METODY SEPARACYJNE CHROMATOGRAFIA CIENKOWARSTWOWA

METODY SEPARACYJNE CHROMATOGRAFIA CIENKOWARSTWOWA analityka chemiczna III rok 1 stopień

TLC1 IDENTYFIKACJA JONÓW HALOGENKOWYCH METODĄ CHROMATOGRAFII CIENKOWARSTWOWEJ Chromatografia jest metodą rozdzielania składników jednorodnych mieszanin w wyniku różnego ich podziału między fazę ruchomą i nieruchomą układu chromatograficznego. Jeżeli fazą ruchomą jest ciecz, zaś faza nieruchoma umieszczona jest na płaszczyźnie, to mówimy o chromatografii cienkowarstwowej. Identyfikacja substancji sprowadza się do porównania wartości współczynników opóźnienia R F wzorca i próbki badanej. W tym celu wykonuje się chromatogram dla roztworów wzorcowych rozdzielanych substancji o stężeniach zbliżonych do zakładanego w próbce badanej. Wartość R F plamek substancji otrzymanych z roztworu badanego powinna odpowiadać R F plamek otrzymanych z odpowiednich roztworów wzorcowych. Składniki analizowanej w ćwiczeniu próbki nie są barwne, należy więc przeprowadzić ich wizualizację. Chromatogram wywołuje się spryskując go w pierwszej kolejności roztworem AgNO 3, a następnie roztworem K 2 CrO 4. Ćwiczenie ma na celu zapoznanie studenta z metodą chromatografii cienkowarstwowej (z ang. Thin Layer Chromatography - TLC) oraz rozdzielenie mieszaniny halogenków i ich identyfikację. Odczynniki roztwór amoniaku (1+3), aceton do HPLC, n-butanol do HPLC, roztwory wrozcowe KCl, KBr i KI o stężeniu 0.1 mol/l, roztwory AgNO 3 i K 2 CrO 4 o stężeniu 0.1 mol/l, badana mieszanina halogenków. Aparatura i sprzęt laboratoryjny zlewka pojemności 25 ml pipeta o pojemniści 1 ml pipeta o pojemniści 2 ml pipeta o pojemności 5 ml płytka aluminiowa pokryta celulozą komora chromatograficzna spryskiwacz TLC automatyczny aplikator Linomat 5 2 szt.

Wykonanie ćwiczenia 1. Przygotowanie płytki chromatograficznej: UWAGA: PODCZAS PRACY Z PŁYTKĄ CHROMATOGRAFICZNĄ NALEŻY UWAŻAĆ ABY NIE USZKODZIĆ POWIERZCHNI SORBENTU. - z aluminiowego arkusza wyciąć płytkę o wymiarach 5x5 cm; - umieścić płytkę w suchej komorze w celu sprawdzenia jej dopasowania, a w razie konieczności przyciąć ją; - w odległości 4.5 cm od jednego z brzegów płytki narysować linię końca do której będzie rozwijany chromatogram. 2. Przygotowanie fazy ruchomei i komory chromatograficznej: - przygotowanie fazy ruchomej: do zlewki o pojemności 25 ml odmierzyć amoniak, aceton i n-butanol w stosunku objętościowym 0.8 : 2.6 : 1.2. Roztwór dobrze wymieszać; - ostrożnie napełnić fazą ruchomą komorę chromatograficzną; - przykryć komorę pokrywką i pozostawić ją w celu nasycenia parami eluentu (jest to czas na aplikację roztworów). 3. Aplikacja roztworów na płytkę za pomocą aplikatora - aplikację roztworów wzorcowych KCl, KBr i KI o objętości 0.5 μl oraz próbki badanej o objętości 0.2 μl przeprowadzić zgodnie z instrukcją obsługi aplikatora Linomat 5. 4. Rozwijanie chrmatogramu: - płytkę z naniesinymi roztworami umieścić w komorze chromatograficznej w celu rozwinięcia chromatogramu, - obserwować czoło rozpuszczalnika; kiedy pokona ono drogę do lini końca wyjąć ją z komory i lekko wysuszyć w strumieniu ciepłego powietrza. 5. Wizualizacja chromatogramu: - do jednej butelki spryskiwacza wlać roztwór AgNO 3, a do drugiej K 2 CrO 4. Dokręcić butelki do korpusu spryskiwaczy; - spryskać płytkę roztworem AgNO 3, lekko podsuszyć, a następnie roztworem K 2 CrO 4 ; - płytkę dobrze osuszyć i zaznaczyć ołówkiem uwidocznione plamki. Opracowanie wyników 1. Wyznaczyć wartość współczynników R f R f = A/B gdzie: R f określa stosunek drogi migracji substancji chromatografowanych (od punktu startu do środka plamki A) do drogi przebytej przez fazę ruchomą (od lini startu do czoła fazy ruchomej B), gdzie B w tym przypadku wynosi 8 cm. 2. Zinterpretować otrzymane wyniki.

