Różnorodność biologiczna od komórki do ekosystemu. Zagrożenia środowiska a ochrona gatunkowa roślin i grzybów

Różnorodność biologiczna od komórki do ekosystemu. Zagrożenia środowiska a ochrona gatunkowa roślin i grzybów

Polskie Towarzystwo Botaniczne Oddział w Białymstoku Różnorodność biologiczna od komórki do ekosystemu. Zagrożenia środowiska a ochrona gatunkowa roślin i grzybów pod redakcją Grażyny Łaskiej Polskie Towarzystwo Botaniczne Białystok 2014

Redakcja naukowa dr hab. Grażyna Łaska, prof. PB Recenzenci prof. dr hab. Wiesław Fałtynowicz; prof. dr hab. Czesław Hołdyński; prof. dr hab. Elżbieta Romanowska; prof. dr hab. Stanisław Rosochacki; dr hab. Agnieszka Gniazdowska, prof. SGGW; dr hab. Anna Mikuła, prof. PAN; dr hab. Andrzej Bajguz, prof. UwB; dr hab. Iwona Ciereszko, prof. UwB; dr hab. Bożena Kiziewicz; dr hab. Grażyna Łaska, prof. PB Copyright 2014 by: Polskie Towarzystwo Botaniczne Oddział w Białymstoku. Wszystkie prawa zastrzeżone ISBN 978-83-62069-93-4 Korekta językowa: Urszula Glińska Projekt okładki: Agencja Wydawnicza EkoPress / fot.: Grażyna Łaska Redaktor techniczny: Andrzej Poskrobko Realizacja: Agencja Wydawnicza EkoPress 601 311 838

Spis treści Wstęp... 7 1. Aneta Adamczuk, Irena Siegień, Iwona Ciereszko Wpływ cytokinin i rodzaju eksplantatu na efektywność organogenezy pędowej lnu w różnych warunkach świetlnych kultury in vitro... 11 2. Andrzej Bajguz, Alicja Piotrowska-Niczyporuk, Iwona Bąkała, Marta Talarek Wpływ kwasu jasmonowego na siewki ogórka traktowanego kadmem... 23 3. Katarzyna Ciąćka, Paulina Andryka-Dudek, Urszula Krasuska, Renata Bogatek, Agnieszka Gniazdowska Modyfikacje strukturalne białek związane z oddziaływaniem tlenku azotu w sygnalizacji komórkowej podczas rozwoju ontogenetycznego i odpowiedzi roślin na warunki stresowe... 35 4. Magdalena Fiłoc, Mirosława Kupryjanowicz Zmiany roślinności Wigierskiego Parku Narodowego w środkowym holocenie jako efekt globalnych oscylacji klimatycznych... 47 5. Sylwia Kiercul Materiały do bioty porostów Podlasia. II. Wieś Tryczówka, Gmina Juchnowiec Kościelny (Polska północno-wschodnia)... 61 6. Bożena Kiziewicz, Elżbieta Muszyńska, Anna Godlewska, Paulina Pawłowska, Ewa Zdrojkowska, Natalia Rogoz Występowanie grzybów i organizmów grzybopodobnych w wybranych akwenach północno-wschodniej Polski... 71 7. Aleksander Kołos, Beata Matowicka, Aniela Szycko Zmiany struktury populacji kosaćca syberyjskiego Iris sibirica L. na stanowiskach naturalnych i synantropijnych... 83 8. Dariusz Kulus Wykorzystanie krioprezerwacji w ochronie cennych zasobów genetycznych chryzantem... 97 5

9. Grażyna Łaska, Joanna Chylińska Nowe stanowisko Liparis loeselii (L.) Rich. w Wigierskim Parku Narodowym i zagrożenie egzystencji populacji pod wpływem działań antropogenicznych... 109 10. Grażyna Łaska, Magdalena Kuklewicz Badania eksperymentalne wpływu higienizowanych osadów ściekowych na endo- i ektomikoryzę świerka pospolitego Picea abies (L.) H. Karst... 121 11. Grażyna Łaska, Bożena Nazaruk Wpływ nawożenia na plonowanie miskanta olbrzymiego Miscanthus giganteus wstępna ocena badań eksperymentalnych... 133 12. Grażyna Łaska, Aneta Sienkiewicz Stan zachowania i zagrożenie populacji sasanki otwartej Pulsatilla patens (L.) Mill. w Nadleśnictwie Spychowo w Puszczy Piskiej... 145 13. Edyta Łukaszuk, Iwona Ciereszko Stres oksydacyjny jako stres wtórny towarzyszący uszkodzeniom mechanicznym na przykładzie rzodkiewnika Arabidopsis thaliana L.... 155 14. Marzena Matejczyk Gen gfp w przyżyciowym monitorowaniu cytotoksycznego i genotoksycznego efektu pozostałości farmaceutycznych doksorubicyny w ekosystemach wodnych... 167 15. Marzena Matejczyk, Sylwia Biedrzycka Zastosowanie szczepu Escherichia coli K-12 z genem gfp do screeningu oddziaływania pozostałości farmaceutycznych antybiotyków β-laktamowych w wodach powierzchniowych... 179 16. Anna Matwiejuk Wpływ warunków siedliskowych na występowanie porostów chronionych i zagrożonych w krajobrazie rolniczym na Podlasiu (Polska północno-wschodnia)... 189 17. Bartłomiej Och, Grażyna Łaska Badania profilu lipidowego mikroglonów z rodzaju Chlorella (Trebouxiophyceae) w aspekcie produkcji biodiesla jako odnawialnego paliwa trzeciej generacji... 203 18. Joanna Olechowicz, Olga Andrzejczak, Urszula Krasuska, Paweł Staszek, Anna Antosik, Renata Bogatek, Agnieszka Gniazdowska Allelopatyczne oddziaływanie m-tyrozyny. Badania w ekosystemach i laboratorium... 215 19. Ewa Oleńska Bobowate różnowiekowych hałd cynkowo-ołowiowych w Polsce... 227 6

20. Stanisław Józef Rosochacki Biologiczna różnorodność komórek po wprowadzeniu nowej informacji genetycznej... 239 21. Aneta Sienkiewicz Wpływ czynników abiotycznych na strukturę populacji sasanki otwartej Pulsatilla patens (L.) Mill. w Nadleśnictwie Spychowo w Puszczy Piskiej... 253 22. Michał Sulkiewicz, Iwona Ciereszko Odpowiedź Triticum aestivum L. na zranienie mechaniczne... 263 23. Marta Szal, Mirosława Kupryjanowicz, Mariusz Wyczółkowski Antropogeniczne przekształcenia roślinności w bezpośrednim sąsiedztwie kompleksu osadniczego w Poganowie na Pojezierzu Mrągowskim... 275 24. Cezary Toma, Andrew N. Efremov Bioróżnorodność typów owoców wodnych roślin okrytozalążkowych we florze europejskiej i syberyjskiej... 287 25. Zofia Tyszkiewicz Grzyby micromycetes rozwijające się na ściole spod sosny zwyczajnej Pinus sylvestris L. i świerka pospolitego Picea abies (L.) H. Karst... 297 26. Wioleta Wasilewska, Ilona Bacławska, Elżbieta Romanowska Rola fosforylacji białek chloroplastowych w kontroli odpowiedzi roślin na zmiany środowiskowe... 309 7

