A CASE OF SUICIDAL POISONING WITH CINNARIZINE

A CASE OF SUICIDAL POISONING WITH CINNARIZINE Rafa³ CELIÑSKI, Ma³gorzata ALBERT, Zofia OLSZOWY, Joanna KULIKOWSKA Chair and Department of Forensic Medicine, Medical Academy, Katowice ABSTRACT: The authors present a case of a suicidal poisoning with cinnarizine, a drug administered in peripheral, cerebral, and central nervous system circulatory disturbances. TLC, TLC+UV, HPLC-DAD, and LC/MS were used for chemo-toxicological analysis. KEY WORDS: Suicidal poisoning; Cinnarizine; Chemo-toxicological analysis; TLC; HPLC-DAD; LC/MS. Problems of Forensic Sciences, vol. LV, 23, 67 75 Received 17 October 23; accepted 3 November 23 INTRODUCTION Cinnarizine (1-Cinnamyl-4-diphenylmethyl-piperazine, molecular weight = 368.52) is a calcium channel antagonist. Blocking the influx of calcium ions into the interior of vascular smooth muscle cells of blood vessels, it has antihistaminic, cholinolytic, and spasmolytic activity within blood vessels. It also exerts an antiemetic and sedating effect. Cinnarizine improves blood flow in vessels of the inner ear and retina, and in peripheral vessels. It prevents motion sickness, e. g. seasickness. CH N N CH2CHCH Cinnarizine m = 368.5 ion = 369.1 m/z Fig. 1. The structural formula of cinnarizine. Cinnarizine attains peak concentrations in the organism 2 to 4 hours after oral administration (the plasma concentration after a therapeutic 5 mg dose is about.8 g/ml). Absorbed in the gastrointestinal tract, it undergoes metabolism in the liver and has a biological half-life of 3 to 6 hours. Cinnarizine is excreted in the urine and the faeces, partly in unchanged form. Cinnarizine is applied in peripheral circulation disturbances (Raynaud s syndrome, intermittent claudication, muscular contractions), vessel distur-

68 R. Celiñski, M. Albert, Z. Olszowy, J. Kulikowska bances within the central nervous system (e.g. in circulation disturbances of the vertebral-basal system), in ischaemia syndromes in ophthalmology, and helps in labyrinthine disorders (vertigo, tinnitus, nausea, vomiting), e.g. accompanying Meniere s disease. Cinnarizine enhances the sedative effect of central nervous system depressants, including sedative-hypnotics, anxiolytics and also alcohol. The most frequent dosage: 25 mg tablet three times daily (daily dosage 75 mg, the maximum recommended daily dosage should not exceed 15 mg) [5]. CASE HISTORY A 59-year-old woman was found dead on the floor of the hall in her flat. The woman was dressed. The flat was kept in good order. The activity of a third party was not ascertained. A search of the rooms and kitchen in the flat revealed cardiac, hypotensive, and analgesic drugs, including Enarenal, Tertensif, Digoxin, Propranolol, Preductal, Sectral, Cinnarizine, and Diclofenac. An autopsy was performed outside the Department of Forensic Medicine. No signs of external injury were revealed during the autopsy, but pathological changes within the circulatory system were observed. In the lumen of the trachea and bronchi a substantial quantity of vomit was found. About 3 white, partly softened tablets of 7 mm diameter were extracted out of the stomach. MATERIALS AND METHODS Blood, stomach with contents, liver, and kidney were secured for chemotoxicological investigations. The blood sample was examined for ethyl alcohol presence by GC and ADH methods. The chemo-toxicological analysis