Prof. dr hab. inż. Grzegorz Bujacz Politechnika Łódzka Instytut Biochemii Technicznej Łódź, 10 maja 2013 rok. Recenzja pracy habilitacyjnej dr Elżbiety Jankowskiej na temat " Badanie peptydów i białek związanych z występowaniem chorób neurodegeneracyjnych oraz poszukiwanie możliwości zapobiegania rozwojowi tych chorób wraz z oceną jej dorobku naukowego. Już na początku swojej kariery naukowej dr Elżbieta Jankowska brała udział w określeniu struktury krystalicznej ludzkiej cystatyny C (hcc), będącej dimerem powstającym poprzez przestrzenną wymianę domen. Publikacja w Nature Structural Biology opisująca to ciekawe zachowanie się białka, mającego związek z chorobą o podłożu amyloidowym, jest najwyżej cytowana w dorobku autorki. Mimo, że praca ta nie wchodzi w skład dorobku habilitacyjnego to stanowi "zarodek krystalizacyjny" jej przyszłych zainteresowań naukowych. Z kolei w trakcie stażu podoktorskiego w laboratorium dr Marii Gaczynskiej dr Jankowska odkryła, że peptydy oparte o sekwencję zasadowej domeny białka Tat wirusa HIV-1 są w stanie doprowadzić do aktywacji proteasomu. Ta obserwacja nasunęła jej pomysł aktywowania proteasomu za pośrednictwem małocząsteczkowych związków zdolnych do oddziaływania z enzymem poprzez mechanizm allosteryczny. Te dwa wydarzenia sprawiły, że dalsze badania prowadzone przez panią dr Jankowską były związane z białkami zaangażowanymi w chorobach neurodegeneracyjnych i tego dotyczy jej praca habilitacyjna. Przedstawiona do recenzji praca habilitacyjna dr Elżbiety Jankowskiej składa się z 15-stu publikacji (13 głównych i 2 uzupełniających) opublikowanych w czasopismach o zasięgu międzynarodowym, o dużym współczynniku wpływu (IF). Po dwie prace zostały opublikowane w: J. Inorg. Biochem., Inorg. Chem., Dalton Trans. a po jednej w: Eur. Biophys. J., Biopolymers, J. Struct. Biol, Acta Cryst. F. i Acta Cryst. D oraz w Proteins Structure, Function and Bioinformatics. Publikacje uzupełniające to prace umieszczone w Proceedings of the 31st European Peptide Symposium, Kopenhaga 2010 i Cur. Pharm. Design. W pięciu z tych prac doktor Elżbieta Jankowska jest pierwszą autorką, a w pięciu autorem korespondencyjnym. Prace dotyczące badań nad białkami związanymi z chorobami neurodegeneracyjnymi publikowane zostały w dość krótkim 6 letnim okresie czasu. Deklarowany przez autorkę udział własny wynosi od 30 do 90%. Ten niższy zakres jest typowy dla prac realizowanych przez kilka współpracujących grup badawczych, natomiast wyższy wydaje zawyżonym, bo oznaczałoby to, iż pozostali współautorzy mają marginalny 1
udział w pracy. Całkowity dorobek publikacyjny Habilitantki jest znaczący i składa się z 31 prac oryginalnych, opublikowanych w czasopismach z listy filadelfijskiej i 10 artykułów w innych periodykach z poza listy. Prace dr Jankowskiej są wysoko cytowane - ogólna liczba cytowań to 441, a indeks Hirsha wynosi 9. Taka liczba cytowań uzyskana w stosunkowo krótkim czasie świadczy o szerokim zainteresowaniu środowiska naukowego tą tematyką badawczą. Do prac stanowiących podstawę habilitacji pani dr Elżbiety Jankowskiej dołączono autoreferat, listę publikacji dodatkowych, liczbowe zestawienie dorobku oraz wykaz dorobku naukowego i dydaktycznego. Kluczowe dla oceny dorobku dokumenty przygotowane są w języku polskim i angielskim. Praca habilitacyjna ma charakter