Wstęp Przyszłość oceni nas nie tylko za to co zrobiliśmy, ale także za to, czego nie pozwoliliśmy zniszczyć John C. Sawhill Prezentowana Państwu monografia jest trzecią pozycją wydawniczą z cyklu poświęconego badaniom bioróżnorodności, prowadzonym na rozmaitych poziomach organizacji życia biologicznego od komórki do ekosystemu. Hasłem przewodnim tegorocznej edycji jest różnorodność biologiczna w aspekcie zagrożeń środowiska i ochrony gatunkowej roślin naczyniowych, grzybów i porostów. Różnorodność biologiczna, w ujęciu zmienności genowej i komórkowej, zmienności wewnątrzgatunkowej i międzygatunkowej badanych populacji oraz ponadgatunkowej zbiorowisk, ekosystemów i krajobrazów roślinnych, pozwoliła autorom na szeroki zakres prezentowanych zagadnień empirycznych oraz dokonanie wielokryterialnej oceny obecnego stanu zachowania badanego poziomu, zidentyfikowania jego zagrożeń oraz zaproponowania kierunków ochrony. Ochrona bioróżnorodności w świetle Konwencji o Różnorodności Biologicznej to wszechstronna analiza zachodzących przemian w aspekcie wielu badań interdyscyplinarnych: genetycznych, fizjologicznych, biochemicznych, biotechnologicznych, florystycznych, demograficznych i fitosocjologicznych. Jest to także poszukiwanie mechanizmów i wskazanie kierunków dalszych działań mających na celu powstrzymanie strat w bioróżnorodności w naszym kraju. Problematyka monografii przedstawia złożoność funkcjonowania przyrody w różnorodnych układach ekologicznych, w świetle oddziaływania różnych czynników zagrożeń: naturalnych, abiotycznych i antropogenicznych, monitoringu zachodzących przemian oraz realizacji działań na rzecz ochrony. Poszczególne rozdziały monografii prezentują problemy z zakresu biotechnologii i biochemii, ekofizjologii i biologii rozwoju roślin, ekologii populacji, fitosocjologii, florystyki i taksonomii. Jest to doskonały przykład interdyscyplinarnego podejścia do zagadnień ochrony przyrody i ochrony środowiska, gdzie wszyscy poczuwamy się do odpo- 9

wiedzialności za zachodzące zmiany. Prezentowane badania, w większości przez członków Polskiego Towarzystwa Botanicznego, są realnym wyrazem integracji wielu działań podjętych w celu zachowania równowagi przyrodniczej i trwałości funkcjonowania podstawowych procesów przyrodniczych na wszystkich poziomach organizacji życia. To kolejny krok naprzód w celu ochrony dziedzictwa naturalnego i zachowania bioróżnorodności dla przyszłych pokoleń. Życząc Państwu miłej lektury, mam nadzieję, że monografia przyczyni się do licznych dyskusji, kontynuacji badań interdyscyplinarnych oraz będzie służyć edukacji ekologicznej i rozwijać w dużej mierze świadomość ekologiczną w zakresie współodpowiedzialności za właściwy stan zachowania przyrody i zasobów środowiska. Grażyna Łaska 10

1 Wpływ cytokinin i rodzaju eksplantatu na efektywność organogenezy pędowej lnu w różnych warunkach świetlnych kultury in vitro Streszczenie Aneta Adamczuk / Irena Siegień / Iwona Ciereszko Uniwersytet w Białymstoku, Wydział Biologiczno-Chemiczny Instytut Biologii, Zakład Fizjologii Roślin ul. Świerkowa 20B, 15-950 Białystok e-mail: aneta.baran5@wp.pl Badano wpływ wybranych cytokinin, rodzaju eksplantatu oraz jakości i natężenia światła na organogenezę pędową lnu (Linum usitatissimum L., odm. Szafir). Badania pokazały, że kaulogeneza indukowana na fragmentach hipokotyli była efektywniejsza niż na eksplantatach liścieni. W kulturach wyprowadzonych z bazalnych fragmentów liścieni, organogeneza była istotnie większa niż w przypadku eksplantatów pochodzących z ich części środkowej. Natomiast apikalne fragmenty liścieni (w stworzonych warunkach kultury) nie były zdolne do formowania pąków przybyszowych. Spośród przetestowanych cytokinin benzyloaminopuryna (BA) była najskuteczniejsza w indukowaniu kaulogenezy pędowej. W obecności tej cytokininy 100% eksplantatów było zdolnych do formowania pąków ze średnią liczbą około 12-16 sztuk na eksplantat pochodzący ze środkowej części hipokotyla. Najefektywniejszą regenerację pędów uzyskano w kulturach utrzymywanych w obecności światła białego, przy natężeniu wyższym niż 20 µmol m -2 s -1 (100% eksplantatów reagujących; średnia liczba pędów 12). Wyniki dotyczące wpływu promieniowania monochromatycznego na kaulogenezę sugerują, że regeneracji sprzyjało promieniowanie w zakresie niebieskim. Słowa kluczowe: cytokininy, eksplantat, kaulogeneza, promieniowanie monochromatyczne. Różnorodność biologiczna od komórki do ekosystemu. Zagrożenia środowiska a ochrona gatunkowa roślin i grzybów 11

1.1. Wstęp Len zwyczajny (Linum usitatissimum L.) stanowi cenne źródło oleju i włókien wykorzystywanych w wielu gałęziach przemysłu. Ze względu na posiadane właściwości terapeutyczne, w ostatnich latach roślina ta stała się obiektem manipulacji genetycznych w celu poprawy jej wartości odżywczych czy odporności na czynniki chorobotwórcze (Czemplik, Szopa 2009). Organogeneza w kulturach in vitro, wyrażona liczbą powstałych pędów, jest ważnym czynnikiem decydującym o powodzeniu doświadczeń związanych z transformacją roślin. Pomimo, iż badania kultur in vitro lnu trwają od ponad 30. lat, jednak nadal niewiele wiadomo o mechanizmach kontrolujących organo- i embriogenezę tego gatunku (Dedičová i in. 2000). Kierunek morfogenezy w kulturach in vitro uzależniony jest w dużym stopniu od rodzaju zastosowanych hormonów, jak też współdziałania między nimi. Koordynując wiele procesów, fitohormony mogą działać niezależnie od siebie, bądź też wzajemnie wzmacniać lub eliminować swoje efekty. Regulatorami wzrostu niezbędnymi do zainicjowania merystemów pędowych w kulturach in vitro są cytokininy (Adamczuk i in. 2012). Stosowane są zarówno cytokininy naturalne m.in. 2-izopentyloadenina (2iP), jak i syntetyczne BA. Spośród cytokinin mocznikowych w największym stopniu wykorzystywany jest tidiazuron (TDZ). Konsekwencją działania TDZ na fragmenty hipokotyli lnu było indukowanie organogenezy pędowej (Gairi, Rashid 2002). Najlepsze zdolności formowania pędów na eksplantatach liścieni i hipokotyli dwóch odmian lnu (Modran i Selena) zaobserwowano natomiast na pożywkach z dodatkiem BA (Janowicz, Wojciechowski 2009). Z drugiej strony, badania Bretagne i in. (1994) wykazały, że kaulogeneza pędowa indukowana na hipokotylach lnu zachodzi intensywniej w obecności TDZ niż BA. Burbulis i in. (2005) wskazują na to, iż liczba pędów indukowanych na kalusie jest ściśle uzależniona od składu pożywki i genotypu roślin. W regeneracji wielu gatunków roślin w warunkach in vitro wykorzystywane są najczęściej eksplantaty hipokotylowe (Tavano i in. 2009). Liścienie rozwijających się młodocianych siewek mogą być czasami również odpowiednim źródłem eksplantatów, ze względu na wysoki poziom endogennych hormonów oraz zawartość związków zapasowych (Kusnetsov i in. 1994; Wilhemova i in. 2004). Wyniki wieloletnich badań nad lnem wskazują jednak na brak organogenezy pędowej na eksplantatach liścieni w warunkach in vitro (Bretagne i in. 1994), w odróżnieniu od efektywnej kaulogenezy z fragmentów hipokotyli (Yildiz i in. 2010). W ostatnich latach udało się stworzyć warunki umożliwiające kaulogenezę pędową na fragmentach liścieni w przypadku lnu włóknistego, chociaż wydajność tego procesu była niewielka (Belonogova, Raldugina 2006). 12

