Edyta Podsiadły Zakład Diagnostyki Laboratoryjnej i Immunologii Klinicznej Wieku Rozwojowego, Samodzielny Publiczny Dziecięcy Szpital Kliniczny w Warszawie AUTOREFERAT Warszawa 2013 str. 1
1. Imię i nazwisko: Edyta Podsiadły 2. Posiadane dyplomy, stopnie naukowe Dyplom specjalisty II w dziedzinie mikrobiologia medyczna (2009) Doktor nauk medycznych w zakresie biologii medycznej (2003) Państwowy Zakład Higieny w Warszawie, tytuł rozprawy: Badania nad zależnością pomiędzy zakażeniem Chlamydophila (Chlamydia) pneumoniae a występowaniem miażdżycy, promotor: prof. dr hab. Stanisława Tylewska-Wierzbanowska, recenzenci: prof. dr hab. med. Gayane Martirosian, prof. dr hab. Janusz Ślusarczyk Dyplom specjalisty I stopnia w zakresie mikrobiologii (2001) Magister biologii, specjalność mikrobiologia (1995) Uniwersytet Warszawski, Wydział Biologii 3. Informacje o dotychczasowym zatrudnieniu w jednostkach naukowych Zakład Diagnostyki Laboratoryjnej i Immunologii Klinicznej Wieku Rozwojowego, Samodzielny Publiczny Dziecięcy Szpital Kliniczny w Warszawie Od 01.05.2010 - starszy asystent, kierownik Pracowni Mikrobiologii Samodzielna Pracownia Riketsji, Chlamydii i Krętków Odzwierzęcych, Narodowy Instytut Zdrowia Publicznego - Państwowy Zakład Higieny w Warszawie 01.12.2003-30.04.2010 adiunkt 01.06.2008-30.04.2010 - kierownik Pracowni Diagnostyki Serologicznej w Akredytowanym Laboratorium Samodzielnej Pracowni Riketsji, Chlamydii i Krętków Odzwierzęcych Zakład Bakteriologii, Państwowy Zakład Higieny w Warszawie, 01.12.1998-30.11.2003 asystent 01.04.1997-30.11.1998 - biolog Zakład Mikrobiologii, Centralny Szpital Kliniczny Akademii Medycznej w Warszawie, 01.03.1996-31.03.1997- młodszy asystent str. 2
I. Wskazanie osiągnięcia wynikającego z art. 16 ust. 2 ustawy z dnia 14 marca 2003 r. o stopniach naukowych i tytule naukowym oraz o stopniach i tytule w zakresie sztuki (Dz. U. Nr 65, poz. 595 ze zm.) A. Tytuł osiągnięcia naukowego: Epidemiologia i charakterystyka polskich szczepów Bartonella spp. B. Wykaz publikacji stanowiących osiągnięcie naukowe: 1. Podsiadły E., Żabicka D., Demkow U., Hryniewicz W., Tylewska-Wierzbanowska S. Susceptibility of Polish Bartonella henselae strains. Pol J Microbiol. 2012; 61: 143-145. [Impact factor - 0,76; MNiSW 15] 2. Podsiadly E., Haddad N., Berrich M., Bouchouicha R., Durand B., Monteil M., Boulouis HJ., Tylewska-Wierzbanowska S. Characterization of Polish feline B. henselae isolates by multiple-locus tandem repeat analysis and pulse-field electrophoresis. Ann Agric Environ Med. 2012;19:39-43. [Impact factor - 2,311; MNiSW 25] 3. Podsiadły E., Chmielewski T., Karbowiak G., Kędra E., Tylewska-Wierzbanowska S. The occurrence of spotted fever rickettsioses and other tick-borne infections in forest workers in Poland. Vector Borne Zoonotic Dis. 2011;11:985-989. [Impact factor - 2,437; MNiSW 30] 4. Podsiadly E., Karbowiak G., Tylewska-Wierzbanowska S. Presence of Bartonella spp. in Ixodidae ticks. Clin Microbiol Infect. 2009;15 Supl 2:120-121 (recenzowana publikacja pełnotekstowa w suplemencie czasopisma, oświadczenie redakcji w załączeniu) [Impact factor - 4,014] 5. Podsiadły E., Chmielewski T., Marczak R., Sochoń E., Tylewska-Wierzbanowska S. Bartonella henselae in the human environment in Poland. Scan J Infec Dis. 2007;39:956-962. [Impact factor - 1,209; MNiSW 20] 6. Podsiadły E., Chmielewski T., Sochoń E., Tylewska-Wierzbanowska S. Bartonella henselae in Ixodes ricinus ticks removed from dogs. Vector Borne Zoonotic Dis. 2007;7:189-192. [Impact factor - 1,919; MNiSW 20] 7. Chmielewski T., Podsiadły E., Tylewska-Wierzbanowska S. Presence of Bartonella spp. in various human populations. Pol J Microbiol. 2007;56:33-38. [ MNiSW-5] str. 3
8. Podsiadły E., Sokołowska E., Tylewska-Wierzbanowska S. Występowanie zakażeń Bartonella henselae i Bartonella quintana w Polsce w latach 1998-2001. Przeg Epidemiol. 2002; 56:399-407. [MNiSW 4] 9. Podsiadły E., Sapiejka E., Dąbrowska-Bień J., Majkowski J., Tylewska- Wierzbanowska S. Diagnostyka choroby kociego pazura oraz współczesne metody rozpoznawania bartoneloz- opis przypadku. Pol Merk Lek. 2009;152:131-136. [MNiSW- 6] 10. Wieczorek M., Elwertowski M., Podsiadły E., Kostrzewski P., Tylewska- Wierzbanowska S. Choroba kociego pazura diagnostyka i leczenie. Reumatologia 2011: 49: 294-297. [MNiSW- 5] 11. Podsiadły E., Chmielewski T., Tylewska-Wierzbanowska S. Bartonella henselae and Borrelia burgdorferi infections of central nervous system. Ann N Y Acad Scien. 2003; 990:404-407. (publikacja pełnotekstowa w suplemencie czasopisma) [Impact factor - 1,892] 12. Podsiadły E., Tylewska-Wierzbanowska S. Występowanie Bartonella spp. w wybranych rezerwuarach i wektorach na terenie Polski. Post Mikrobiol. 2008;47:275-281. [MNiSW- 13] 13. Podsiadły E., Tylewska-Wierzbanowska S. Współczesne postacie bartonelozrozpoznawanie, diagnostyka i leczenie. Nowa Klinika 2008;15:559-564. [MNiSW- 2] 14. Podsiadły E., Tylewska-Wierzbanowska S. Bartonella spp. nowe zagrożenie dla zdrowia człowieka. w: Świat człowieka światem drobnoustrojów red. Hryniewicz W., Polskie Towarzystwo Mikrobiologów, Warszawa, 2007, s. 87-94. C. Omówienie celu naukowego ww. prac i osiągniętych wyników wraz z omówieniem ich ewentualnego wykorzystania Bakterie z rodzaju Bartonella to krótkie gram-ujemne pałeczki lub pleomorficzne ziarniakopałeczki o wysokich wymaganiach odżywczych. Należą do wewnątrzkomórkowych patogenów, pasożytów krwinek czerwonych i komórek śródbłonka naczyń ssaków. Do niedawna bakterie te były patogenami mało znaczącymi w medycynie. Intensywne badania rozpoczęte w ostatnich dwóch dekadach sprawiły, że obecnie bartonelozy są traktowane jako choroby odzwierzęce o zasięgu światowym, ciągle zaliczane do grupy nowopojawiających się i nawracających zakażeń (ang. emerging & re-emerging diseases). str. 4