monotematyczny i dotyczy badań na białkami odgrywającymi znaczącą rolę w chorobach neurodegeneracyjnych. Wytworzenie szkodliwej formy białka powiązane jest często z procesami oksydacyjnymi i amyloidową agregacją białek. Poznanie molekularnych podstaw tych zjawisk stwarza potencjalne możliwości hamowania tych procesów, co może pomóc w prewencji i terapii chorób o których tak głośno jest ostatnimi czasy. Badania naukowe, jakimi zajmuje się Habilitantka, mogą przyczynić się do wyjaśnienia mechanizmu chorób neurodegeneracyjnych, z którymi walczymy od lat, a których istnienie związane jest najczęściej z powstawaniem amyloidów. Amyloid jest to nieprawidłowo sfałdowana struktura włóknista białek, w której dominują struktury helikalnie skręconego arkusza β. Struktury te tworzą włókna o nanometrowej średnicy. Powstawanie złogów amyloidowych towarzyszy wielu jednostkom chorobowym, takim jak: Alzheimera, Parkinsona, Creutzfelda-Jakoba czy genetycznie uwarunkowanej amyloidozy krwotocznej. Zagadnienie tworzenia amyloidu jest procesem relatywnie słabo poznanym. Różna geneza, odmienne przebiegi kliniczne chorób i odmienne białka będące prekursorami włókien amyloidowych bardzo utrudniają prace badawcze. Dodatkowo prowadzenie doświadczeń na organizmach żywych jest bardzo trudne, a śledzenie procesu tworzenia się złogów na poziomie molekularnym wewnątrz organizmu wręcz niemożliwe. Z tego względu podjęcie przez autorkę badań nad białkami zaangażowanymi w proces formowania włókien amyloidowych uważam za bardzo cenne. Prace włączone do habilitacji podzielić można na trzy grupy: badania nad ludzką cystatyną C, zagadnienia związane z oksydacją α-synukleiny i tachykininy oraz projekt dotyczący podwyższania aktywności proteasomu na drodze allosterycznej modulacji. Badania nad ludzką cystatyną C dr Elżbieta Jankowska kontynuowała po zakończeniu doktoratu. Wyznaczona struktura krystaliczna formy dzikiej hcc okazała się strukturą nieaktywnego dimeru powstającego poprzez przestrzenną wymianę domen. Istnieje hipoteza, że mechanizm wymiany domen i tworzenie się amyloidu biegną przez zbliżony stan pośredni częściowo rozfałdowanego białka. Mutacja L68E w hcc jest przyczyną 2
groźnej choroby genetycznej - amyloidowej angiopatii mózgowej, występującej w krajach skandynawskich i Islandii. Niszczy ona rdzeń hydrofobowy pomiędzy helisą α i antyrównoległym arkuszem β destabilizując białko. Obszarem otwartego interfejsu jest pętla L1 hcc i właśnie jej konformacja ma kluczowe znaczenie dla stabilności białka. Dr Elżbieta Jankowska zaplanowała mutanty punktowe hcc z resztą Val57 podstawioną odpowiednio kwasem asparaginowym (V57D hcc), asparaginą (V57N hcc) i proliną (V57P hcc). Dwa z białek mutanty V57N i V57P okazały się krystalizować podobnie jak białko natywne w postaci dimerów z wymienionymi domenami, natomiast w strukturze krystalicznej mutanta V57D występuje monomer. Aktywna formą hcc oddziałująca z proteazami cysteinowymi jest właśnie taki monomer. Struktura monomeryczna ludzkiej cystatyny C pokazała konformację białka aktywnego względem proteaz. Stanowi ona dowód, że minimalna ingerencja w pętlę L1, stanowiącą rejon zawiasowy, umożliwia poprawienie stabilności monomerycznej formy cystatyny C. Jednakże wprowadzenie takiej mutacji w warunkach fizjologicznych ma potencjalnie ograniczone zastosowanie gdyż