ILOŚCIOWE OZNACZANIE ESPERALU W TABLETKACH ANTICOL TECHNIKĄ CHROMATOGRAFII CIENKOWARSTWOWEJ Z WYKORZYSTANIEM TECHNIKI ANALIZY OBRAZU Esperal (disulfiram, disiarczek bis[dietylokarbamoilu]) jest substancją czynną leków stosowanych w leczeniu alkoholizmu. Zaburza on metabolizm alkoholu etylowego. Blokuje działanie dehydrogenazy aldehydowej (enzymu) przez co spowalnia utlenieniu aldehydu octowego do mniej szkodliwej substancji jakim jest kwas octowy. Spożycia alkoholu (we wszelkiej postaci, nawet produkty spożywcze zawierające niewielkie ilości alkoholu) podczas kuracji esperalem towarzyszą bardzo nieprzyjemne reakcje: pulsujący ból głowy, gwałtowne bicie serca, wymioty, mdłości, silne zaczerwienienie twarzy, uczucie braku tchu. Ćwiczenie ma na celu ilościowe oznaczanie esperalu w tabletach ANTICOL metodą dodatku wzorca. Analiza ilościowa opiera się na przekształceniu chromatogramu plamkowego w pikowy z wykorzystaniem techniki analizy obrazu (image analysis) przy użyciu odpowiedniego oprogramowania komputerowego. Otrzymany chromatogram pikowy jest następnie analizowany w programie mierzy się pola powierzchni pików otrzymanych dla plamek odpowiadających roztworowi nieznanemu oraz roztworom sporządzonym przez wielokrotny dodatek znanej ilości wzorca do próbki badanej, które nanoszone były na płytkę chromatograficzną. Wykonuje się wykres jak na rysunku poniżej. A A - pole powierzchni piku dla próbki zawierającej jedynie Anticol A A+w - pole powierzchni piku dla próbki zawierającej Anticol z kolejnymi dodatkami wzorca, m A masa esperalu w Anticolu w roztworze nakładanym na płytkę. m w masa dodanego wzorca. Punkt przecięcia linii z osią x odpowiada zawartości oznaczanej substancji. Odczynniki Roztwór siarczanu (VI) miedzi (II) o stężeniu c(cuso 4 )=0.5 mol/l Disiarczek tetraetylotiuramu (esperal, disulfiram) Metanol, cz.d.a. Preparat farmaceutyczny ANTICOL 500 mg - Warszawskie Zakłady Farmaceutyczne, Warszawa Aparatura i sprzęt laboratoryjny Kolby miarowe pojemności 5 ml Kolby miarowe pojemności 1 ml Kolbki Eppendorfa o pojemności 1.5 ml Zlewka o pojemności 25 ml Lejki 2 szt. 4 szt. 4 szt. 2 szt.

