Wykorzystanie modelowania molekularnego oddziaływań ligandów z receptorem nikotynowym jako wstępny etap projektowania nowych leków Katarzyna Targowska-Duda Samodzielna Pracownia Chemii i Neuroinżynierii Medycznej, Uniwersytet Medyczny w Lublinie Wstęp Receptor nikotynowy (nicotinic acetylcholine receptor nachr) jest białkiem błonowym należącym do rodziny kanałów bramkowanych ligandami (Ligand Gated Ion Channels). Aktywacja receptora następuje na skutek przyłączenia liganda (cząsteczki leku czy innej aktywnej substancji chemicznej) i prowadzi to do zmian konformacyjnych w strukturze białka, otwierania kanału jonowego i przepływu jonów sodu, potasu czy wapnia. Receptory nikotynowe odpowiadają za proces szybkiej transmisji w układzie nerwowym na skutek przetworzenia sygnału chemicznego na sygnał elektryczny, a ich rola jest bardzo istotna dla zachowania homeostazy i prawidłowego funkcjonowania organizmu. Receptory nikotynowe są silnie zaangażowane w procesy poznawcze (pamięć, uwagę), odczuwanie bólu, skurcze mięśni, angiogenezę a także odpowiedź immunologiczną [1]. Zaburzenie funkcji przekaźnictwa cholinergicznego prowadzi do wielu schorzeń, m. in. choroby Alzheimera, Parkinsona, schizofrenii, ADHD, syndromu Tourette, rozwoju uzależnienia, depresji czy chorób o podłożu immunologicznym i zapalnym. Receptory nikotynowe mają strukturę pentameryczną. Heteropentamery zbudowane są z różnych kombinacji genetycznie odmiennych podjednostek α(1-10), β(1-4), γ, δ i ε. Homopentamery tworzone są przez jednakowe podjednostki (α7, α8, α9). Podtypy receptorów możemy podzielić na mięśniowe (obecne w synapsach nerwowo-mięśniowych) lub neuronalne (w ośrodkowym układzie nerwowym), co wiąże się z ich różnymi profilami działania farmakologicznego. Rodzaj podtypu neuronalnego receptora decyduje o rozmieszczeniu w różnych strukturach ośrodkowego układu nerwowego (α3β4 i α4β2- obecne są w mezolimbicznym układzie nagrody, szczególnie w nakrywce brzusznej- ventral tegmental area (VTA), korze przedczołowej, jądrze półleżącym; α7- w substancji czarnej oraz VTA) [2]. Podtypy te odgrywają ważną rolę w rozwoju zaburzeń kognitywnych, schizofrenii czy uzależnień. W ciągu ostatnich sześćdziesięciu lat liczba doniesień naukowych świadczących o istotności receptorów nikotynowych dla funkcjonowania naszego organizmu stale rośnie. Rys. 1. Struktura receptora nikotynowego, podtypu α3β4. Pięć podjednostek oznaczonych kolorem czerwonym jest ułożonych wokół centralnie położonego kanału jonowego; receptor jest białkiem błonowym, część transmembranowa (przezbłonowa) znajduje się w błonie fosfolipidowej oznaczonej kolorem niebieskim; część zewnątrzkomórkowa znajduje się nad błoną, natomiast pod błonączęść wewnątrzkomórkowa; miejsca wiążące neurotransmiter- ACh oznaczone są strzałkami. Podstawą terapeutycznego działania każdego leku jest oddziaływanie cząsteczek jego substancji czynnej z celami molekularnymi odgrywającymi znaczącą rolę w prawidłowym funkcjonowaniu organizmu. Celami molekularnymi są najczęściej białka a mechanizm działania cząsteczek leku polega na oddziaływaniach z miejscami aktywnymi białek i pozytywnej bądź negatywnej modulacji prowadzącej do przesuwania dynamicznej