Światło, jako jeden z najważniejszych czynników środowiskowych, warunkujących wzrost i rozwój roślin, oddziałuje również na procesy morfogenetyczne w kulturach in vitro. Jakość i intensywność światła wpływa między innymi na formowanie i namnażanie pędów, anatomię i wielkość liścia czy na proces ryzogenezy w kulturach różnych gatunków roślin (Reuveni, Evenor 2007). W warunkach in vitro, analogicznie do warunków naturalnych, najbardziej efektywnym jest światło fotosyntetycznie aktywne (400-700 nm). U woskownicy europejskiej (Myrica gale L.) wysoka intensywność światła indukowała wytwarzanie oraz wydłużanie korzeni, jak również miała stymulujący wpływ na masę i długość pędów (Tavares i in. 1998). Natomiast w przypadku eksplantatów korzeni czosnku pospolitego (Allinum sativum L.), indukcję i proliferację kalusa warunkuje zupełny brak światła, natomiast światło ma stymulujący wpływ na organogenezę pędową (Martín-Urdíroz i in. 2004). Światło białe, czerwień i daleka czerwień wpływają stymulująco na kaulogenezę dzikiej odmiany pomidora (Lycopersicon esculentum Mill.), zaś doświetlanie światłem niebieskim powoduje spadek zdolności regeneracyjnej (Bertram, Lercari 2000). Poszukiwanie czynników usprawniających regenerację roślin w kulturach in vitro należy do aktualnych problemów badawczych, ponieważ prowadzi to do podwyższenia wydajności mikrorozmnażania wielu gatunków wykorzystywanych do różnych celów w biotechnologii roślin. W badaniach tych brane są pod uwagę uwarunkowania zewnętrzne, w których kultury są prowadzone, jak też predyspozycje samej rośliny, lub jej poszczególnych organów będących potencjalnym źródłem eksplantatów. Celem prezentowanej pracy było określenie wpływu wybranych cytokinin, rodzaju eksplantatu oraz jakości i natężenia światła na proces kaulogenezy lnu w warunkach in vitro. 1.2. Materiał i metody Przedmiotem badań były kultury pędowe lnu zwyczajnego (Linum usitatissimum L., typ oleisty, odm. Szafir), wyprowadzone z eksplantatów liścieni, lub hipokotyli 5-dniowych siewek, rosnące w warunkach in vitro. Nasiona lnu, otrzymane ze Stacji Hodowli Roślin w Strzelcach (woj. łódzkie) sterylizowano w 0,1% roztworze chlorku rtęci (HgCl 2 ) przez 15 minut i wykładano na szalki Petriego na podłoże agarowe 0,75% (w/v). Szalki z nasionami pozostawiano do wzrostu w kontrolowanych warunkach fitotronowych (Siegień i in. 2013). Sposób pobierania eksplantatów ze sterylnych liścieni i hipokotyli przedstawiono na rycinie 1.1. 13

Rycina 1.1. Schematyczne przedstawienie pochodzenia badanych w pracy eksplantatów hipokotyla (a) i liścienia (b) siewki lnu: część apikalna (A), część środkowa (S), część bazalna (B) Eksplantaty hipokotyli wykładano na szalki Petriego, na pożywkę według Murashige i Skoog (MS) (Murashige, Skoog 1962), eksplananty liścieni natomiast na pożywkę zawierającą makroelementy według MS, mikroelementy i witaminy wg Gamborga (B5) (Gamborg i in. 1968), o ph = 5,7-5,9, do których dodawano 30g l -1 sacharozy i zestalano 0,75% (w/v) agarem. W celu uzyskania efektywnej indukcji pędów do pożywki zawierającej 0,05 mg l -1 kwasu 2,4 dichlorofenoksyoctowego (2,4-D) dodawano różne cytokininy: BA, TDZ i 2iP w stężeniu 1,0 mg l -1. Wpływ natężenia promieniowania oraz promieniowania monochromatycznego na procesy morfogenetyczne zbadano w kulturach wyprowadzonych ze środkowej części hipokotyla. Kultury poddano działaniu światła białego o natężeniu: 0, 20, 50, 90, 180 μmol m -2 s -1. W celu określenia wpływu promieniowania różnej jakości na kaulogenezę, kultury pozostawiono do wzrostu w ciemności (D) oraz w świetle białym (W), a także pod wpływem promieniowania w zakresie niebieskim (B), czerwonym (R), dalekiej czerwieni (FR) każde o natężeniu 50 μmol m -2 s -1. Promieniowanie monochromatyczne uzyskano przez zastosowanie odpowiednich filtrów (Niedźwiedź-Siegień, Lewak 1992): B (λ = 450 nm) filtr niebieski: Scenoroid nr 212; R (λ = 660 nm) filtr czerwony: Scenoroid nr 227; FR (λ = 730 nm) filtr niebieski + filtr czerwony (Coframap, Paris, France). Kultury lnu rosły w pomieszczeniu fitotronowym przez 30 dni w świetle białym, lub pod wpływem różnych jakości światła, w kontrolowanych warunkach (Siegień i in. 2013). Kontrolę stanowiły kultury rosnące w ciemności, umieszczone w pojemnikach uniemożliwiających dostęp światła. Obserwacji kultur dokonywano codziennie, licząc formujące się pędy. Ostatecznej oceny zdolności regeneracyjnych (procent eksplantatów ze zregenerowanymi pędami oraz ilości zregenerowanych pędów na eksplantacie) dokonano po 30 dniach od wyłożenia eksplantatów na pożywki. Oznaczono także świeżą i suchą masę eksplantatów. Każde doświadczenie powtarzano co najmniej dwukrotnie. Otrzymane wyniki porównywano między sobą testem t-studenta przy poziomie istotności p 0,05. Wyniki przedstawiono jako wartości średnie ±SD (odchylenie standardowe). 14

1.3. Wyniki Pędy formowały się zarówno na eksplantatach hipokotyli, jak i liścieni, ale organogeneza była o około 20% wyższa w kulturach wyprowadzonych z hipokotyli. Niezależnie od miejsca pobrania eksplantatu (A, S, B część hipokotyla), kaulogeneza przebiegała podobnie. Obserwowano powstawanie powyżej 10 pędów na eksplantat (Tab. 1.1). W przypadku eksplantatów liścieni, pojedyncze pędy formowały się tylko z części środkowej i bazalnej liścienia (Tab. 1.1). Kultury wyprowadzone ze wszystkich części hipokotyla odznaczały się ponad dwukrotnie niższą świeżą masą w porównaniu do kultur pochodzących z eksplantatów liścieni. Kultury inicjowane z części bazalnych i środkowych liścieni, w których obserwowano organogenezę, charakteryzowały się niższą o około 40% świeżą masą niż kultury z części apikalnych, w których kaulogeneza nie nastąpiła (Tab. 1.1). Tabela 1.1. Efektywność organogenezy pędowej lnu, indukowanej na apikalnej (A), środkowej (S), bazalnej (B) części liścienia i hipokotyla oraz świeża i sucha masa eksplantatów po 30 dniach wzrostu na pożywce B5 (eksplantaty liścieni) i MS (eksplantaty hipokotyli) z dodatkiem BA 1,0 mg l -1 + 2,4-D 0,05 mg l -1 Rodzaj eksplantatu liścień hipokotyl % reagujących eksplantatów Liczba pędów/ ekspl. [szt.] Świeża masa [mg/ekspl.] Sucha masa [mg/ekspl.] A 0 d 0 1577,0 a ± 76,0 70,0 a ± 3,1 S 13 c ± 2,1 7,0 b ± 2,2 1072,3 b ± 174,0 66,0 a ± 6,1 B 88 b ± 1,0 1,7 c ± 0,9 976,3 b ± 167,2 68,0 a ± 12,1 A 100 a 11,8 ab ± 3,0 541,7 c ± 91,5 43,6 a ± 27,2 S 100 a 16,3 a ± 2,8 518,6 c ± 147,1 30,0 b ± 10,4 B 100 a 10,8 b ± 1,4 533,3 c ± 76,0 33,1 b ± 5,3 Wyniki średnie ±SD. Wartości w kolumnach oznaczone różnymi literami są statystycznie istotne (p 0,05) Źródło: badania własne. Wpływ cytokinin na efektywność kaulogenezy badano wykorzystując eksplantaty liścieni pochodzące z ich środkowej (S) i bazalnej (B) części. W przypadku eksplantatów hipokotyli, do dalszych badań wybrano jego środkowy (S) fragment, gdyż cechował się on największą efektywnością formowania pędów. Pojawianie się pierwszych pędów obserwowano po około 5 dniach od wyłożenia eksplantatów hipokotyli na pożywki we wszystkich wariantach doświadczenia (Tab. 1.2). Procent reagujących eksplantatów, po 30 dniach wzrostu w kulturach wyprowadzonych z fragmentów hipokotyli był podobny, niezależnie od zastosowanego regulatora 15