for drug presence encompassed: ethanolic eluent from a tablet fragment isolated from the stomach and extracts from aqueous solutions of a tablet at acid and alkaline ph; ethanolic extracts of blood, stomach contents and kidney obtained from a varied ph medium with the use of liquid-liquid extraction after previous hydrolysis and deproteinisation of biological material by ammonium sulphate methods according to Borkowski [2]. In screening examinations, the TLC method using silica gel G with a fluorescent marker, F 254 (Merck), was applied. Plates were developed with the following solvent systems: chloroform-acetone (9:1) and methanol-ammonia (99:1). Searched substance zones were visualised by means of mercuric ni-

A case of suicidal poisoning with cinnarizine 69 trate (I), Dragendorff s reagent, FeCl 3 + D, Marquis reagent, and Braton- Marshal reaction and developed chromatograms were observed under UV light [3, 4]. Thin-layer chromatography together with UV spectrophometric analysis and the LC/MS method were used for further identification. Quantification was done by the LC/MS method [1]. A Hitachi UV 2 was used in the spectrophotometric examinations. Fig. 2. The absorption curves of the cinnarizine standard and the eluent from TLC chromatogram zones with Rf. D:\Album M S\Cinnarizinum wz 3/ 17/ 3 12:17:32 RT:. - 4. 8 6 4 2 32.86 NL: 3.6E8 m/ z= 368.5-369.5 MS Cinnarizinu mwz 1.17 2.36 4.7 6.24 8.28 9.28 11.11 12.14 14.57 17.17 18.91 2.76 21.51 22.38 25.33 29.56 3.54 35.35 36.52 2 4 6 8 1 12 14 16 18 2 22 24 26 28 3 32 34 36 38 Time (min) Cinnarizinum wz#248 RT : 32.86 AV: 1 NL: 3.6E8 T: + c ESI Full ms [ 5.-7.] 369.1 8 6 4 37.1 2 99.5 167.3 21.2 234.2 278.7 354.4 371.1 453.9 489. 58.8 62. 646.6 666. 5 15 2 25 3 35 4 45 5 55 6 65 7 m/z Fig. 3. LC/MS results gained for the cinnarizine standard.

7 R. Celiñski, M. Albert, Z. Olszowy, J. Kulikowska D:\Ikwartal.23\3.23\Kaczorowska2 3/12/3 1:1:12 RT:. - 39.99 33.61 5 1.7 15.6 8 3.57 22.24 7.88 1.3 6 2 4.9 3 6.29 12.9 25.83 27.75 18.42 2 9.51 5.14 2.16 31.89 1. 35.31 37.27 1.1 5 33.52 3.77 3.96 1.91 23.81 6.86 13.3 14. 6 18.1 31.22 7.54 8.38 27.3 36.75 3.9 11.41 22.25 37.3 18.82 2 4 6 8 1 12 14 16 18 2 22 24 26 28 3 32 34 36 38 Time (min) NL: 3.38E7 m/ z= 368.5-369.5 MS Kaczorowsk a2 NL: 1.5 E8 TIC MS Kaczorowsk a2 Kaczorowska2#247 RT : 33.55 AV: 1 NL: 3.35E7 T: + c ESI Full ms [ 5.-7.] 369.1 8 6 4 37.1 2 167.3 74. 99.4 181.8 255.7 278.9 321.3 371.1 456.8 522.6 585.9 634.9 646.7 656.4 5 15 2 25 3 35 4 45 5 55 6 65 7 m/z Fig. 4. LC/MS results for the blood alkaline extract. D:\Ikwartal.23\3.23\Kaczorowska2 3/12/3 1:1:12 RT:. - 39.99 8 6 4 23.82 NL: 4.23E6 m/ z= 276.5-277.5 M S Kaczor ows ka2 3.13 2 3.37 24.91 1. 2.93 3.18 3.82 4.68 8.13 9.1 25.62 11.3 4 13.64 14.54 16.2 7 19.17 23.9 27.8 34.41 35.33 37.4 38.94 2 4 6 8 1 12 14 16 18 2 22 24 26 28 3 32 34 36 38 Time (min) Kaczorowska2#1718 RT : 23.91 AV: 1 NL: 9.96E6 T: + c ESI Full ms [ 5.-7.] 293.9 8 6 4 277. 574.8 2 322. 246.2 339.3 81.6 99.6 156.9 23. 369.9 445.6 494.1 569.5 575.9 61.2 685.3 5 15 2 25 3 35 4 45 5 55 6 65 7 m/z Fig. 5. The mass spectrum of the cinnarizine metabolite eluted from the TLC chromatogram zone (Rf = 8) obtained for the blood alkaline extract. LC/MS analysis was carried out with the use of Finnigan LQC Duo apparatus, equipped with a column of 125 mm length and 2.1 mm ID, with Hypersil BDS C-18 packing of 5 m grain diameter.