równowagi między ich konformacją aktywną a nieaktywną. W tym świetle istotne jest poznanie molekularnego mechanizmu oddziaływania cząsteczki leku (liganda) z białkiem docelowym (receptorem). Dogłębna analiza oddziaływań znanych substancji czynnych będących już lekami pozwoli na poszukiwanie nowych związków charakteryzujących się większym powinowactwem czy bardziej selektywnych wobec danego celu molekularnego. Aktywność receptorów nikotynowych może być modulowana pozytywnie jak również negatywnie w zależności od pożądanego efektu farmakologicznego. Etap aktywacji następuje na skutek przyłączenia endogennej acetylocholiny do specyficznych dla niej miejsc ortosterycznych (Rys. 1. i Rys. 3.). Pozytywna modulacja allosteryczna receptorów nikotynowych ma związek ze stabilizowaniem konformacji otwartej kanału, po związaniu cząsteczki modulatora (agonisty) do miejsca innego niż dla endogennego neuroprzekaźnika. Prowadzi to do zwiększenia odpowiedzi na innych agonistów i utrzymania receptora w konformacji otwartej. Hamowanie przepływu jonów przez kanał receptora poprzez blokowanie jego światła nazywamy negatywną modulacją allosteryczną aktywności receptora, a grupę modulatorów niekompetycyjnymi (allosterycznymi) inhibitorami [3]. Do znanych agonistów nachr należą m. in.: endogenna acetylocholina, epibatydyna, nikotyna i karbamylocholina. Antagonistami mogą być -bungarotoksyna, -konotoksyna, które blokują miejsca ortosteryczne lub mekamylamina będąca inhibitorem allosterycznym wiążącym się do kanału jonowego receptora. Uzależnienia, choroby neurodegeneracyjne oraz zaburzenia depresyjnie należą do jednych z najbardziej powszechnych schorzeń współczesnych, szczególnie istotnych w społeczeństwach rozwiniętych. Dużym sukcesem terapeutycznym byłoby opracowanie skutecznej terapii leczenia uzależnienia (m.in. nikotynizmu). Palenie tytoniu jest na świecie przyczyną prawie 4 milionów zgonów rocznie. Oznacza to, że z powodu tzw. chorób odtytoniowych umiera dziennie 11 tysięcy palaczy. Uzależnienie jest złożoną chorobą ośrodkowego układu nerwowego charakteryzującą się utratą kontroli oraz prowadzącą do przymusowego ciągłego lub okresowego poszukiwania i przyjmowania substancji uzależniającej w celu doświadczania psychicznych skutków jej działania lub uniknięcia nieprzyjemnych objawów związanych z jej brakiem. Uzależnienie jest zaburzeniem chronicznym, z nawrotami pojawiającymi się nawet po bardzo długim okresie abstynencji. Istnieje grupa substancji czynnych, działających na receptor nikotynowy, które pomagają np. w walce z nałogiem nikotynowym, m. in. cytyzyna (Tabex)- agonista, bupropion (Zyban) czy mekamylamina (Inversine)- antagoniści. Na duże znaczenie zasługuje grupa analogów ibogainy, których działanie zdaje się być znaczące w poszukiwaniu negatywnych modulatorów (inhibitorów) receptora nikotynowego a jednocześnie nowych, bezpieczniejszych substancji aktywnych w terapii uzależnień. Badania in vivo na szczurach wykazały, że pochodna ibogainy, 18-metoksykoronarydyna (18-MC) zmniejsza samopodawanie substancji uzależniających (metamfetaminy, morfiny i nikotyny) oraz pojawianie się innych efektów ubocznych w teście samopodawania (self-administration) u szczurów. Jej właściwości farmakologiczne mogłyby stać pomocne w walce z uzależnieniem [4]. Niezwykle istotne jest znalezienie nowych, bardziej skutecznych leków pomocnych w leczeniu schorzeń układu nerwowego charakteryzujących się upośledzeniem pamięci i funkcji poznawczych (choroba Alzheimera czy Parkinsona). Choroba Alzheimera jest bardzo poważnym problemem dotykającym nie tylko osoby w wieku podeszłym, ale także osoby młode. W Polsce odnotowano ok. 200 tysięcy przypadków zachorowań. Na całym świecie jest około 30 mln osób chorych. Leki, jakimi obecnie dysponujemy pozwalają jedynie na hamowanie objawów choroby. Poszukiwanie i projektowanie nowych modulatorów allosterycznych receptora nikotynowego jest dużą nadzieją na poprawę funkcji poznawczych u osób chorych, a to znacznie ulepszy ich funkcjonowanie w społeczeństwie.
