sylwan nr 4: 44 48, 2007 Chalara fraxinea nowo opisany gatunek grzyba na zamierających jesionach w Polsce Chalara fraxinea new described fungus species on dying ash in Poland ABSTRACT Kowalski T. 2007. Chalara fraxinea new described fungus species on dying ash in Poland. Sylwan 4: 44 48. The paper provides the characteristics of the fungus Chalara fraxinea which may enable its identification. The disease symptoms on ashes regularly accompanied by this fungus were specified. Possible casual relationship between Ch. fraxinea and ash dieback is discussed in the paper. KEY WORDS Fraxinus excelsior, Chalara fraxinea, wilting, dieback Addresses Katedra Fitopatologii Leśnej; Akademia Rolnicza; Al. 29 listopada 46; 31 425 Kraków; e mail: rltkowal@cyf kr.edu.pl Wstęp Jesion wyniosły (Fraxinus excelsior L.) przez lata zaliczany był do gatunków drzew odpornych na choroby. Na ogół rzadko obserwowano takie nasilenie procesu chorobowego, które zagrażałoby całym drzewostanom lub egzystencji tego gatunku [Grzywacz 1995; Butin 1996; Mańka 2005]. Sytuacja w Polsce uległa zasadniczej zmianie w ostatniej dekadzie ubiegłego wieku, kiedy to zaczęto obserwować intensywne zamieranie jesionu, najpierw w części północno wschodniej, a następnie we wszystkich rejonach kraju. Chorują drzewa we wszystkich klasach wieku, niezależnie od zajmowanego siedliska i sposobu odnowienia. U chorych drzew powstają lokalne, z czasem rozszerzające się nekrozy na pędach głównych i gałęziach, co prowadzi do uwiądu liści, zamierania szczytowych odcinków pędów, gałęzi lub całych drzew. Rozpoczęte zostały prace i analizy celem wyjaśnienia przyczyn tego zjawiska [Stocki, Stocka 1999; Szwałkiewicz 1999; Przybył 2002; Kowalski, Łukomska 2005]. Autor, od początku badań tego procesu, stwierdzał szczególnie licznie w nekrotycznych tkankach pewien gatunek grzyba, który na podstawie cech morfologicznych zaklasyfikował do rodzaju Chalara [Kowalski 2001]. Dalsze badania taksonomiczne wykazały, że grzyb ten nie może być przyporządkowany do żadnego z dotychczas znanych gatunków [Nag Raj, Kendrick 1975; Holubová Jechová 1984; Kowalski, Halmschlager 1996; McKenzie i in. 2002], w związku z czym został opisany jako nowy gatunek, o nazwie Chalara fraxinea T. Kowalski [Kowalski 2006 a]. W pracy przedstawiono jego cechy rozpoznawcze oraz zwrócono uwagę na możliwy związek z zamieraniem jesionów, a także perspektywy naukowego rozpracowania niepokoją cego zjawiska.
Chalara fraxinea nowo opisany gatunek grzyba na zamierających jesionach 45 Metodyka Grzyb Chalara fraxinea izolowano z chorych i zamarłych tkanek jesionów zarówno na pożywkę agarowo maltozową, jak i glukozowo ziemniaczaną, przy czym rodzaj zastosowanej pożywki miał wpływ na makroskopowe cechy kolonii. Przed izolacją dokonywano szczegółowego opisu zewnętrznych i wewnętrznych objawów chorobowych. Dezynfekcji próbek pobranych z pędów lub innych organów dokonywano przez ich zanurzenie najpierw w 96% alkoholu etylowym (1 min), a następnie w 4% podchlorynie sodu (5 min) i w 96% alkoholu etylowym (0.5 min). Po ich osuszeniu w sterylnej bibule filtracyjnej i ścięciu wierzchniej warstwy kory, wycinano frag menty o wymiarach 5 2 2 mm i wykładano na pożywkę zestaloną w płytkach Petriego. Wyrastające kolonie odszczepiano i inkubowano w temperaturze 20 C. Do potwierdzenia przy należności badanego gatunku grzyba do rodzaju Chalara i określenia jego pokrewieństwa do rodzaju Ceratocystis, przeprowadzono test polegający na hodowli kultur in vitro na pożywce z dodatkiem cykloheksimidu (0,1 g na litr pożywki), wykorzystując dla celów porównawczych kolonie Ceratocystis polonica, Chalara ovoidea i Ophiostoma piceae. Objawy chorobowe Grzyb Chalara fraxinea najczęściej stwierdzano na jesionach z objawami więdnięcia, które szczególnie