wzrostu. W obecności TDZ w pożywce, liczba pędów inicjowanych na pojedynczym eksplantacie była niższa niż w przypadku BA i 2iP (Tab. 1.2). Kultury pędowe, rosnące w obecności 2iP były bardziej rozwinięte, ale wykazywały oznaki starzenia (dane nieprzedstawione). Tabela 1.2. Efektywność organogenezy pędowej lnu, indukowanej na środkowej (S) części hipokotyla oraz świeża i sucha masa eksplantatów po 30 dniach wzrostu na pożywce MS z dodatkiem 2,4-D oraz wybranych cytokinin Cytokininy [1,0 mg l -1 ] Reagujące eksplantaty [%] Liczba pędów/ ekspl. [szt.] Początek regeneracji [dni] Świeża masa [mg/ekspl.] Sucha masa [mg/ekspl.] BA 100 a 11,8 a ± 3,0 5 497,8 b ± 69,5 36,9 ac ± 4,7 TDZ 96,0 a ± 6,4 5,4 b ± 2,2 5 616,6 a ± 25,6 43,3 a ± 3,3 2iP 88,0 b ± 11,0 10,2 a ± 1,3 5 397,9 b ± 41,1 31,1 bc ± 4,2 Wyniki średnie ±SD. Wartości w kolumnach oznaczone różnymi literami są statystycznie istotne (p 0,05) Źródło: badania własne. Świeża i sucha masa kultur wyprowadzonych ze środkowej części hipokotyla, rosnących w obecności TDZ była wyższa niż w przypadku pozostałych cytokinin (Tab. 1.3). Kaulogenezy nie zaobserwowano na fragmentach liścieni rosnących na pożywce z dodatkiem 2iP (dane nieprzedstawione). Natomiast organogeneza indukowana na bazalnej części liścienia (B) była wyższa o około 90% niż w kulturach wyprowadzonych z jego środkowej (S) części oraz efektywniejsza w obecności BA niż TDZ. Tabela 1.3. Efektywność organogenezy pędowej lnu indukowanej na środkowej (S) i bazalnej (B) części liścienia oraz świeża i sucha masa eksplantatów po 30 dniach wzrostu na pożywce B5 z dodatkiem 2,4-D oraz wybranych cytokinin Cytokininy [1,0 mg l -1 ] BA TDZ Fragment liścienia Reagujące eksplantaty [%] Liczba pędów /ekspl. [szt.] Początek regeneracji [dni] Świeża masa [mg/ekspl.] Sucha masa [mg/ekspl.] S 13,0 c ± 2,1 7,0 a ± 2,2 21 1072,3 ac ± 174 66,0 a ± 6,1 B 88,0 a ± 1,0 1,7 b ± 0,9 5 976,3 bc ± 167,2 68,0 a ± 12,1 S 19,0 c ± 8,5 2,1 b ± 1,2 15 1470,0 a ± 238 70,0 a ± 20,0 B 53,0 b ± 12,2 1,0 b ± 0,2 7 987,5 bc ± 159 66,2 a ± 14,0 Wyniki średnie ±SD. Wartości w kolumnach oznaczone różnymi literami są statystycznie istotne (p 0,05) Źródło: badania własne. 16

Świeża i sucha masa eksplantatów pochodzących z kultur liścieniowych była porównywalna. Wartości te były wyższe w kulturach pochodzących z bazalnej części liścienia, rosnących w obecności TDZ niż BA (Tab. 1.3). Najwyższą liczbą pędów odznaczały się kultury, gdy natężenie światła było wyższe niż 20 μmol m -2 s -1. Organy te były liczne (około 10 szt./ekspl.) i dobrze wykształcone, natomiast przy natężeniu 20 μmol m -2 s -1 były bardzo małe (dane nieprzedstawione) i nie przekraczały 5 sztuk na eksplantat. Kultury utrzymywane w obecności światła białego przy natężeniu wyższym niż te, które rosły na świetle o natężeniu przekraczającym 20 μmol m -2 s -1, odznaczały się najwyższą świeżą i suchą masą (Tab. 1.4). Tabela 1.4. Efektywność organogenezy pędowej lnu indukowanej na środkowej części hipokotyla oraz świeża i sucha masa eksplantatów po 30 dniach wzrostu na pożywce MS z dodatkiem BA (1,0 mg l -1 ) + 2,4-D (0,05 mg l -1 ) przy różnym natężeniu światła białego Natężenie napromieniowania [µmol m -2 s -1 ] Reagujące eksplantaty [%] Liczba pędów/ ekspl. [szt.] Świeża masa [mg/ekspl.] Sucha masa [mg/ekspl.] 0 63 b ± 5,8 1,3 c ± 0,3 153,7 d ± 8,8 6,1 e ± 0,9 20 100 a 3,1 b ± 1,2 203,7 c ± 30,2 20,0 d ± 2,1 50 100 a 11,8 a ± 3,0 547,0 a ± 67,6 62,1 a ± 7,0 90 100 a 10,8 a ± 1,3 316,4 b ± 42,5 31,8 c ± 4,6 180 100 a 10,5 a ± 2,1 457,2 a ± 38,6 45,2 b ± 6,3 Wyniki średnie ±SD. Wartości w kolumnach oznaczone różnymi literami są statystycznie istotne (p 0,05) Źródło: badania własne. Organogeneza pędowa była efektywniejsza w kulturach utrzymywanych w obecności światła białego (W) i promieniowania niebieskiego (B) niż w pozostałych wariantach świetlnych doświadczenia (Ryc. 1.2A-B). Kaulogeneza mieściła się w granicach 100% w przeciwieństwie do pozostałych wariantów, gdzie była o około 20% niższa (Ryc. 1.2A). Liczba zregenerowanych pędów była o około 2,5 raza większa w kulturach w świetle białym i o około 2 razy większa w świetle niebieskim, w stosunku do liczby pędów otrzymanych w kulturach rosnących w pozostałych badanych warunkach oświetlenia (Ryc. 1.2B). 17

A 120 % reagujących eksplantatów 100 80 60 40 20 b a b b a,b 0 D W R FR B Warunki świetlne B 25 Liczba pędów/eksplantat [szt.] 20 15 10 5 b a b b a,b 0 D W R FR B Warunki świetlne Rycina 1.2. Efektywność formowania pędów przybyszowych w kulturach in vitro lnu, wyprowadzonych ze środkowej części hipokotyla, po 30 dniach wzrostu na pożywce MS z dodatkiem BA 1,0 mg l -1 + 2,4-D 0,05 mg l -1 w ciemności (D), w świetle białym (W), czerwonym (R), dalekiej czerwieni (FR) oraz niebieskim (B) każde o natężeniu 50 µmol m -2 s -1 Wyniki średnie ±SD. Wartości oznaczone różnymi literami są statystycznie istotne (p 0,05) Źródło: badania własne. 18

