STREPTOCOCCUS AGALACTIAE (GBS) CHARAKTERYSTYKA SZCZEPÓW IZOLOWANYCH Z DRÓG RODNYCH KOBIET W OKRESIE ROZRODCZYM

MED. DOŚW. MIKROBIOL., 2010, 62: 141-151 Katarzyna Wolny 1, Ewa Gołda Matuszak 2 STREPTOCOCCUS AGALACTIAE (GBS) CHARAKTERYSTYKA SZCZEPÓW IZOLOWANYCH Z DRÓG RODNYCH KOBIET W OKRESIE ROZRODCZYM 1 Katedra Mikrobiologii, Uniwersytet Rolniczy im. Hugona Kołłątaja w Krakowie. Kierownik: prof. dr hab. W. Barabasz 2 Centrum Badań Mikrobiologicznych i Autoszczepionek im. dr Jana Bobra w Krakowie. Kierownik: dr A. Kasprowicz Celem pracy była charakterystyka szczepów S. agalactiae izolowanych od kobiet w okresie rozrodczym. Podczas prowadzonych badań określono odsetek kobiet skolonizowanych S. agalactiae, oceniono przydatność metod aktualnie stosowanych w diagnostyce mikrobiologicznej do wykrywania obecności GBS, a także określono lekowrażliwość i serotyp badanych szczepów. Paciorkowce to Gram-dodatnie ziarniaki, należące do rodzaju Streptococcus. Charakteryzują się odmiennymi właściwościami hodowlanymi oraz różnią się chorobotwórczością (27). Streptococcus agalactiae należy do grupy serologicznej B, w preparacie barwionym metodą Grama barwi się na kolor fioletowy a bakterie ułożone są w pary lub krótkie łańcuszki. Na podłożu agarowym z krwią baranią rośnie w postaci szarobiałych, drobnych kolonii otoczonych wąską strefą beta hemolizy, występują także szczepy z hemolizą gamma (21). S. agalactiae kolonizuje dolny odcinek przewodu pokarmowego, odbyt oraz środowisko pochwy. Dane epidemiologiczne podają, że obecność GBS (Group B Streptococcus) stwierdza się u 10 30% zdrowych kobiet, które z reguły nie wykazują żadnych objawów stanu zapalnego. S. agalactiae jest szczególnie niebezpieczny dla kobiet ciężarnych. GBS intensywnie namnaża się w środowisku pochwy podczas ciąży i stanowi realne zagrożenie dla matki i płodu. Do zakażenia płodu może dojść dwoma drogami. Dzieje się to albo na skutek zaaspirowania zakażonego płynu owodniowego przez płód i mówimy wtedy o tzw. zakażeniu drogą wstępującą lub też może dojść do niego podczas porodu (5,6,14). GBS są przyczyną ciężkiej inwazyjnej choroby u noworodków. Zakażenia noworodków klasyfikowane są jako wczesne, gdy proces chorobowy rozwija się do pierwszego tygodnia życia i objawia się pod postacią posocznicy i zapalenia płuc, rzadziej zapalenia opon mózgowo rdzeniowych, mówimy wtedy o tzw. wczesnym zespole chorobowym. Gdy objawy pojawią się po siódmym dniu życia i trwają do trzeciego miesiąca oraz przypominają zapalenie opon mózgowo rdzeniowych, wtedy mówimy o późnym zespole chorobowym. U kobiet w ciąży lub zaraz po porodzie paciorkowce grupy B są odpowiedzialne za zapa-

142 K. Wolny, E. Gołda-Matuszak Nr 2 lenie dróg moczowych, błon płodowych i śluzówki macicy oraz za posocznicę, rzadko za zapalenie opon mózgowo rdzeniowych. U osób dorosłych i tych, które ukończyły 60 rok życia, zwłaszcza z obniżoną odpornością oraz przewlekłymi chorobami, mikroorganizm ten wywołuje zapalenie dróg moczowych, płuc, wsierdzia, opon mózgowo rdzeniowych, a także zapalenie skóry i tkanki podskórnej (14,27). S. agalactiae z epidemiologicznego punktu widzenia, budzi szczególny niepokój, dlatego celem poniższej pracy było: określenie częstości izolacji S. agalactiae u kobiet w okresie rozrodczym ocena przydatności metod aktualnie stosowanych w diagnostyce mikrobiologicznej do wykrywania obecności GBS określenie stopnia zróżnicowania fenotypowego wykazanie różnic biochemicznych i lekowrażliwości pomiędzy szczepami GBS wykazującymi hemolizę i nie wykazującymi hemolizy określenie serotypu badanych szczepów S. agalactiae MATERIAŁ I METODY Wszystkie badania zostały wykonane w Centrum Badań Mikrobiologicznych i Autoszczepionek im. dr Jana Bobra w Krakowie. Do badań wykorzystano szczepy zgromadzone w latach 2008 2009. Materiał do badań stanowiło 380 szczepów paciorkowców β hemolizujących i nie wykazujących hemolizy izolowanych z próbek pobranych z dróg rodnych 1727 kobiet w wieku rozrodczym, będących pacjentkami CBMiA w Krakowie. Materiał poddano standardowym procedurom hodowlanym. Z uzyskanych