Recenzja rozprawy doktorskiej mgr Patrycji Kozub pt. Otrzymywanie oraz charakterystyka liposomów potencjalnych nośników leków w celu zwiększenia skuteczności terapii fotodynamicznej W ostatnich latach dokonał się znaczący postęp w leczeniu nowotworów złośliwych. Jest on w dużej mierze wynikiem wprowadzenia do praktyki klinicznej nowych metod diagnostycznych, umożliwiających wczesne wykrycie i określenie rozległości nowotoworu, a także wynikiem postępu w dziedzinie chemioterapii. Neleży podkreślić jednak, iż aplikacja wielu leków stosowanych w chemioterapii nowotworów, ze względu na brak swoistości tych leków, związana jest z ogólnoustrojową toksycznością i słabą farmakokinetyką. Problemy te próbuje się rozwiązać poszukując tzw. nowych nośników leków. Do tej pory zaprojektowano i zbadano efektywność terapeutyczną wielu systemów dostarczania leków m.in. koniugatów, w których substancją czynną jest białko, peptyd lub polimer syntetyczny/naturalny. Na szczególną uwagę zasługują również nośniki w postaci emulsji i liposomów, w których lek fizycznie zamykany jest w nanocząstkach. Leki w tej postaci są mniej toksyczne, a jednocześnie mogą wykazywać większą aktywność przeciwnowotworową w wyniku poprawionych parametrów farmakokinetycznych. Terapia fotodynamiczna jest metodą leczenia zarówno onkologicznych, jak i nieonkologicznych zmian patologicznych. Polega na dostarczeniu do chorej tkanki związku (fotouczulacza), który poddany ekspozycji na promieniowanie, o odpowiedniej mocy i długości fali, generuje powstanie reaktywnych form tlenu bezpośrednio odpowiedzialnych za destrukcję struktur komórkowych w oświetlonym obszarze. Aby terapia fotodynamiczna przyniosła oczekiwany efekt fotouczulacz musi spełniać określone kryteria (m.in. wykazywać wysoką wydajność generowania tlenu singletowego, silną absorpcję światła w zakresie podczerwieni, wybiórczą akumulację w tkankach zmienionych chorobowo). Cancer Research UK and EPSRC Cancer Imaging Centre at The Institute of Cancer Research and The Royal Marsden NHS Foundation Trust Gabriela Kramer-Marek, Dr hab. Team Leader Preclinical Molecular Imaging 15 Cotswold Road Surrey, SM2 5NG T +44 20 8722 4412 E gkramermarek@icr.ac.uk W icr@ac.uk Niestety dostępne obecnie na rynku związki fotouczulające nie spełniają wszystkich tych wymogów, dlatego wciąż prowadzone są intensywne poszukiwania nowych fotouczulaczy. Ponadto, w celu zwiększenia efektywności PDT oraz zmniejszenia efektów ubocznych terapii, podobnie jak w przypadku chemioterapii, tworzy się kompleksy barwników z różnorodnymi nośnikami by zwiększyć selektywność ich akumulacji oraz stabilność w środowisku biologicznym. W tym aktualnym i ważnym nurcie kontrowersji naukowej osadzona jest rozprawa doktorska Pani mgr Patrycji Kozub, będąca kontynuacją cyklu cennych prac realizowanych przez Zespół badawczy pod kierunkiem prof. zw. dr hab. Alicji Ratusznej. Recenzowana rozprawa doktorska ma charakter interdyscyplinarny i porusza problemy z pogranicza fizyki, chemii i biologii. Praca ma klasyczny układ, liczy 120 stron tekstu i zawiera 148 pozycji literaturowych. Składa się ze spisu treści, wykazu skrótów stosowanych w pracy, wprowadzenia oraz rozdziałów: Wstęp
