BADANIA NAD OPRACOWANIEM PRZESIEWOWEJ METODY OZNACZANIA PCDD I PCDF W PASZACH

BADANIA NAD OPRACOWANIEM PRZESIEWOWEJ METODY OZNACZANIA PCDD I PCDF W PASZACH Sylwia Stypuła-Trębas, Jadwiga Piskorska-Pliszczyńska, Paweł Małagocki Zakład Radiobiologii Państwowy Instytut Weterynaryjny Państwowy Instytut Badawczy Al. Partyzantów 7 24-100 Puławy e-mail: jagoda@piwet.pulawy.pl Ustawiczny postęp, nowe technologie oraz rosnące wymagania wobec metod stosowanych w oznaczaniu dioksyn sprawiają, że istnieje wyraźna potrzeba opracowywania nowych i modyfikowania już istniejących procedur badawczych. Analiza próbek pasz na obecność toksycznych polichlorowanych dibenzo-p-dioksyn (PCDD) i polichlorowanych dibenzofuranów (PCDF) stanowi wyzwanie dla analityków nie tylko ze względu na złożoność matryc i konieczność jednoczesnego oznaczania wielu analitów, ale przede wszystkim z uwagi na bardzo niskie, rzędu ppt (pg/g) stężenia tych związków. Powoduje to, że metody oznaczania dioksyn muszą być wyjątkowo czułe, dokładne, specyficzne i selektywne. Warunki te spełnia chemiczna metoda instrumentalna HRGC-HRMS (ang. High Resolution Gas Chromatography-High Resolution Mass Spectrometry). Jednakże pomimo swych licznych zalet ze względu na wysokie koszty i długi czas analizy, metoda ta nie jest zbyt sprawnym i wydajnym narzędziem analitycznym do oceny skażeń, co szczególnie dobitnie ukazały sytuacje kryzysowe [3, 33, 34, 36]. Prowadzenie kontroli urzędowej z wykorzystaniem kosztownych metod analitycznych ogranicza zakres i częstotliwość prowadzonych badań. Wszystko to powoduje, że uzyskanie pełnej informacji o poziomie zanieczyszczenia pasz dioksynami jest w praktyce trudne do realizacji. Poszukiwanie szybkich i mniej kosztownych metod analizy doprowadziło do rozwoju metod biologicznych. Jednakże dopiero poznanie mechanizmu działania toksycznego dioksyn i związków dioksynopodobnych na poziomie komórkowym oraz postęp w dziadzinie biologii molekularnej doprowadziły do opracowania skutecznych narzędzi bioanalitycznych w roli wstępnych metod przesiewowych do wykrywania tzw. próbek podejrzanych. W konsekwencji tradycyjne, chemiczne podejście do oznaczania dioksyn w żywności i paszach zostało oficjalnie uzupełnione przez alternatywne metody bioanalityczne [10, 11, 12]. Inaczej niż w przypadku instrumentalnych metod chemicznych, za pomocą biotestów oznacza się całkowitą toksyczność próbki, wyrażoną w równoważnikach toksyczności TEQ (ang. Toxic EQuivalent), bez konieczności ustalenia poziomu indywidualnych kongenerów. Wartość TEQ wyznaczona metodą biologiczną integruje wszystkie rodzaje biologicznej aktywności i potencjalnych interakcji między kongenerami PCDD i PCDF w złożonej mieszaninie, co pozwala na ocenę stopnia ryzyka, z jakim wiąże się ekspozycja na dioksyny zawarte w danej próbce. Spośród metod biologicznych do najczęściej stosowanych w monitoringu skażeń dioksynami żywności i pasz należy biotest CALUX (ang. Chemically Activated LUciferase gene expression), oparty na genetycznie zmodyfikowanej linii komórkowej mysiej hepatomy [7, 17, 20, 2, 26, 27, 29, 30,, 37]. Zasada biotestu oparta jest na mechanizmie aktywacji receptora węglowodorów arylowych (AhR) przez dioksyny i ekspresji genu reporterowego lucyferazy. Powstała lucyferaza w obecności substratu (lucyferyna, ATP, jony Mg 2+) katalizuje reakcję chemiczną, której efektem energetycznym jest luminescencja. Stężenie dioksyn w próbce mierzone jest pośrednio przez pomiar ekspresji natężenia emitowanego sygnału 1