1.4. Dyskusja Organogeneza pędowa z eksplantatów hipokotyli była bardziej efektywna niż z fragmentów liścieni. Wydajność procesu kaulogenezy w przypadku eksplantatów liścieniowych zależała od miejsca ich pobrania (Tab. 1.1). Podobny potencjał kaulogenezy w zależności od wykorzystywanego rodzaju eksplantatu obserwowano w kulturach rzepy jadalnej (Brassica rapa L.) (Cogbill i in. 2010). Również w kulturach psianki podłużnej (Solanum melongena L.) efektywność kaulogenezy zależała od miejsca pobrania eksplantatu (Sharma, Rajam 1995). Wykazano, że w zależności od rodzaju eksplantatu, skład hormonalny pożywki sprzyjający organogenezie pędowej lnu jest nieco odmienny (Tab. 1.2, 1.3). W przypadku kultur pochodzących z eksplantatów hipokotylowych, obecność 2iP oraz BA w pożywce sprzyjało formowaniu pędów (Tab. 1.2). W kulturach wyprowadzonych z bazalnych fragmentów liścieni organogeneza była efektywniejsza na pożywce z dodatkiem BA niż TDZ (Tab. 1.3). Generalnie BA jest uważana za najbardziej użyteczną i niezawodną cytokininę, stosowaną do indukcji pędów, co wykazano w przypadku Drymaria cordata (L.) Willd. czy kultur śliwy (Prunus microcarpa C. A. Mey.) (Ghimire i in. 2010; Nas i in. 2010). Jednak nie u wszystkich gatunków roślin BA jest dobrym regulatorem w indukcji organogenezy. W innych przypadkach stosowano TDZ, regulator o charakterze cytokininy. W kulturach in vitro żyworódki pierzastej Kalanchoë pinnata (Lam.) Pres. indukował on organogenezę pędową (Jaiswal, Sawhney 2006). Natomiast badania Burbulis i in. (2005) sugerują, iż dodatek 2iP do pożywki wspomaga efektywną indukcję organogenezy pędowej z kalusa powstającego na eksplantatach hipokotyli lnu. W niniejszych badaniach zaobserwowano jednocześnie, że świeża masa kultur była wyższa w obecności TDZ niż BA (Tab. 1.2, 1.3). Przypuszczać można, że TDZ prowadzi do zwiększenia świeżej masy przez akumulację wody, co może wpływać negatywnie na zdolności regeneracyjne eksplantatów (Paques, 1991). Wzrost kultur lnu uzależniony był również od natężenia światła białego i jakości promieniowania. Dobrze wykształcone i liczne (ponad 5 sztuk na fragmencie) pędy na eksplantatach hipokotylowych obserwowano na świetle przy natężeniu wyższym niż 20 μmol m -2 s -1 (Tab. 1.4). Podobne zależności między intensywnością światła a wytwarzaniem pąków przybyszowych wykazano u Trema orientalia L. (Samantaray i in. 1995). Obecność światła białego w trakcie wzrostu kultur sprzyjała powstawaniu większej liczby pędów na eksplantacie (Ryc. 1.2.A-B). W kulturach utrzymywanych w obecności światła białego, 100% eksplantatów było zdolnych do formowania pędów ze średnią liczbą powyżej 5 sztuk na eksplantat, natomiast 19

w ciemności ich liczba nie przekraczała 5 sztuk (Ryc. 1.2.B). Efekt działania światła na intensywniejszą indukcję i rozwój pędów mógł być konsekwencją wyższego tempa fotosyntezy (Tavares i in. 1998). Poza składnikami organicznymi dodanymi do pożywki, w eksplantatach mogły być wytwarzane inne związki organiczne, dodatkowo wzbogacające podłoże do wzrostu kultur. Światło może również wpływać na aktywność enzymów oraz syntezę hormonów i w ten sposób regulować procesy prowadzące do regeneracji. Wpływ jakości promieniowania na efektywność organogenezy pędowej lnu był niewielki i przejawiał się zasadniczo stymulacją tego procesu przez światło niebieskie (B) (Ryc. 1.2A-B). Promieniowanie to, zaabsorbowane przez odpowiednie fotoreceptory (m.in. kryptochromy), mogło inicjować ciąg zdarzeń prowadzących między innymi do ekspresji genów zaangażowanych w regulację procesów fotomorfogenetycznych. Mogło to skutkować nieco bardziej efektywną kaulogenezą. Natomiast w przypadku petunii ogrodowej (Petunia hybryda hort. ex Vilm), organogeneza pędowa była stymulowana przez promieniowanie w zakresie czerwieni (Reuveni, Evenor 2007). Podsumowując, w przeprowadzonych badaniach wykazano zależność między rodzajem i pochodzeniem eksplantatu oraz wykorzystaną do procesów regeneracyjnych cytokininą. W porównaniu do wcześniejszych badań prowadzonych głównie na odmianach lnu włóknistego (Belonogova, Raldugina 2006; Janowicz, Wojciechowski 2009), udało się uzyskać organogenezę pędową na eksplantatach liścieni odmiany Szafir lnu oleistego. Zaobserwowano stymulujący efekt działania światła białego i promieniowania w zakresie niebieskim na organogenezę pędową. Przedstawione wyniki mogą być pomocne w badaniach nad uzyskaniem efektywniejszej organogenezy lnu. Podziękowania Aneta Adamczuk jest beneficjentem projektu Stypendia dla doktorantów województwa podlaskiego. Projekt jest współfinansowany w 85% ze środków Europejskiego Funduszu Społecznego, 7,5% ze środków budżetu państwa, 7,5% ze środków budżetu województwa podlaskiego. Realizowany w ramach Programu Operacyjnego Kapitał Ludzki 2007-2013, Działanie 8.2. Transfer wiedzy, Poddziałanie 8.2.2. Regionalne Strategie Innowacji. 20

Literatura Adamczuk A., Siegień I., Ciereszko I. 2012. Roślinne kultury in vitro charakterystyka i zastosowania. Edukacja Biologiczna i Środowiskowa, 4: 38-46. Belonogova M. A., Raldugina G. N. 2006. Shoot regeneration from cotyledon explants of fibre flax (Linum usitatissimum L.) and their subsequent rooting. Russ. J. Plant Physiol., 53: 501-506. Bertram L., Lercari B. 2000. Phytochrome A and phytochrome B1 control the acquisition of competence for shoot regeneration in tomato hypocotyl. Plant Cell Rep., 19: 604-609. Bretagne B., Chupeau M., Chupeau Y., Fouilloux G. 1994. Improved flax regeneration from hypocotyls using thidiazuron as a cytokinin source. Plant Cell Rep., 14: 120-124. Burbulis N., Blinstrubiene A., Venskutoniene E., Katauskye L. 2005. Organogenesis in callus cultures of Linum usitatissimum L. Acta Univ. Latv., 691: 129-135. Cogbill S., Faulcon T., Jones G., McDaniel M., Harmon G., Blackmon R., Young M. 2010. Adventitious shoot regeneration from cotyledonary explants of rapid cycling fast plants of Brassica rapa L. Plant Cell Tiss. Organ Cult., 101: 127-133. Czemplik M., Szopa J. 2009. Optimizing biomedical and industrial products development based on flax. CAB Reviews: Perspectives in Agriculture. Veterinary Science, Nutrition and Natural Resources, 4: 062. Dedičová B., Hricová A., Šamaj J., Obert B., Bobák M., Pret ová A. 2000. Shoots and embryo-like structures regenerated from cultured flax (Linum usitatissimum L.) hypocotyls segments. J. Plant Physiol., 157: 327-334. Gairi A., Rashid A. 2002. In vitro stimulation of shoot buds on hypocotyls of Linum seedlings, by flooding and ethereal treatment of cultures. Plant Sci., 163: 691-694. Gamborg O. L., Miller R. A., Ojima K. 1968. Nutrient requirements of suspension cultures of soybean root cells. Exp. Cell Res., 50: 151-158. Ghimire B. K., Seong E. S., Goh E. J., Kim N. Y., Kang W. H., Kim E. H., Yu C. Y., Chung I. M. 2010. High-frequency direct shoot regeneration from Drymaria cordata Willd. leaves. Plant Cell Tiss. Organ Cult., 100: 209-217. Jaiswal S., Sawhney S. 2006. Modulation of TDZ-induced morphogenetic responses by antiauxin TIBA in bud-bearing foliar explants of Kalanchoe pinnata. Plant Cell Tiss. Organ Cult., 86: 69-76. Janowicz J., Wojciechowski A. 2009. Ocena zdolności regeneracyjnych dwóch odmian lnu (Linum usitatissimum L.) w kulturach in vitro. Rośliny Oleiste, 30: 35-49. Kusnetsov V. V., Oelmuller R., Sarwat M. I., Porfirova S. A., Cherepneva G. N., Herrmann R. G., Kulaeva O. N. 1994. Cytokinins, abscisic acid and light affect accumulation of chloroplast protein in Lupinus luteus cotyledons without notable effect on steady-state mrna level. Planta, 124: 318-327. 21