2 of 5 Teoretyczny, Cel i Zakres Pracy, Materiały i Metody Badawcze, Analiza i Dyskusja Wyników, Podsumowanie i Wnioski. Ciekawie i klarownie zredagowany na 35 stronach Wstęp Teoretyczny rozprawy Doktorantka przygotowała w sposób interesujący, w oparciu o najnowszą literaturę. Jest to również ta część rozprawy, która bardzo dobrze wprowadza czytelnika do dalszych rozdziałów pracy. Autorka omawia w tej częśći: 1. Główne założenia i ograniczenia terapii fotodynamicznej (PDT), w tym rolę fotouczulaczy, tlenu i źródeł światła. 2. Rodzaje fotouczulaczy stosowanych w tej metodzie. 3. Mechanizmy śmierci komórek indukowane przez ten typ terapii. 4. Sposoby zwiększania selektywności oraz efektywności fotouczulaczy poprzez zastosowanie nośników liposomowych, których budowa oraz sposoby przygotowania, a także wykorzystanie w medycynie zostały szczegółowo przedyskutowane. Do tej części pracy mam jedynie drobne uwagi, które nie wpływają jednak na jakość merytoryczną tego rozdziału. We Wstępie Autorka powinna oprzeć swoją statystykę zachorowalności oraz umieralności na choroby nowotworowe na bardziej aktualnych danych, opublikowanych raczej w roku 2014 a nie 2012. Unikałabym sformułowań typu: terapię fotodynamiczną wykorzystuje się do leczenia nowotworów i nie tylko. Co znaczy nie tylko? W rozdziale I.1.2 brakuje kilku pozycji literaturowych. Dyskusji podlega fakt, czy porfiryny obecnie należą do najczęściej badanych związków pod kątem PDT, ze względu na słabą penetrację światła w zakresie 630-650 nm. Tabela 1 przedstawia charakterystykę 12 związków, które opisane zostały w 10 publikacjach. W tej sytuacji pozycje literaturowe powinny zostać umieszczone w tabeli obok związku, którego dotyczą. Cel Pracy: Otrzymanie oraz charakterystyka liposomów jako potencjalnych nośników leków przeciwnowotworowych został jasno sprecyzowany i stanowi logiczną konsekwencję powyższego wprowadzenia. Materiał i Metody Badwcze opisane są w sposób staranny i należycie szczegółowy. Autorka do swoich badań wykorzystała trzy fotouczulacze z rodziny chloryn. Parametry fizykochemiczne dwóch z nich były przedmiotem innej pracy doktorskiej. Nie mniej jednak nowatorskie jest ich wykorzystanie w połączeniu z nośnikami liposomowymi, będącymi przedmiotem niniejszej rozprawy. Wydaje mi się, iż niepotrzebnie Doktorantka umieściła w tej cześci pracy wprowadzenie teoretyczne dotyczące każdej z wykorzystywanych metod. Taki opis metod fizykochemicznych powinien raczej zostać umieszczony we wstępie pracy. Protokoły eksperymentalne są przygotowane w sposób czytelny i szczegółowy. Na uwagę zasługuje fakt, że zarówno materiał, jak i zastosowane metody badawcze zostały dobrane adekwatnie do postawionego sobie celu badań, co świadczy o dobrym przygotowaniu metodycznym Doktoranta.