świetlnego i pozwala wyznaczyć sumaryczną toksyczność próbki, wyrażoną w TEQ [16, 18, 34]. Zastosowanie biotestu CALUX bez odpowiednich metod ekstrakcji i oczyszczania może prowadzić do znacznego zawyżenia wyników analizy, ponieważ oprócz toksycznych kongenerów PCDD i PCDF, wykrywa on także inne związki będące agonistami receptora Ah. Z tego względu dobór właściwych technik izolacji dioksyn z matrycy oraz sposobu oczyszczania ekstraktów mają zasadniczy wpływ na wynik końcowy oznaczenia za pomocą testu biologicznego CALUX. Celem podjętych badań było opracowanie szybkiej metody skryningowej oznaczania dioksyn z użyciem biotestu CALUX. Doboru optymalnego sposobu izolacji dioksyn z mieszanek paszowych i mączek rybnych oraz techniki oczyszczania ekstraktów dokonano w kontekście oficjalnych wymagań stawianym dla odzysku (30-140%) oraz współczynników zmienności (CV<30%) biologicznych metod przesiewowych oznaczania dioksyn w paszach [10, 11, 12]. Biotest CALUX. W niniejszej pracy stosowano biotest CALUX, opatentowany przez amerykańskiego producenta Xenobiotic Detection Systems Inc., Durham NC, USA. Schemat sposobu wykonania biotestu przedstawiono na rycinie 1 [28]. Rycina 1. Schemat wykonania biotestu CALUX. 2

Dobór metody ekstrakcji. Proces ekstrakcji to jeden z najistotniejszych etapów w procedurze oznaczania dioksyn. Podstawowym kryterium wyboru odpowiedniej metody ekstrakcji jest jej efektywność, pozwalająca na odseparowanie badanych substancji od potencjalnych interferencji jak również na koncentrację analitów. Nie są to jednak jedyne czynniki brane pod uwagę podczas doboru procedury ekstrakcyjnej. Do bardzo istotnych parametrów należy również dostępność aparatury, a także czas trwania i koszty procesu. W piśmiennictwie opisano wiele metod ekstrakcji dioksyn z różnorodnych matryc [1, 4,, 6, 13, 14, 1, 19, 21, 24, 31, 32]. Spośród nich do optymalizacji metody wybrano wytrząsanie mechaniczne (W), ekstrakcję ultradźwiękami (USE), wytrząsanie mechaniczne wraz z ekstrakcją ultradźwiękami (W+USE), przyspieszoną ekstrakcję rozpuszczalnikami (ASE) oraz ekstrakcję na kolumnie (EK). Materiał do badań. Do optymalizacji procesu ekstrakcji wykorzystano mieszanki paszowe i mączki rybne. Ich wybór wynikał z bieżących potrzeb badawczych laboratorium, w związku z koniecznością podjęcia badań nad oceną skażeń pasz w ramach krajowego monitoringu paszowego. Zakładając błąd szacunku średniego stężenia dioksyn wynoszący 0,16 i 0,1 ng WHOTEQ/kg suchej masy odpowiednio dla mączek rybnych i mieszanek paszowych, minimalną liczebność próby ustalono na n=6 (poziom istotności = 0,0). Badania prowadzono w seriach, z których każda składała się z dwóch ślepych próbek odczynnikowych, sześciu ślepych próbek matrycowych oraz dla wyznaczenia odzysku sześciu próbek wzbogaconych roztworem 17 kongenerów PCDD i PCDF do połowy maksymalnego dopuszczalnego poziomu. Poziom ten wynosi dla mączki i mieszanki paszowej odpowiednio 1,2 i 0,7 ng WHO-TEQ/kg suchej masy badanego materiału. Z jednorodnych próbek laboratoryjnych pobierano do analizy ±0,0 g mączek rybnych i 10±0,1 g mieszanek paszowych. Zawartość wilgoci oznaczano poprzez suszenie w temperaturze 80ºC przez 24 godziny. Wyniki i omówienie. Wyniki porównań efektywności ekstrakcji z użyciem czterech mieszanin aceton/cykloheksan (2:8, v/v), aceton/n-heksan (2:8, v/v), metanol/toluen (2:8, v/v) oraz izopropanol/n-heksan (2:8, v/v) do ekstrakcji dioksyn z mączek rybnych i mieszanek paszowych przedstawiono na rycinach 2 i 3. Względna skuteczność porównywanych mieszanin ekstrakcyjnych okazała się być podobna w wypadku mieszanek paszowych i mączek rybnych. Najgorsze rezultaty dało zastosowanie mieszaniny izopropanol/n-heksan, zaś najlepszą efektywność uzyskano stosując mieszaninę toluen/metanol, 8:2 v/v (M-1). Mieszaninę tą stosowano w dalszych badaniach. 3