Martín-Urdíroz N., Garrido-Gala J., Martin J., Barandiaran X. 2004. Effect of light on the organogenic ability of garlic using a one-step in vitro system. Plant Cell Rep., 22: 721-724. Murashige T., Skoog F. 1962. A revised medium for rapid growth and bio-assays with tobacco tissue cultures. Physiol. Plant., 15: 473-497. Nas M. N., Bolek Y., Sevgin N. 2010. The effects of explant and plant cytokinin type on regeneration of Prunus microcarpa. Sci. Hort., 126: 88-94. Niedźwiedź-Siegień I., Lewak S. 1992. Involvement of high irradiance response in photoinhibition of white clover seed germination at low water potential. Physiol. Plant., 86: 293-296. Paques M. 1991. Vitrification and micropropagation: causes, remedies and prospects. Acta Hort., 289: 283-290. Reuveni M., Evenor D. 2007. On the effect of light on shoot regeneration in petunia. Plant Cell Tiss. Organ Cult., 89: 49-54. Samantaray S., Rout G. R., Das R. 1995. An in vitro study on organogenesis in Trema orientalis (Blume) Linn. Plant Science 105: 87-94. Sharma P., Rajam M. V. 1995. Genotype explant and position effects on organogenesis and somatic embryogenesis in eggplant (Solanum melongena L.). J. Exp. Bot., 46: 136-141. Siegień I., Adamczuk A., Wróblewska K. 2013. Light affects in vitro organogenesis of Linum usitatissimum L. and its cyjanogenic potential. Acta Physiol. Plant., 35: 781-789. Tavano E.C.R., Stipp L.C.L., Muniz F.R., Mourão Filho F.A.A., Mendez B.M.J. 2009. In vitro organogenesis of Citrus volkameriana and Citrus aurantium. Bio. Plant., 53: 395-399. Tavares F., Abreu I., Salema R. 1998. Regeneration of the actinorhizal plant Myrica gale L. from epicotyl explants. Plant Sci., 135: 203-210. Wilhemova N., Prochazkova D., Macháčková L., Vagner M., Srbova M. 2004. The role of cytokinins and ethylene in bean cotyledon senescence. The effect of free radicals. Biol. Plant., 4: 523-529. Yildiz M., Ozcan S., Telci C., Day S., Ozat H. 2010. The effect of drying and submersion pretreatment on adventitious shoot regeneration from hypocotyls explants of flax (Linum usitatissimum L.). Turk. J. Bot., 34: 323-328. 22

2 Wpływ kwasu jasmonowego na siewki ogórka traktowanego kadmem Andrzej Bajguz / Alicja Piotrowska-Niczyporuk / Marta Talarek / Iwona Bąkała Uniwersytet w Białymstoku, Wydział Biologiczno-Chemiczny Instytut Biologii, Zakład Biochemii Roślin i Toksykologii ul. Świerkowa 20B, 15-950 Białystok e-mail: abajguz@uwb.edu.pl Streszczenie W przystosowaniu się roślin do stresów środowiskowych, ważną rolę odgrywają fitohormony. W artykule przedstawiono wpływ kwasu jasmonowego (JA) w zakresie stężeń 10-8 -10-5 M na wybrane procesy metaboliczne zachodzące w ogórku siewnym (Cucumis sativus L.), traktowanym chlorkiem kadmu w stężeniu 10-4 M. Przeprowadzono pomiary długości pędów i korzeni, oznaczono zawartość barwników asymilacyjnych, monosacharydów oraz białek. Zbadano również wpływ JA oraz kadmu (Cd) na aktywność peroksydazy askorbinianowej (APX), zawartość fitochelatyn (PC), kwasu askorbinowego, nadtlenku wodoru (H 2 O 2 ) oraz peroksydację lipidów błonowych. Celem pracy było również ustalenie czy JA może zmniejszać toksyczny wpływ Cd na wzrost i rozwój ogórka. Badania wykazały, że Cd ogranicza wzrost pędów i korzeni, powoduje obniżenie zawartości barwników asymilacyjnych, białek i monosacharydów. W roślinach traktowanych Cd stwierdzono natomiast wzrost aktywności APX, peroksydacji lipidów, zwiększenie zawartości kwasu askorbinowego, H 2 O 2 oraz PC. Wykazano, że tylko JA w stężeniu 10-8 M w roślinach traktowanych jonami Cd powodował: wzrost długości pędu i korzenia, zwiększenie zawartości białek, monosacharydów, barwników asymilacyjnych, kwasu askorbinowego, PC i aktywności APX oraz zmniejszał zawartość H 2 O 2 i obniżał peroksydację lipidów. Słowa kluczowe: kwas jasmonowy, kadm, ogórek, stres oksydacyjny Różnorodność biologiczna od komórki do ekosystemu. Zagrożenia środowiska a ochrona gatunkowa roślin i grzybów 23

2.1. Wstęp Rośliny występujące w naturalnym środowisku przyrodniczym coraz częściej narażone są na działanie wielu niekorzystnych czynników. Prawidłowe funkcjonowanie roślin uzależnione jest od utrzymania homeostazy organizmu (Kopcewicz, Lewak 2012). Do czynników stresowych zewnętrznych należą metale ciężkie, które dostają się do środowiska, głównie w wyniku niekontrolowanych emisji (Solanka, Dhankhar 2011; Delmail, Labrousse 2014). Szczególnie toksycznym działaniem wyróżnia się kadm (Cd), powodując częściowe lub całkowite zahamowanie wzrostu roślin, pojawienie się plam chlorotycznych czy skręcanie liści. Ponadto Cd wywołuje uszkodzenia struktury białek, lipidów oraz kwasów nukleinowych. W efekcie, rośliny narażone na działanie tego metalu wykazują zahamowanie procesu fotosyntezy (Rucińska-Sobkowiak 2010; Kopcewicz, Lewak 2012; Han i in. 2013; Delmail, Labrousse 2014). Do czynników wewnętrznych oddziałujących na rośliny zaliczamy hormony roślinne. Do fitohormonów biorących udział w kontroli reakcji roślin na stres należą jasmoniany i salicylany (Jarecka-Boncela, Saniewska 2011; Khan i in. 2012; Bosco i in. 2014; Wasternack 2014). Do jasmonianów zalicza się m.in. kwas jasmonowy (JA). Wzmożona produkcja jasmonianów w roślinach jest skutkiem działania wielu czynników stresowych, takich jak uszkodzenia mechaniczne, infekcje spowodowane przez patogeny lub owady, dotyk czy stres osmotyczny (Jarecka- Boncela, Saniewska 2011). Obecność jasmonianów stwierdzono u wielu gatunków roślin wyższych, a także u przedstawicieli roślin niższych i grzybów. Występują one we wszystkich częściach roślin, zarówno w pyłku kwiatowym, korzeniach, łodygach, nasionach, bulwach, jak i kwiatach i owocach. Najwyższe stężenie tych związków występuje w częściach generatywnych roślin, mniejsze ilości stwierdzono w częściach wegetatywnych (Khan i in. 2012; Wasternack 2014). Do chwili obecnej przeprowadzono wiele badań dotyczących wpływu metali ciężkich na wzrost, rozwój i metabolizm roślin. Wpływ kadmu na rośliny różni się od toksycznego działania innych metali ciężkich np. ołowiu (Pb) czy miedzi (Cu). W związku z powyższym, przeprowadzono badania wpływu Cd na wzrost ogórka siewnego (Cucumis sativus L.), zawartość podstawowych metabolitów i poziom stresu oksydacyjnego. Celem pracy było również ustalenie czy JA może obniżać toksyczny wpływ Cd na wzrost i rozwój siewek ogórka poprzez uruchomienie biochemicznych mechanizmów naprawczych. 24