3 of 5 Poniżej szczegółowe uwagi: Strona 52 - należałoby zaznaczyć, iż badana linia komórkowa to ludzkie komórki raka okrężnicy Hct116. W niektórych miejscach Doktorantka posługuje się określeniami anglojęzycznymi. Brakuje jednak pewnej chronologii. Wiele określeń, których nazwę angielską należałoby wprowadzić, zostało pominiętych. W takiej sytuacji raczej w ogóle nie wprowadzałabym określeń obcojęzycznych. Analiza i Dyskusja Wyników przedstawiona jest w sposób czytelny, opisowy oraz jest odpowiednio udokumentowana w formie wykresów, w analizie których poprawnie uwzględniono istotność statystyczną. Tę część pracy Autorka podzieliła na dwa etapy: 1. Badania fizykochemiczne fotouczulacza z rodziny chloryn pod kątem jego wykorzystania w PDT. 2. Charakterystykę kompleksów liposom-fotouczulacz oraz określenie właściwości otrzymanych kompleków w układzie biologicznym. Badania fizykochemiczne wykonane przez Doktorantkę świadczą o szerokim i zrozumiałym zgłębieniu wiedzy na temat reakcji fotodynamicznych oraz o dużej dojrzałości naukowej Doktorantki. Autorka zmierzyła widma absorpcjne chloryny w różnych rozpuszczalnikach, dla których wyznaczyła także molowe współczynniki absorpcji. Dodatkowo sprawdziła czy związek nie ulega agreagacji w badanych roztworach, co ma istotne znaczenie z punktu widzenia efektywności PDT. Autorka zmierzyła także widma fluorescencji i wyznaczyła energię pierwszego wzbudzonego stanu singletowego S 1. Wyznaczone przez Nią wydajności kwantowe fluorescencji mieszczą się w zakresie 3.8-40% i zależą od użytego rozpuszczalnika. Wysokie wartości kwantowej wydajności fluorescjencji w niektórych rozpuszczalnikach wskazywałyby na mało wydajne przejście międzysystemowe S 1 -T 1, co z kolei sugerowałoby niską użyteczność tego związku w terapii. Fakt ten nie wyklucza jednak jego zastosowania w diagnostyce, gdzie wysoka wydajność fluorescencji jest czynnikiem korzystnym, umożliwiającym dokładne zlokalizowanie zmian chorobowych. Pierwszy wzbudzony stan trypletowy chloryny został scharakteryzowany przy zastosowaniu nanosekundowej fotolizy laserowej i był wystarczający do wygenerowania tlenu singletowego. Ponadto, wyznaczona przez Doktorantkę kwantowa wydajność tworzenia tlenu singletowego badanego związku była wysoka co w ostateczności wskazuje na potencjalne wykorzystanie go jako fotouczulacza w PDT. Tym bardziej, że przeprowadzone przez Doktorantkę badania fotodegradacji związku wskazały na jego wysoką fotostabilność. Ze względu na agregację przedstawionych w pracy fotouczulaczy w środowisku wodnym związki zamykano w różnych formulacjach liposomowych, które obecnie często wykorzystywane są jako nośniki leków przeciwnowotworowych. Doktorantka wykorzystała trzy typy liposomów: anionowe, kationowe oraz neutralne. W pierwszym etapie określiła podstawowe parametry fizyczne liposomów pustych oraz z fotouczulaczem zamkniętym w dwuwarstwie fosfolipidowej tj. współczynik polidyspersyjności, średnicę liposomów, stabilność oraz efektywność zamykania badanych związków w nośnikach liposomowych. Następnie zbadała in vitro efektywność terapeutyczną uzyskanych kompleksów liposomfotouczulacz wykorzystując ludzkie komórki raka jelita grubego linii Hct116.