90 80 70 Ś re d n ia Ś r e d n ia ± S D Z a k re s 60 Odzysk (%) 0 40 M -1 M -2 M -3 M -4 M ie s z a n in a e k s tra k c y jn a O d z ysk (% ) Rycina 2. Wpływ doboru mieszaniny ekstrakcyjnej na efektywność ekstrakcji dioksyn z mączki rybnej. M-1- aceton/cykloheksan (2:8, v/v), M-2- aceton/n-heksan (2:8, v/v), M-3- metanol/toluen (2:8, v/v) oraz M-4- izopropanol/n-heksan (2:8, v/v). 8 8 7 7 6 6 4 4 3 0 0 0 0 0 Ś r e d n ia Ś r e d n ia ± S D Z a k re s M -1 M -2 M -3 M -4 M ie sz a n in a e k stra k c y jn a Rycina 3. Wpływ doboru mieszaniny ekstrakcyjnej na efektywność ekstrakcji dioksyn z mieszanki paszowej. M-1- aceton/cykloheksan (2:8, v/v), M-2- aceton/n-heksan (2:8, v/v), M-3- metanol/toluen (2:8, v/v) oraz M-4- izopropanol/n-heksan (2:8, v/v). Dalsza optymalizacja metody polegała na porównaniu czterech technik ekstrakcji przedstawionych w tabeli 1. Wypełnienie celek do ekstrakcji techniką ASE przedstawiono na rycinie 4A, zaś warunki prowadzenia ekstrakcji ASE w tabeli 2 [1, 4,, 13,1]. Tabela 1. Układ eksperymentów. Porównanie warunków prowadzenia procesów ekstrakcji. Ekstrakcja Matryca Mączka rybna Wytrząsanie (W) Ultradźwięki (USE) ASE 300 Ekstrakcja kolumnowa (EK) 3, 120, 240 min Czas:1, 30, 60 min Temp.: 2, 3 oc Cela: ryc. 4A Warunki: tab. 2 Ryc. 4B 4

Pasza Czas: 60 min Temp.: 3 oc 120 min Cela: ryc. 4 A Warunki: tab. 2 A. Ryc. 4B B. Rycina 4. Wypełnienie celki ekstrakcyjnej do ASE (A) oraz kolumny do ekstrakcji kolumnowej (B ) Tabela 2. Warunki prowadzenia ekstrakcji ASE. Parametr Temperatura Czas trwania fazy statycznej Czas ogrzewania Czas płukania Ilość cykli Ciśnienie Objętość płukania Wielkość celki Rozpuszczalnik Warunki ekstrakcji 120 C 2 min 6 min 200 sek. 3 100 psi 7 % 66 ml metanol/toluen (2:8, v/v) 90 O d z y s k (% ) W wypadku wytrząsania mechanicznego przy wydłużeniu czasu wytrząsania z 3 do 80 240 minut obserwowano wzrost odzysku i obniżenie współczynników zmienności, jak przedstawiono7 0na rycinie. Ś r e d n ia Ś r e d n ia ± S D M in im u m - M a ks im u m 60 0 40 t1 t2 C z a s w y tr z ą s a n ia t3