Dane na temat występowania Bartonella spp. na terenie Polski są bardzo ograniczone. Wynika to z niewielkiej liczby rozpoznawanych zakażeń o tej etiologii, trudności diagnostycznych, braku danych epidemiologicznych. Celem przedstawianego cyklu prac było poznanie biologii tych bakterii oraz epidemiologii zakażeń wywoływanych przez Bartonella spp. na wybranych terenach kraju. Badania obejmowały pięć bloków tematycznych. Zagadnienie 1. Określenie rozpowszechnienia Bartonella spp. w wybranych rezerwuarach zwierzęcych na terenie Polski Podsiadły E., Chmielewski T., Marczak R., Sochoń E., Tylewska-Wierzbanowska S. Bartonella henselae in the human environment in Poland. Scan J Infec Dis. 2007;39:956-962. Podsiadły E., Tylewska-Wierzbanowska S. Występowanie Bartonella spp. w wybranych rezerwuarach i wektorach na terenie Polski. Post Mikrobiol. 2008;47:275-281. Rezerwuarem gatunków należących do rodzaju Bartonella są zwierzęta domowe i dzikie, u których bakterie te wywołują bezobjawowe, długo utrzymujące się bakteriemie. Zbadano 137 kotów i 54 psów, zwierzęta były zdrowe i pochodziły z obszarów miejskich Warszawy i okolic. Od zwierząt pobierano krew i prowadzono hodowlę na podłożu czekoladowym oraz linii komórkowej L-929 wywodzącej się z fibroblastów mysich, przez 4-6 tygodni, w atmosferze 5% CO 2, w temperaturze 37 C. Identyfikację gatunkową szczepów prowadzono metodą PCR ze starterami Bh CS 781, Bh CS 1137n dla fragmentu genu syntetazy cytrynianowej glta (1). Uzyskane amplikony sekwencjonowano i porównywano z sekwencjami opublikowanymi w GenBank dostępnymi w National Centre for Biotechnology Information (NCBI) przy pomocy Basic Local Alignment Search Tool (BLAST). Jako alternatywną metodę identyfikacji wykorzystano metodę PCR-RFLP (ang. Polymerase Chain Reaction Restriction Fragment Length Polymorphism) opartą o gen syntetazy ryboflawiny ribc i enzymy restrykcyjne Eam oraz Taq I. Uzyskany wzór restrykcyjny identyfikował wybrane gatunki Bartonella (2). U wszystkich badanych zwierząt wykrywano metodą immunofluorescencji pośredniej swoiste dla B. henselae przeciwciała klasy IgG, w przypadku psów dodatkowo przeciwciała dla B. vinsonii subsp. berkhoffii. Miano 64 uważano za dodatnie. Bartonella spp. wyhodowano z krwi 14 ze 137 badanych zwierząt (10,2%). Łącznie z dwóch systemów hodowlanych otrzymano 19 izolatów. Metodami molekularnymi osiemnaście szczepów zidentyfikowano jako B. henselae, jeden jako B. clarridgeiae. Od 4 kotów szczepy str. 5
wyhodowano zarówno w linii komórkowej L-929 jak i na podłożu czekoladowym. Od 8 kotów pozytywny wynik hodowli uzyskano jedynie na podłożu czekoladowym. W przypadku hodowli od jednego kota na linii komórkowej uzyskano wzrost B. clarridgeiae, a na podłożu czekoladowym B. henselae. U 45% (59/131) badanych kotów stwierdzono występowanie swoistych dla B. henselae przeciwciał, u 9 zwierząt miano przeciwciał było równe lub wyższe 512. Seropozytywność istotnie statystycznie korelowała z bakteriemią p<0,1. Wyniki badań wykazały, że najistotniejszym czynnikiem ryzyka zakażenia Bartonella sp. u kotów jest tryb życia. U kotów wychodzących stwierdzono znacznie częstsze występowanie przeciwciał dla B. henselae jak i częstszą bakteriemię, niż u kotów niewychodzących (42,9% i 17,1% vs 13,1% i 0, p<0,02). Od żadnego z 54 badanych psów nie wyhodowano Bartonella spp., u 27 stwierdzono obecność swoistych dla B. henselae przeciwciał w niskich mianach poniżej 64, tylko u jednego psa miano wynosiło 512. Psy są uznanym rezerwuarem B. vinsonii subsp. berkhoffii, swoiste dla tego gatunku przeciwciała stwierdzono u 5,5% (3/54) badanych zwierząt. U 30% (16/55) krów z województwa lubelskiego stwierdzono obecność DNA B. bovis we krwi obwodowej. Wnioski: Potwierdzono występowanie bezobjawowych zakażeń bakteriami należącymi do rodzaju Bartonella u psów, kotów i krów z wybranych terenów kraju. Wyniki przeprowadzonych badań wskazują na znaczne rozpowszechnienie B. henselae wśród kotów z terenów miejskich centralnej Polski. Potwierdzono obecność w bezpośrednim otoczeniu człowieka innych niż B. henselae gatunków z rodzaju Bartonella : B. bovis i B. clarridgeiae. Rola psów jako rezerwuaru B. henselae jest ciągle niepotwierdzona. Stwierdzone niskie poziomy swoistych przeciwciał oraz brak bakteriemii u psów, wskazują na ich rolę jako przypadkowego gospodarza B. henselae. Zagadnienie 2. Określenie częstości występowania zakażeń Bartonella sp. u ludzi zdrowych i w grupach zwiększonego ryzyka Podsiadły E., Tylewska-Wierzbanowska S. Występowanie Bartonella spp. w wybranych rezerwuarach i wektorach na terenie Polski. Post Mikrobiol. 2008;47:275-281. str. 6
Chmielewski T., Podsiadły E., Tylewska-Wierzbanowska S. Presence of Bartonella spp. in various human populations. Pol J Microbiol. 2007;56:33-38. Podsiadły E., Sokołowska E., Tylewska-Wierzbanowska S. Występowanie zakażeń Bartonella henselae i Bartonella quintana w Polsce w latach 1998-2001. Przeg Epidemiol. 2002; 56:399-407. Według badań przeprowadzonych w Niemczech i Francji bakterie należące do gatunku B. henselae są odpowiedzialne za większość limfadenopatii u dzieci i dorosłych w tych krajach. W roku 1998 rozpoczęto w Zakładzie Bakteriologii Państwowego Zakładu Higieny diagnostykę laboratoryjną opartą na wykrywaniu swoistych dla B. henselae przeciwciał klasy IgM i IgG. Przez dekadę placówka ta była jedyną w Polsce wykonującą diagnostykę serologiczną w kierunku zakażeń Bartonella spp. W kolejnych latach potwierdzono serologicznie następującą liczbę przypadków CSD (CSD ang. cat scratch disease): rok 1998-21 serododatnich na 50 badanych (21/50), 1999 30/55, 2000 55/81, 2001 40/79, w 2002 45/108, w 2003 37/106, w 2004 59/141, w 2005 90/140, w 2006 34/120, w 2007 79/168. Wyliczony na podstawie tych danych szacunkowy współczynnik zapadalności wahał się od 0,05 do 0,25 na 100 000 osób w zależności od roku. Dla porównania, w Belgii współczynnik zapadalności wynosi 0,69 na 100 000 mieszkańców, w Holandii 12,5, w USA 9,3. Prawdopodobnie różnica zapadalności w Polsce jest wynikiem niedoszacowania. Analiza populacji serododatnich pacjentów wykazała zależność między częstością występowania zakażeń B. henselae a wiekiem chorego. Stwierdzono dwa piki zachorowań, pierwszy u dzieci w przedziale wiekowym 8-16 lat i drugi u osób w wieku 40-50 lat. Na podstawie uzyskanych danych zaobserwowano sezonowość zakażeń B. henselae, która wynika głównie z cyklu biologicznego kotów i pcheł. Najmniej przypadków CSD stwierdzano od kwietnia do września, ze znaczącym spadkiem w czerwcu. Wzrost zachorowań miał miejsce w miesiącach jesienno-zimowych, od listopada do marca. Wyniki te są zgodne z ostatnio przeprowadzonym badaniem, w którym diagnostykę CSD, wykonywano przez wykrycie DNA B. henselae w węzłach chłonnych pacjentów (3). Określono częstość występowania swoistych dla B. henselae i B. quintana przeciwciał w wybranych grupach ryzyka. Zbadano 120 osób, w tym 29 bezdomnych alkoholików, 6 narkomanów, 20 weterynarzy, 15 właścicieli kotów. Grupę odniesienia stanowiło 50 dawców krwi. Jako znamiennie dodatnie uważano miano 64 dla przeciwciał klasy IgG i 10 dla klasy IgM. str. 7