Pipeta pojemności 5 ml pipeta o pojemności 1 ml Pipeta automatyczna nastawna pojemności 200 l Pipeta automatyczna nastawna pojemności 0.1-1 l Naczynka wagowe 2 szt. Moździerz Łopatka Płytka pokryta żelem krzemionkowym Silica gel S60 RP-18 (wymiary 5 cm x 5 cm) Komora chromatograficzna DESAGA, CHROMDES Spryskiwacz TLC WYKONANIE ĆWICZENIA 1. Przygotowanie roztworów. - ROZTWÓR LEKU ANTICOL (L) - w moździerzu rozetrzeć jedną tabletkę preparatu farmaceutycznego. Odważyć 50 mg i przenieść ilościowo do kolbki o pojemności 5 ml. Dodać około 2 ml metanolu i wytrząsać przez 5 minut na płuczce ultradźwiękowej. Kolbkę uzupełnić metanolem do kreski. - ROZTWÓR WZORCOWY ESPERALU (W) - odważyć 50 mg wzorca esperalu, przenieść ilościowo do kolbki o pojemności 5 ml, rozpuścić w około 2 ml metanolu i uzupełnić kolbkę metanolem do kreski. - do 4 kolbek o pojemności 1 ml przenieść po 100 l roztworu leku (L), a następnie odpowiednio 0 l, 50 l, 100 l i 150 l roztworu wzorca esperalu (W). Kolbki uzupełnić metanolem do kreski. 2. Przygotowanie płytki chromatograficznej. - z arkusza wyciąć płytkę chromatograficzną o wymiarach (5 x 5) cm; - umieścić płytkę w suchej komorze DESAGA w celu sprawdzenia jej dopasowania, a w razie konieczności przyciąć ją. 3. Przygotowanie fazy ruchomej i komory chromatograficznej - do probówki z tworzywa przenieść 3.6 ml metanolu oraz 0.4 ml wody. Całość wymieszać. - ostrożnie napełnić fazą ruchomą komorę chromatograficzną i przykryć szklaną płytką. 4. Aplikacja roztworów na płytkę za pomocą aplikatora - na płytkę nanosić w odstępach 1 cm po 0.5 μl każdego z przygotowanych roztworów. 5. Rozwijanie chrmatogramu - płytkę z naniesinymi roztworami umieścić w komorze chromatograficznej w celu rozwinięcia chromatogramu, - obserwować czoło rozpuszczalnika; kiedy pokona ono drogę do końca płytki wyjąć ją z komory i lekko wysuszyć w strumieniu ciepłego powietrza. 6. Wizualizacja chromatogramu - wysuszona płytkę ustawić w komorze spryskującej i spryskać ją za pomocą spryskiwacza roztworem siarczanu (VI) miedzi (II). Suszyć płytkę w suszarce w temperaturze 50 0 C przez 2 min.

7. Skanowanie płytki - analiza ilościowa z wykorzystaniem techniki analizy obrazu polega na zamianie chromatogramu plamkowego na chromatogram pikowy. Aby przeprowadzić ten etap analizy, konieczne jest uzyskanie obrazu cyfrowego płytki czyli jej zeskanowanie. 7. Otrzymywanie chromatogramu pikowego za pomocą programu TLSee - zeskanowany obraz płytki wczytujemy do programu TLSee i przeprowadzamy jego analizę. - sporządzamy tabelę, w której umieszczamy dane dotyczące wartości współczynnika R f oraz pola powierzchni każdego z otrzymanych pików. OPRACOWANIE WYNIKÓW ANALIZA JAKOŚCIOWA 1. Wyznaczyć współczynnik opóźnienia R f każdej z plamek. gdzie: a R f b R f określa stosunek drogi migracji substancji chromatografowanych (od punktu startu do środka plamki a) do drogi przebytej przez fazę ruchomą (od linii startu do czoła fazy ruchomej b). 2. Zinterpretować otrzymane wartości. Czy w tabletce znajduje się esperal? ANALIZA ILOŚCIOWA 1. Sporządzić wykres będący zależnością pola powierzchni piku A od masy dodatku wzorca m w (A p+w = f(m w )). UWAGA: próbce bez dodatku wzorca odpowiada wartość masy dodatku m w = 0. 2. Przez otrzymane punkty poprowadzić krzywą regresji liniowej (A p+w = a m w + b) i wyznaczyć jej równanie. Na podstawie równania prostej obliczyć masę esperalu w Anticolu w przygotowanym roztworze nakładanym na płytkę. UWAGA: masę esperalu w Anticolu w przygotowanym roztworze nakładanym na płytkę obliczmy przyjmując wartość pola powierzchni A p+w = 0. 3. Obliczyć zawartość esperalu w 1 tabletce Anticolu, wiedząc że 1 tabletka ma masę 668 mg. 4. Zinterpretować otrzymane wyniki.