uwidaczniają się w pierwszej połowie okresu wegetacyjnego (ryc. 1). Poza tym izolowano go bardzo często z lokalnych nekroz na żywych pędach głównych i bocznych. Nekrozy takie najczęściej powstają w rejonie odgałęzień bocznych oraz wokół pączków. Porażenie przez Ch. fraxinea wiąże się zwykle z jasno lub ciemnobrunatnym przebarwieniem kory, nierzadko przybierającym postać nieregu larnych smug. Nekrozom takim towarzyszy, zwłaszcza na grubszych pędach zapadanie tkanek, przez co zaznacza się wyraźnie granica miedzy tkankami obumarłymi a żywymi [Kowalski 2006 b]. Charakterystyka grzyba Grzybnia Ch. fraxinea osiąga po trzech tygodniach wzrostu na 2% pożywce agarowo maltozowej w temperaturze 20 C od 9 do 28 mm średnicy. Rośnie więc stosunkowo wolno, stąd w trakcie prób izolacji z chorych tkanek nierzadko może być uprzedzana przez inne, szybko rosnące gatunki grzybów, np. z rodzaju Alternaria, Epicoccum lub Phomopsis. Tworzy kolonię weł nistą, szarawobiałą, niekiedy z czarnymi, nie wielkimi sklerotycznymi utworami. Wykazuje tendencję do wytwarzania sektorów o nieco odmiennej strukturze i barwie (ryc. 2). Na po żywce glukozowo ziemniaczanej kolonia ma bardziej zwartą strukturę oraz przybiera barwę rdzawobrunatnawą. Wytwarza do pożywki sub stancje o charakterze antybiotycznym, co wiąże Ryc. 1. Jesion z objawami więdnięcia An ash with wilting symptoms
46 Ryc. 2. Kolonia Ch. fraxinea na pożywce agarowo maltozowej (28 dni, 20 C) A colony of Ch. fraxinea on malt extract agar (28 days, 20 C) Ryc. 3. Trzonki konidialne Ch. fraxinea Phialophores of Ch. fraxinea Ryc. 4. Konidia Ch. fraxinea Conidia of Ch. fraxinea się często z wykształcaniem miedzy jego kolonią a koloniami innych gatunków strefy inhibicyjnej o szerokości kilku milimetrów. Podobnie jak testowa ny Ceratocystis polonica i Chalara ovoidea, nie wykazuje wzrostu na pożywce z dodatkiem cykloheksimidu. W grzybni powietrznej wytwarza charakterysty czne dla rodzaju Chalara trzonki konidialne (fialofory), często zredukowane do fialid. Są one 1 do 4 komór kowe, cylindryczne lub butelkowate, oliwkowo brunatne, o długości 24 37 µm, w starszych koloniach dochodzące do 96 µm. Fialidy zakończone są cylin dryczną kolaretą o długości 5 7 /9/ µm (ryc. 3). Konidia wykształcają się endogenicznie, to zna czy wewnątrz fialid. Gromadzą się nad wylotem fialidy, tworząc kropelkowate skupienie, znacznie rzadziej układają się w łańcuszki (ryc. 3). Są one 1 komór kowe, bezbarwne, krótkocylindryczne, gładkościenne 50 µm 50 µm i osiągają wymiary 3,2 4,0 2,0 2,5 µm (ryc. 4). Jedynie te zarodniki, które tworzą się jako pierwsze w fialidach, osiągają nieco większe wymiary. Dyskusja Gdy ponad 10 lat temu obserwowano w Polsce pierwsze przypadki zamierania jesionu na szerszą skalę, można było odnieść wrażenie, że jest to wynik nieko rzystnego wpływu czynników abiotycz nych, zwłaszcza przymrozków w okresie wiosennym lub niedoboru wody i wysokiej temperatury latem. W takich przypadkach powinno jednak nastąpić po pewnym okresie zmniejszenie nasilenia procesu chorobowego i zamierania drzew tego gatunku. W rzeczywistości można było obserwować zjawisko odwrotne, proces chorobowy jesionów rozszerzał się, obej mując po kilku latach drzewostany w coraz to innych rejonach Polski. Rozprzestrze nianie się choroby jesionów trwa nadal. Wskazują na to ostatnie doniesienia z Lit wy, Austrii oraz Szwecji [Bakys i in. 2005; Barklund 2005; Cech 2006]. Dotychczasowe badania i analizy wskazują, że zamieraniu ulega jesion w szkółkach i w drzewostanach w różnych