Od 39 badanych osób pobrano krew na posiew w kierunku Bartonella spp. (warunki prowadzenia hodowli opisano w punkcie 1). Identyfikację wyhodowanych szczepów wykonywano metodą PCR-RFLP dla fragmentu genu syntetazy ryboflawiny (rib C). Swoiste dla B. henselae przeciwciała klasy IgG występowały znamiennie statystycznie częściej u bezdomnych alkoholików (48,3%, OR=2,9; 95%CI 1,5-4,4), weterynarzy (45.0%, OR=2,5; 95% CI 1,1-3,8) i właścicieli kotów (53%, OR=3,6; 95% CI 1,5-5,7) niż w grupie kontrolnej (24%). Wszyscy badani narkomani byli seronegatywni. Najwyższe miana przeciwciał dla B. henselae wykrywano u właścicieli kotów - 4096. W pozostałych grupach badanych najwyższe wykrywane miana wynosiły: u bezdomnych alkoholików - 256, u weterynarzy 128. Badania pokazały, że w Polsce również obserwuje się nawracanie zakażeń B. quintana. Wysokie miana przeciwciał klasy IgG swoistych dla B. quintana wynoszące 256 i 1024 stwierdzono u dwóch bezdomnych alkoholików. Od 2 na 29 osób z tej grupy z krwi wyhodowano szczepy Bartonella, zidentyfikowane metodami molekularnymi jako B. henselae. Wnioski: Uzyskane wyniki pokazały, że B. henselae i B. quintana są obecne i częste w Polsce w takich grupach ryzyka jak: bezdomni alkoholicy, właściciele kotów, weterynarze. Właściciele kotów i osoby bezdomne są grupą najbardziej narażoną na zakażenie B. henselae B. quintana czynnik etiologiczny nie występującej współcześnie gorączki okopowej jest raportowany w niektórych krajach europejskich w nowej postaci przewlekłych bakteriemii bez objawów gorączkowych wśród bezdomnych alkoholików. Serologiczne dowody zakażenia B. quintana stwierdzono również w tej grupie ryzyka w Polsce. Zagadnienie 3. Określenie roli kleszczy gatunku Ixodes ricinus i Dermacentor reticulatus w transmisji Bartonella spp. Podsiadły E., Chmielewski T., Tylewska-Wierzbanowska S. Bartonella henselae and Borrelia burgdorferi infections of the central nervous system. Ann N Y Acad Sci. 2003;990: 404-406. Podsiadły E., Chmielewski T., Marczak R., Sochoń E., Tylewska-Wierzbanowska S. Bartonella henselae in the human environment in Poland. Scan J Infec Dis. 2007;39:956-962. Podsiadły E., Chmielewski T., Sochoń E., Tylewska-Wierzbanowska S. Bartonella henselae in Ixodes ricinus ticks removed from dogs. Vector Borne Zoonotic Dis. 2007;7:189-192. Podsiadly E., Karbowiak G., Tylewska-Wierzbanowska S. Presence of Bartonella spp. in Ixodidae ticks. Clin Microbiol Infect. 2009;15 Supl 2:120-121. Podsiadły E., Chmielewski T., Karbowiak G., Kędra E., Tylewska-Wierzbanowska S. The occurrence of spotted fever rickettsioses and other tick-borne infections in forest workers in Poland. Vector Borne Zoonotic Dis. 2011;11:985-989. str. 8
Zakażenia Bartonella spp. to metazoonozy przenoszone przez wektor. Ze względu na znaczne rozpowszechnienie Bartonella spp. wśród ludzi oraz różnorodnych gatunków zwierząt przypuszcza się, że istnieje wiele wektorów przenoszących te infekcje. Wyniki ostatnich badań wskazują na prawdopodobną rolę kleszczy w tym procesie. Pierwsza z przedstawionego cyklu prac opisuje ko-infekcję B. henselae i Borrelia burgdorferi u osób z klinicznie i laboratoryjnie potwierdzoną neuroboreliozą. U 2 z 17 chorych stwierdzono jednoczesne zakażenie B. henselae. Uzyskany wynik zapoczątkował badania nad tą hipotezą. W początkowym etapie oceniono częstość występowania Bartonella w dorosłych postaciach kleszczy gatunku I. ricinus. Zbadano 102 dorosłe osobniki, 83 stawonogi zebrano z 49 psów, 19 z 11 kotów. Obecność DNA Bartonella spp. stwierdzono w 5 (4,7%) ze 102 badanych kleszczy. Wszystkie Bartonella-PCR dodatnie kleszcze żerowały na psach, w żadnym z badanych stawonogów usuniętych od kotów nie stwierdzono obecności DNA Bartonella spp. Sekwencja uzyskanych amplikonów wykazała 100% komplementarność do sekwencji genu syntetazy cytrynianowej (glta) występującej w obrębie genomu B. henselae. Badania te zostały rozszerzone w drugiej pracy z tego cyklu, w której w celu wykazania ewentualnej transmisji B. henselae, od trzech spośród pięciu psów, na których żerowały Bartonella-PCR dodatnie kleszcze, pobrano krew kilka miesięcy po usunięciu zakażonych stawonogów. Badania serologiczne i bakteriologiczne w kierunku wykrycia zakażenia Bartonella spp, u psów pokłutych przez B. henselae-pcr dodatnie kleszcze nie wykazały transmisji Bartonella spp z zakażonych stawonogów na psy. Z krwi żadnego z psów Bartonella spp nie wyhodowano. U dwóch z badanych zwierząt stwierdzono niski poziom swoistych dla B. henselae przeciwciał, w mianach 32 i 64. Wynik ten może mieć związek z niedostatecznym czasem żerowania, niezbędnym do transmisji patogenów lub wynikać ze stwierdzonego wcześniej braku adaptacji B. henselae do bytowania w psach. W ostatniej trzeciej pracy z tego cyklu zwiększono liczebność kleszczy gatunku I. ricinus do 242 osobników, badaną grupę uzupełniono o gatunek D. reticulatus (205 osobników). Spośród badanych kleszczy gatunku I. ricinus, 165 osobników zebrano ze zwierząt a 77 z roślinności. Wszystkie, za wyjątkiem jednego, kleszcze gatunku D. reticulatus zebrane były metodą flagowania z roślinności. Kleszcze zbierano na terenach zielonych Warszawy, Białowieży, okolic Biebrzy, natomiast z psów, kotów i krów: z terenów województwa str. 9