Metody badawcze Obecnie obok technik eksperymentalnych stosuje się techniki komputerowe aby lepiej zrozumieć mechanizmy oddziaływania leków z białkami. W celu określenia miejsca wiązania potencjalnego leku oraz powinowactwa wiązania (binding affinity) względem różnych podtypów receptora nikotynowego wykorzystywane są symulacje dokowania molekularnego dla różnych grup badanych związków. Polega to na odpowiednim dopasowaniu przestrzennym cząsteczki liganda do miejsca wiążącego w białku dzięki zastosowaniu odpowiednich algorytmów obliczeniowych. Jako wynik dokowania otrzymujemy różne wartości energii przyporządkowane kompleksom ligand receptor oraz możemy dokonać wizualizacji i interpretacji poszczególnych oddziaływań cząsteczki z miejscem wiążącym białka. Bardzo ważna jest znajomość struktury przestrzennej białka jak również badanych cząsteczek ligandów. Modele receptora nikotynowego Jednym z pierwszych kroków przed przeprowadzeniem dokowania jest przygotowanie odpowiednich modeli białek oraz zbudowanie struktur molekularnych ligandów. Receptor nikotynowy należy do białek transbłonowych. W związku z zakotwiczeniem w błonie białka te mają specyficzną budowę, ich hydrofobowe regiony -helikalne oraz - wstęgi tworzące -baryłkę przeplatają się z hydrofilowymi elementami. Przewidywanie struktury białek metodą modelowania homologicznego jest używane do przygotowywania wybranych modeli i jest oparte na wykorzystaniu białka o znanej strukturze, które posłuży jako szablon dla nowego modelu. Tą techniką zostały przygotowane modele różnych podtypów neuronalnych i mięśniowych kanału jonowego receptora (części transmembranowej), a jako model wzorcowy został użyty model molekularny Torpedo AChR znajdujący się w bazie danych PDB (Protein Data Bank), oznaczony kodem 2BG9. Rys. 2. Model molekularny kanału jonowego podtypu α3β4, widok z góry. Część kanału zaznaczona na zielono jest zbudowana z reszt aminokwasowych oddziałujących z badanymi ligandami. Reszty aminokwasowe zaznaczone na niebiesko są bardzo istotne dla oddziaływań z badanymi ligandami. Modele różnych podtypów neuronalnych receptora nikotynowego dla części zewnątrzkomórkowej zostały wykonane także w oparciu o modelowanie przez homologię z wykorzystaniem różnych modeli wzorcowych: 2BYQ, 2BYR, 2UZ6, 1UV6. Rys. 3. Model części zewnątrzkomórkowej receptora podtypu α3β4, widok z góry. Miejsca wiążące neurotransmiter acetylocholinę znajdują się między podjednostkami α3 (zaznaczone na różowo) oraz β4 (zaznaczone na niebiesko).
Kolejnym krokiem jest przygotowanie badanych cząsteczek. Wszystkie struktury ligandów (neutralne, bez ładunku) wykorzystane do modelowania molekularnego zostały zbudowane w programie HyperChem 6.0, optymalizacja struktur była wykonana z wykorzystaniem metody półempirycznej AM1 [4, 5, 6]. Symulacje dokowania molekularnego możemy wykonać przy użyciu różnych specjalistycznych programów np. Molegro Virtual Docker, AutoDock, Glide (Schrodninger), Gold, Yasara. W zależności od wybranego programu należy odpowiednio przygotować model białka, cząsteczkę liganda a następnie wybrać miejsce wiążące, do którego chcielibyśmy zadokować badany związek. Wyniki otrzymujemy w postaci wartość liczbowej energii wiązania dla kompleksów ligandreceptor oraz możemy dokonać analizy oddziaływań ligand receptor. Grupa substancji aktywnych (allosterycznych inhibitorów) względem różnych podtypów receptora nikotynowego Przeprowadzono modelowanie