CHROMATOGRAFICZNA ANALIZA POZOSTAŁOŚCI HORMONALNYCH STYMULATORÓW WZROSTU W TKANKACH ZWIERZĘCYCH

Transkrypt

1 CHROMATOGRAFICZNA ANALIZA POZOSTAŁOŚCI HORMONALNYCH STYMULATORÓW WZROSTU W TKANKACH ZWIERZĘCYCH AUTOR: Barbara Woźniak PROMOTOR: prof. dr hab. Bolesław Wojtoń RECENZENCI: prof. dr hab. Jan Żmudzki, prof. dr hab. Jan Uradziński STRESZCZENIE Skuteczna kontrola pozostałości hormonów anabolicznych w tkankach zwierzęcych jest możliwa dzięki ciągłemu rozwijaniu nowych metod analitycznych oraz doskonaleniu istniejących. W przedstawionej pracy zaprezentowano kolejne etapy badań, które podjęto przy opracowaniu i walidacji metod oznaczania hormonów anabolicznych w próbkach pochodzenia zwierzęcego. Na wstępie pracy scharakteryzowano trzy grupy hormonalnych stymulatorów wzrostu: stilbenów, steroidów oraz zeranolu. Opisane zostały ich właściwości fizykochemiczne, mechanizm działania, metabolizm. Omówiono również toksyczność hormonów, a w szczególności zwrócono uwagę na ich kancerogenne i mutagenne właściwości. Nakreślono też problem obecności hormonów w żywności pochodzenia zwierzęcego oraz występowania pozostałości hormonów naturalnych i syntetycznych w tkankach zwierzęcych, które mogą być następstwem implantacji zwierząt, jak też nielegalnego stosowania hormonów w celach anabolicznych. Przedstawiono też zasady kontroli pozostałości hormonów obowiązujące w krajach UE oraz kwestie związane z interpretacją wyników. Na podstawie dostępnego piśmiennictwa przeanalizowano opublikowane metody oznaczania hormonów w próbkach biologicznych i opisano nowe trendy w analityce tych związków. W dalszej kolejności zaprezentowano aktualne wymagania analityczne dla metod potwierdzających, zasady ich walidacji oraz kryteria oceny wyników. W części doświadczalnej pracy główny nacisk położono na optymalizację warunków detekcji hormonów, sposób ekstrakcji analitów z matrycy, dobór warunków oczyszczania ekstraktów oraz przeprowadzania hormonów w lotne pochodne.

2 Wyniki badań optymalizacyjnych wykorzystano do opracowania skryningowej, wielokierunkowej metody HPLC- DAD oznaczania hormonów w próbkach biologicznych oraz czterech procedur potwierdzających opartych na chromatografii gazowej ze spektrometrią mas z pojedynczym kwadrupolem do oznaczania stilbenów i steroidów w próbkach moczu, mięśni i mleka, octanu medroksyprogesteronu w tkance tłuszczowej zwierząt oraz 17β- estradiolu i testosteronu w surowicy bydlęcej. Zastosowanie chromatografii cieczowej z detektorem diodowym do celów skryningowych podyktowane było tym, że jest to metoda tańsza w porównaniu z technikami spektrometrii mas, daje sposobność identyfikacji badanych związków poprzez rejestrację ich widm w UV i umożliwia wykrywanie wielu związków jednocześnie, co jest jej dodatkowym atutem. Analizę hormonów: dietylostilbestrolu, dienestrolu, heksestrolu, 19- nortestosteronu, trenbolonu, zeranolu prowadzono na chromatografie cieczowym HP1100 z detektorem DAD, przy czterech optymalnych dla poszczególnych związków długościach fali wynoszących 230, 242, 265 i 340 nm. Spośród sześciu testowanych kolumn fazy odwróconej najlepszy rozdział chromatograficzny uzyskano na kolumnie LiChrosorb RP-18 (250 x 4 mm, 5μm), stosując jako fazę ruchomą metanol z wodą zmieszany w proporcji 65: 35 (v/v), przy przepływie fazy 1 ml/min i temperaturze kolumny 30 C. W procedurach potwierdzających opartych o technikę GC-MS zastosowano jonizację strumieniem elektronów (EI), dla której uzyskano najkorzystniejszą fragmentację pochodnych hormonów, oraz monitorowanie wybranych jonów (SIM) ze względu na znacznie większą intensywności jonów fragmentacyjnych uzyskiwanych w tym trybie, w porównaniu z trybem full scan. Prawidłowy rozdział chromatograficzny badanych związków osiągnięto na niepolarnej kolumnie HP5ms w programowanej temperaturze kolumny zaczynając od 120 C, a kończąc na 310 C. Biorąc pod uwagę ocenę intensywności otrzymanych jonów fragmentacyjnych oraz specyficzność widma mas, spośród siedmiu sprawdzanych metod derywatyzacji hormonów z zastosowaniem trzech czynników: HFBA, MSTFA i BSTFA, dla stilbenów i steroidów wybrano derywatyzację z HFBA, natomiast dla trenbolonu zastosowano dwuetapową derywatyzację, kolejno z mieszaniną MSFTA /I 2, a następnie z samym MSTFA. Dla wszystkich badanych hormonów, z wyjątkiem heksestrolu, uzyskano co najmniej cztery jony diagnostyczne, spełniając tym samym kryteria identyfikacji związków. Heksestrol przeprowadzano w dwie pochodne w celu uzyskania czterech punktów identyfikacyjnych, stanowiących kryterium dla metod potwierdzających.