mazowieckiego (Warszawa i okolice), łódzkiego (Radomsko) i lubelskiego (Biała Podlaska). DNA Bartonella spp. wykrywano w reakcji PCR ze starterami dla fragmentu genu glta. U 1 z 205 badanych kleszczy gatunku D. reticulatus stwierdzono obecność DNA Bartonella spp. Po porównaniu sekwencji uzyskanego amplikonu ze zgromadzonymi w kolekcji NCBI, stwierdzono > 80% homologi z odpowiadającym mu fragmentem genu syntetazy cytrynianowej B. quintana. Kleszcz ten został zebrany z roślinności na terenach zielonych Warszawy (Czerniaków). Po zwiększeniu grupy badanej, fragmenty DNA Bartonella wykryto ostatecznie u 9 z 242 kleszczy I. ricinus. W przypadku 8 kleszczy otrzymane sekwencje amplikonów były w 99-100% homologiczne do fragmentu genu glta gatunku B. henselae. W przypadku 1 kleszcza stwierdzono 97% homologii z niehodowlanym szczepem Bartonella spp. wykrytym w kleszczach I. tasmani i I. scapularis. Kleszcze, w których stwierdzono obecność DNA Bartonella spp. zebrane były podczas ich żerowania na zwierzętach: 8 zebrano z psów, a 1 z krowy. Osiem z 9 Bartonella-PCR dodatnich kleszczy były częściowo lub całkowicie najedzone, jeden głodny. U żadnego głodnego kleszcza zebranego z roślinności nie stwierdzono DNA Bartonella. Taka sytuacja może wynikać z niskiego, poniżej poziomu wykrywalności, stężenia bakterii w głodnych kleszczach. Dopiero podczas pobierania pokarmu przez ten hematofagiczny wektor, bakterie namnażają się w sprzyjającym dla siebie środowisku osiągając liczbę jednostek tworzących kolonie umożliwiającą ich wykrycie. Analiza danych dotyczących B. henselae-pcr dodatnich kleszczy wskazała, że wykryte bakterie pochodziły raczej z tkanek stawonogów, a nie z krwi żywicieli, z których zostały zdjęte. Wskazało na to między innymi: wykrycie DNA B. henselae w głodnym kleszczu oraz tylko w jednym z grupy kilku żerujących jednoczasowo na tym samym zwierzęciu pajęczaków. Ponadto, wśród 22 kleszczy zdjętych z jednego psa, u dwóch stwierdzono obecność bakterii rodzaju Bartonella, jeden izolat zidentyfikowano jako niehodowany Bartonella spp, a drugi jako B. henselae. Wyniki te potwierdzają wysuniętą przez Cotte i wsp. (4) hipotezę o transstadialnym przenoszeniu Bartonella spp. Hipotezę o kleszczach jako wektorze Bartonella spp. sprawdzano również pośrednio w badaniu serologicznym przeprowadzonym na grupie zawodowo narażonej na częste pokłucia. U badanych osób wykrywano obecność swoistych przeciwciał dla Bartonella spp. oraz innych bakterii o udowodnionej transmisji przez te stawonogi: B. burgdorferi, Anaplasma phagocytophilum, wybranych gatunków riketsji należących do grupy gorączek str. 10
plamistych (spotted fever group SFG): Rickettsia rickettsii, R. conori, R. helvetica, R. slovaca, R. sibirica, R. massiliae. Zbadano 129 pracowników leśnych: 91 pracujących w Puszczy Białowieskiej i 38 leśników z okolic Radomska. Swoiste przeciwciała dla Bartonella spp stwierdzono u 29,5% badanych. W grupie kontrolnej 21 zdrowych mężczyzn powyżej 30 roku życia, u 14% z nich stwierdzono występowanie swoistych dla tych bakterii przeciwciał w mianie 64. Z porównania częstości występowania przeciwciał dla Bartonella spp. u osób narażonych na pokłucie przez kleszcze i osób z brakiem takiej ekspozycji wynika, że przeciwciała dla Bartonella spp występują statystycznie częściej u osób mających kontakt z kleszczami. Wśród badanych leśników swoiste przeciwciała dla B. burgdorferi stwierdzono u 34% badanych, dla A. phagocytophilum u 15,5% i 14,7% dla SFG rickettsia. Analizie poddano występowanie koinfekcji bakteriami przenoszonymi przez kleszcze w badanej grupie. Najczęściej tzn. u 10% wszystkich serododatnich osób obserwowano jednoczesne występowanie przeciwciał dla B. burgdorferi i Bartonella spp. Ponieważ Bartonella spp. i B. burgdorferi posiadają ten sam rezerwuar środowiskowy dzikie gryzonie, taki wynik badania może sugerować przenoszenie przez wspólny wektor - kleszcze. Borelioza jest najczęściej występującą chorobą odkleszczową w Polsce, co potwierdził również wykonany przegląd serologiczny. Odsetek procentowy wyników dodatnich uzyskany dla Bartonella spp. był zbliżony. Jednak, należy zaznaczyć, że swoiste dla Bartonella spp. przeciwciała występowały w niskich mianach 64 i 128 u 95% seropozytywnych osób. Wysoka seroprewancja dla Bartonella spp. w niskich mianach może być wyjaśniona wynikami badań molekularnych. W surowicach osób z przeciwciałami dla Bartonella spp. poszukiwano DNA tych bakterii (fragmentu genu glta). U 3 spośród 38 badanych seropozytywnych osób uzyskano reakcję dodatnią. Molekularna analiza uzyskanych sekwencji, wykazała ich 90% podobieństwo do środowiskowych izolatów Bartonella spp. zdeponownych w GenBank takich jak: B. koehlerae pochodzącego od psów (GenBank number FJ832088), niehodowalnego szczepu Bartonella spp od stawonogów opisanego w Peru (GenBank number GU 583842.1) i B. clarridgeiae z ektopasożytów na Tajwanie (GenBank number GU 056189). Sekwencje 3 uzyskanych izolatów zostały zdeponowane w GenBank jako niehodowane Bartonella spp accession no HM1 16784, HM1 16785, HM1 16786. Wykryte w badaniu z użyciem antygenów dla B. henselae i B. quintana przeciwciała mogą być wynikiem reakcji krzyżowych między zaadaptowanymi ludzkimi szczepami i szczepami str. 11
środowiskowymi należącymi do tego rodzaju, co wyjaśniałoby uzyskane niskie miana odczynów. Droga transmisji środowiskowych szczepów Bartonella spp. na człowieka nie jest znana, wynik badania wskazuje na cyrkulację tych bakterii w środowisku. Dalsze prace dotyczące mechanizmu przenoszenia tych bakterii oraz czynników wpływających na transmisję, są niezbędne dla ostatecznego potwierdzenia hipotezy o kleszczach jako wektorze tych zakażeń. Wnioski: Uzyskano szereg pośrednich dowodów sugerujących rolę kleszczy gatunku I. ricinus w transmisji Bartonella spp.: 1) wykazano obecność DNA Bartonella spp., w tym gatunku B. henselae, w kleszczach, 2) uzyskane wyniki wskazują na transstadialną transmisję tych bakterii: B. henselae wykryto w kleszczu głodnym, w jednym z kilku żerujących kleszczy na tym samym zwierzęciu a w dwóch częściowo najedzonych kleszczach usuniętych z tego samego psa stwierdzono obecność różnych gatunków Bartonella, 3) u osób narażonych na częste pokłucia przez kleszcze częściej stwierdza się obecność przeciwciał dla Bartonella spp., niż w grupie kontrolnej. W badaniu koinfekcji wywołanych 4 gatunkami bakterii przenoszonymi przez wektor, najczęściej stwierdzanym mieszanym zakażeniem była etiologia B. burgdorferi i Bartonella spp. Zagadnienie 4. Molekularna charakterystyka wyhodowanych szczepów Bartonella henselae i określenie ich wrażliwości na antybiotyki Podsiadły E., Żabicka D., Demkow U., Hryniewicz W., Tylewska-Wierzbanowska S. Susceptibility of Polish Bartonella henselae strains. Pol J Microbiol. 2012; 61: 143-145. Podsiadly E., Haddad N., Berrich M., Bouchouicha R., Durand B., Monteil M., Boulouis HJ., Tylewska-Wierzbanowska S. Characterization of Polish feline B. henselae isolates by multiple-locus tandem repeat analysis and pulse-field electrophoresis. Ann Agric Environ Med. 2012;19:33-43. Wiedza na temat epidemiologii i rozprzestrzenienia geograficznego szczepów B. henselae ma bardzo duże znaczenie dla poznania klonów o szczególnej zjadliwości i chorobotwórczości dla ludzi. Celem badania była charakterystyka molekularna szczepów B. henselae wyhodowanych w Polsce i porównanie ich ze szczepami wyhodowanymi na świecie. Do określenia genetycznego podobieństwa szczepów zastosowano różne metody str. 12