hodowli izolowano kolonie drobne, szare, gładkie z hemolizą oraz bez hemolizy. Identyfikacja polegała na ocenie mikroskopowej komórek bakteryjnych oraz na potwierdzeniu czystości kolonii. Zakwalifikowane do badań szczepy namnożono i poddano dalszej analizie. Z kolonii, które wyrosły na podłożu agarowym z krwią, sporządzono preparaty, barwiono metodą Grama i dokonywano obserwacji mikroskopowych. Kolejnym etapem było wykonanie testu na obecność katalazy a następnie testu serologicznego wg Lancefield przy użyciu zestawu surowic Slidex Strepto Plus (biomerieux, Francja). Właściwości hodowlane zgromadzonych szczepów S. agalactiae badano z zastosowaniem podłoża TSA z 5% krwi baraniej (Becton&Dickinson, podłoże własne) oraz podłoży wybiórczych: Strepto B ID, Granada agar, (biomerieux, Francja). Paciorkowce identyfikowano przy użyciu testów API 20 Strep (biomerieux, Francja). Po zidentyfikowaniu szczepów S. agalactiae badano ich wrażliwość na antybiotyki (ampicylina, azytromycyna, chloramfenikol, ciprofloksacyna, doksycyklina, erytromycyna, klindamycyna, kotrimoksazol), obecność mechanizmu MLS B oraz oznaczono MIC (minimalne stężenie antybiotyku w µg/ml) i przy użyciu E-testów (biomeriux, Francja). Korzystano z metodyki zalecanej przez Krajowy Ośrodek Referencyjny ds. Lekowrażliwości Drobnoustrojów (KORLD). (9) Serotypowanie wyizolowanych szczepów wykonano przy użyciu zestawu GBS Serotyping Test (ESSUM ProBiotics, Szwecja), jest to zestaw 6 fiolek zawierających odpowiednie przeciwciała dla serotypów: Ia, Ib, II, III, IV, V.

Nr 2 Charakterystyka szczepów S. agalactiae 143 WYNIKI I ICH OMÓWIENIE Wszystkie przebadane szczepy zidentyfikowane później jako S. agalactiae (n=380, 22%) należały do bakterii Gram-dodatnich, grupy serologicznej B oraz nie produkowały katalazy. Takie same wyniki uzyskiwali inny autorzy, którzy jednocześnie wskazują w swoich publikacjach na konieczność prowadzenia wstępnej identyfikacji, jako punktu wyjścia dla dalszych analiz (4,6,7,8,11,12,14,17,18). W przeprowadzonych badaniach, w celu prowadzenia obserwacji makroskopowych wzrostu kolonii bakteryjnych, materiały od pacjentek posiewano na podłoże podstawowe TSA z 5% krwi baraniej oraz podłoża wybiórcze, chromogenne tj. Strepto B ID i Granada agar (biomerieux, Francja). Na podłożu TSA z 5% krwi baraniej paciorkowce z hemolizą β (n=358) rosły w postaci drobnych, szarych i błyszczących kolonii otoczonych wąskim, jasnym pierścieniem. Na tym samym podłożu dało się zaobserwować S. agalactiae bez hemolizy β, z tzw. hemolizą gamma (γ), w badanym materiale stanowiły one 6% (n=22). Porównano odsetek izolacji S. agalactiae z dróg rodnych kobiet w okresie rozrodczym w zależności od rodzaju zastosowanego podłoża (Tabela I) Tabela I. Procent izolacji S. agalactiae w 1727 materiałach z dróg rodnych w zależności od rodzaju podłoża. Liczba uzyskanych izolatów GBS Rodzaj podłoża 380 (100%) Podłoże TSA + 5% krwi baraniej (podłoże uniwersalne do hodowli paciorkowców z hemolizą β i γ) Kolonie z β hemolizą 358 (94%) Podłoże Strepto B ID (podłoże wybiórcze do hodowli paciorkowców z hemolizą β i γ) Kolonie czerwone 380 (100%) Podłoże Granada agar (podłoże wybiórcze do hodowli paciorkowców z hemolizą β) Kolonie pomarańczowe 358 (94%) S. agalactiae nie wytwarzający hemolizyn może zostać przeoczony podczas rutynowej diagnostyki i stać się powodem brzemiennego w skutki zakażenia okołoporodowego (2,4,6,8,12,14,17,18,22). Dlatego właśnie zaleca się stosowanie podłoży, które ułatwiają wykrycie maskujących się paciorkowców. Agar Strepto B ID (biomerieux, Francja) jest wybiórczym podłożem chromogennym do badań przesiewowych w kierunku wykrywania S. agalactiae. Specjalnie dobrany skład podłoża zapewnia charakterystyczny wzrost dla S. agalactiae. Kolonie wybarwiają się spontanicznie na kolor od bladoróżowego do czerwonego, są okrągłe i perłowe. Przeprowadzone badania pokazały, że wszystkie szczepy (n=380) zidentyfikowane jako S. agalactiae na tym podłożu rosły w charakterystyczny dla tego gatunku sposób. Ponadto zastosowanie w diagnostyce podłoża Strepto B ID (biomerieux, Francja) pomogło w wychwyceniu kolonii nie wykazujących hemolizy β. Użycie podłoży wybiórczych podnosi wykrywalność S. agalactiae, co pokazują także prace innych autorów. (20,22) W trakcie badań prowadzonych w Szpitalu Klinicznym im. Ks. Anny Mazowieckiej w Warszawie analizowano 250 wymazów od pacjentek. S. agalactiae wyhodowano w 12,4% analizowanych materiałów przy użyciu podłoża TSA + 5% krwi baraniej (podłoże własne)