2.2. Materiał i metody Badania przeprowadzono na ogórku siewnym (Cucumis sativus L.), roślinie należącej do rodziny dyniowatych (Cucurbitaceae). Laboratoryjną hodowlę ogórka siewnego przeprowadzono w polietylenowych, przezroczystych pojemnikach. Nasiona ogórka były przez 48 godzin moczone w: 1) wodzie destylowanej (próba kontrolna), 2) roztworze CdCl 2 5H 2 O, którego stężenie 10-4 M przeliczano na kadm, 3) roztworze 10-4 M Cd z JA (w stężeniu od 10-8 do 10-5 M). Następnie po 3-krotnym przepłukaniu wodą destylowaną, nasiona przenoszono na ligninę. Nasiona kiełkowały i siewki ogórka rosły w fitotronie w temperaturze 22 ± 2 C, przy natężeniu światła 50 μmoli fotonów m -2 s -1 w trakcie 16-godzinnego dnia. Po upływie 7. dni mierzono długość pędu i korzenia siewek oraz analizowano zawartość białka, monosacharydów, chlorofilu a, karotenoidów, nadtlenku wodoru, kwasu askorbinowego, fitochelatyn (PC), peroksydację lipidów i aktywność peroksydazy askorbinianowej (APX). Długość pędu i korzenia zmierzono za pomocą podziałki centymetrowej. Wykorzystano metody spektrofotometryczne do oznaczenia zawartości: chlorofilu a, karotenoidów (według metody Wellburna (1994)), białka (według metody Lowry ego (Lowry i in. 1951)), monosacharydów (według metody Somogyi-Nelsona (Nelson 1954)). Aktywność APX mierzono metodą Nakano i Asada (1981), fitochelatyny oznaczono metodą De Kok (De Kok i in. 1986), natomiast kwas askorbinowy według metody Jagota i Dani (1982). Zawartość nadtlenku wodoru oraz poziom peroksydacji lipidów zbadano metodą Heath i Packera (1968). Wyniki badań uzyskane z siedmiu powtórzeń zostały poddane analizie statystycznej, m.in. użyto testu Duncana, wykorzystując program IBM SPSS Statistics 21. 2.3. Wyniki Badania przeprowadzone na siewkach ogórka wykazały, że 10-4 M Cd zahamował wydłużanie pędów i korzeni (Ryc. 2.1). JA w stężeniu 10-8 M w obecności 10-4 M Cd zwiększył o 14% długość pędów w porównaniu z kontrolą. Natomiast JA w stężeniach wyższych (10-7 -10-5 M) nie miał wpływu na wzrost siewek ogórka w obecności Cd 2+. 25

Rycina 2.1. Wpływ jonów kadmu i kwasu jasmonowego na długość pędów i korzeni ogórka Wyniki przedstawiają wartości średnie ±SD, n = 7. Oznaczenia literowe przy kolumnach wskazują na różnice istotne statystycznie między zmiennymi, zgodnie z testem Duncana Źródło: badania własne. W wyniku badań stwierdzono obniżenie zawartości chlorofilu a, karotenoidów, monosacharydów i białek w roślinach traktowanych 10-4 M Cd (Ryc. 2.2). Natomiast JA w stężeniu 10-8 M w obecności Cd spowodował wzrost zawartości chlorofilu a o 18%, zaś karotenoidów o około 8%, w porównaniu z próbą kontrolną. Natomiast w wyższych stężeniach (10-7 -10-5 M) JA stwierdzono znaczny spadek zawartości chlorofilu a, karotenoidów, białek i monosacharydów. Przeprowadzone badania wykazały, że w roślinach traktowanych 10-4 M Cd nastąpił niewielki wzrost akumulacji PC (Ryc. 2.3). Natomiast JA w stężeniu 10-8 M + Cd powodował wzrost zawartości PC o ponad 75% w stosunku do kontroli. Jedynie w ogórku traktowanym mieszaniną 10-5 M JA i Cd wykazano zmniejszenie o 74% poziomu PC w stosunku do kontroli. 26

Rycina 2.2. Wpływ jonów kadmu i kwasu jasmonowego na zawartość chlorofilu a, karotenoidów, monosacharydów i białek w pędach ogórka Wyniki przedstawiają wartości średnie ±SD, n = 7. Oznaczenia literowe przy kolumnach wskazują na różnice istotne statystycznie między zmiennymi, zgodnie z testem Duncana. Źródło: badania własne. Rycina 2.3. Wpływ jonów kadmu i kwasu jasmonowego na zawartość fitochelatyn w pędach ogórka Wyniki przedstawiają wartości średnie ±SD, n = 7. Oznaczenia literowe przy kolumnach wskazują na różnice istotne statystycznie między zmiennymi, zgodnie z testem Duncana. Źródło: badania własne. 27

Przeprowadzone badania wykazały, że 10-4 M Cd stymuluje akumulację H 2 O 2 w siewkach ogórka (Ryc. 2.4). JA w stężeniu 10-8 M w obecności 10-4 M Cd spowodował zmniejszenie o ponad 18% zawartości H 2 O 2 w pędach ogórka. Natomiast wraz ze wzrostem stężenia JA (10-7 -10-5 M), zawartość tej reaktywnej formy tlenu zwiększyła się ponad dwukrotnie w siewkach traktowanych mieszaniną 10-5 M JA i 10-4 M Cd, w stosunku do próby kontrolnej. W wyniku badań stwierdzono również, że Cd w stężeniu 10-4 M powoduje znaczny wzrost peroksydacji lipidów w badanym materiale roślinnym (Ryc. 2.4). JA w stężeniu 10-8 M w obecności 10-4 M Cd obniżył peroksydację lipidów o około 9%, w porównaniu do kontroli. Fitohormon w wyższych stężeniach w obecności kadmu wykazał brak działania. Rycina 2.4. Wpływ jonów kadmu i kwasu jasmonowego na zawartość nadtlenku wodoru i peroksydację lipidów w pędach ogórka Wyniki przedstawiają wartości średnie ±SD, n = 7. Oznaczenia literowe przy kolumnach wskazują na różnice istotne statystycznie między zmiennymi, zgodnie z testem Duncana. Źródło: badania własne. Badania wykazały ponadto, że 10-4 M Cd działa stymulująco na aktywność APX (Ryc. 2.5). 28