4 of 5 Do tej części pracy mam jednak największe wątpliwości. Dla skuteczności PDT istotne znaczenie mają nie tylko właściwości fizykochemiczne fotouczulacza ale również jego farmakokinetyka oraz farmakodynamika. Zastosowanie nośników liposomowych niewątpliwie umożliwia skuteczny transport fotouczulaczy do komórek. Jednak sposób w jaki Doktorantka przedstawiła użyteczność otrzymanych kompleksów w układzie biologicznym budzi zastrzeżenia: Autorka nie wykonała badań transportu oraz dystrybucji badanych nośników in vitro, jak również nie wskazała literatury potwierdzającej, iż 4 godzinna inkubacja komórek z kompleksem liposom-fotouczulacz jest czasem wystarczającym do zgromadzenia się kompleksu w obszarze komórki. Zatem za zasadne uważam, iż w celach publikacyjnych dobrze byłoby wykonać dodatkowe badania kolokalizacji kompleksów z organellami komórkowymi na poziomie mikroskopu konfokalnego. Istotne jest zlokalizowanie takich kompleksów, bowiem warunkuje to kierunek zmian i odpowiedzi komórkowej na zadaną terapię. Niewątpliwie podniesie to również wartość merytoryczną pracy. Nie wyjaśniła również dlaczego wybrała takie a nie inne dawki energii do naświetlania komórek. Ponadto, w testach nie umieściła grupy kontrolnej komórek, które poddane były tylko ekpozycji na światło. W tekście zabrakło sformułowania, iż badane nośniki liposom-fotouczulacz są nietoksyczne jedynie w testowanym zakresie stężeń. Doktorantka przeprowadziła badania jedynie dla 4 różnych koncentracji. Wszystkie wykresy przeżywalości komórek zostały błędnie opisane. Doktorantka oceniała przeżywalność komórek po 28 godzinach (4 godziny inkubacji z kompleksami plus 24 godziny inkubacji w medium hodowlanym w 37 o C), a nie po 4 godzinach jak wskazują wszystkie opisy pod wykresami. Szkoda, że Doktorantka nie wyjaśnia, dlaczego zdecydowała się aż na 24-godzinną inkubację po PDT, rezygnując z oceny przeżywalności po krótszych czasach od naświetlania. Po 24 godzinach część uszkodzeń na terenie komórki mogła zostać naprawiona. W części Materiały i Metody doktorantka pisze, iż w przypadku liposomów pustych podawała 5 L, 10 L, 25 L 50 L zawiesiny liposomalnej, co w przypadku kompleksów odpwiadało stężeniom fotouczulaczy 0.5 M, 1 M, 2.5 M, 5 M. Na wykresach przedstawiających przeżywalność komórek po inkubacji z pustymi liposomami w części Analiza i Dyskusja doktorantka posługuje się pojęciem stężeń, co w tym wypadku jest błędnym określeniem. Analizując wszystkie wykresy przeżywalości wydaje się, iż niezależnie od rodzaju użytego nośnika przy danej dawce energii efekt terapeutyczny pomiędzy użytymi nośnikami był porównywalny. Uważam iż warto byłoby ten fakt skomentować. Do uwag krytycznych należałoby dołączyć również nieprawidłowe posługiwanie się pewnymi terminami takimi jak: liposom-lek. Przedstawiane w pracy folouczulacze nie są jeszcze lekami. W dyskusji brakuje również kilku zdań podsumowujących i określających perspektywy wykorzystania wyników rozprawy w praktyce klinicznej bowiem praca ma jak najbardziej charakter aplikacyjny i otwiera bardzo obiecujące pole wykorzystania. W zakończeniu pracy Doktorantka przedstawia Podsumowanie i Wnioski, które są poprawnie sformułowane i wynikają z uzyskanych wyników.
5 of 5 Recenzowana praca zawiera wyraźne elementy nowości i prezentuje wysoki poziom naukowy. Dodatkowo wyróżnia się bogatą szatą graficzną oraz starannością edytorską. Większość zarzutów, które wcześniej podniosłam można określić jako subiektywne opinie lub usterki redakcyjne, które nie rzutują na moją wysoką ocenę rozprawy. A słabo opisana część biologiczna pracy wynika z faktu, iż Doktorantka nie jest z wykształcenia biologiem. Dlatego z pełnym przekonaniem uważam, że rozprawa spełnia warunki stawiane pracom doktorskim i wnioskuję o dopuszczenie Pani mgr Patrycji Kozub do dalszych etapów przewodu doktorskiego. Sądzę ponadto, że ze względu na nakład pracy, stosowanie bogatego warsztatu badawczego oraz uzyskane oryginalne i nowatorskie wyniki rozprawa ta zasługuje na wyróżnienie. Gabriela Kramer-Marek, Dr hab.