pętla L1 stanowi ważny element kompleksu hcc/proteazy cysteinowe, a valina 57 ma znaczącą rolę w oddziaływaniach inhibitor - enzym. Habilitantka wykonała szereg badań fizyko-chemicznych wykorzystując warunki przyspieszające procesy agregacyjne, takie jak podwyższona temperatura oraz działanie chlorowodorku guanidyny. Eksperymenty te pozwoliły na śledzenie zmian konformacyjnych zachodzących w cząsteczce hcc dla formy dzikiej i szeregu mutantów, które mają miejsce podczas tworzenia się amyloidów. Białkami o częściowo nieuporządkowanej strukturze są α-synukleiny, które mogą odkładać się w postaci złogów amyloidowych, tzw. ciał Lewy ego w naczyniach krwionośnych mózgu u osób cierpiących na chorobę Parkinsona. Proces amyloidozy może być przyspieszony w warunkach oksydacyjnych i obecności jonów metali, które wpływają na konformację tych białek. Badań nad tymi procesami podjęła się dr Elżbieta Jankowska we współpracy z prof. Teresą Kowalik-Jankowską i przeanalizowała skutki działania układu Cu(II)/H2O2 na fragmenty α-synukleiny. W pracach opublikowanych w tym temacie opisała miejsca wiązania jonów miedzi oraz modyfikacje badanych peptydów, zachodzące pod wpływem działania rodnika hydroksylowego powstającego w warunkach stresu oksydacyjnego przy udziale jonów miedzi. Kontynuacją badań wykonanych dla fragmentów α-synukleiny były prace nad procesami oksydacyjnymi tachykinin - neurokininy A i neuropeptydu gamma. Tachykininy pełnią w organizmie funkcje neuroprzekaźników, ale zaangażowane są także w mechanizmy neurodegeneracyjne. W wyniku przeprowadzonych badań zespół badawczy, w którym dr Jankowska odgrywała wiodąca rolę uzyskał informacje na temat znaczenia reszt histydyny oraz N-terminalnej reszty kwasu asparaginowego tachykinin w wiązaniu jonów miedzi. Habilitantka określiła również, jakie modyfikacje 3
zachodzą w kompleksach peptydów tachykininowych z jonami miedzi w warunkach stresu oksydacyjnego. Proteasom jest odpowiedzialny za degradację wszystkich utlenionych, zmutowanych lub strukturalnie nieprawidłowych białek. Z tego względu może spowalniać procesy neurodegeneracyjne usuwając z komórki niepotrzebne i nieprawidłowo sfałdowane białka zaznaczone przez ubikwitynę jako "przeznaczone do kasacji". Opóźnienie proteasomalnej hydrolizy prowadzi do nadmiernego gromadzenia się nieprawidłowych białek, a w konsekwencji do ich agregacji. Jest to zjawisko obserwowane w szeregu chorób neurodegeneracyjnych, takich jak choroba Alzheimera i Parkinsona, stwardnienie boczne zanikowe, czy też choroba Huntingtona. Nie opracowano dotąd dla tych chorób efektywnego sposobu terapii. Selektywne i kontrolowane zwiększenie efektywności proteolizy może być jedną z potencjalnych metod terapii, synergicznej do innych ścieżek terapeutycznych. Proteasom ma złożoną strukturę heksameryczną, a komora katalityczna ulokowana jest w centrum tego wielobiałkowego kompleksu. Komora ta jest zablokowana i jej otwarcie wymaga zmiany konformacji kompleksu zachodzącej w obecności białek aktywujących. Odkrycie przez dr Jankowską zjawiska aktywacji proteasomu przez krótkie peptydy oparte o sekwencję zasadowej domeny białka Tat wirusa HIV-1 nasunęło jej pomysł modulowania aktywności proteasomu za pośrednictwem małocząsteczkowych związków zdolnych do oddziaływania z enzymem poprzez mechanizm allosteryczny. Kolejną grupę