STRESZCZENIE W medycznych laboratoriach mikrobiologicznych do oznaczania lekowrażliwości bakterii stosowane są systemy automatyczne oraz metody manualne, takie jak metoda dyfuzyjno-krążkowa i oznaczanie minimalnego stężenia hamującego MIC metodą dyfuzji z paska z gradientem antybiotyku. Interpretacja wyników oznaczania lekowrażliwości jest dokonywana z zastosowaniem wartości granicznych EUCAST. SŁOWA KLUCZOWE oznaczanie lekowrażliwości, minimalne stężenie hamujące MIC, metoda dyfuzyjno-krążkowa, wartości graniczne EUCAST fot. Thinkstock SUMMARY Antimicrobial susceptibility testing of bacteria isolated in the medical microbiology laboratories is performed with using automated systems as well as manual methods, such as disc diffusion method and gradient strip minimal inhibitory concentration (MIC) evaluation. EUCAST breakpoints are used for interpretation of susceptibility testing results. KEY WORDS susceptibility testing, minimal inhibitory concentration MIC, disc diffusion method, EUCAST breakpoints Detekcja i identyfikacja drobnoustrojów oznaczanie lekowrażliwości bakterii dr n. med. Dorota Żabicka KRAJOWY OŚRODEK REFERENCYJNY DS. LEKOWRAŻLIWOŚCI DROB- NOUSTROJÓW, ZAKŁAD EPIDEMIOLOGII I MIKROBIOLOGII KLINICZNEJ, NARODOWY INSTYTUT LEKÓW, WARSZAWA 40
DIAGNOSTYKA LABORATORYJNA LABORATORIUM 7-8/2012 Badania bakteriologiczne w medycznych laboratoriach mikrobiologicznych mają na celu identyfikację gatunku i oznaczenie lekowrażliwości bakterii, które wywołały zakażenie u pacjenta. Wynik oznaczania lekowrażliwości jest następnie interpretowany z zastosowaniem odpowiednich wartości granicznych, określonych w stosowanych w danym kraju rekomendacjach amerykańskich CLSI (Clinical Laboratory Standards Institute) lub europejskich EUCAST (European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing), kwalifikujących wyhodowany drobnoustrój do kategorii wrażliwy, średniowrażliwy lub oporny na dany lek, co umożliwia dobranie skutecznej terapii. W laboratoriach wykonujących rutynowe badania bakteriologiczne dla szpitali i pacjentów ambulatoryjnych lekowrażliwość bakterii oznaczana jest z zastosowaniem kilku podstawowych metod, takich jak metoda dyfuzyjno-krążkowa, oznaczanie minimalnego stężenia hamującego MIC metodą dyfuzji z paska z gradientem antybiotyku oraz przy użyciu systemów automatycznych. METODA DYFUZYJNO-KRĄŻKOWA Metoda dyfuzyjno-krążkowa została opisana po raz pierwszy w 1954 roku przez Erickssona. W metodzie tej na bogate podłoże wzrostowe, najczęściej Muller-Hinton agar lub Muller-Hinton agar z dodatkami wzrostowymi (defibrynowana krew barania lub defibrynowana krew końska + 20 mg/l β-nad), nakładana jest zawiesina bakterii w 0,9% NaCl o gęstości 0,5 w skali McFarlanda oraz krążki ze znanym stężeniem antybiotyku. Tak przygotowane płytki inkubowane są w temperaturze ± 35 C przez 18-24 godz. Antybiotyk dyfundujący w podłożu agarowym powoduje zatrzymanie wzrostu bakterii, co obserwujemy w postaci strefy zahamowania wzrostu dookoła krążka (fot. 1, s. 42). Średnica strefy zahamowania wzrostu badanego szczepu bakterii jest zależna zarówno od wrażliwości danego drobnoustroju na badany antybiotyk i jego tempa wzrostu, jak i od dynamik dyfuzji antybiotyku w podłożu agarowym. Wykonując kolejne oznaczenia dla tego samego układu badanego: szczep bakterii antybiotyk, można uzyskać niewielkie, do kilku milimetrów, różnice średnicy strefy zahamowania wzrostu dookoła krążka. Teoretycznie dla badanego szczepu bakterii wielkość strefy zahamowania wzrostu odpowiada wartości minimalnego stężenia hamującego MIC badanego antybiotyku, jednakże różnice wielkości strefy obserwowane w kolejnych oznaczeniach powodują, że z wielkości strefy nie można odczytać prawdziwej wartości MIC. Zmierzoną średnicę strefy zahamowania wzrostu dookoła krążka porównuje się z wartościami granicznymi dla szczepów wrażliwych i opornych, określonych w