3 Przeprowadzone badania trwałości pochodnych hormonów wykazały, że pochodne HFBA są znacznie trwalsze niż pochodne MSTFA i nie tracą właściwości nawet po miesięcznym przechowywaniu w temperaturze poniżej -18 C. Do ekstrakcji hormonów z próbek moczu i mleka zastosowano eter dietylowy, natomiast z próbek mięśni hormony izolowano metanolem w obecności buforu octanowego. Dalsze oczyszczanie próbek prowadzono stosując ekstrakcję ciecz - ciecz oraz ekstrakcje do fazy stałej na kolumienkach C18 i NH 2. Octan medroksyprogesteronu z próbek tłuszczu ekstrahowano eterem naftowym, oczyszczanie prowadzono stosując ekstrakcję do fazy stałej na kolumience C18, po uprzednim odtłuszczeniu ekstraktu poprzez wymrażanie. Do izolacji hormonów naturalnych: 17β- estradiolu i testosteronu z próbek surowicy użyto mieszaniny rozpuszczalników, eteru ter-butylowo-metylowego i naftowego (30:70, v/v). Tak dobrany układ rozpuszczalników okazał się bardzo efektywny, ponieważ uzyskane ekstrakty były wystarczająco czyste do wykonania analizy metodą GC-MS, bez konieczności dalszego oczyszczania. Przeprowadzone z zastosowaniem przygotowanych metod badania wpływu gatunkowości próbek, rodzaju matrycy i techniki detekcji na wynik analizy wykazały, że czynniki te nie rzutują w istotny sposób na wynik badania. Opracowane procedury zostały w pełni zwalidowane zgodnie z wymaganiami określonymi w Decyzji Rady 2002/657/EC, spełniają międzynarodowe kryteria analityczne i umożliwiają oznaczanie hormonów poniżej ustalonych minimalnych poziomów oznaczania. Przedstawione metody zostały zweryfikowane w międzynarodowych badaniach biegłości, które potwierdziły, że wyniki uzyskiwane przy ich użyciu są wiarygodne i porównywalne z wynikami otrzymywanymi przez laboratoria referencyjne innych państw europejskich. Opracowane skryningowe i potwierdzające metody przygotowano w formie procedur badawczych i wdrożono do badań diagnostycznych i kontrolnych pozostałości hormonów prowadzonych w kraju. Metody potwierdzające po poddaniu ich procesowi akredytacji uzyskały status metod akredytowanych nadany im przez PCA. Wyniki prowadzonych w latach badań z zastosowaniem opracowanych metod wskazują, że anaboliki pochodzenia hormonalnego nie są stosowane w kraju do stymulacji wzrostu zwierząt rzeźnych.