genotypowania. Podstawowym podziałem w obrębie gatunku B. henselae jest podział na genotyp I i genotyp II. Analiza badanych szczepów B.henselae wykonana metodą PCR ze starterami BH1/16SF dla genotypu I i starterami BH2/16SF dla genotypu II, wykazała u 10 z badanych szczepów genotyp II a u 1 genotyp I. Uzyskany wynik potwierdza dominację u kotów w Europie genotypu II B. henselae. W typowaniu wyhodowanych szczepów B. henselae metodą PFGE (and. pulse-field gel electrophoresis), wyizolowane DNA cięto enzymem restrykcyjnym Sma I. Otrzymano od 14 do 22 fragmentów o ciężarze molekularnym 20-200 kb dla poszczególnych izolatów. Analiza uzyskanych wzorów restrykcyjnych według kryteriów zaproponowanych przez Tenover i wsp. (5) wykazała duże zróżnicowanie badanych szczepów. Wyróżniono 6 typów wzorów PFGE (A, B, C, D, E, F). W obrębie typów A, C, F wyodrębniono podtypy, odpowiednio: A1, A2, C1, C2 oraz F1, F2. Ograniczeniem techniki PFGE są trudności z porównaniem szczepów typowanych w różnych laboratoriach. Takie porównanie umożliwia zastosowanie metody MLVA (ang. multiple-locus variable tandem repeat analysis), ponieważ uzyskiwane są wyniki numeryczne. Przeprowadzono typowanie MLVA polskich szczepów B. henselae, wykorzystujące 5 loci VNTR (variable-numer tandem repeats) nazywanych jako BHV-A (B. henselae VNTR), BHV-B, BHV-C, BHV-D, BHV-E. Amplifikację i rozdział prowadzono w warunkach opisanych przez Monteil i wsp. (6). Wśród 11 badanych szczepów wykazano istnienie 10 profili. Dla każdego z badanych loci stwierdzono od 4 do 5 alleli. Wysoki polimorfizm szczepów odzwierciedla wysoka wartość DI (discrimination index) wynosząca 0,93. Dla siedmiu izolatów, wyniki MLVA potwierdziły typowanie wykonane metodą PFGE. Szczepy klasyfikowane jako subtypy A1, A2 i C1, C2 w metodzie PFGE, nie wykazały pokrewieństwa genetycznego w typowaniu metodą MLVA, wykazano natomiast pokrewieństwo szczepów zaliczonych w PFGE do subtypów F1 i F2. Wyniki uzyskane metodą MLVA i PFGE korelowały z danymi epidemiologicznymi. Dwa z analizowanych szczepów pochodziły od zwierząt, które mieszkały w tym samym domu i od których krew została pobrana w tym samym czasie. Zarówno w metodzie MLVA jak i PFGE szczepy te sklasyfikowano jako należące do tych samych typów. Wynik ten potwierdza dużą siłę dyskryminującą MLVA przy jednocześnie zachowanej czułości tej metody. Porównano profile MLVA polskich szczepów z genotypowanymi tą metodą 178 szczepami wyhodowanymi w Europie i USA. U krajowych szczepów wykazano obecność w obrębie str. 13
dwóch loci 3 alleli charakterystycznych tylko dla Polski: allel 18 w BHV-C oraz allele 23 i 24 w BHV-B. Siedem z uzyskanych profili nie było wcześniej opisywanych i określono je jako nowe, natomiast 3 uzyskane profile były identyczne z powszechnie występującymi w Europie profilami VNTR dla szczepów B. henselae hodowanych od kotów. Jeden z profili (10-14-2-2- 1) należy do dominującego w Europie (17,5% profili), występuje głównie w Dani, Francji i Niemczech. Uzyskane wyniki potwierdzają, że profile VNTR mogą być wykorzystywane jako geograficzne markery szczepów. Mimo, że PFGE jest uważana za złoty standard molekularnego różnicowania szczepów B. henselae, uzyskane wyniki genotypowania metodą MLVA pokazują wyższą siłę dyskryminującą tej techniki, łatwość interpretacji wyników i możliwość porównywania numerycznych danych dotyczących szczepów uzyskanych w różnych laboratoriach. Wiedza na temat wrażliwości B. henselae na antybiotyki jest bardzo ograniczona. Sytuacja ta jest spowodowana faktem, że bakterie te należą do wymagających i trudno rosnących drobnoustrojów, czego konsekwencją jest niewielka liczba wyhodowanych szczepów na świecie. Celem badania było określenie minimalnego stężenia hamującego (MIC) dla wybranych antybiotyków w polskich szczepach B. henselae. Ponadto w izolatach zbadano występowanie genów sul warunkujących oporność na sulfonamidy. Zalecenia Clinical and Laboratory Standard Institute (CLSI), czy Europejskiego Komitetu ds. Oznaczania Lekowrażliwości (EUCAST) nie definiują sposobu określania wrażliwości na antybiotyki dla rodzaju Bartonella. Pierwszym etapem badań było opracowanie i walidacja metody oznaczania lekowrażliwości dla B. henselae. W doborze warunków oznaczenia uwzględniono takie punkty krytyczne jak: możliwość i szybkość uzyskania zlewnego wzrostu, powtarzalność oznaczeń, uzyskanie prawidłowych wartości dla wybranych szczepów kontrolnych. Kontrolę jakości oznaczeń lekowrażliwości z wykorzystaniem E-testów prowadzono z zastosowaniem następujących szczepów wzorcowych wg CLSI (M100 S16, 2006): Haemophilus influenzae ATCC 49247 (azytromycyna, cefotaksym, rifampicyna, ciprofloksacycna, ampicylina, lewofloksacycna, tetracyklina), E. coli ATCC 35218 (amoksycylina/kwas klawulanowy), E. faecalis ATTC 2921 (gentamycyna i klindamycyna). Oznaczenie wykonywano ze szczepu zebranego w fazie logarytmicznego wzrostu na podłożu czekoladowym (7-8 dniowa hodowla), zawieszonego w 2 ml jałowego roztworu 0,9% NaCl o gęstości 3,0 McFarland. Metodą E-test na podłożu czekoladowym uzupełnionym VITOX str. 14