144 K. Wolny, E. Gołda-Matuszak Nr 2 i Granada agar (biomerieux, Francja). Po zastosowaniu podłoża Strepto B ID (biomerieux, Francja) wykrywalność S. agalactiae w tym samym materiale wzrosła do 14,8% (20). Na podstawie przeprowadzonych badań oraz analiz ośrodka warszawskiego można stwierdzić, że ocena izolacji S. agalactiae w zależności od rodzaju podłoża wykazała przewagę podłoża Strepto B ID nad pozostałymi (TSA z 5% krwi baraniej, Granada agar). Zarówno w przeprowadzonych badaniach jak i u innych autorów (20,22) widać konieczność stosowania podłoży wybiórczych w rutynowej diagnostyce w celu podniesienia wykrywalności S. agalactiae. Z danych piśmiennictwa wynika, że odsetek kobiet będących nosicielkami S. agalactiae zawiera się w przedziale od 3% do 40% (3,6,11,12,14,18,22,23). Istnieje bardzo duże zróżnicowanie w ilości skolonizowanych kobiet w poszczególnych krajach. Badania prowadzone w Turcji w 2006 roku wykazały nosicielstwo na poziomie 14,6% (24), takie same wyniki uzyskano w Brazylii rok później (18). W Polsce nosicielstwo zostało stwierdzone na poziomie 19,7% (12) oraz 17,2% (6). Nieco odmienne dane, dotyczące kolonizacji paciorkowcami grupy B wśród kobiet ciężarnych, podaje Katedra i Klinika Położnictwa i Ginekologii Śląskiej Akademii Medycznej w Katowicach-Ligocie. Na podstawie wyników prac w tym ośrodku wykazano kolonizację paciorkowcami grupy B jedynie u 23 kobiet na 701 włączonych do badania, co stanowiło zaledwie 3,3% (23). Włoskie badania przesiewowe donoszą o kolonizacji rzędu 18% (17). Wysoką kolonizację kobiet w wieku rozrodczym wykazano w Czechach 25% (16). Podczas wykonywania badań przebadano 1727 kobiet w wieku rozrodczym - paciorkowce S. agalactiae wyizolowano w 22% przypadków (380 kobiet). Taka rozbieżność wyników może być skutkiem nieco innych zasad pobierania materiałów od pacjentek oraz odmiennych procedur mikrobiologicznych. Identyfikacji gatunkowej badanych szczepów dokonano przy użyciu testu API 20 Strep (biomerieux, Francja). Jest to wystandaryzowany zestaw zawierający 20 testów biochemicznych, który umożliwia identyfikację grup lub gatunków większości paciorkowców. Dwudziesty pierwszy test stanowi reakcja hemolizy, jej obecność lub brak. Wszystkie 380 szczepów wyizolowanych od kobiet w okresie rozrodczym zostało zidentyfikowanych jako S. agalactiae na poziomie dobrym lub bardzo dobrym. Otrzymane wyniki potwierdziły tym samym wcześniej wykonane analizy (barwienie Grama, test na katalazę, testy hodowlane, grupa serologiczna wg. Lancefield). Identyfikacja biochemiczna przy użyciu testu biomerieux jest wiarygodna i zalecana szczególnie do analizy przypadków wątpliwych. (5,6,7) Dzięki zestawowi API 20 Strep podzielono zidentyfikowane szczepy na biotypy z uwzględnieniem rodzaju hemolizy. Najliczniejszą grupę stanowiły szczepy o wzorze 3463414 (33%). Drugie w kolejności, co do liczebności szczepy S. agalactiae, należały do biotypu 3463014 (21%). Na trzecim i czwartym miejscu znalazły się biotypy: 3463004 (9%) i 3463011 (6%). (Tabela II) Wśród szczepów S. agalactiae wykazujących hemolizę (n=358) najliczniejszą grupę stanowił biotyp 3463414 (38%). Na drugim miejscu znalazły się szczepy o wzorze 3463014 (24%), na trzecim - 3463004 (10%) a na czwartym - 3463404 (6%) (Tabela II). Wśród szczepów S. agalactiae nie wykazujących hemolizy (n=22) najliczniejszą grupę stanowił biotyp 3463011 (45,5%). Na drugim miejscu znalazły się szczepy o wzorze 3463010 (14%), na trzecim - 3463410 (9%) i 3463411 (9%). (Tabela II) Na podstawie oceny biochemicznej stwierdzono, że inne biotypy dominowały wśród paciorkowców z hemolizą β a inne wśród paciorkowców nie wykazujących hemolizy.