A case of suicidal poisoning with cinnarizine 71 Separation of compounds was achieved using a pump working in a gradient system with.2 ml/min flow of mobile phase made up of a.5-molar solution of ammonium formate buffered to ph = 3.5 with formic acid and a mixture of acetonitrile and a solution of ammonium formate of ph = 3.5 in a 9:1 ratio. Duration of analysis was 4 minutes. The compounds were identified by a mass detector (ion trap), using the electrospray ionisation (positive ions) method. Collision energy was in the range of 2 55%; and capillary temperature was 2 o C. The programme of the work of the pump was as follows: solution A:.5 M ammonium formate buffered with formic acid to ph = 3.5; solution B: acetonitrile-ammonium formate solution, ph = 3.5 (9:1). TABLE I. PUMP WORK PROGRAMME Time [min] Solution A [%] Solution B [%] 95 5 2 95 5 3 3 7 32 3 7 4 95 5 RESULTS Blood ethyl alcohol examination yielded a negative result. Cinnarizine was determined in the ethanolic extract and in the alkaline extract of a tablet isolated from stomach by the TLC method. The unchanged form of the drug and considerable amounts of its metabolites were observed in alkaline extracts from stomach contents and blood. Only cinnarizine metabolites were ascertained in the alkaline extract from kidney. In the ammonia-methanol (99:1) system, Rf 8. Dragendorff s reagent dyed the substances orange, whereas the reaction with Mandelin s reagent produced green spots. Analysis of the ether-acid and chloroform-alkaline extracts excluded the presence of drugs revealed in the flat of the deceased i.e. Enarenal, Tertensif, Digoxin, Propranolol, Preductal, Sectral, and Diclofenac, and also substances derived from amphetamine, barbituric acid, salicylic acid, bromoureides, pirazolon, sulfonamide, benzodiazepine, dibenzoazepine, and thioxanten. The examination did not reveal any of the following drugs either: Antineuralgine, Paracetamol, Noveril, Isoptin, Carbamazepine, Meprobra-

72 R. Celiñski, M. Albert, Z. Olszowy, J. Kulikowska mate, Methaqualone, Parkopan, and Dolantin, or alkaloids including opium, raubasine, cocaine, quinine, and strychnine. The absorption spectra for the substance with Rf ed the absorption curve of the cinnarizine standard with max = 251 nm, obtained under the same analytical conditions. Additional substances found in the biological extracts were acknowledged to be products of cinnarizine metabolism. Ions obtained as a result of fragmentation of the pseudomolecular ion with m/z = 369 had masses corresponding to those of ions observed in alkaline extracts of the stomach, blood, and kidney. The concentration of the unchanged form of cinnarizine in blood was 1.1 g/ml (the plasma cinnarizine concentration after a 5 mg dose is about.8 g/ml and is achieved after 2 4 h) [3]. 1. The applied analytical procedure allowed us to identify the unchanged form of cinnarizine in a tablet retrieved from the stomach and in biological material, and also to determine the quantity in the blood. 2. The LC/MS method, in particular fragmentation of the cinnarizine pseudomolecular ion, enabled us to ascertain that the additional substances found in the biological material are metabolites of cinnarizine. 3. The number of cinnarizine tablets in the deceased s stomach (about 3) and the blood concentration of the unchanged form of the drug, 1.1 g/ml, indicate that in this case the therapeutic dose was greatly exceeded. Since cinnarizine is a drug of low toxicity, in accordance with the autopsy, the cause of the death was aspiration of vomit, causing choking. However, one can not exclude the influence of the ingested cinnarizine dose on the course of the incident. References: 1. Bogusz M. J., Maier R. D., Krüger K. D.[et al.], Determination of common drugs of abuse in body fluids using one isolation procedure and liquid chromatography atmospheric-pressure chemical-ionization mass spectrometry, Journal of Analytical Toxicology 1998, vol. 22, pp. 549 558. 2. Borkowski T., Metoda wyosabniania trucizn organicznych z materia³u biologicznego, Archiwum medycyny s¹dowej i kryminologii 1968, t. 18, s. 95. 3. Clarcke s isolation and identification of drugs, The Pharmaceutical Press, London 1986. 4. D³u niewska A., Ka³a M., Schemat identyfikacji trucizn organicznych, w szczególnoœci leków, za pomoc¹ chromatografii cienkowarstwowej, Z zagadnieñ kryminalistyki 1975, z. X, s. 49 61. 5. Podlewski J. K., Chwalibogowska-Podlewska A., Leki wspó³czesnej terapii, Fundacja Büchnera, Warszawa 21.