oznaczono MIC dla antybiotyków zalecanych w empirycznym leczeniu CSD oraz innych bartoneloz: ampicylina (0,016-256), amoksycylina/kwas klawulanowy ((0,016-256), cefotaksym (0,016-256), azytromycyna (0,015-256), ciprofloksacyna (0,002-32), lewofloksacyna (0,002-32), tetracyklina (0,016-256), trimetoprim/sulfametoksazol (0,002-32), gentamycyna (0,016-256), rifampicyna (0,002-32) oraz dla potwierdzenia identyfikacji szczepu klindamycyna (0,016-256). Wartość MIC odczytywano w 4 i 7 dniu hodowli. W przypadku wszystkich 11 badanych szczepów stwierdzone wartości MIC dla testowanych antybiotyków były bardzo niskie. Według kryteriów nie związanych z gatunkiem bakterii określonych w oparciu o farmakokinetykę, farmakodynamikę oraz standardowe dawkowanie antybiotyku wg EUCAST (wersja 2.0, obowiązująca od 01.01.2012), wartości te klasyfikowały badane szczepy jako wrażliwe. Najniższe wartości MIC uzyskano dla rifampicyny ( 0,004 mg/l). MIC wszystkich szczepów był niższy lub równy 0,016 mg/l dla: ampicyliny, amoksycyliny z kwasem klawulanowym, tetracykliny. Dla azytromycyny, antybiotyku rekomendowanego w leczeniu CSD, MIC wahał się od 0,016 do 0,023 mg/l. W przypadku dwóch badanych fluorochinolonów: ciprofloksacyny i lewofloksacyny MIC był w zakresie 0,016 do 0,125 mg/l. Najwyższe wartości MIC, sięgające do 2.0 mg/l, uzyskano dla gentamycyny. Sulfonamidy są szeroko wykorzystywanymi w hodowli zwierząt chemioterapeutykami w leczeniu biegunek i innych chorób zakaźnych. Powszechne wykorzystanie sprzyja rozprzestrzenianiu się genów oporności na ten chemioterapeutyk, które są związane z integronem klasy 1 przenoszonym na plazmidzie i chromosomie bakteryjnym. Ponieważ odczyt krawędzi strefy inhibicji w przypadku kotrimoksazolu nie był możliwy w warunkach opracowanych dla potrzeb przeprowadzanego badania, w charakteryzowanych szczepach zbadano metodą PCR obecność genów warunkujących oporność na sulfonamidy: sul 1, sul 2, sul 3. W żadnym z 11 szczepów nie wykryto fragmentów wyżej wymienionych genów. Lekowrażliwość badanych szczepów zestawiono z wynikami typowania molekularnego uzyskanymi metodą MLVA. U trzech szczepów, posiadających profile VNTR określone jako powszechnie występujące w Europie: 9-15-2-1-1, 10-14-2-2-1 oraz 9-15-2-2-1, stwierdzono najwyższe z określonych wartości MIC dla gentamycyny. Dodatkowo u dwóch z tych szczepów stwierdzono podwyższone wartości MIC dla ciprofloksacyny. Wnioski: str. 15
Jak wynika z przeglądu literatury (PubMed, sierpień 2013) opisane i scharakteryzowane w powyższym cyklu prac szczepy B. henselae są dotychczas jedynymi wyhodowanymi w Polsce. Podobnie jak w innych krajach europejskich, w Polsce, wśród kotów dominuje genotyp II B. henselae. Wśród badanych polskich szczepów B. henselae została stwierdzona obecność 3 powszechnie występujących w Europie i 7 nowych profili MLVA. Charakterystyka molekularna B. henselae hodowanych od polskich zwierząt przeprowadzona metodą MLVA i PFGE wykazała duże zróżnicowanie genetyczne szczepów tego gatunku. U szczepów B. henselae nie stwierdzono oporności in vitro na żaden stosowany w leczeniu antybiotyk. Stwierdzono, że szczepy o potwierdzonym metodami molekularnymi zasięgu europejskim mają wysokie wartości MIC dla gentamycyny i podwyższone wartości MIC dla ciprofloksacyny. Zagadnienie 5. Zaproponowanie metod i algorytmów prowadzenia rutynowej diagnostyki choroby kociego pazura i innych bartoneloz Wieczorek M., Elwertowski M., Podsiadły E., Kostrzewski P., Tylewska-Wierzbanowska S. Choroba kociego pazura diagnostyka i leczenie. Reumatologia 2011: 49: 294-297. Podsiadły E., Sapiejka E., Dąbrowska-Bień J., Majkowski J., Tylewska-Wierzbanowska S. Diagnostyka choroby kociego pazura oraz współczesne metody rozpoznawania bartoneloz- opis przypadku. Pol Merk Lek. 2009;152:131-136. Przedmiotem doniesień było przedstawienie możliwości potwierdzenia rozpoznania choroby kociego pazura (CSD) z zastosowaniem metod serologicznych i molekularnych. Przez wiele lat diagnostyka CSD w Polsce polegała na wykonywaniu mało swoistego badania histopatologicznego, które może jedynie wskazywać na CSD, gdyż podobne zmiany w węźle występują w przypadku limfadenopatii wywołanych przez różne bakteryjne czynniki np. gruźlica, tularemia. Zaproponowano nowy algorytm postępowania diagnostycznego w chorobie kociego pazura, w którym uwzględniono wprowadzenie kolejnego kryterium diagnostycznego: obecności DNA B. henselae w wycinkach z węzłów chłonnych. Jak wykazano w opublikowanych pracach, badanie to powinno stanowić podstawowe narzędzie diagnostyczne zarówno w przypadkach wyników wątpliwych jak i podstawowych badań różnicujących limfadenopatii, ponieważ CSD może przebiegać bez podwyższenia wskaźników zapalnych, co może sugerować chorobę rozrostową. Jednocześnie na podstawie przedstawionych przypadków poddano dyskusji zasadność podawania antybiotyków β- laktamowych w terapii CSD. Wykazano, że antybiotyki z tej grupy nie eradykują zakażenia str. 16
toczącego się w tkance węzła. W opisywanych przypadkach podanie amoksycyliny z kwasem klawulanowym, cefoperazonu, penicyliny krystalicznej, cefetametu piwoksylu nie zahamowało procesów chorobowych i doszło do zropienia węzłów chłonnych. Głównym czynnikiem uniemożliwiającym osiągnięcie efektu terapeutycznego był brak penetracji wewnątrzkomórkowej β-laktamów. Wnioski: Zaproponowano algorytm postępowania w diagnostyce choroby kociego pazura i innych bartoneloz w oparciu o opracowane i walidowane w toku badań metody. Podsumowanie Badania nad wektorem, rozpoznanie rezerwuaru, poznanie prewalencji Bartonella spp. w najbliższym otoczeniu człowieka oraz charakterystyka wyhodowanych w Polsce szczepów, stanowią uzupełnienie danych dotyczących zasięgu występowania i rozprzestrzeniania się nowo pojawiających się i nawracających patogenów. Piśmiennictwo 1. Norman AF., Regnery R., Jameson P., Greene C., Krause DC. Differentiation of Bartonella-like isolates at the species level by PCR-restriction fragment length polymorphism in the citrate synthase gene. J Clin Microbiol. 1995;33:1797-803. 2. Johnson G., Ayers M., McClure SC., Richardson SE., Tellier R. Detection and identification of Bartonella species pathogenic for humans by PCR amplification targeting the riboflavin synthase gene (ribc). J Clin Microbiol. 2003;41:1069-72. 3. Sanguinetti-Morelli D., Angelakis E., Richet H., Davoust B., Rolain JM., Raoult D. Seasonality of cat-scratch disease, France, 1999-2009. Emerg Infect Dis. 2011;17:705-7. 4. Cotté V., Bonnet S., Le Rhun D., Le Naour E., Chauvin A., Boulouis HJ., Lecuelle B., Lilin T., Vayssier-Taussat M. Transmission of Bartonella henselae by Ixodes ricinus. Emerg Infect Dis. 2008;14:1074-80. 5. Tenover FC., Arbeit RD., Goering RV., Mickelsen PA., Murray BE., Persing DH.,Swaminathan B. Interpreting chromosomal DNA restriction patterns produced by pulsed-field gel electrophoresis: criteria for bacterial strain typing. J Clin Microbiol. 1995;33:2233-9. 6. Monteil M., Durand B., Bouchouicha R., Petit E., Chomel B., Arvand M., Boulouis HJ., Haddad N. Development of discriminatory multiple-locus variable number tandem repeat analysis for Bartonella henselae. Microbiology.2007;153:1141-8. II. Omówienie pozostałych osiągnięć naukowo-badawczych Moje pozostałe badania naukowe dotyczą głównie riketsjoz, chlamydioz oraz zagadnień związanych z mikrobiologią medyczną. W związku z pracą w Samodzielnej Pracowni Riketsji, Chlamydii i Krętków Odzwierzęcych zaangażowałam się również w badania dotyczące innych niż Bartonella spp. bakterii należących do rzędu: Rickettsiales. W ramach realizowania tematów badawczych przez zespół, którego byłam członkiem, zajmowałam się między innymi identyfikacją i charakterystyką gatunków Rikettsia spp. występujących na terenie Polski. str. 17