molekularne oddziaływań analogów ibogainy z modelem Torpedo AChR. Analogi ibogainy: 18-metoksykoronatydyna (18-MC), 2-metoksyetylo-18- metoksykoronarydyna (2-ME-18-MC), 18-metylaminokoronarydyna (18-MAC), albifloranina i 19-ibogaminol [6]. Do badań wykorzystany był także znany allosteryczny inhibitor receptora nikotynowego fencyklidyna (PCP), TCP (analog PCP), ibogaina oraz [ 3 H]ibogaina oraz [ 3 H]TCP [5, 6]. Badania eksperymentalne Badania eksperymentalne stanowią ważny punkt rozwoju nauki, pozwalający na weryfikację hipotez stawianych przez naukowców. W ostatnich latach nastąpił dynamiczny rozwój w dziedzinie proteomiki czyli działu zajmującego się badaniem struktury i funkcji białek. Istnieje wiele metod pozwalających doświadczalnie wyznaczyć aktywność nowych substancji, potencjalnych leków względem objętych zainteresowaniem badacza celów molekularnych. Na dużą uwagę zasługują eksperymenty z wykorzystaniem radioligandów (znakowanych trytem) oraz wyznaczaniem zmiany stężenia wewnątrzkomórkowego Ca 2+. Grupa badaczy pod kierownictwem dr H. Arias a z Midwestern University wyznaczyła stałą powinowactwa badanych analogów ibogainy względem podtypu ludzkiego, mięśniowego receptora nikotynowego oraz zmiany stężenia Ca 2+ w komórce (IC 50 ) po podaniu analogów ibogainy i po wcześniejszej aktywacji agonistą epibatydyną [4, 5, 6]. Eksperymenty wyznaczenia stężenia Ca 2+ w komórce oraz badania z radioizotopami zostały przeprowadzone z wykorzystaniem komórek lini HEK293 stabilnie transfekowanej genami α3 i β4 nachr [5].oraz linii komórek TE671 transfekowanej genami na podtyp mięśniowy ludzki AChR ( i [4, 6]. Badania eksperymentalne z radioligandami były wykonane na komórkach gdy receptor był zarówno w stanie zdesensytyzowanym, otwartym (po aktywacji agonistą karbamylocholiną) jak również stanie spoczynkowym, zamkniętym (po związaniu antagonisty -bungarotoksyny). Wyniki symulacji dokowania molekularnego Wyniki dokowania dla analogów ibogainy i modelu Torpedo AChR Wyniki energii kompleksów otrzymanych w Molegro Virtual Docker dla analogów ibogainy i modelu ludzkiego mięśniowego kanału jonowego receptora nikotynowego przedstawia Tabela 1.
Analogi ibogainy Wartość energetyczna [kj/mol] model Torpedo AChR Ibogaina -92.7 18-MC -113.8 2-ME-18MC -137.0 19-ibogaminol -93.0 Albifloranina -107.3 Katarantyna -101.2 18-MAC -114.2 Tabela 1. Wartość energetyczna dla kompleksów analogów ibogainy z modelem Torpedo AChR. Rys. 4. Kompleks o najlepszej energii analogu ibogainy 18-MAC (kolor niebieski) oraz modelu Torpedo AChR; helisy budujące kanał jonowy zaznaczone są kolorem żółtym, a na niebiesko są zaznaczone ważne reszty aminokwasowe (VAL, LEU, SER) przy oddziaływaniu z 18 MAC. Wyniki modelowania molekularnego oddziaływań ibogainy i modelu α3β4 nachr Wyniki symulacji dokowania (Molegro Virtual Docker), przedstawione w Tabeli 2. pokazują, że miejsce wiążące dla obu ligandów jest jednakowe, ale powinowactwo wiązania (binding affinity) do receptora jest większe dla ibogainy. Nazwa liganda α3β4 nachr model [kj/mol] Ibogaina -97.2 Fencyklidyna (PCP) -87.0 Tabela 2. Wartości energetyczne dla kompleksów ibogainy i PCP z modelem α3β4 nachr Rys. 5. Miejsce wiążące dla ibogainy (oznaczonej na zielono) oraz PCP (oznaczonej na różowo) w kanale jonowym modelu α3β4 receptora nikotynowego; helisy tworzące kanał jonowy zaznaczone są na żółto, ważne reszty aminokwasowe (PHE/VAL, LEU, SER) na niebiesko.