Nr 2 Charakterystyka szczepów S. agalactiae 145 Tabela II. Procentowy udział biotypów S. agalactiae w puli badanych szczepów (n=380). Biotyp Wszystkie Szczepy z hemolizą Szczepy bez Biotyp Biotyp szczepy (n=380) (n=358) hemolizy (n=22) 3463414 33% 3463414 38% 3463011 45,5% 3463014 21% 3463014 24% 3463010 14% 3463004 9% 3463004 10% 3463410 9% 3463011 6% 3463404 6% 3463411 9% 3463404 5% 3461014 4% 3063451 4,5% 3461014 3% 3463015 4% 3661010 4,5% 3463415 3% 3463415 3% 3671010 4,5% 3463015 3% 3462414 1% 3461000 4,5% 3463010 2% 3433004 1% 3461312 4,5% 3462414 1% 3473414 1% 3433004 1% Inne 8% 3473414 1% 3463410 1% 3463411 1% Inne 10% W grupie paciorkowców β-hemolizujących dominujące biotypy miały inne wzory niż w przypadku paciorkowców nie wykazujących hemolizy. W najwyższym odsetku wśród paciorkowców z hemolizą β izolowano biotypy: 3463414 (38%), 3463014 (24%), 3463004 (10%), 3463404 (6%). Dla paciorkowców bez hemolizy układ jest inny: 3463011 (45,5%), 3463010 (14%), 3463410 (9%), 3463411 (9%). Przeprowadzone badania wskazują, że inne wzory biochemiczne dominują w wśród paciorkowców z hemolizą β a inne wśród paciorkowców bez hemolizy. Ten fakt jest szczególnie niepokojący, gdy weźmiemy pod uwagę, że paciorkowce z hemolizą γ stanowią 6% (22 izolatów) w przeprowadzonych badaniach i jak już wspomniano, są trudne do identyfikacji. W celu zbadania wrażliwości S. agalactiae na antybiotyki zbadano wszystkie wyizolowane szczepy z hemolizą oraz bez hemolizy (n=380). Odsetek szczepów wrażliwych, średnio wrażliwych i opornych na poszczególne antybiotyki przedstawiono na rycinie 1. Wszystkie szczepy były wrażliwe na ampicylinę oraz na kotrimoksazol. Równie wysoką wrażliwość wykazały w stosunku do chloramfenikolu (99% wrażliwych, 1% opornych). Wobec azytromycyny 72% szczepów było wrażliwych a 28% - opornych. W przypadku erytromycyny 72% szczepów było wrażliwych, 3% - średnio wrażliwych a 25% - opornych. Podobnie dla klindamycyny 79% stanowiły szczepy wrażliwe, 2% - średnio wrażliwe, 19% - oporne. Szczepy wrażliwe na ciprofloksacynę stanowiły 70% wszystkich badanych szczepów, średnio wrażliwe - 29% a oporne - 1%. Najwyższą oporność wykazały badane szczepy w stosunku do doksycykliny 50% opornych, 26% - średnio wrażliwych i 24% - wrażliwych. Nie wykryto szczepów S. agalactiae opornych na penicylinę, co potwierdzają aktualne wyniki badań z ośrodków na całym świecie (1,3,4,8,13,15,16,17,24). Odsetek opornych szczepów na erytromycynę w badaniach innych autorów był zróżnicowany i wynosił: 3,8% (16), 4% (13), 5,9% (4), 16,3% (1), 23,9% (15), 24,5%.(24) Podobny

146 K. Wolny, E. Gołda-Matuszak Nr 2 Ryc. 1. Obraz lekowrażliwości 380 szczepów S. agalactiae izolowanych z dróg rodnych kobiet w okresie rozrodczym (n=1727) rozrzut wartości obserwujemy w przypadku oporności S. agalactiae na klindamycynę: 3,2% (16), 4% (13), 13,6% (1), 19,4% (24), 20% (15). Badanie lekooporności na antybiotyki wykonano ze szczególnym uwzględnieniem mechanizmu MLS B. Wśród 380 przebadanych szczepów S. agalactiae znaleziono 4 (1%) szczepy wykazujące mechanizm indukcyjny - imls B oraz 102 (27%) szczepy wykazujące mechanizm konstytutywny - kmls B. Wynik ten potwierdzają badania prowadzone w Hiszpanii - tam szczepy z mechanizmem konstytutywnym - kmls B stanowiły 10,4% (n=221), z mechanizmem indukcyjnym imls B 3,2% z fenotypem M 2,7% (1). Bardzo niepokojącym zjawiskiem jest narastanie oporności na makrolidy, linkosamidy i streptograminy B w wyniku nabywania przez szczepy mechanizmu oporności MLS B typu indukcyjnego lub konstytutywnego. Ta tendencja wskazuje na konieczność wprowadzenia na terenie całego kraju zaleceń o których była już tutaj wcześniej mowa, a dotyczących badania nosicielstwa GBS