W przeprowadzonych badaniach kleszczy, stanowiących wektor i rezerwuar tych bakterii, wykazaliśmy występowanie riketsji z grupy gorączek plamistych w kleszczach gatunku Ixodes ricinus i Dermacentor reticulatus. Klasyfikację izolatów riketsji do gatunku przeprowadzono w oparciu o sekwencje uzyskane dla 3 genów: glta, ompa, i genu dla rodzajowo specyficznego białka zewnątrzbłonowego o ciężarze 17 kda. Najczęściej, bo u 29% kleszczy (obu gatunków) zebranych z kilku rejonów Polski stwierdzono obecność DNA Rickettsia raoulti. W kleszczach I. ricinus wykryto chorobotwórcze gatunki: Rickettsia slovaca (0,5%) i Rickettsia helvetica (3,3%), do niedawna uważano, że ich północna granica występowania przebiega przez teren Słowacji i Czech (IIa1). W tych samych rejonach, skąd pochodziły zakażone kleszcze, stwierdzono występowanie u 14,7% pracowników leśnych swoistych przeciwciał dla riketsji z grupy gorączek plamistych (I3). Rejony geograficzne, w których występują zakażenia Rickettsia spp., zależą od zasięgu występowania przenoszących je kleszczy. Uzyskane wyniki wskazują, że I. ricinus, najpospolitszy gatunek kleszcza w Polsce, może mieć istotne znaczenie w szerzeniu się tych infekcji. Sytuacja ta dotyczy również gatunku D. reticulatus, ponieważ w ostatnim czasie pojawił się w piśmiennictwie opisy przypadków riketsjowej gorączki plamistej wywołanej przez R. raoulti - TIBOLA/DEBONEL (Tick-borne lymphadenopathy / Dermacentor-borne necrosis erythema lymphadenopathy) (Przegl Epidemiol 2012;66:347). Wyniki przeprowadzonych badań wskazują na potrzebę prowadzenia diagnostyki różnicowej w kierunku Rickettsia spp. w przypadkach chorób gorączkowych o nieznanej etiologii. Znaczącą część mojego dorobku naukowego po obronie tytułu doktora, zajmują publikacje będące kontynuacją tematu rozprawy dotyczące udziału C. pneumoniae w powodowaniu zmian miażdżycowych tętnic (IIa6, IIa7). Ciekawy aspekt tych badań stanowią analizy dotyczące miażdżycy tętnic szyjnych. W badaniu przeprowadzonym na grupie 36 chorych poddanych zabiegowi endarektomii tętnic szyjnych nie stwierdzono DNA C. pneumoniae w pobranych blaszkach miażdżycowych (IIb9). Kolejne badanie przeprowadzono na grupie 128 osób, u których metodą ultrasonografi określono wykładniki miażdżycy tętnic szyjnych takie jak grubość kompleksu intima-media (KIM) i powierzchnia przekroju poprzecznego blaszek miażdżycowych. Nie stwierdzono istotnych statystycznie różnic w grubości KIM i powierzchni blaszek miażdżycowych w grupach osób z dodatnim i ujemnym wynikiem PCR na obecność C. pneumoniae w leukocytach str. 18
krwi obwodowej (p>0,05). Najsilniejszymi czynnikami ryzyka rozwoju miażdżycy tętnic szyjnych była liczba białych krwinek (p<0,01), palenie tytoniu (p=0,026), nadciśnienie tętnicze (p=0,023) i stężenie CRP (p=0,036). W analizie jednoczynnikowej wykazano związek pomiędzy wykładnikami miażdżycy tętnic szyjnych a obecnością swoistych dla C. pneumoniae przeciwciał klasy IgG. Po standaryzacji poziom tych przeciwciał nie okazał się niezależnym czynnikiem ryzyka rozwoju miażdżycy (IIb6,IIa3). Na podstawie badań własnych oraz analizy wyników otrzymanych przez innych badaczy można stwierdzić, że rola zakażenia C. pneumoniae w rozwoju miażdżycy tętnic domózgowych jest dużo niższa, niż w przypadku tętnic wieńcowych. Tematyka prowadzonych badań dotycząca udziału C. pneumoniae w wywoływaniu chorób niezakaźnych została rozszerzona o badania dotyczące roli tych bakterii w procesie przewlekłego odrzucania nerek (IIa5, IIa6). Grupę badaną stanowiło 86 pacjentów po przeszczepie allogenicznym. U 46% (12/26) biorców z potwierdzonym histologicznie przewlekłym odrzucaniem przeszczepu stwierdzono obecność DNA C. pneumoniae w leukocytach krwi obwodowej. U osób bez zmian w przeszczepionej nerce materiał genetyczny tych bakterii wykryto u 20% (12/60) badanych (p<0,05). W analizie wieloczynnikowej obecność C. pneumoniae w leukocytach krwi obwodowej stanowiła najsilniejszy czynnik ryzyka wystąpienia procesu przewlekłego odrzucania nerki (p=0,001). Według danych literaturowych zakażenia C. pneumoniae pojawiają się u dzieci w wieku szkolnym między 5 a 15 rokiem życia. Zbadano 150 osób w wieku 1 tydzień 36 miesięcy (IIb7). U 13% (16/28) pacjentów z objawami zakażenia dróg oddechowych stwierdzono obecność swoistych przeciwciał klasy IgM dla C. pneumoniae. Najczęściej, bo u 32%, wykrywano świeże zakażenie u dzieci z zapaleniem oskrzeli. Uzyskane wyniki wskazały na sezonowość zakażeń dróg oddechowych o tej etiologii, ze szczytem zachorowań w miesiącach jesiennych. Wśród grupy kontrolnej 28 dzieci bez objawów zakażenia dróg oddechowych, przeciwciała klasy IgM dla C. pneumoniae stwierdzono u 2 z nich. Co sugeruje występowanie bezobjawowych zakażeń C. pneumoniae w tej grupie wiekowej. Uzyskane wyniki badań wskazują, że C. pneumoniae jest czynnikiem etiologicznym infekcji dróg oddechowych u dzieci poniżej 3 roku życia. Przewlekłe zapalenie tkanki migdałka gardłowego przebiegające zwykle z jego nadmiernym przerostem jest jedną z częstszych chorób wieku dziecięcego. W str. 19