Wyniki badań eksperymentalnych Wpływ ibogainy i febcyklidyny(pcp) na aktywację α3β4 nachr wywołaną epibatydyną z wykorzystaniem oznaczania wewnatrzkomórkowego stężenia Ca 2+. Epibatydyna indukuje aktywność, która jest blokowana przez ibogainę z IC 50 9-krotnie niższym, co oznacza wyższe powinowactwo do receptora niż wyznaczone dla znanego inhibitora allosterycznego kanału PCP [5]. Wpływ ibogainy na aktywację α3β4 nachr w obu stanach konformacyjnych receptora z wykorzystaniem [ 3 H]ibogainy i [ 3 H]TCP. Oba ligandy hamują 100% specyficzne wiązanie znakowanej ibogainy i inhibitora TCP (będącego analogiem PCP) do receptora w obu stanach konformacyjnych. Symulacje komputerowe pokazują, że ibogaina i fencyklidyna (której analogiem jest TCP) mają to samo miejsce wiązania w kanale jonowym receptora (Rys. 5.) [5]. Wpływ analogów ibogainy na aktywację ludzkiego mięśniowego nachr oznaczania wewnatrzkomórkowego Ca 2+ w komórce. Wartości inhibicji IC 50 są przedstawione zgodnie z rosnącą stałą powinowactwa do receptora (czyli malejącą aktywnością) [6]. 18-MAC (5,9 +/- 0,3) > ibogaina (17+/ 3) ~ katarantyna ( 20+/- 1) > albifloranina (46+/-13) [6]. Wyniki wyznaczonej stałej powinowactwa ze znakowanym wzorcowym allosterycznym inhibitorem- [ 3 H]TCP. Aktywności wyznaczono dla dwóch stanów konformacyjnych receptora zdesensytyzowanego oraz spoczynkowego. W stanie zdesensytyzowanym receptora aktywność poszczególnych analogów jest przedstawiona zgodnie z rosnącą stałą powinowactwa: 18-MAC (1,3 +/- 0,2) ~ 2-ME-18-MC (1,3 +/- 0,1) > albifloranina (3,2 +/-0,3) ~ katarantyna (3,2 +/- 0,4) > ibogaina (5,4 +/- 0,3) >>19- ibogaminol (40 +/- 2) [6]. W stanie spoczynkowym: 18-MAC (19 +/- 2) > albifloranina (31 +/-4) > katarantyna (48 +/- 5) > 2-ME-18-MC (82 +/- 8) [6]. Wyniki te wyraźnie wskazują na znacznie wyższe powinowactwo analogów ibogainy względem receptora będącego w stanie zdesensytyzowanym niż w stanie spoczynkowym. Wyniki zależności budowy od aktywności (pki) wyznaczonej względem modelu ludzkiego mięśniowego AChR dla analogów ibogainy. Zależność powinowactwa (pki) od objętości molekularnej (vdw) dla analogów ibogainy względem mięśniowego, ludzkiego podtypu receptora nikotynowego przedstawia Rys. 6. Ligandy o objętości znacząco większej od 345 Å 3 są zbyt duże i nie pasują do miejsca wiążącego (2-ME-18-MC). Pozwala to na stwierdzenie jak ważną cechą jest wielkość cząsteczki potencjalnego leku i jak duży ma to wpływ ma na powinowactwo do danego receptora [6]. Rys. 6. Zależność powinowactwa (pki) wyznaczonego dla analogów ibogainy od objętości molekularnej cząsteczek. Oznaczenie symboli: 18-MC ( ), 18-MAC (O), albifloranina ( ), katarantyna ( ), 19-ibogaminol ( ), ibogaina (Δ) oraz 2-ME-18- MC ( ). Linia ciągła pokazuje zależność pki dla receptora w stanie zdesensytyzowanym, wartość R=0,960, p=0,010, natomiast linia przerywana przedstawia zależność dla receptora jest w stanie spoczynkowym, R=0,989, p=0,001.