4 SUMMARY An efficient control of anabolic hormone residues in animal tissues is possible due to a sustained development of new analytical methods and improvement of the methods used. In the present work successive stages of the studies undertook to work out and validate methods of anabolic hormones detections in sample of animal origin were demonstrated. At the beginning of the work three groups of hormonal growth stimulators: stilbenes, steroids and zeranol including their physicochemical properties, the mechanism of action, and metabolism were characterized. In addition, the toxicity of hormones mainly focused at their cancerogenic and mutagenic properties. Moreover, issues involving the presence of hormones in the food of animal origin and the occurrence of natural and synthetic hormones in animal tissues as a result of animal implantation, and also illegal use of hormones for anabolic purpose were discussed. Furthermore, the rules of the hormone residue controls applied in the UE countries and questions connected with the interpretation of results were put forward. Basing on the available literature, the published methods of hormone determination in biological samples were analyzed and new trends in the analysis of these compounds were described. Later, present analytical requirements for confirmatory methods, the rules of their validation and criteria of the estimation of results were shown. In the experimental part, a main emphasis was put on optimization of hormone detection conditions, the way of analyte extraction from a matrix, selection of the condition of extract purification and converting hormones into volatile derivatives. Results of operational research were used to elaborate the multi-residue screening HPLC-DAD method for hormone detection in biological samples and four confirmatory procedures which were based on gas chromatography with mass spectrometry with a single quadrupole for detection of stilbenes and steroids in urine sample, muscles and milk, medroxyprogesterone acetate in animal fat tissue and 17 β estradiol and testosterone in cattle serum. The use of liquid chromatography with diode array detector for screening reasons was dictated by the fact that this method is a cheaper in comparison to mass spectrometry techniques, gives possibility to identify tested compounds by their UV spectrum registration and enables to detect simultaneously several compounds, which seems to be an additional benefit. The analysis of diethylstilbestrol, dienestrol, hexestrol, nortestosterone, trenbolone, zeranol was carried out using the HP1100 liquid chromatography with a DAD detector at four

5 optimal valve lengths (230 nm, 242 nm, 265 nm, and 340 nm) for selected compounds. Of six tested columns of inversed phase the best separation was achieved on an LiChrosorb RP-18 column (250 x 4 mm, 5μm) using a mixture of methanol and water (65:35, V/V) as a mobile phase (1 ml/min) and at a column temperature of 30 o C. The confirmatory procedures based on the GC-MS technique included ionization with an electron impact (EI) which permitted the most efficient selectivity of hormone derivates, and selected ions monitoring (SIM) for reasons of much more intense ion partition obtained by this method in comparison to that achieved by a full scan one. The regular chromatography selectivity of examined compounds was obtained on a non-polar HP-5ms column at a programmed column temperature ranging from 120 o C to 310 o C. Of seven examined methods of hormone derivatization with the use of three derivative agents such as HFBA, MSTFA, and BSTFA, the following methods were selected considering intensity of the ions, that were obtained and mass spectrum specificity: for stilbenes and steroids derivatization with HFBA, whereas for trenbolone a two-step derivatization involving an MSTA/I 2 mixture and then only MSTFA. Except for hexestrol, at least four diagnostic ions fulfilling the criteria of the compound identification were achieved for all tested hormones. Hexestrol was covered into two derivatives, to obtain four identification points that were regarded as a criterion for the confirmatory methods. Investigations into the stability of the hormone derivatives showed that HFBA derivatives are much more stable then MSTFA ones and do not lose property even after a one month storing at a temperature below 18 o C. The hormones were extracted from urine and milk samples with the use of diethyl ether whereas from muscle sample with the use of methanol and acetate buffer. Further sample purification was performed using liquid-liquid extraction and C18 and NH 2 columns. Medroxyprogesterone acetate was extracted from fat samples by petroleum ether, then purified by solid phase extraction on C18 columns, after extract degreasing by freezing. The natural hormones 17 β estradiol and testosterone were isolated from serum using tert-butylmethyl ether and petroleum ether (30:70 V/V). Such well-matched solvents were very effective because the extracts obtained were sufficiently pure to perform the analysis using the GC-MS method without further purification. The investigations performed with the use of elaborated methods to evaluate the species specific of the sample, matrix effects and detection technique on the analysis effect indicate that the factors do not affect significantly the results obtained.

6 The elaborated procedures were completely validated according to requirements of Commission Decision 2002/657/EC, they fulfill international analytical criteria and permit the hormone determination below determined minimum detection levels. The method presented were verified by the international proficiency testing that supported that results achieved by the methods are reliable and comparable with those obtained by reference laboratories in other European countries. The worked out screening and confirmatory methods were prepared as procedures and introduced to diagnostic and control examinations of hormone residues performed in Poland. The reference methods achieved the status of accredited methods certified by the PCA. Results of the examinations carried out in the years 2005 to 2007 with the use of the methods developed indicate, that anabolic of hormonal origin are not use in Poland to stimulate growth of slaughter animals.