stosowanych w danym kraju rekomendacjach CLSI lub EUCAST i następnie interpretację wrażliwy lub oporny wpisuje się do wyniku oznaczania lekowrażliwości badanego szczepu bakterii. W celu zapewnienia odpowiedniej jakości badań w wewnętrznej kontroli jakości stosowane są kontrolne szczepy bakterii o znanym profilu lekowrażliwości i zakresie wahań wielkości strefy zahamowania wzrostu wokół krążków z antybiotykami. W Polce do oznaczania lekowrażliwości metodą dyfuzyjno-krążkową stosowane są najczęściej krążki i podłoża bakteriologiczne produkowane przez cieszące się dobrą opinią i zapewniające odpowiednią jakość swoich produktów firmy Oznaczenie lekowrażliwości bakterii ma na celu wskazanie odpowiedniej terapii, skutecznej w leczeniu zakażenia wywołanego przez badany izolat bakteryjny BD Diagnostics, Bio-Rad, Oxoid Ltd. (Thermo Fisher Scientific) oraz MAST Group. Odczytu wielkości strefy zahamowania wzrostu dookoła krążków można dokonać manualnie lub z użyciem systemu automatycznego Bio-Rad OSIRIS/ ADAGIO. W systemie Bio-Rad OSIRIS/ADAGIO możliwe jest zaprogramowanie różnych wariantów płytek antybiogramowych z antybiotykami dobranymi do poszczególnych grup drobnoustrojów. Aparat umożliwia automatyczny odczyt i manualną korektę wielkości strefy zahamowania wzrostu, która jest następnie interpretowana przez aparat zgodnie z wybranymi wartościami granicznymi CLSI lub EUCAST. Metoda dyfuzyjno-krążkowa jest także stosowana do wykrywania ważnych z punktu widzenia epidemiologicznego mechanizmów oporności na antybiotyki, takich jak oporność na metycylinę u gronkowców czy produkcja β-laktamaz o rozszerzonym spektrum substratowym ESBL (ang. extended-spectrumβ-lactamase), produkcja karabapenemaz MBL (ang. metalo-βlactamase) i karbapenemaz KPC (ang. Klebsiella pneumoniae carbapenemase) u pałeczek Gram-ujemnych (fot. 2, s. 42). 41
fot. archiwum Zakładu Epidemiologii i Mikrobiologii Klinicznej, NIL, Warszawa Fot. 1. Oznaczanie lekowrażliwości drobnoustrojów metodą dyfuzyjno-krążkową; szczep Staphylococcus aureus ATCC 25923 Fot. 2. Oznaczanie produkcji β-laktamaz o rozszerzonym spektrum substratowym ESBL metodą dyfuzyjno-krążkową; szczep Klebsiella pneumoniae ESBL-dodatni Fot. 3. Oznaczanie lekowrażliwości drobnoustrojów metodą dyfuzji z paska z gradientem antybiotyku; szczep Staphylococcus aureus MIC wankomycyny = 2 mg/l METODA DYFUZJI Z PASKA Z GRADIENTEM ANTYBIOTYKU Opracowana w Szwecji przez firmę AB BIODISK metoda dyfuzji z paska z gradientem antybiotyku została po raz pierwszy zaprezentowana w 1988 roku. Łączy ona zasadę metody dyfuzji antybiotyku w podłożu agarowym z oznaczaniem minimalnego stężenia hamującego MIC antybiotyku metodą rozcieńczeń w agarze. W metodzie tej stosowane są paski z antybiotykiem w gradiencie stężeń obejmujących 15 podwójnych rozcieńczeń, najczęściej w zakresie stężeń od 0,016 mg/l do 256 mg/l. Po nałożeniu paska z gradientem antybiotyku na płytkę z podłożem agarowym (najczęściej Muller-Hinton agar lub Muller- Hinton agar z dodatkami wzrostowymi) z naniesioną zawiesiną bakterii następuje natychmiastowa dyfuzja antybiotyku w podłożu agarowym. W rezultacie w podłożu dookoła paska tworzy się stabilny gradient stężenia antybiotyku, odpowiadający stężeniu leku w pasku. Odczytu wartości MIC dokonuje się po inkubacji płytek w temperaturze ± 35 C przez 18-24 godz. Zahamowanie wzrostu bakterii przez dyfundujący w podłożu agarowym antybiotyk jest widoczne w postaci elipsy, której krawędź przecina pasek w miejscu, w którym stężenie antybiotyku odpowiada wartości MIC dla danej pary szczep bakteryjny antybiotyk (fot. 3). Odczytana wartość minimalnego stężenia hamującego jest następnie interpretowana z zastosowaniem wartości granicznych CLSI lub EUCAST. Metoda dyfuzji z paska z gradientem antybiotyku jest obecnie jedynym sposobem oznaczania wartości MIC stosowanym w rutynowych oznaczeniach w medycznych laboratoriach mikrobiologicznych na całym świecie. Inne metody oznaczania MIC, czyli metoda seryjnych rozcieńczeń antybiotyku w podłożu płynnym oraz metoda seryjnych rozcieńczeń antybiotyku w podłożu stałym, ze względu na swoją pracochłonność mają zastosowanie jedynie w laboratoriach referencyjnych. Metoda dyfuzji z paska z gradientem antybiotyku ma zastosowanie zarówno do oznaczania MIC dla szybko rosnących bakterii tlenowych, takich jak gronkowce, pałeczki Gram-ujemne z rodziny Enterobacteracieae czy pałeczki Gram-ujemne niefermentujące, jak i dla 42