Korelacje danych eksperymentalnych (powinowactwa pki) oraz wyników dokowania dla analogów ibogainy i modelu Torpedo receptora nikotynowego. Rys. 7. Zależność powinowactwa (pki) wyznaczonego dla analogów ibogainy od wartości energii (MolDockScore). Oznaczenie symboli: 18-MC ( ), 18-MAC (O), albifloranina ( ), katarantyna ( ), 19-ibogaminol ( ), ibogaina (Δ) oraz 2-ME-18- MC ( ). W stanie zdesensytyzowanym (ciągła linia) wartość R= -0,833, p= 0,039, w stanie spoczynkowym (przerywana linia) R= -0,887, p=0.019. Korelacja zależności funkcji MolDockScore otrzymanej z symulacji dokowania molekularnego dla analogów ibogainy i modelu Torpedo względem wartości powinowactwa (pki) dla receptora w stanie zdesensytyzowanym (des) i spoczynkowym (res) przedstawia Rys. 7. [6]. Wnioski Zastosowanie metod modelowania molekularnego pozwala na wyjaśnienie pewnych mechanizmów oddziaływania leków z białkami. W przypadku oddziaływań ibogainy i modelu neuronalnego α3β4 nachr symulacje komputerowe pozwoliły na wnikliwą analizę miejsca wiązania badanego liganda w kanale jonowym receptora (Rys. 5.). Ponadto potwierdziły wyniki eksperymentalne, dlaczego oba związki - PCP i ibogaina hamują w 100% specyficzne wiązanie znakowanej trytem ibogainy. Porównanie wyników eksperymentalnych z teoretycznymi otrzymanymi metodami modelowania molekularnego staje się bardzo istotne w analizie substancji czynnych, które mogą stać się potencjalnymi działającymi lekami. Analiza zależności struktury od aktywności (co przedstawia Rys. 6.) oraz zależności wyników dokowania od badań eksperymentalnych (Rys. 7.) pozwoliły na szczegółową analizę grupy analogów ibogainy. Otrzymane wyniki modelowania molekularnego oddziaływań tych związków z modelem Torpedo receptora nikotynowego wykazują wysoki poziom korelacji z badaniami eksperymentalnymi powinowactwa i są istotne statystycznie. Przedstawione przykłady oddziaływania molekularnego z receptorem nikotynowym pokazują jak znaczące mogą być badania komputerowe w początkowym etapie poszukiwania i projektowania nowych struktur chemicznych i jednocześnie jak ważna jest ich zależność z badaniami eksperymentalnymi. Wykorzystanie coraz wnikliwszych informacji o strukturze i funkcjach receptora nikotynowego mogą przyczynić się do zaprojektowania nowych, bardziej selektywnych substancji czynnych zarówno w kierunku uzależnienia jak i chorób neurodegeneracyjnych. W oparciu o nowo przygotowane modele przeprowadzone zostaną szczegółowe analizy komputerowe, które w przyszłości mogą odegrać kluczową rolę w nowych terapiach zaburzeń kognitywnych. Literatura
1. Arias H. R., Mousa S. A.: Angiogenesis modulation by nicotine and nicotinic ligands. J. Pediatr. Biochem. 2010, 1, 91-104. 2. Nashmi R., Lester H. A.: CNS localization of neuronal nicotinic receptors. J. Mol. Neurosci. 2006, 30 (1-2), 181-4. 3. Arias H.R.: Positive and negative modulation of nicotinic receptors. Adv. Protein Chem. Struct. Biol. 2010, 80, 153-203. 4. Arias H. R., Rosenberg A., Feuerbach D., Targowska-Duda K. M., Maciejewski R., Jozwiak K., R. Moaddel,, Glick S. D.,. Wainer I.W: Interaction of 18- methoxycoronaridine with nicotinic acetylcholine receptors in different conformational states. Biochim. Biophys. Acta - Biomembranes 2010, 1798 (6), 1153-1163. 5. Arias H. R., Rosenberg A., Targowska-Duda K. M., Feuerbach D., Yuan Y., Jozwiak K., Moaddel R., Wainer I. W.: Interaction of ibogaine with human α3β4-nicotinic acetylcholine receptors in different conformational states. Int. J. Biochem. Cell Biol. 2010, 42 (9), 1525-1535. 6. Arias H. R., Feuerbach D., Targowska-Duda K. M., Jozwiak K.: Structure-activity relationship of ibogaine analogs interacting with nicotinic acetylcholine receptors in different conformational states. Int. J. Biochem. Cell Biol. 2011, w druku.