z zastosowaniem ujednoliconych metod diagnostycznych. Wyniki uzyskane w przeprowadzonych badaniach pokazują, że 26% szczepów S. agalactiae było opornych na azytromycynę z czego 24% szczepów należało do wysoce opornych (MIC 256). W badaniach autorów hiszpańskich 16,3% szczepów było opornych na ten antybiotyk (MIC=8) (1). Analiza wartości MIC dla doksycykliny, antybiotyku zwykle używanego w leczeniu zakażenia dróg rodnych, wykazała wysoki odsetek szczepów opornych (55%). Wśród szczepów średnio wrażliwych stwierdzono wartości MIC zbliżające się do granicy oporności (MIC 16). Wysoką oporność rzędu 83,9% na antybiotyki z grupy tetracyklin, do których należy doksycyklina, odnotowano w Czechach (16). Rozkład wartości MIC dla ciprofloksacyny wskazuje na niebezpieczną tendencję przechodzenia szczepów z kategorii wrażliwych (MIC 1) do kategorii średnio wrażliwych (MIC=2). Większość szczepów opornych dla klindamycyny należała do wysoce opornych 19% (MIC 256). Odnotowano wysoki odsetek szczepów wrażliwych na klindamycynę (79%). Podobny wynik uzyskano w Hiszpanii 13,6% szczepów opornych (1). Inaczej sprawa

Nr 2 Charakterystyka szczepów S. agalactiae 147 wygląda w badaniach prowadzonych w Chile i Czechach, tam procent szczepów opornych wynosił kolejno: 4% (13) i 3,2% (16). Analiza wartości MIC dla chloramfenikolu dowodzi, że prawie wszystkie szczepy (98,5%) były wrażliwe na ten antybiotyk. Wysoce opornych na erytromycynę było 19% szczepów (MIC 256) a 73,5% szczepów było na nią wrażliwych. Podobny wynik uzyskano w Hiszpanii 16,3% szczepów opornych. (1) Inaczej sprawa wygląda w badaniach prowadzonych w Chile i Czechach, tam procent szczepów opornych wynosił kolejno: 4% (13) i 3,8% (16). 100% szczepów S. agalactiae było wrażliwe na ampicylinę i kotrimoksazol. Takie same wyniki dotyczące wrażliwości S. agalactiae uzyskali inni autorzy (1,13,16). Zauważono pewne różnice dotyczące lekowrażliwości na antybiotyki pomiędzy paciorkowcami-β a paciorkowcami nie wykazującymi hemolizy. Paciorkowce bez hemolizy wykazywały większą oporność na azytromycynę. Z kolei paciorkowce-β były bardziej oporne na doksycyklinę i erytromycynę. W obrębie pozostałych antybiotyków nie odnotowano istotnych różnic. Na podstawie różnic w budowie polisacharydów powierzchniowych w obrębie gatunku S. agalactiae wyróżniono 9 serotypów: Ia, Ib, II, III, IV, V, VI, VII, VIII, (IX) (19). Z szeregu badań epidemiologicznych wynika, że inwazyjne infekcje w krajach Europy Zachodniej i Stanów Zjednoczonych wywoływane są najczęściej przez serotypy Ia, II, III i V. W krajach azjatyckich dominują serotypy VI i VIII a w krajach arabskich serotyp IV (14,17). Serotypowaniu przy użyciu zestawu GBS Serotyping Test (ESSUM ProBiotics) poddano szczepy S. agalactiae zaliczone do biotypów dominujących (3063451, 3461014, 3462414, 3463004, 3463010, 3463011, 3463014, 3463404, 3463405, 3463410, 3463411, 3463414, 3463415, 3463416, 3661010, 3671010). (n=72) Najliczniej występowały serotypy: III (50%), Ia (18%) i V (14%). Odnotowano także występowanie serotypów: IV (4%), Ib (3%) i II (3%). Jako NT zostały oznaczone serotypy niezidentyfikowane, stanowiły one 4%. Autoaglutynacji uległo 4% szczepów, z tego powodu nie zostały zakwalifikowane do żadnej z grup. (Ryc.2) Wśród szczepów z hemolizą β najliczniej występowały serotypy: III (45%), Ia (23%) i V (17%). Odnotowano także występowanie serotypów: IV (5%), Ib (4%) i II (2%). Jako Ryc. 2. Streptococcus agalactiae z hemolizą i bez hemolizy procentowy udział wybranych serotypów w puli badanych szczepów (n= 72)