PRZYPADEK SAMOBÓJCZEGO ZATRUCIA CYNARYZYN Rafa³ CELIÑSKI, Ma³gorzata ALBERT, Zofia OLSZOWY, Joanna KULIKOWSKA WSTÊP Cynaryzyna (1-cynamylo-4-difenylometylopiperazyna; masa cz¹steczkowa = 368,52) jest antagonist¹ kana³ów wapniowych. Hamuj¹c nap³yw jonów wapnia do wnêtrza komórek miêœni g³adkich naczyñ krwionoœnych, dzia³a przeciwhistaminowo, cholinolitycznie oraz spazmolitycznie w obrêbie naczyñ krwionoœnych. Wykazuje tak e dzia³anie przeciwwymiotne i uspokajaj¹ce. Cynaryzyna poprawia przep³yw krwi w naczyniach ucha wewnêtrznego, siatkówki i w naczyniach obwodowych. Zapobiega chorobie lokomocyjnej, np. morskiej. Cynaryzyna po podaniu doustnym najwiêksze stê enie w organizmie osi¹ga po 2 4 godzinach (jej stê enie w osoczu po dawce terapeutycznej 5 mg wynosi ok.,8 g/ml). Wchlaniana w o³¹dku i jelicie, ulega przemianie metabolicznej w w¹trobie; biologiczny okres pó³trwania cynaryzyny wynosi 3 6 godzin. Wydalana jest z moczem i ka³em, czêœciowo w postaci niezmienionej. Cynaryzyna stosowana jest w zaburzeniach kr¹ enia obwodowego (zespó³ Raynauda, chromanie przestankowe, skurcze miêœniowe); zaburzeniach naczyniowych w obrêbie oœrodkowego uk³adu nerwowego (np. w zaburzeniach kr¹ enia w uk³adzie krêgowo-podstawnym); w zespo³ach niedokrwiennych w okulistyce; pomocniczo w zaburzeniach b³êdnikowych (zawroty g³owy, szum w uszach, nudnoœci, wymioty), np. w zespole Meniere a. Cynaryzyna nasila dzia³anie leków wp³ywaj¹cych depresyjnie na oœrodkowy uk³ad nerwowy: uspokajaj¹co-nasennych, anksjolityków oraz alkoholu. Najczêœciej dawkowana jest 3 razy dziennie po 25 mg (dawka dobowa wynosi 75 mg, maksymalna dawka dobowa 15 mg) [5 ]. OPIS PRZYPADKU Zw³oki 59-letniej kobiety zosta³y znalezione w jej mieszkaniu na pod³odze w przedpokoju. Kobieta by³a ubrana. W mieszkaniu panowa³ ³ad. Nie stwierdzono dzia³ania osób trzecich. Podczas przeszukania pomieszczeñ pokojowych i kuchni znaleziono leki nasercowe i usprawniaj¹ce kr¹ enie oraz przeciwbólowe, jak: Enarenal, Tertensif, Digoxin, Propranolol, Preductal, Sektral, Cynaryzyna i Diklofenak. Sekcja zw³ok przeprowadzona by³a poza Zak³adem Toksykologii S¹dowo-Lekarskiej. Nie stwierdzono adnych obra eñ zewnêtrznych, ujawniono natomiast zmiany chorobowe w obrêbie uk³adu sercowo-naczyniowego, zaœ w œwietle tchawicy i oskrzeli du ¹ iloœæ treœci wymiotnej. Z o³¹dka denatki wydobyto oko³o 3 bia³ych, czêœciowo rozpulchnionych tabletek o œrednicy 7 mm.