Chalara fraxinea nowo opisany gatunek grzyba na zamierających jesionach 47 warunkach wzrostu, istnieje niekiedy tylko zróżnicowanie nasilenia tego zjawiska zależnie od siedliska, cech hodowlanych drzewostanu, czy sposobu odnowienia [Szwałkiewicz 1999; Matyjasik 2001; Przybył 2002; Kowalski 2001; Bielawska 2006]. Spośród czynników biotycznych wskazuje się na powodowanie nekrozy tkanek jesionów przez grzyby, spośród których dużą rolę przypisuje się Diplodia mutila [Przybył 2002]. Często na zamierających pędach stwierdza się obecność patogenów słabości z rodzaju Phomopsis i Cytospora [Przybył 2002; Kowalski, Łukom ska 2005; Barklund 2006; Cech 2006]. Orlikowski i in. [2004] na jesionach w szkółkach stwierdzili Phytophthora citricola. Od strony poszukiwania biotycznych przyczyn zamierania jesionu ważne jest, zdaniem autora, wyizolowanie z chorych jesionów i zidentyfikowanie nowego gatunku grzyba, który opisano, nadając mu nazwę Chalara fraxinea [Kowalski 2006a]. Gatunek ten różni się od dotychczas poznanych w obrębie rodzaju Chalara pod względem wielu cech: wielkością i kształtem zarodników, wielkością fialid i kolaret, a także cechami morfolo gicznymi kolonii, włącznie z wytwarzaniem utworów sklerotycznych, co można obserwować zaledwie u kilku, spośród znanych około 120 gatunków z tego rodzaju. Chalara fraxinea tworzy konidia głównie w kropelkowatych skupieniach, tylko rzadko w łańcuszkach. Ta cecha najbar dziej różni nowo opisany gatunek od typowych przedstawicieli rodzaju Chalara, dla którego charakterystyczną cechą jest wytwarzanie konidiów w łańcuszkach [Nag Raj, Kendrick 1975]. Rodzaj Chalara w obecnym ujęciu obejmuje heterogeniczną grupę grzybów, z czym wiąże się propozycja innego podziału taksonomicznego w obrębie tego rodzaju [Paulin Mahady i in. 2002]. Stają się w tym bardzo pomocne badania genetyczne. I tak, w ostatnich latach wyodręb niono nowy rodzaj Xenochalara [Coetsee i in. 2000], a część gatunków z rodzaju Chalara wyt warzających aleurokonidia przeniesiono do rodzaju Thielaviopsis [Paulin Mahady i in. 2002]. Identyfikacja i taksonomiczne rozpracowanie licznie izolowanego z jesionów gatunku grzyba jest ważnym, ale dopiero wstępnym etapem w badaniach nad zjawiskiem dotyczącym zamierania jesionu. W związku z identyfikacją Ch. fraxinea, istnieją jednak przesłanki na wyja śnienie przynajmniej części obserwowanych u jesionów symptomów chorobowych. Gatunek ten został przez autora wyizolowany z chorych jesionów z różnych rejonów Polski, co wskazuje, że jego występowanie nie jest tylko lokalne. Poza tym, należy on do gatunków najliczniej izolowanych z jesionów w początkowym stadium choroby, w którym jesiony wykazują objawy nekroz i nagłego więdnięcia. Wyklucza to raczej jego wtórną, saprotroficzną rolę. Przeprowa dzony test, wskazujący na wrażliwość na cykloheksimid, czyni bardzo prawdopodobne stwier dzenie, że Ch. fraxinea jest stadium wegetatywnym (anamorfą) grzyba workowego z rodzaju Ceratocystis [Harrington 1981]. Wśród grzybów z rodzaju Ceratocystis i Chalara jest wiele gatunków, które powodują bardzo groźne choroby drzew leśnych, drzew owocowych i cennych roślin uprawnych [Nag Raj, Kendrick 1975; Holubová Jechová 1984]. Na pato geniczne właściwości przynajmniej niektórych szczepów Ch. fraxinea zdają się wskazywać także wyniki wstępnych testów in vivo [Kowalski, niepubl.]. Konieczne jest przeprowadzenie wielu dalszych badań zarówno dotyczących samego grzy ba, zasięgu jego występowania, rozmnażania w warunkach naturalnych, sposobów rozprze strzeniania zarodników, infekcji, inkubacji oraz uwarunkowań przebiegu i nasilenia procesu chorobowego. Rozpoznania te mogą dać dopiero pewne podstawy do rozważań nad możliwo ściami ochrony jesionów przed chorobą. Literatura Bakys R., Vasiliauskas R., Barklund P., Ihrmark K., Stenlid J. 2005. Fungal attacks to root systems and crowns of declining Fraxinus excelsior. Proceed from the SNS meeting in Forest Pathology at Skogbrukets Kursinstitutt, Biri Norway, 28 31. Aug. 2005, Aktuelt fraskogforskningen. 1/06: 71 72.