148 K. Wolny, E. Gołda-Matuszak Nr 2 NT zostały oznaczone serotypy niezidentyfikowane, stanowiły one 2%. Autoaglutynacji uległo 2% szczepów, z tego powodu nie zostały zakwalifikowane do żadnej z grup. (Ryc.3) Ryc. 3. Streptococcus agalactiae z hemolizą procentowy udział wybranych serotypów w puli badanych szczepów (n= 58) Wśród szczepów bez hemolizy β najliczniej wystąpił serotyp: III (72%). Odnotowano także występowanie serotypu: II (7%). Serotypy: Ia, Ib, IV, V nie wystąpiły. Jako NT zostały oznaczone serotypy niezidentyfikowane, stanowiły one 7%. Autoaglutynacji uległo 14% szczepów, z tego powodu nie zostały zakwalifikowane do żadnej z grup (Ryc.4). Ryc.4. Streptococcus agalactiae bez hemolizy procentowy udział wybranych serotypów w puli badanych szczepów (n= 14) Przeprowadzone badania pokazują, że dominującym serotypem zarówno dla paciorkowców z hemolizą β jak i bez hemolizy był serotyp III stanowiący odpowiednio 45% i 72%. Jakkolwiek wśród paciorkowców-β można wyróżnić wszystkie badane serotypy (Ia, Ib, II, III, IV, V) oraz serotypy NT a także szczepy z autoaglutynacją, tak wśród paciorkowców bez hemolizy poza serotypem III jest jeszcze tylko serotyp II (7%) oraz 7% szczepów NT i szczepów z autoaglutynacją (14%).

Nr 2 Charakterystyka szczepów S. agalactiae 149 Uzyskane wyniki są zbieżne z wynikami badań przeprowadzonymi w Czechach, gdzie także dominowały serotypy: III (33,2%), Ia (22%) i V (13,9%) (16). Podobnie sytuacja przedstawiała się we Włoszech, gdzie udział wyżej wymienionych serotypów wynosił: III (32,9%), V (26,1%) i Ia (20,5%) (17) oraz w Atlancie w Stanach Zjednoczonych: III (53%), Ia (24%), V (13%). (10) S. agalactiae jest bez wątpienia dużym zagrożeniem dla kobiet w ciąży i noworodków, dlatego ciągle poszukuje się metod zapobiegania tym zakażeniom. Do tej pory zaproponowano dwa sposoby postępowania: profilaktyczne podawanie antybiotyków lub szczepienia ochronne. Paciorkowce grupy B są wrażliwe na penicylinę i ten właśnie antybiotyk jest podawany w pierwszej kolejności, można go także zastąpić ampicyliną, erytromycyną lub klindamycyną. Stosowanie powszechnej antybiotykoterapii stwarza zagrożenie pojawienia się szczepów opornych (2,4,16,17,18,20,25,26). Z przeprowadzonych badań wynika jednoznacznie, iż istnieje tendencja do przechodzenia szczepów S. agalactiae z kategorii wrażliwych do kategorii średnio wrażliwych i wreszcie opornych na niektóre grupy chemioterapeutyków (fluorochinolony, tetracykliny). Drugą możliwością postępowania profilaktycznego byłoby opracowanie i zastosowanie szczepionki zawierającej wielocukry otoczkowe. Prace badawcze zakończyły się sukcesem uzyskano wysoce immunogenny preparat zawierający oczyszczone otoczkowe wielocukry typów I i III skoniugowane z toksoidem tężcowym. Niestety, czas wprowadzenia szczepionki na rynek nie jest znany (2). Publikacje z całego świata wskazują na fakt istnienia geograficznego zróżnicowania w występowaniu poszczególnych serotypów (Ia, Ib, II, III, IV, V, VI, VII, VIII) - w związku z tym, nie jesteśmy w stanie opracować jednej uniwersalnej szczepionki (14,16,17,18,25,26). Ponadto nie wiadomo, jak długo utrzymuje się odporność poszczepienna, a także jak wprowadzenie szczepionki wpłynie na epidemiologię zakażeń. Pozostaje kwestią do rozstrzygnięcia komu i kiedy należy podawać szczepionkę anty GBS (czy tylko kobietom ciężarnym, czy wszystkim nastolatkom, a może dopiero kobietom w wieku rozrodczym). W obecnej sytuacji jedynym sposobem walki z zakażeniami S. agalactiae pozostaje profilaktyka antybiotykowa. Należy jednak pamiętać o racjonalnym jej stosowaniu oraz stale monitorować czynniki etiologiczne zakażeń okołoporodowych i ich lekowrażliwość (2). PODSUMOWANIE 1. Dwadzieścia dwa procent przebadanych kobiet w okresie rozrodczym było skolonizowanych przez S. agalactiae (380 izolatów GBS/1727 kobiet) 2. Sześć procent (22/380 GBS) puli