sacharozy (dla całej grupy); UWAGA! do frakcjonowania próby pobiera się tylko 0.2 ml! *Masy cząsteczkowe: Blue dextran ; Cyt.c ; dwuchromian potasu - 300] V. WYKONANIE DWICZENIA A. FORMOWANIE KOLUMNY Z ŻELU SEPHADEX Kolumnę szklaną, owiniętą kilkoma kawałeczkami ligniny, ustawid pionowo w,,łapie" metalowego statywu, zamknąd jej wylot zaciskaczem i wlad do niej ok. 2 ml NaCl. Następnie ostrożnie wlad (po bagietce) do kolumny zamieszaną uprzednio zawiesinę żelu Sephadex. Uwaga! Przed zamieszaniem, zawiesina w zlewce powinna byd przygotowana tak, aby 2/3 jej objętości stanowił osiadły żel, a 1/3 r-r NaCl. Ostrożnie otworzyd zacisk kolumny. Roztwór soli powinien wypływad z szybkością 1 kropla/sek. Wysokośd uformowanego żelu powinna wynosid cm. Po uformowaniu warstwy o żądanej wysokości należy zamknąd wylot kolumny, pozostawiając nad powierzchnią żelu minimum 1 cm roztworu. Uwaga! Kolumna uformowana z żelu Sephadex musi zawsze byd przykryta warstwą roztworu, aby nie dopuścid do wyschnięcia górnej powierzchni złoża i jego zapowietrzenia.

7 B. RÓWNOWAŻENIE KOLUMNY Do cylindra miarowego przenieśd ok ml r-r NaCl. Wykorzystując strzykawkę wzbudzid przepływ i równoważyd kolumnę z uformowanym żelem Sephadex G-75. C. FRAKCJONOWANIE NA ŻELU SEPHADEX Po przemyciu żelu zaznaczyd markerem górną granicę złoża, przerwad dopływ cieczy do kolumny, po czym zamknąd wylot kolumny, pozostawiając nad powierzchnią żelu warstwę minimum 1 cm r-ru. Przy pomocy mikropipety nanieśd na żel 0,2 ml r-ru badanej próbki podwarstwiając ją ostrożnie pod r-r NaCl (nie wolno naruszyd powierzchni żelu!). Podstawid pod kranik kolumny I-szą probówkę ze skalą i ostrożnie podłączyd zbiornik z r-rem NaCl do kolumny. Otworzyd kranik i zbierad eluat. Pierwsze 2 ml wycieku zbierad do jednej probówki ze skalą (l-sza probówka), następnie zbierad frakcje o obj. 1 ml również do probówek ze skalą aż do momentu całkowitego zaniku żółtego zabarwienia eluatu (co najmniej dwie ostatnie próby powinny byd już przeźroczyste). Przerwad elucję, wypakowad żel z kolumny z powrotem do zlewki! Zmierzyd objętośd, jaką zajmował żel, napełniając kolumnę wodą i mierząc cylindrem objętośd wody, mieszczącej sie w części kolumny zaznaczonej uprzednio kreską. Wartośd tę (V t ) zanotowad. VI. WYNIKI I OBLICZENIA Zmierzyd absorpcje każdej próby przy długości fali 620 nm i 450 nm. Zanotowad wyniki wg wzoru: Nr Frakcji itd. V e (ml) 620 nm (detekcja blue dextran) Absorpcja 450 nm (detekcja cytochrom c. /dwuchromian potasu) Sporządzid na papierze milimetrowym diagram elucji wg wzoru:

8 Na podstawie wykresu wyznaczyd V 0, V e dla cytochromu oraz V e dla dwuchromianu potasu. Wyznaczyd wartośd V t na podstawie obliczeo całkowitej objętości, jaką zajmował żel w kolumnie. Obliczyd dla cytochromu c i dwuchromianu wartośd K AV w/g wzoru: K AV = (V e V 0 )/ (V t V 0 ) gdzie: V e - objętośd elucyjna badanej substancji V 0 - objętośd elucyjna Blue Dextranu V t - objętośd całkowita złoża Uzupełnid tabelkę: Substancja V e (ml) V e V 0 (ml) (V e V 0 )/ (V t V 0 ) Cytochrom c Dwuchromian potasu VII. WNIOSKI Sporządzid wnioski z dwiczenia.