90 Odz ys k (%) 80 70 Śred nia Śre dnia± SD Min imu -Ma ksim um 60 0 40 t1 t 2 t3 C za sw yt rzą sa ni a Zakres Rycina. Wpływ czasu wytrząsania na efektywność ekstrakcji dioksyn z mączki rybnej, gdzie t1= (1+10+10) min, t2= (60+30+30) min oraz t3= (120+60+60) min. Podobną tendencję zaobserwowano w wypadku wydłużania czasu ekstrakcji ultradźwiękami (ryc. 6), gdzie ze wzrostem temperatury i czasu ekstrakcji obserwowano wzrost odzysku przy jednoczesnym obniżeniu współczynników zmienności (CV) z 2% (T=2oC) do 20% w (T=30C). O d zy s k (% ) 90 80 70 Ś r e d n ia Ś r e d n ia ± S D MZakres in im u m - M a k s im u m 60 0 40 30 2 0 m in., 2 0 C 2 0 m in., 3 0 C 4 0 m in., 2 0 C 4 0 m in., 3 0 C 6 0 m in., 2 0 C 6 0 m in., 3 0 C a W a r u n k i e k s t r a k c ji Rycina 6. Wpływ czasu i temperatury na efektywność ekstrakcji ultradźwiękami - mączka rybna. Wyniki porównania technik ekstrakcji przedstawiono w tabeli 3, zaś graficzną ilustrację wpływu porównywanych technik ekstrakcji na odzyski i współczynniki zmienności wszystkich układów doświadczalnych przedstawia rycina 7. Tabela 3. Porównanie odzysków, wartości CV i czasu ekstrakcji stosowanych technik ekstrakcji. Mączka rybna Średnia Odzysk(R, %) Przedział ufności ( =0,0) Współczynnik zmienności (CV, %) Czas (h) W 73 6-81 13 4 Technika ekstrakcji USE EK 62 72 3-71 7-87 19 26 2 10 ASE 84 77-91 11 0, Mieszanka paszowa Średnia Odzysk (R, Przedział ufności ( =0,0) %) Współczynnik zmienności (CV, %) Czas (h) W 64 6-72 16 4 USE 66 4-78 22 2 ASE 91 82-100 13 0, Matryca Parametr EK 60 0-70 20 Objaśnienia: W - wytrząsanie mechaniczne, USE - ekstrakcja ultradźwiękami, EK - ekstrakcja na kolumnie, ASE - przyspieszona ekstrakcja rozpuszczalnikami. 6

Rycina 7. Wpływ technik ekstrakcji na odzysk (R) i współczynnik zmienności (CV). Biorąc pod uwagę odzysk, współczynniki zmienności i czas ekstrakcji, spośród wszystkich porównywanych technik w wypadku obu rodzajów badanych matryc, najgorsze rezultaty uzyskano dla ekstrakcji ultradźwiękami (USE) oraz na kolumnie (EK). Najlepsze rezultaty uzyskano stosując przyspieszoną ekstrakcję rozpuszczalnikami (ASE), co znalazło potwierdzenie w piśmiennictwie [, 14, 21]. Jej odzysk w każdym wypadku przekraczał 70%, współczynniki zmienności były niższe niż 1%, zaś czas wykonania okazał się najkrótszy. Wadą tego rodzaju ekstrakcji jest wysoka cena nie tylko samego ekstraktora ASE, ale również eksploatacji. Stąd pomimo znacznie niższych odzysków, ale biorąc pod uwagę koszty analityczne postanowiono wybrać do dalszych prac wytrząsanie mechaniczne jako podstawową technikę ekstrakcji, przygotowującą ekstrakty do badań testem biologicznym. Dobór metody oczyszczania ekstraktów. Zasadniczym kryterium doboru metody oczyszczania obok wysokich odzysków i powtarzalności jest skuteczne usuwanie związków interferujących. W próbkach pasz występuje szeroki wachlarz zanieczyszczeń organicznych. Największy problem analityczny stanowią trwałe związki organiczne, które również mogą być agonistami receptora Ah. Z tego powodu selektywna izolacja kongenerów PCDD i PCDF wymaga stosowania długich procedur oczyszczania. Proces oczyszczania jest żmudnym, pracochłonnym i najdłuższym etapem przygotowawczym w analizie dioksyn. Do oczyszczania surowych ekstraktów zastosowano chromatografię kolumnową z wypełnieniami wybranymi na podstawie przeglądu piśmiennictwa [9,30,31]. Pięć rodzajów stosowanych kolumn chromatograficznych przedstawia rycina 8 a układ doświadczeń tabela 4. 7

Kolumny: A z żelem krzemionkowym (33% H2SO4) B z żelem krzemionkowym (44% H2SO4) C węglowa D wielowarstwowa E florisilowa Rycina 8. Stosowane kolumny chromatograficzne Matryca Mączka rybna (g) L. powtórzeń n=4 Tabela 4. Oczyszczanie - układ doświadczalny. Kolumny Poziom wzmocnienia chromatograficzne* pg WHO-TEQ/g A+C B+C 0,8 A+E+C D+C Objaśnienie: opis kolumn chromatograficznych na ryc. 8. Materiał do badań. Do porównań etapu oczyszczania jako matrycę wybrano olej paszowy i mączkę rybną. W próbkach tych, stosując rutynową metodę CALUX oznaczono wstępnie wysokie poziomy dioksyn. Analiza chemiczna metodą HRGC-HRMS nie potwierdziła obecności PCDD i PCDF w ilości przekraczającej dopuszczalne stężenia (tab. ), co wyraźnie wskazywało na obecność związków interferujących z oznaczanymi dioksynami i dlatego próbki te użyto do oceny efektywności procesu oczyszczania. Dla zbadania efektywności oczyszczania służyła seria próbek, w skład której wchodziły: cztery próbki ślepe (matryce), cztery próbki wzbogacone i dwie próbki odczynnikowe. W celu wyznaczenia odzysków próbki wzmacniano standardową mieszaniną 8

