Pomiar krzywych zaniku fluorescencji metod zliczania pojedynczych fotonów skorelowanych czasowo (metoda TCSPC - time correlated single photon counting) Zanik (homogeniczny) jednoeksponencjalny Zanik (heterogeniczny) wieloeksponencjalny Schemat aparatury do zliczania pojedynczych fotonów skorelowanych czasowo. Spektroskopia laserowa 17
Fluorometria impulsowa, cd Zasada dzia ania konwertera czas-amplituda i wielokana owego analizatora amplitud. Rejestrowana przez analizator amplitud krzywa zaniku jest w istocie splotem odpowiedzi aparatury na impuls wzbudzaj cy oraz prawdziwego rozk adu nat enia fluorescencji i opisana jest zale no ci Znalezienie kszta tu funkcji przeprowadzenia oblicze numerycznych. wymaga rozwik ania splotu, czyli Spektroskopia laserowa 18
Metoda fazowo-modulacyjna pomiaru krzywych zaniku fluorescencji Polega na wzbudzaniu fluorescencji wiat em zmodulowanym i pomiarze przesuni cia fazowego wiat a fluorescencji wzgl dem wiat a wzbudzaj cego oraz pomiarze wzgl dnej g boko ci modulacji wiat a fluorescencji. Im d u szy czas ycia fluorescencji, tym wi ksze przesuni cie fazowe i tym mniejsza g boko modulacji. Dla zaniku jednoeksponencjalnego zachodzi Spektroskopia laserowa 19
Metoda fazowo-modulacyjna pomiaru krzywych zaniku fluorescencji, cd Reprezentacje ró nych kszta tów krzywych zaniku w fluorometrii fazowo-modulacyjnej: górny panel - zaniki jednoeksponencjalne, dolny panel: zanik dwueksponencjalny, krzywa przerywana: zanik jenoeksponencjany najbardziej zbli ony do wyników do wiadczalnych. Im wi ksza cz sto modulacji, tym krótszy mo e by zmierzony czas ycia. Zakres górnych cz sto ci modulacji w wi kszo ci fluorometrów fazowomodulacyjnych jest ograniczony do ok. 200 MHz (elementy elektrooptyczne nie s w stanie modulowa wiat a z wy sz cz sto ci ). T trudno przezwyci a technologia oparta na wykorzystaniu cz sto ci harmonicznych zawartych w ci gu impulsów. Np. ci g impulsów powtarzaj cych si z cz sto ci 4 MHz zawiera cz sto ci 4, 8, 12, 16,... MHz. BS - zwierciad o pó przepuszczalne, S - próbka, PD - fotodioda, MCP PMT - fotopowielacz mikrokanalikowy, PS - dzielnik mocy, F - cz sto repetycji impulsów, n - numer harmonicznej, F - niska cz sto (rz du 25 Hz). Spektroskopia laserowa 20
Zastosowanie laserów do pomiarów czasów ycia w szybkich wi zkach atomowych W metodzie tej korzysta si z szybkich wi zek atomowych, molekularnych lub jonowych o energiach rz du kev lub MeV. Atomy poruszaj ce si w kierunku s wzbudzane w dobrze okre lonym, ma ym obszarze wokó. ród em wzbudzenia jest laser, lub zderzenia z innymi atomami tarczy (folii) albo w komórce zawieraj cej gaz. Rejestruje si fluorescencj jako funkcj odleg o ci od punktu wzbudzenia. Aby otrzyma zale no fluorescencji od czasu, korzysta si z zale no ci, gdzie pr dko jonów okre la si na podstawie napi cia przyspieszaj cego i masy jonu. Wad tej metody jest wp yw efektów kaskadowych zwi zany z równoczesnym nieselektywnym wzbudzeniem wielu poziomów. a - czysto wyk adniczy zanik obsadzenia poziomu i, b - wzrost obsadzenia i spowodowany przej ciami kaskadowymi. c - zanik obserwowany. Spektroskopia laserowa 21
Zastosowanie laserów do pomiarów czasów ycia w szybkich wi zkach atomowych, cd Selektywne wzbudzenie laserem dostrojonym do przej cia rozwi zuje problem kaskad. W tym przypadku w odleg o ci kilku cm od szczeliny wyj ciowej z komórki zawieraj cej gaz wi zka jonów zostaje o wietlona laserem. Je eli laser dostrojony jest do przej cia, dzi ki pompowaniu optycznemu obsadzenia obydwu poziomów zmieniaj si o wielko, zale n od nat enia wiat a laserowego, prawdopodobie stwa przej cia oraz od pocz tkowego obsadzenia obu poziomów. Po wprowadzeniu do wi zki laserowej przerywacza mo na wyznaczy ró nic sygna ów - nat enie fluorescencji ze wzbudzeniem laserowym, - nat enie fluorescencji bez wzbudzenia laserowego. Sygna stanowi t cz sygna u fluorescencji, która jest wynikiem selektywnego wzbudzenia laserowego. Sygna ten zawiera informacj o zaniku czysto wyk adniczym nawet w obecno ci kaskad. Spektroskopia laserowa 22
Dudnienia kwantowe Jest to wspó czesna metoda spektroskopowa umo liwiaj ca rozdzielenie po o onych blisko siebie poziomów energetycznych. Je eli krótkim impulsem laserowym wzbudzi równocze nie dwa lub wi cej po o onych blisko siebie poziomów cz steczkowych, zale no od czasu nat enia fluorescencji z tych spójnie przygotowanych poziomów ma charakter wyk adniczy z modulacjami. Aby osi gn spójne wzbudzenie poziomów 1 i 2 impulsem laserowym o czasie trwania, jego szeroko wynikaj ca z ograniczenia fourierowskiego (a jest sta rz du jedno ci zale n od kszta tu impulsu) musi by wi ksza od ró nicy cz sto ci. Prosty opis teoretyczny dudnie kwantowych Funkcj falow stanu wzbudzonego mo na przedstawi jako liniow superpozycj funkcji podpoziomów ( ), - amplitudy prawdopodobie stwa, e impuls wiat a wzbudzi atom do poziomu, - sta e zaniku poziomów k. Spektroskopia laserowa 23
Prosty opis teoretyczny dudnie kwantowych, cd Zale no od czasu nat enia fluorescencji wysy anej ze wzbudzonych poziomów okre la kwadrat modu u macierzowego elementu przej cia - wektor polaryzacji wysy anego fotonu fluorescencji, - operator momentu dipolowego, C - wspó czynnik proporcjonalno ci zale ny od warunków do wiadczenia. Przy upraszczaj cym za o eniu otrzymujemy gdzie Modulacje mo na zaobserwowa na podk adzie zaniku wyk adniczego, je eli obydwa elementy macierzowe przej i s ró ne od zera. Pomiary cz sto ci modulacji pozwalaj na okre lenie odst pu energetycznego obu poziomów, nawet gdy ich rozszczepienie jest mniejsze od szeroko ci dopplerowskiej. Spektroskopia laserowa 24
Dudnienia kwantowe, cd Dudnienia kwantowe we fluorescencji jonu obserwowanej w nast pstwie wzbudzenia wiat em o d ugo ci fali oraz odpowiadaj ce im widmo fourierowskie. Schemat poziomów energetycznych ukazuje struktur nadsubteln stanu z zaznaczeniem obserwowanej cz sto ci dudnie. Spektroskopia laserowa 25