INSTRUKCJA OBSŁUGI AUTOMATYCZNEGO APLIKATORA TLC LINOMAT 5 1. Załadowanie płytki TLC (Rys. 1) - przesunąć, znajdującą się z prawej strony dźwignię stolika ( 1 ) do góry i w tylne położenie dla obniżenia płyty stolika; - mieścić płytkę TLC ( 2 ) w lewym górnym rogu stolika w taki sposób aby stykała się z tylną krawędzią i dwoma kołkami pozycjonującymi ( 3 ); - zabezpieczyć położenie płytki za pomocą listwy ( 4 ); - przemieścić uważnie dźwignię stolika ( 1 ) w poprzednie położenie. Kierowanie dźwignią powinno odbywać się w taki sposób aby uniknąć zbyt szybkiego unoszenia się ruchomej płaszczyzny stolika. Rys. 1 2. Odkręcić butlę z azotem. 3. Włączyć aplikator przyciskiem O/I umieszczonym na lewym boku obudowy (świeci się dioda POWER ON). Aplikator będzie teraz spełniać następujące funkcje kontrolne: - inicjowanie napędu płyty. - inicjowanie napędu strzykawki. Jeśli uruchomienie się powiodło na ekranie pojawi się napis: ** Linomat 5 ** Instrument ready 3. Wprowadzanie parametrów metody. - w celu wybrania metody nacisnąć przycisk RUN: zostanie wyświetlona metoda, która w ostatnim okresie czasu była najczęściej używana. Przy pomocy klawiszy i można wybrać inną przechowywaną metodę. - w celu zmiany parametrów dla wybranej metody nacisnąć przycisk DIALOG: przy pomocy klawiszy i wybrać grupę parametrów, które chcemy zmienić. Aby zmienić parametry z danej grupy nacisnąć ENTER. - dostępne są następujące grupy parametrów: wybór kolejnego parametru, który ma być zmieniony następuje przez przyciśnięcie przycisku ENTER, a wybrany parametr zmienia się przy pomocy klawiszy i. Zatwierdzenie i jednocześnie przejście do kolejnego parametru następuje przez przyciśnięcie przycisku ENTER.

GLOBALS PARAMETERS parametr syringe volume objętośd strzykawki dosage speed prędkośd dozowania predosage volume objętośd wstępnego dozowania plate size wielkośd płytki number of tracks ilośd ścieżek number of samples ilośd próbek band length szerokośd plamki first position X pozycja X track distance odległośd między plamkami app. position Y pozycja Y track No. numer ścieżki wartość 100 µl 25 µl/s 0.2 µl 10x10cm 4 4 0 mm 10 mm 10 mm 10 mm kolejno: 1, 2, 3, 4 TRACK ASSIGNMENT dozowana objętośd 0.2 µl (TLC 1) 0.5 µl (TLC 2) ID próbki kolejno: 1, 2, 3, 4 SAVE METHOD save as? method No.... zapisz jako? metoda nr... metoda 4/5 UWAGA! Po zapisaniu metody naciśnięcie kolejne przycisku ENTER powoduje rozpoczęcie procedury aplikacji