48 Barklund P. 2005. Recent disease problems in Swedish forests. Proceed. from the SNS meeting in Forest Pathology at Skogbrukets Kursinstitutt, Biri Norway, 28 31. Aug. 2005, Aktuelt fraskogforskningen. 1/06: 83. Bielawska K. 2006. Regres jesionu spojrzenie hodowlane. Głos Lasu 4:19 22. Butin H. 1996. Krankheiten der Wald und Parkbaeume. Diagnose Biologie Bekaempfung. G. Thieme Verlag, Stuttgart. Cech L. T. 2006. Auffalende Schadfaktoren an Waldbaeumen im Jahr 2005. Forstschutz Aktuell 35: 6 7. Coetsee C., Wingfield M. J., Crous P. W., Wingfield B. D. 2000. Xenochalara, a new genus of dematiaceous hyphomycetes for chalara like fungi with apical wall building conidial development. S. Afr. J. Bot. 66, 2: 99 103. Grzywacz A. 1995. Ważniejsze choroby infekcyjne. W: Jesion wyniosły Fraxinus excelsior L. Bugała W. [red.]. Wyd. Sorus, Poznań Kórnik. 371 415. Harrington T. C. 1981. Cycloheximide sensitivity as a taxonomic character in Ceratocystis. Mycologia 73: 1123 1129. Holubová Jechová V. 1984. Lignicolous hyphomycetes from Czechoslovakia. 7. Chalara, Exochalara, Fusichalara and Dictyochaeta. Folia Geobotanica et Phytotaxonomica 19: 387 438. Kowalski T. 2001. O zamieraniu jesionów. Trybuna Leśnika 4/359: 6 7. Kowalski T. 2006a. Chalara fraxinea sp. nov. associated with dieback of ash (Fraxinus excelsior) in Poland. Forest Pathology 36: 264 270. Kowalski T. 2006b. Zamieranie jesionu poszukiwanie przyczyn. Głos Lasu 12: 4 6. Kowalski T., Halmschlager E. 1996. Chalara angustata sp.nov. from roots of Quercus petraea and Quercus robur. Mycol. Res. 100, 9: 1112 1116. Kowalski T., Łukomska A. 2005. Badania nad zamieraniem jesionu (Fraxinus excelsior L.) w drzewostanach Nadleśnictwa Włoszczowa. Acta Agrobotanica 59, 2: 429 440. Matyjasik J. 2001. Zamieranie jesionu w Nadleśnictwie Jamy. Biuletyn RDLP w Toruniu Nr 2/15: 20 21. McKenzie E. H. C., Pinnoi A., Wong M. K. M., Hyde K. D., Jones E. B. G. 2002. Two new hyaline Chalara species and a key to species described since 1975. Fungal Diversity 11: 129 139. Nag Raj T. R., Kendrick B. 1975. A monograph of Chalara and Allied Genera. Dept. of Biology, University of Waterloo, Ontario, Canada. Orlikowski L. B., Oszako T., Duda B., Szkuta G. 2004. Występowanie Phytophthora citricola na jesionie wyniosłym (Fraxinus excelsior) w szkółkach leśnych. Leśn. Prace Bad. 4: 129 136. Paulin Mahady A. E., Harrington T. C., McNew D. 2002. Phylogenetic and taxonomic evaluation of Chalara, Chalaropsis, and Thielaviopsis anamorphs associated with Ceratocystis. Mycologia 94, 1: 62 72. Przybył K. 2002. Fungi associated with necrotic apical parts of Fraxinus excelsior shoots. Forest Pathology 32: 387 394. Stocki J., Stocka T. 1999. Przyczyny zamierania drzew i drzewostanów jesionowych. Bibl. Leśn. Nr 118, Wyd. Świat, Warszawa. Szwałkiewicz J. 1999. Zamieranie drzew i drzewostanów jesionowych przyczyny, skutki, prognoza. Postępy Tech. w Leśn. 69:24 30. summary Chalara fraxinea new described fungus species on dying ash in Poland The fungus of the genus Chalara has been frequently isolated by the author since 2000 when he started the research on ashes showing the symptoms of dieback. Most often the presence of the fungus was detected on ashes with the symptoms of wilting and in an area local necroses on live main and lateral shoots. In 2006, the author described the fungus as a new, previously unknown species named Chalara fraxinea. The paper provides the major characteristics of the fungus which may enable its identification. The distinctive feature of the fungus are particularly small conidia and, unlike the majority of the Chalara species, they develop primarily in slimy droplets. A characteristic feature of a part of the colony is the development of sclerotic bodies. The author indicates the scope of the research necessary to confirm the role of the fungus in the process of ash dieback.