zgromadzonych szczepów stanowił S. agalactiae bez hemolizy 3. W rutynowej diagnostyce należy obok podłoży ogólnych (TSA + 5% krwi baraniej) stosować podłoża wybiórcze (Strepto B ID, Granada agar) 4. Zaobserwowano znaczące różnice pomiędzy S. agalactiae z hemolizą β i bez hemolizy (inny wzrost na podłożach TSA z 5% krwi baraniej oraz Granada agar, różne biotypy, serotypy) 5. Serotypami dominującymi były: III (50%), Ia (18%) i V (14%) 6. Niezbędne jest ciągłe monitorowanie oporności szczepów na antybiotyki oraz prowadzenie racjonalnej antybiotykoterapii 7. Należy bezwzględnie stosować Rekomendacje Polskiego Towarzystwa Ginekologicz-

150 K. Wolny, E. Gołda-Matuszak Nr 2 nego dotyczące wykrywania nosicielstwa paciorkowców grupy B (GBS) u kobiet w ciąży i zapobiegania zakażeniom u noworodków wydanych w Polsce w 2008 roku na temat konieczności wykonywania badań między 35 a 37 tygodniem ciąży oraz zapobiegania zakażeniom S. agalactiae u noworodków K. Wolny, E. Gołda Matuszak STREPTOCOCCUS AGALACTIAE (GBS) THE CHARACTERISTIC OF ISOLATED STRAINS FROM PRODUCTIVE WOMEN S VAGINA SUMMARY The main aim of my research: to determine the frequency of colonisation Streptococcus agalactiae from productive women s vagina, an evaluation of usefulness microbiological diagnostic methods to detect GBS, to define serotype of analysed strains of S. agalactiae. After all, I tried to define fenotypic differential, biochemical and antimicrobial susceptibility between GBS with and without hemolysis. All of strains S.agalactiae (n=380) belong to bacteria Gram(+), they had B serologic group and didn t produce catalase. On the basis of TSA+5% sheep blood streptococcus with β-hemolysis grew like a small, grey and shiny colonies with a narrow, bright ring. On the same base we had S. agalactiae without β-hemolysis, in examine material 6% (n=22). On the basis of Strepto B ID S. agalactiae grew like a small, round red colonies and on the base Granada agar like an orange, white colonies. The level of colonisation S. agalactiae was 22% (380GBS/1727women). Identification of analysed strains of S. agalactiae was made by test API 20 Strep. The susceptibility was examined to ampicilin, azithromycin, erythromycin, clindamycin, chloramphenicol, doxycyclin, cotrimoxasol, ciprofloxacin. Serotypes III (50%), Ia (18%) and V (14%) prevailed. PIŚMIENNICTWO 1. Aracil B, Minambres M, Oteo J i inni. Susceptibility of strains of Streptococcus agalactiae to macrolides and lincosamides, phenotype patterns and resistance genes. Clin Microbiol Infect; 2002, 8: 745-8 2. Bacz A. Zapobieganie zakażeniom perinatalnym paciorkowcami grupy B. Aktualne wytyczne Centers for Disease Control and Prevention. Medycyna Praktyczna Ginekologia i Położnictwo 2003 3. Barcaite E, Bartusevicus A, Tameliene R i inni. Prevalence of maternal group B streptococcal colonisation in European countries. Acta Obstet Gynecol Scand 2008, 87: 260-71 4. Biól A, Zaragoza M, Biól R. Serotypes and antimicrobial susceptibility of group B Streptococcus isolated from pregnant women in Mexico 2002; 44: 133-6 5. Brzychczy-Włoch M, Strus M, Pawlik D i inni. Ocena możliwości zastosowania metod molekularnych do diagnostyki nosicielstwa oraz analizy podobieństwa izolatów Streptococcus agalactiae. Med Dośw Mikrobiol 2008; 60: 91-9 6. Brzychczy-Włoch M, Strus M, Pawlik D i inni. Narastanie stopnia kolonizacji kobiet w ciąży i noworodków przez Streptococcus agalactiae na obszarze Polski południowo-wschodniej. Med Dośw Mikrobiol 2008; 60: 5-12 7. Dąbrowska-Szponar M, Galiński J. Typowanie biochemiczne jako metoda różnicowania paciorkowców grupy B. Med Dośw Mikrobiol 2001; 53: 227-32 8. Heczko P, Niemiec T, Lauterbach R i inni. Zalecenia dotyczące wykrywania nosicielstwa paciorkowców grupy B (GBS) u kobiet w ciąży i zapobiegania zakażeniom u noworodków spowodowanym przez ten drobnoustrój. 2008, Numer 2, Kraków