Aplikacja badanych roztworów na płytkę 2. Napełnienie strzykawki dozującej 1 trzykrotnie przemyć strzykawkę wodą dejonizowaną 2 trzykrotnie strzykawkę roztworem, który ma być nanoszony na płytkę 3 napełnić strzykawkę roztworem, który ma być nanoszony na płytkę w objętości przynajmniej takiej jak jest wyświetlana na wyświetlaczu; Kroki 2-3 powtórzyć dla wszystkich roztworów, które mają być aplikowane. Po zakończeniu aplikacji wszystkich roztworów przemyć strzykawkę trzykrotnie wodą dejonizowaną, a następnie siedmiokrotnie metanolem. 3. Umieszczanie napełnionej strzykawki dozującej w aplikatorze (Rys. 2) - upewnić się czy płyta jest w odpowiednim położeniu i poziome ramię wieżyczki znajduje się w górnym położeniu; - przy pomocy lewej ręki przesunąć ramię dźwigni ( 1 ) w lewo i pozostawić w tym położeniu; - ostrożnie przełożyć strzykawkę przez uchwyt strzykawki ( 2 ) i ostrożnie obniżać aż do oparcia strzykawki w głowicy rozpylającej ( 3 ). Rys. 2. 4. Rozpoczęcie aplikacji próbki - nacisnąć przycisk ENTER co spowoduje inicjację napędu strzykawki i ustawienie stolika. - nacisnąć ponownie przycisk ENTER: Napęd strzykawki będzie teraz wykonywać automatyczne wypuszczanie ustalonej objętości wstępnego dozowania, a następnie nastąpi aplikacja pierwszej próbki. - po aplikacji pierwszej próbki napęd strzykawki i stolik powrócą automatycznie do pozycji wstępnego dozowania. - napełnić strzykawkę kolejnym dozowanym roztworem i postępując analogicznie jak w przypadku pierwszej próbki zaaplikować go na płytkę. - całą procedurę powtórzyć dla wszystkich roztworów. 5. Zakończenie aplikacji - wyłączyć aplikator przyciskiem O/I i zakręcić butlę z gazem; - przemyć strzykawkę trzykrotnie wodą dejonizowaną, a następnie siedmiokrotnie metanolem.

OTRZYMYWANIE CHROMATOGRAMU PIKOWEGO ZA POMOCĄ PROGRAMU TLSee 1. uruchamiamy program TLSee korzystając ikony -> znajdującej się na Pulpicie komputera 2. z menu File wybieramy opcję New Experiment -> Without calibration (Rys. 1) co powoduje otwarcie zakładki wyboru zeskanowanego obrazu płytki (Rys. 3). Rys. 1. 3. w wierszu Image klikamy lewym przyciskiem myszy ikonkę i wybieramy ścieżkę dostępu zeskanowanej płytki (np. D:\(data)\plytka(nr).jpg). (Rys. 2.). Rys. 2. 4. lewym przyciskiem myszy aktywujemy zakładkę Plate (u dołu aktywnego okna) i suwaczkami (na Rys. 3. zaznaczone strzałkami) określamy linię startu i końca przeciągając je lewym przyciskiem myszy do odpowiedniej wysokości. Rys. 3. 5. poprzez kliknięcie lewym przyciskiem myszy ikony -> (w pasku na górze) zaznaczonej na Rys. 4 aktywujemy funkcję Fixed Band. Najeżdżamy myszką na obraz płytki i zaznaczamy tzw. pasmo, czyli

drogę migracji plamki oraz fazy ruchomej od linii startu aż do linii końca, tak by cała plamka mieściła się między ogranicznikami (Rys. 4.). Postępujemy tak dla wszystkich otrzymanych plamek. Rys. 4. 6. klikamy lewym przyciskiem myszy ikonę View Profiles (Rys. 5). Pojawia się chromatogram pikowy (Rys. 5). Zakładka Lane 1 odpowiadający ścieżce 1, Lane 2 ścieżce 2 itd. By poruszać się między ścieżkami wystarczy lewym przyciskiem myszy kliknąć interesującą nas zakładkę. Rys. 5. 7. W celu wyznaczenia pola powierzchni poszczególnych pików należy je zintegrować. Poprzez kliknięcie lewym przyciskiem myszy ikony aktywujemy funkcję Band Integration (Rys. 5.). 8. trzymając wciśnięty lewy przycisk myszy przeciągamy strzałkę wzdłuż podstawy piku zaznaczając pole jego integracji (Rys. 6). Robimy tak dla wszystkich czterech pików (Lane 1, Lane 2, Lane 3, Lane 4), które otrzymaliśmy. Komputer automatycznie liczy wartość R f (Peak R f ) oraz pole powierzchni (Area) poszczególnych pików. 9. sporządzamy tabelę, w której umieszczamy dane dotyczące wartości R f oraz pola powierzchni każdego z otrzymanych pików. 10. zamykamy program bez zapisywania otrzymanych wyników.