przeprowadzonym badaniu zajęto się określeniem roli C. pneumoniae w patogenezie przerostu i przewlekłego stanu zapalnego migdałka gardłowego. Zbadano wycinki z usuniętej tkanki pobrane w czasie adenoidektomi od 200 dzieci w wieku 2-16 lat metodą real-time PCR. U 5,5% dzieci stwierdzono obecność DNA C. pneumoniae. Zakażenie C. pneumoniae występowało znacznie częściej (24,14%) w najstarszej grupie wiekowej (10-16 lat) w porównaniu z grupami dzieci młodszych (2,83%) (p<0,05). Nie stwierdzono istotnych statystycznie różnic w grupie dzieci PCR(+) i PCR(-) w zakresie wielkości migdałka gardłowego, występowania przewlekłego nieżytu nosa, kaszlu, nawracających infekcji górnych dróg oddechowych, wysiękowego zapalenia ucha środkowego, astmy, chorób o podłożu atopowym oraz częstości antybiotykoterapii. W grupie dzieci PCR(+) częściej (54,55%) niż w grupie PCR(-) (14,29%) występowały złe warunki socjoekonomiczne (p<0,01). Obecność tego patogenu głównie u dzieci starszych z klinicznymi cechami przerostu i przewlekłego stanu zapalnego migdałka gardłowego sugeruje udział C. pneumoniae, być może jako ko-patogenu, w wywoływaniu przewlekłego zapalenia migdałka gardłowego w grupie wiekowej, w której najczęściej dochodzi do zakażeń tymi bakteriami (publikacja w trakcie recenzji). Poza działalnością naukową i dydaktyczną, od 2010 roku jestem diagnostą laboratoryjnym w szerokoprofilowej Pracowni Mikrobiologii, którą kieruję. Od tego czasu zaczęłam zajmować się tematami badawczymi związanym z mikrobiologią medyczną. Moje zainteresowanie znalazło odzwierciedlenie w pracach poglądowych dotyczących ważnych patogenów wywołujących zakażenia szpitalne : metycylinoopornych szczepów Staphylococcus aureus oraz Pseudomonas aeruginosa wytwarzających metalo-β-laktamazy (MBL), jak również w opisie interesującego przypadku zakażenia cewnika centralnego wywołanego przez Nocardia spp. (IIb1 IIb2, IIb3). Jednocześnie we współpracy z Pracownią Biologii Molekularnej, Narodowego Instytutu Zdrowia Publicznego-Państwowego Zakładu Higieny rozpoczęłam badania dotyczące szczepów pałeczek z rodziny Enterobacteriaceae oraz pałeczek niefermentujących z rodzaju Pseudomonas produkujących MBL, wyhodowanych z próbek klinicznych podczas rutynowych badań mikrobiologicznych. Porównanie sekwencji genu bla VIM badanych szczepów wykazało u nich obecność metalo-β-laktamazy typu VIM-4. Przeprowadzone analizy wskazały na horyzontalny transfer genów, gdyż u wszystkich badanych szczepów stwierdzono występowanie genu bla VIM-4 na dużym plazmidzie str. 20
90kb, o identycznym profilu uzyskanym po trawieniu enzymem restrykcyjnym PstI (publikacja w trakcie przygotowania). Obecnie, po zaadaptowaniu opracowanej klasycznej reakcji PCR ze starterami komplementarnymi do fragmentu genu bla VIM-4 na reakcję metodą real-time PCR, rozprzestrzenienie się tego genu jest badane u innych hodowanych w obrębie tej samej placówki medycznej pałeczek Gram ujemnych wytwarzających MBL w celu oceny horyzontalnego rozprzestrzenienia się plazmidu niosącego gen bla VIM-4 w środowisku szpitala. W najbliższej przyszłości planuję zająć się tematyką związaną z zakażeniami Clostridium difficile w populacji pediatrycznej. Znaczenie C. difficile jako czynnika etiologicznego biegunek poantybiotykowych u dzieci jest ciągle nieokreślone. Jednak w latach 1997-2006 wskaźnik hospitalizacji spowodowanych zakażeniem Clostridium difficile wśród dzieci wzrósł z 7,24 do 12,80 (Emerg Infec Dis 2010;16:604). Metody diagnostyczne CDAD (C. difficile associated disease) nie umożliwiają jednoznacznego rozróżnienia stanu kolonizacji/nosicielstwa (która w tej grupie jest bardzo wysoka) i aktywnego zakażenia. Celem planowanego badania jest opracowanie panelu badawczego umożliwiającego rozpoznanie zakażeń C. difficile oraz określenie częstości występowania tych biegunek wśród dzieci. Wykaz innych (nie wchodzących w skład osiągnięcia wymienionego w pkt I) opublikowanych prac naukowych oraz wskaźniki dokonań naukowych W efekcie wykonania wyżej omówionych prac, mój dorobek po obronie tytułu doktora został uzupełniony o 7 prac posiadających impact factor i 10 publikacji bez impact factor. a. Publikacje naukowe w czasopismach znajdujących się w bazie Journal Citation Reports (JCR) 1. Chmielewski T., Podsiadly E., Karbowiak G., Tylewska-Wierzbanowska S. Rickettsia spp. in ticks, Poland. Emerg Infect Dis. 2009 ;15:486-488. [ IF 6,794] 2. Chmielewski T., Sidi-Boumedine K., Duquesne V., Podsiadly E., Thiéry R., Tylewska-Wierzbanowska S. Molecular epidemiology of Q fever in Poland. Pol J Microbiol. 2009;58:9-13. [IF-0,994] 3. Kaźmierski R., Watala C., Podsiadły E., Dorszewska J., Kozubski W. Association of atherosclerotic risk factors with carotid adventitial thickness assessed by str. 21
ultrasonography. J Clin Ultrasound. 2009; 37: 333-341. [IF- 0,91] 4. Fesołowicz S., Kwiatkowski A., Wszoła M., Podsiadły E., Ostrowski K., Durlik M.,Paczek L., Tylewska-Wierzbanowska S., Rowinski W., Chmura A. Chlamydia pneumoniae infection in patients after kidney transplantation treated with spiramycin. Transplant Proc. 2009; 41:167-169. [IF - 0,994] 5. Kwiatkowski A., Wszoła M., Nosek R., Podsiadły E., Meszaros J., Ostrowski K., Lisik W., Michalak G., Chmura A., Kosieradzki M., Danielewicz R., Fesołowicz S., Kasprzyk T., Pączek L., Durlik M., Persson K., Tylewska-Wierzbanowska S., Rowiński W. Chlamydia pneumoniae infection: an additional factor for chronic allograft rejection. Transplant Proc. 2006; 38: 108-111. [IF- 0,962] 6. Wszoła M., Kwiatkowski A., Nosek R., Podsiadły E., Meszaros J., Danielewicz R., Lisik W., Ostrowski K., Chmura A., Adadyński L., Pączek L., Durlik M., Tylewska- Wierzbanowska S., Rowiński W. Chlamydia pneumoniae infection and ischemic heart disease in hemodialysis patients. Transplant Proc. 2006;38:31-34. [IF- 0,962] 7. Podsiadły E., Przyłuski J., Kwiatkowski A., Kruk M., Wszoła M., Nosek R., Rowiński W., Rużyłło W., Tylewska-Wierzbanowska S. Presence of Chlamydia pneumoniae in patients with and without atherosclerosis. Eur J Clin Microbiol Infec Dis. 2005;24:507-513. [IF-2,061] b. Monografie, publikacje naukowe w czasopismach międzynarodowych lub krajowych innych niż znajdujące się w bazie, o której mowa w pkt II a: 1. Podsiadły E., Demkow U. Badania przesiewowe i diagnostyka zakażeń MRSA. Forum Zakażeń 2013; 4 (3):181-185. [MNiSW -3] 2. Obitko Płudowska A., Podsiadły E., Rogulska J., Demkow U., Matysiak M. Zakażenie cewnika centralnego Nocardia spp. u dziewczynki z ostrą białaczką limfoblastyczną. Onkol Pol. 2012;15:37-40. [MNiSW - 5] 3. Podsiadły E. Epidemiologia, patogeneza i kontrola zakażeń szpitalnych wywołanych przez Pseudomonas aeruginosa wytwarzające enzymy typu MBL. Nowa Klinika 2011;18:4037-4044. 4. Januszkiewicz A., Podsiadły E., Szych J., Semkowicz-Chmielewska A., Demkow U., Pierzchlewicz A., Rastawicki W. Charakterystyka fenotypowych i genotypowych właściwości werotoksycznego szczepu E. coli O111 str. 22