aktywatorów stanowiły związki wywodzące się z sekwencji peptydu PR39. Dr Elżbiera Jankowska brała udział w określeniu struktury przestrzennej kompleksu proteasommodulator wraz z grupą dr Z. Otwinowskiego. Połączenie badań biochemicznych ze strukturalnymi umożliwiło zrozumienie mechanizmu allosterycznej aktywacji. Uzyskanie przez Habilitantkę grantu NCN pozwoliło jej zintensyfikować badania nad allosteryczną regulacją aktywności proteasomu. Doktor Elżbieta Jankowska brała udział w trzech krajowych projektach badawczych finansowanych przez KBN, MNiSzW oraz NCN (w którym jest kierownikiem). Oprócz grantów ministerialnych otrzymywała również trzykrotnie granty wydziałowe. Umiejętność pozyskiwania środków na badania naukowe będzie niezmiernie przydatna w samodzielnej pracy naukowej. Jedyny niedosyt w ocenie dorobku budzi fakt, iż Habilitantka nie była dostrzeżona przez edytorów czasopism i nie wykonywała recenzji artykułów naukowych, co nie było od niej zależne. Mam nadzieję, że wkrótce edytorzy zwrócą uwagę na spore doświadczenie badawcze i publikacyjne pani dr Elżbiety Jankowskiej i zaczną jej powierzać prace do recenzji. Pani dr Jankowska brała aktywny udział w międzynarodowych i krajowych konferencjach naukowych. Wygłosiła 5 komunikatów ustnych, zaprezentowała 9 4
komunikatów posterowych i 50 razy była współautorem komunikatów konferencyjnych prezentowanych przez inne osoby, w tym doktorantów którymi się opiekowała. Habilitantka jest zaangażowana w kształcenie studentów na swoim wydziale, prowadzi wykład kursowy "Nowoczesne metody syntezy organicznej", którego treść samodzielnie opracowała oraz cały szereg ćwiczeń audytoryjnych i zajęć laboratoryjnych związanych z chemią organiczną i biochemią. Brała udział w przygotowaniu programów studiów i skryptów dla studentów. Pod jej opieką 9 studentów wykonywało prace magisterskie. Tematy tych prac świadczą o tym, że potrafi zainteresować magistrantów własną tematyką badawczą i włączyć ich do prac w projekcie grantowym. Kariera naukowa pani dr Elżbiety Jankowskiej związana jest w dużej mierze z Wydziałem Chemii Uniwersytetu Gdańskiego. Na wydziale tym ukończyła studia magisterskie a następnie została zatrudniona jako asystent. W trakcie wykonywania badań do pracy doktorskiej odbyła trzymiesięczny staż w Centrum Badań Biokrystalograficznych w Instytucie Chemii Bioorganicznej PAN w Poznaniu, gdzie poznała podstawy badań strukturalnych białek. Po doktoracie została zatrudniona na Wydziale Chemii Uniwersytetu Gdańskiego jako adiunkt w grupie badawczej prof. Zbigniewa Grzonki. W trakcie zatrudnienia w tym laboratorium odbyła podoktorancki staż naukowy (półtoraroczny) w laboratorium dr M. Gaczynskiej na Uniwersytecie w Teksasie (University of Texas Department of Molecular Medicine, Institute of Biotechnology, Health Science Center, San Antonio, USA) Stwierdzam, że dorobek naukowy, dydaktyczny i organizacyjny dr Elżbiety Jankowskiej spełnia wszelkie warunki do nadania stopnia naukowego doktora habilitowanego zgodnie z Ustawą o stopniach naukowych i tytule naukowym z 18 marca 2011 roku. W związku z czym wnioskuję do komisji habilitacyjnej o pozytywne zaopiniowanie dorobku pani dr Elżbiety Jankowskiej, a do Rady Wydziału Chemii Uniwersytetu Gdańskiego o głosowanie nad nadaniem jej stopnia naukowego doktora habilitowanego. Grzegorz Bujacz 5