Fot. 4. Oznaczanie lekowrażliwości drobnoustrojów metodą dyfuzji z paska z gradientem antybiotyku Etest biomerieux; szczep Streptococcus pneumoniae MIC cefotaksymu = 0,023 mg/l oraz MIC penicyliny = 0,023 mg/l a) b) Fot. 5. a, b. Oznaczanie lekowrażliwości drobnoustrojów metodą dyfuzji z paska z gradientem antybiotyku M.I.C. Evaluator Strips Oxoid Ltd. a) Szczep Enterococcus faecalis MIC wankomycyny = 4 mg/l ; b) Streptococcus grupy viridans MIC penicyliny = 2 mg/l drobnoustrojów wymagających, takich jak Streptococcus pneumoniae i inne paciorkowce, pałeczki hemofilie, gonokoki i bakterie beztlenowe. Metoda ta pozwala również na oznaczenie wartości MIC grzybów drożdżopodobnych i strzępkowych z rodzaju Aspergillus na wiele leków przeciwgrzybiczych. W Polsce oznaczenia MIC metodą dyfuzji z paska z gradientem antybiotyku dla bakterii i grzybów są najczęściej wykonywane z zastosowaniem pasków z gradientem antybiotyku Etest biomerieux (fot. 4). Od 2009 roku są również dostępne paski M.I.C. Evaluator Strips Oxoid Ltd., które mają zastosowanie do oznaczania MIC u wielu gatunków bakterii (fot. 5). Oznaczenia należy wykonywać zgodnie z metodyką proponowaną przez producenta stosowanych pasków gradientowych, gdyż metody proponowane przez każdą z firmy różnią się w niektórych szczegółach. W celu zapewnienia wiarygodności oznaczeń w wewnętrznej kontroli jakości stosowane są odpowiednie szczepy kontrolne o znanych wartościach MIC. SYSTEMY AUTOMATYCZNE Systemy automatyczne znalazły zastosowanie zarówno w identyfikacji, jak i w oznaczaniu lekowrażliwości bakterii. Używane w poszczególnych systemach gotowe panele diagnostyczne umożliwiają albo osobne oznaczenie lekowrażliwości lub identyfikację drobnoustroju, albo jednoczesne wykonanie obu oznaczeń w jednym panelu. Zakres stężeń antybiotyków w panelach do systemów automatycznych umożliwia oznaczenie wartości MIC w zakresie wartości granicznych i zakwalifikowanie oznaczanego szczepu bakterii do kategorii wrażliwy, średniowrażliwy lub oporny na dany antybiotyk, nie pozwala natomiast podać prawdziwej wartości MIC. W zależności od systemu panele są napełniane ręcznie lub automatyczne w aparacie zawiesiną bakterii o określonej gęstości, przygotowanej w sterylnej wodzie lub 0,9-proc. NaCl. Stosowane w medycznych laboratoriach mikrobiologicznych systemy automatyczne pozwalają na identyfikację i oznaczenie lekowrażliwości najczęściej izolowanych bakterii Gram-dodatnich i Gram-ujemnych: gronkowców, paciorkowców (w tym S. pneumoniae), enterokoków, pałeczek fermentujących z rodziny 44
DIAGNOSTYKA LABORATORYJNA LABORATORIUM 7-8/2012 Enterobacteriaceae i pałeczek niefermentujących. W Polsce najczęściej są stosowane systemy automatyczne firmy biomérieux: ATB Expression miniapi, Vitek 2 i Vitek 2 Compact, rzadziej Phoenix/EpiCenter firmy BD diagnostics i aparat WalkAway Plus System z rodziny aparatów MicroScan Simens Healthcare Diagnostic. Do kontroli jakości oznaczeń w poszczególnych systemach automatycznych każda z firm proponuje odpowiedni zestaw kontrolnych szczepów bakterii. Wszystkie stosowane w Polsce systemy automatyczne dają możliwość interpretacji wyników oznaczania wrażliwości bakterii na leki z zastosowaniem zarówno rekomendacji europejskich EUCAST, jak i rekomendacji amerykańskich CLSI. Systemy te mają najczęściej również odpowiednie oprogramowanie