Rycina 2.5. Wpływ jonów kadmu i kwasu jasmonowego na zawartość askorbinianu i aktywność peroksydazy askorbinianowej w pędach ogórka Wyniki przedstawiają wartości średnie ±SD, n = 7. Oznaczenia literowe przy kolumnach wskazują na różnice istotne statystycznie między zmiennymi, zgodnie z testem Duncana. Źródło: badania własne. Zastosowanie JA w stężeniach 10-8 -10-6 M w obecności 10-4 M Cd spowodowało wzrost aktywności APX w pędach ogórka nawet o około 44%, w porównaniu do próby kontrolnej. Jedynie 10-5 M JA zahamował aktywność enzymu antyoksydacyjnego. Zaobserwowano także, że pod wpływem Cd wzrasta zawartość kwasu askorbinowego w pędach ogórka (Ryc. 2.5). Zastosowanie JA w stężeniach 10-8 -10-6 M w obecności 10-4 M Cd spowodowało wzrost poziomu askorbinianu. Największą zawartość stwierdzono w roślinach traktowanych 10-8 M JA i była ona wyższa o 82% w porównaniu z kontrolą. Natomiast 10-5 M JA w obecności 10-4 M Cd spowodował zmniejszenie zawartości tego antyoksydantu o około 74% w porównaniu do kontroli. 2.4. Dyskusja Ważną rolę w dostosowaniu się roślin do niekorzystnych warunków środowiskowych pełnią fitohormony. JA, w zależności od stężenia, ma wpływ na przebieg szeregu procesów metabolicznych w roślinach w warunkach stresu (Jarecka- Boncela, Saniewska 2011). Kadm jest pierwiastkiem silnie fitotoksycznym, ponieważ w jego obecności obserwuje się zmiany w strukturze liści, zmniejszenie świeżej masy czy zaburzenia fotosyntezy (Bednarek i in. 2007; Bajguz, Piotrowska-Niczyporuk 2012). W związku z powyższym, przeprowadzono badania dotyczące wpły- 29

wu JA w przystosowaniu siewek ogórka do stresu abiotycznego indukowanego kadmem. Celem pracy było ustalenie czy fitohormon obniża szkodliwy wpływ metalu ciężkiego na wzrost roślin oraz zawartość kluczowych związków, tj. białka, chlorofilu a, karotenoidów i monosacharydy. Zbadano również wpływ JA na zawartość fitochelatyn (PC) uczestniczących w detoksykacji Cd, zawartość nadtlenku wodoru, poziom peroksydacji lipidów oraz aktywność APX i zawartość askorbinianu. Stwierdzono, że kadm działa toksycznie na wzrost ogórka, przyczyniając się do zahamowania wzrostu pędów i korzeni. Uzyskane wyniki potwierdziły badania przeprowadzone przez Bednarka i in. (2007) oraz Badorę i Kozłowską-Strawską (2011). W wyniku oddziaływania Cd na siewki ogórka stwierdzono również zahamowanie syntezy chlorofilu a i karotenoidów. Zmiany zawartości barwników asymilacyjnych mają niewątpliwie wpływ na asymilację CO 2 (Kintake, Terashima 1994; Parmar i in. 2013). Spadek zawartości białek pod wpływem metalu ciężkiego, a przypuszczalnie ich degradacja jest związana z silnym powinowactwem metali do grup karboksylowych, tiolowych i histydylowych białek, co również może wpływać na zahamowanie fotosyntezy. Jak przypuszczamy, zmniejszona wydajność tego procesu przyczynia się do obniżenia zawartości monosacharydów w roślinach, ponieważ Cd zaburza prawidłowe funkcjonowanie enzymów biorących udział w metabolizmie cukrów (Hossian i in. 2012). Zwiększona aktywność APX i wzrost zawartości askorbinianu oraz PC świadczy o aktywacji mechanizmów obronnych w roślinie poddanej działaniu Cd (Rucińska-Sobkowiak 2010); prawidłowość tę również stwierdzono w wyniku przeprowadzonych badań własnych. Wykazano także podwyższenie zawartości nadtlenku wodoru (H 2 O 2 ) i dialdehydu malonowego (MDA), który jest wskaźnikiem peroksydacji lipidów błonowych w komórkach roślinnych. Świadczy to o występującym w roślinach stresie oksydacyjnym wywołanym oddziaływaniem Cd na siewki ogórka, przyczyniającym się do powstania wcześniej wymienionych zmian (Rucińska-Sobkowiak 2010). Badania wykazały także, że JA ma wpływ na wzrost pędów i korzeni zależnie od stężenia oraz na zawartość chlorofilu a, karotenoidów, białek, monosacharydów w siewkach ogórka traktowanego Cd. Fitohormon ten pełni kluczową rolę w odpowiedzi roślin na zmieniające się warunki środowiska, jak również bierze czynny udział w odpowiedzi na stres, który w badanym przypadku wywołany jest obecnością Cd (Jarecka-Boncela, Saniewska 2011). JA w stężeniu 10-8 M wpływał stymulująco na zwiększenie zawartości związków biorących udział w zmniejszeniu objawów stresu oksydacyjnego u roślin oraz obniżał zawartość H 2 O 2 i MDA. Stwierdzono również wzrost długości pędów i korzeni u roślin traktowanych 10-8 M JA, podczas gdy JA w wyższych stężeniach (10-7 -10-5 M) nie działał. Podobne wyniki uzyskano w przypadku zawartości chlorofilu a, karotenoidów oraz monosachary- 30

dów. Rakwal i Komatsu (2002) wykazali, że jasmoniany biorą udział w indukowaniu syntezy specyficznych białek (ang. jasmonate-induced-protein), regulując ich transkrypcję i translację. Badania własne wykazały, że mieszanina 10-8 M JA i 10-4 M Cd działa stymulująco na akumulację białek w pędach ogórka. Prawdopodobnie JA, będąc przekaźnikiem informacji między sygnałem stresowym a reakcją stresową (Frankowski i in. 2009), wzmacnia procesy odpornościowe roślin na toksyczne działanie Cd u ogórka, stymulując aktywność APX, zawartość PC oraz kwasu askorbinowego. Stwierdzono, że JA w niskich stężeniach wspomaga procesy detoksykacji metali ciężkich w komórkach roślin, stymulując syntezę PC metalotiolowych polipeptydów. Rola PC w detoksyfikacji metali polega na ich wiązaniu w kompleksy, dzięki czemu grupy tiolowe oraz histydylowe białek komórkowych są chronione przed oddziaływaniem z metalami. Kompleksy PC-metal są następnie transportowane do wakuoli, gdzie metal ulega oddzieleniu od pozostałych organelli komórkowych i poprzez to unieszkodliwieniu (Baranowska-Morek 2003; Bajguz, Piotrowska-Niczyporuk 2012; Hossian i in. 2012). Wyższe stężenia JA nie wykazywały działania na siewki ogórka rosnące w obecności Cd, które charakteryzowało się zmniejszoną syntezą substancji, takich jak askorbinian, karotenoidy, biorących udział w mechanizmach obronnych oraz zwiększoną akumulacją H 2 O 2 i peroksydacją lipidów. JA jest efektywną cząsteczką sygnałową, regulującą ekspresję genów uczestniczących w odpowiedzi roślin na stres abiotyczny. Badania przeprowadzone na Arabidopsis thaliana wskazują, iż jasmonian metylu stymuluje ekspresję genów kodujących PC, uczestniczących w detoksykacji metali ciężkich, co w efekcie zwiększa tolerancję roślin na obecność Cu i Cd (Maksymiec i in. 2007). Ponadto Xiang i Oliver (1998) wykazali, że u siewek A. thaliana traktowanych JA, zwiększa się aktywność enzymów uczestniczących w szlaku biosyntezy glutationu, który jest prekursorem PC, zwiększając w ten sposób tolerancję roślin na obecność toksycznych metali w środowisku. Współdziałanie między tym fitohormonem i metalami ciężkimi potwierdzają dane uzyskane przez Agrawal i in. (2003), wskazujące, że gen kodujący kinazę MAP indukowaną przez JA w ryżu (OsBWMK1), uczestniczącą w odpowiedzi na czynniki stresowe, jest stymulowany przez obecność takich metali jak Cu, Cd i rtęć. Prawdopodobnym mechanizmem działania JA u roślin traktowanych metalami ciężkimi, jest również rola tego fitohormonu w aktywacji antyoksydacyjnych mechanizmów naprawczych. Wcześniejsze badania wykazały, że JA zwiększa aktywność APX, katalazy i peroksydazy zależnej od NADH w kulturach Wolffia arrhiza poddanych działaniu Pb (Piotrowska i in. 2009). Dzięki temu JA zmniejsza toksyczność Pb poprzez obniżenie zawartości reaktywnych form tlenu oraz stopnia oksydacyjnych uszkodzeń lipidów i białek wywołanych przez stres 31