74 R. Celiñski, M. Albert, Z. Olszowy, J. Kulikowska MATERIA I METODY Do badañ chemiczno-toksykologicznych zabezpieczono krew, o³¹dek z treœci¹, w¹trobê i nerkê. Badanie na obecnoœæ alkoholu etylowego przeprowadzono, analizuj¹c próbkê krwi metod¹ GC i ADH. Analiz¹ chemiczno-toksykologiczn¹ maj¹c¹ stwierdziæ obecnoœæ leków objêto: eluat etanolowy fragmentu tabletki wyosobnionej z o³¹dka oraz ekstrakty uzyskane z roztworów wodnych tabletki o ph kwaœnym i alkalicznym; etanolowe wyci¹gi krwi, treœci o³¹dkowej i nerki uzyskane na drodze ekstrakcji ciecz: ciecz ze œrodowiska o zró nicowanym ph po uprzedniej hydrolizie i odbia³czeniu materia³u biologicznego metod¹ siarczanowo-amonow¹ wg Borkowskiego [2 ]. W badaniach przesiewowych zastosowano metodê TLC na elu krzemionkowym G ze znacznikiem fluorescencyjnym F 254 firmy Merck. P³ytki rozwijano w uk³adach chloroform : aceton (9:1) i metanol : amoniak (99:1). Do wizualizacji stref szukanych substancji zastosowano odczynniki: azotan rtêci (I), odczynnik Dragendorffa, FeCl 3 + D, odczynnik Marquisa i reakcjê Bratona-Marshala oraz obserwacjê rozwiniêtych chromatogramów w œwietle ultrafioletowym [3, 4]. Do dalszej identyfikacji substancji wykorzystano chromatografiê cienkowarstwow¹ w po³¹czeniu z spektrofotometri¹ w œwietle UV oraz metodê LC/MS. Do oznaczeñ iloœciowych u yto metody LC/MS [1]. W badaniach spektrofotometrycznych zastosowano aparat firmy Hitachi UV 2. Analizê LC/MS przeprowadzono za pomoc¹ aparatu firmy Finnigan LCQ Duo wyposa onego w kolumnê o d³ugoœci 125 mm i o œrednicy 2,1 mm z wype³nieniem Hypersil BDS C-18 o œrednicy ziaren 5 m. Rozdzia³u zwi¹zków dokonano w systemie gradientowym pracy pompy przy przep³ywie fazy ruchomej z³o onej z,5-molowego roztworu mrówczanu amonu zbuforowanego do ph = 3,5 kwasem mrówkowym i mieszaniny acetonitrylu z roztworem mrówczanu amonu o ph = 3,5 w stosunku 9:1,,2 ml/min. Czas analizy wynosi³ 4 min. Zwi¹zki identyfikowano w detektorze mas (pu³apka jonowa), stosuj¹c metodê jonizacji dodatniej ESI (electrospray). Energia kolizji wynosi³a 2 55%, a temperatura kapilary 2 o C. Program pracy pompy by³ nastêpuj¹cy: roztwór A:,5 M mrówczan amonu zbuforowany kwasem mrówkowym do ph = 3,5; roztwór B: acetonitryl : roztwór mrówczanu amonu o ph = 3,5 (9:1). WYNIKI BADAÑ Badanie na obecnoœæ alkoholu etylowego we krwi da³o wynik ujemny. Metod¹ TLC wykazano obecnoœæ cynaryzyny w etanolowym wyci¹gu oraz ekstrakcie zasadowym tabletki wyjêtej z o³¹dka. Niezmienion¹ formê tego leku, jak i znaczne iloœci metabolitów, obserwowano w ekstraktach zasadowych z treœci o³¹dkowej i krwi. W ekstrakcie zasadowym z nerki stwierdzono jedynie obecnoœæ metabolitów cynaryzyny.