do sporządzania zestawień statystycznych i analizy wyników w celu monitorowania lekowrażliwości hodowanych szczepów bakterii. INTERPRETACJA WYNIKÓW OZNACZANIA LEKOWRAŻLIWOŚCI BAKTERII Oznaczenie lekowrażliwości bakterii ma na celu wskazanie odpowiedniej terapii, skutecznej w leczeniu zakażenia wywołanego przez badany izolat bakteryjny. Interpretacja wyników polega na zakwalifikowaniu wyhodowanego szczepu bakterii do kategorii wrażliwy, średniowrażliwy lub oporny na dany lek, z zastosowaniem klinicznych wartości granicznych definiowanych następująco: wrażliwy wrażliwość drobnoustroju na standardowe dawki leku wysokie prawdopodobieństwo odniesienia sukcesu terapeutycznego; średniowrażliwy szczep w zakresie wartości MIC pomiędzy wrażliwym a opornym, efekt terapeutyczny niepewny, ale może zostać osiągnięty, jeśli zakażenie przebiega w takiej lokalizacji, gdzie lek jest fizycznie zagęszczany (np. drogi moczowe) lub gdy jest możliwość podania wysokich dawek leku; oporny wysokie prawdopodobieństwo niepowodzenia terapeutycznego, nawet w przypadku zastosowania wysokich dawek leku. Na świecie do interpretacji wyników oznaczania lekowrażliwości bakterii stosowane są obecnie rekomendacje amerykańskie CLSI oraz opracowane po raz pierwszy w 2009 r. rekomendacje europejskie EUCAST. W Polsce do kwietnia 2011 r. stosowane były rekomendacje amerykańskie CLSI, natomiast od kwietnia 2011 r. stosowane są rekomendacje europejskie EUCAST. Rekomendacje EUCAST zostały opracowane w oparciu o doświadczenia kliniczne oraz wiedzę o zależnościach farmakokinetyki i farmakodynamiki przy zastosowaniu odpowiedniej dawki leku. Zgodnie z tymi rekomendacjami zakwalifikowanie bakterii do kategorii wrażliwy oznacza, że występuje wysokie prawdopodobieństwo sukcesu terapeutycznego w przypadku zastosowania standardowej dawki leku. W przypadku szczepów kwalifikowanych do kategorii średniowrażliwy osiągnięcie sukcesu terapeutycznego jest możliwe w przypadku zastosowania maksymalnej dawki leku. Tabele z klinicznymi wartościami granicznymi EUCAST obowiązujące w roku następnym są publikowane corocznie w grudniu roku poprzedzającego ich wejście w życie. W Polsce w celu ułatwienia stosowania rekomendacji EUCAT na stronach internetowych Krajowego Ośrodka Referencyjnego ds. Lekowrażliwości KORLD (www.korld.edu.pl) oraz konsultanta krajowego w dziedzinie mikrobiologii lekarskiej (www.mikrobiologia.edu.pl) zostały opublikowane podstawowe dokumenty EUCAST w tłumaczeniu na język polski: Europejski Komitet ds. Oznaczania Lekowrażliwości EUCAST. Tabele interpretacji wartości granicznych minimalnych stężeń hamujących (MIC) oraz wielkości stref zahamowania wzrostu, Wersja 2.0, obowiązująca od 1 stycznia 2012 oraz Zasady interpretacji wyników oznaczania lekowrażliwości drobnoustrojów zalecenia ekspertów EUCAST, 2011. Na wymienionych stronach dostępne są również inne opracowania, w tym przygotowane przez powołany przez konsultanta krajowego w dziedzinie mikrobiologii lekarskiej prof. dr hab. n. med. Walerię Hryniewicz zespół ds. oznaczania lekowrażliwości zgodnie z zaleceniami EUCAST, odpowiadające na wiele pytań związanych ze stosowaniem zaleceń EUCAST w praktyce medycznego laboratorium mikrobiologicznego. Oznaczanie lekowrażliwości bakterii izolowanych z zakażeń jest ostatnim etapem badania bakteriologicznego w medycznym laboratorium mikrobiologicznym. Prawidłowe wykonanie oraz właściwa interpretacja wyniku oznaczenia lekowrażliwości umożliwiają dobranie terapii celowanej u pacjenta, od którego izolowano drobnoustrój. Analiza danych o wrażliwości drobnoustrojów izolowanych od pacjentów umożliwia śledzenie trendów lekowrażliwości wśród izolatów bakteryjnych danego gatunku i rekomendowanie terapii empirycznej, a w przypadku analizy wyników wrażliwości bakterii hodowanych w szpitalach jest również niezbędnym elementem kształtowania jego polityki antybiotykowej. 45