Nr 2 Charakterystyka szczepów S. agalactiae 151 9. Hryniewicz W, Sulikowska A, Szczypa K i inni. Rekomendacje doboru testów do oznaczania wrażliwości bakterii na antybiotyki i chemioterapeutyki. 2006, Narodowy Instytut Zdrowia Publicznego 10. Jordan HT, Farley MM, Craig A i inni. Revisiting the need for vaccine prevention of late-onset neonatal group B streptococcal disease: a multistate, population-based analysis. Pediatr Infect Dis J 2008; 27: 1057-64 11. Kotarski L, Heczko P, Lauternbach R i inni. Rekomendacje Polskiego Towarzystwa Ginekologicznego dotyczące wykrywania nosicielstwa paciorkowców grupy B (GBS) u kobiet w ciąży i zapobiegania zakażeniom u noworodków. Ginekol Pol 2008; 79: 221-3 12. Kowalska B, Niemiec K, Drejewicz H i inni. Częstość występowania kolonizacji paciorkowcami β hemolizującymi grupy B kobiet ciężarnych i noworodków określona na podstawie badań przeprowadzonych u pacjentek polikliniki i kliniki położnictwa i ginekologii Instytutu Matki i Dziecka badania pilotażowe. Gin Pol 2003, 74, 10 13. Martinez MA, Ovalle A, Duran C i inni. Serotypes and antimicrobial susceptibility of Streptococcus agalactiae. Rev Med Chil 2004; 132: 549-55. 14. Matynia B., Streptococcus agalactiae i jego rola w zakażeniach u ludzi. Aktualności biomerieux. 2007, Numer 41, Warszawa 15. Mikołajczyk D, Budzyńska A, Kaczmarek A, Gospodarek E. Częstość występowania i lekooporność paciorkowców beta-hemolizujących izolowanych z materiału klinicznego. Med Dośw Mikrobiol 2007; 59: 301-7 16. Motlova J, Strakova L, Urbaskova P i inni. Vaginal & rectal carriage of Streptococcus agalactiae in the Czech Republic: incidence, serotypes distribution & susceptibility to antibiotics. Indian J Med Res 2004; 119: 84-7. 17. Savoia D, Gottimer C, Crocilla C, Zucca M. Streptococcus agalactiae in pregnant women: Phenotypic and genotypic characters. J Infec 2008; 56: 120-5 18. Simoes J, Alves V, Fracalanzza S i inni. Phenotypica characteristics of Group B Streptococcus in parturiens. The Brazilian Journal of Infectious Diseases 2007; 11: 261-6 19. Slotved H, Kong F, Lambertsen L i inni. Serotype IX, a proposed new Streptococcus agalactiae serotype. Journal of Clinical Microbiology 2007, p. 2929-36 20. Sulik M, Roszko E, Łata J. Ocena nowego podłoża chromogennego Strepto B ID. Aktualności biomeriux. 2006, Numer 39, Warszawa 21. Szewczyk EM. Diagnostyka bakteriologiczna. 2005, PWN Warszawa 22. Votava M, Tejkalova M, Drabkova M i inni. Use of GBS Media for Rapid Detection of Group B Streptococci in Vaginal and Rectal Swabs from Women in Labor. Eur J Clin Microbiol Infect Dis 2001; 20: 120-2 23. Wilk K, Sikora J, Bakon I i inni. Rola infekcji paciorkowcem z grupy B u rodzących. Ginekol Pol 2003; 74: 463 7 24. Yenisehirli G, Bulut Y, Demirturk F, Caliskan AC. Antimicrobial susceptibilities and serotype distribution of Streptococcus agalactiae strains isolated from pregnant women. Mikrobiyol Bul 2006; 40: 155-60 25. Young U, Jang IH, Hwang GY, Lee MK i inni. Serotypes and Genotypes of Erythromycin-Resistant Group B Streptococci in Korea. Journal of Clinical Microbiology 2004; 3306 8 26. Young U, Kim HY, Jang IH i inni. Correlation of Serotypes and Genotypes of Macrolide Resistans Streptococcus agalactiae. Yonsei Medical Journal 2005; 46: 480 3 27. Zaremba ML, Borowski J. Podstawy mikrobiologii lekarskiej. 1994, PZWL Warszawa Otrzymano: 18 III 2010 r. Adres Autora: 30-059 Kraków, al. Mickiewicza 24/28, Uniwersytet Rolniczy im. Hugona Kołłątaja w Krakowie, Katedra Mikrobiologii, Wydział Rolniczo Ekonomiczny