Przypadek samobójczego zatrucia cynaryzyn¹ 75 W uk³adzie: metanol : amoniak (99:1) Rf dla formy niezmienionej cynaryzyny wynosi³o 73, a dla metabolitu 8. Odczynnik Dragendorffa wybarwia³ substancje na pomarañczowo, w reakcji z odczynnikiem Mandelina uzyskano natomiast plamy o barwie zielonej. W ekstraktach eterowo-kwaœnych i chloroformowo-zasadowych wykluczono obecnoœæ leków zabezpieczonych w mieszkaniu denatki, tj. Enarenalu, Tertensifu, Digoxiny, Propranololu, Preductalu, Sektralu i Diklofenaku, a tak e substancji z grupy pochodnych amfetaminy, kwasu barbiturowego, kwasu salicylowego, bromoureidów, pyrazolonu, sulfonoamidu, benzodiazepiny, dibenzoazepiny i tioksantenu. Nie stwierdzono równie obecnoœci nastêpuj¹cych leków: Antyneuralginy, Paracetamolu, Noverilu, Izoptinu, Karbamazepiny, Meprobamatu, Metaqualonu, Parkopanu i Dolantyny, a tak e alkaloidów: opium, rauwolfii, kokainy, chininy i strychniny. Sporz¹dzone widma absorpcji dla substancji o Rf = 73 wystêpuj¹cej w eluacie z tabletki, ekstrakcie zasadowym tabletki i ekstrakcie zasadowym treœci o³¹dkowej wyeluowanej za pomoc¹,5 N H 2 SO 4 z chromatogramu cienkowarstwowego mia³y kszta³t i przebieg zgodny z krzyw¹ absorpcji wzorcowej cynaryzyny o max = 251 nm uzyskan¹ w tych samych warunkach analitycznych. Czas retencji (t = 33 min) dla substancji wystêpuj¹cej w eluacie etanolowym tabletki i jej ekstrakcie zasadowym oraz w ekstraktach zasadowych treœci o³¹dkowej i krwi by³ zgodny z czasem retencji cynaryzyny. Uzyskany jon pseudomolekularny o masie m/z = 369 wystêpuj¹cy w badanym materiale by³ taki sam, jak uzyskany w wyniku jonizacji wzorcowej cynaryzyny. Wystêpuj¹ce w ekstraktach biologicznych dodatkowe substancje uznano jako produkty przemiany metabolicznej cynaryzyny. Otrzymane w wyniku fragmentacji jonu pseudomolekularnego m/z = 369 jony mia³y masy odpowiadaj¹ce masom jonów obserwowanych w ekstraktach zasadowych o³¹dka, krwi i nerki. Stê enie niezmienionej formy cynaryzyny we krwi wynosi³o 1,1 g/ml (stê enie cynaryzyny w osoczu po dawce terapeutycznej 5 mg wynosi ok.,8 g/ml i osi¹gane jest po 2 4 h) [3]. PODSUMOWANIE 1. Zastosowana procedura analityczna pozwoli³a na identyfikacjê formy niezmienionej cynaryzyny w tabletce wydobytej z o³¹dka i w materiale biologicznym oraz na oznaczenie iloœciowe we krwi. 2. Metoda LC/MS, a zw³aszcza przeprowadzenie fragmentacji jonu pseudomolekularnego cynaryzny, umo liwi³a stwierdzenie, e dodatkowe substancje w materiale biologicznym to metabolity cynaryzyny. 3. Liczba tabletek cynaryzyny w o³¹dku denatki (ok. 3 sztuk) oraz wykazane w jej krwi stê enie formy niezmienionej leku 1,1 g/ml wskazuj¹, i dawka terapeutyczna cynaryzyny zosta³a w tym przypadku znacznie przekroczona. Poniewa cynaryzna jest lekiem ma³o toksycznym, zgodnie z wynikiem badania sekcyjnego przyczyn¹ zgonu denatki by³o zach³yœniêcie siê treœci¹ wymiotn¹, powoduj¹ce uduszenie. Nie mo na jednak wykluczyæ wp³ywu przyjêtej dawki cynaryzny na przebieg zdarzenia.