wzorców 17 toksycznych PCDD i PCDF o stężeniu 4,22 pg WHO-TEQ/ l w ilościach podanych w tabeli 4. Tabela. Wyniki oznaczania metodą HRGC-HRMS i XDS-CALUX Matryca Olej paszowy Mączka rybna HRGC-HRMS 2,08 0,21 XDS-CALUX 11,02 1,74 Wyniki i omówienie. Przeprowadzone doświadczenia pozwoliły stwierdzić, że zastosowanie dwu- i trzy- etapowych procedur oczyszczania pozwala uzyskać odzyski na zbliżonym poziomie. W przypadku mączek rybnych uzyskano odzyski na poziomie 62-67%, w wypadku oleju i tranu w zakresie 74-79% (ryc. 9). Rycina 9. Wpływ sposobu oczyszczania na odzysk. Zwiększenie liczby etapów oczyszczania z dwóch do trzech, pozwoliło w sposób statystycznie istotny ograniczyć ilość interferencji tylko w przypadku oleju paszowego (ryc. 10). Nie stwierdzono znamiennych statystycznie różnic stężeń uzyskiwanych przy zastosowaniu różnych metod oczyszczana w pozostałych matrycach. Stwierdzono, że dwa etapy oczyszczania są wystarczające, także z ekonomicznego punktu widzenia. Zestawienie bezwzględnych wartości stężeń dioksyn, wyznaczonych metodą XDS-CALUX i metodami chemicznymi wykazało, że wyniki biotestu XDS-CALUX są znacząco wyższe w porównaniu z wynikami metod chemicznych. W dalszych pracach nad metodą oznaczania PCDD i PCDF w tkankach ryb, mieszankach paszowych i mączkach rybnych, oczyszczanie prowadzono metodą chromatografii kolumnowej, kolejno na dwóch kolumnach: kolumnie z żelem krzemionkowym (33% H2SO4) oraz na kolumnie węglowej (kolumny A i C, ryc.8). Podsumowanie. Na podstawie porównania rozpuszczalników, mieszanin i technik ekstrakcyjnych oraz sposobów oczyszczania surowych ekstraktów opracowano metodę skryningową oznaczania PCDD i PCDF w wybranych matrycach z zastosowaniem biotestu CALUX, której schemat przedstawiono ryc. 11. 9

Rycina 10. Wpływ sposobu oczyszczania na usuwanie interferencji. Porównanie wyników biotestu CALUX z metodą HRGC-HRMS. OCZYSZCZANIE EKSTRAKCJA Mączki rybne ±0,0 g Mieszanki paszowe 10±0,1g Mieszanina ekstrakcyjna 1. Metanol/toluen (8:2 v/v), 20 ml 2. Toluen, 1 ml 3. Toluen, 10 ml Wytrząsanie mechaniczne 1. 120 min. 2. 60 min. (2x) Wirowanie 1000 obrotów/min., 200C, min. Filtracja - kolumna chromatograficzna Bezwodny siarczan sodu, g; Celit, 2g Oznaczanie wagowe zawartości tłuszczu Wytrząsanie z żelem krzemionkowym (33% H2SO4) na 1g tłuszczu: 1. N-heksan, 20ml, 10 g żelu krzemionkowego (33% H2SO4), 2 min. 2. N-heksan, 10 ml, 2 min.(4x) Ekstrakcja ultradźwiękami min., Hz Chromatografia kolumnowa: żel krzemionkowy (33% H2SO4) (ryc. 8A) n-heksan, 60 ml Chromatografia kolumnowa: węgiel/celit (ryc. 8C) 1. dl-pcb: n-heksan/toluen/octan etylu (8:1:1, v/v), 1ml 2. PCDD i PCDF: toluen, 20 ml Odparowanie rozpuszczalników o 40 C, wirówkowy koncentrator próżniowy Biotest XDS-CALUX 10

Rycina 11. Schemat metody ekstrakcji PCDD i PCDF oraz oczyszczania surowych ekstraktów dla mączki rybnej i mieszanek paszowych. Podsumowanie. W badaniach nad adaptacją biotestu CALUX do oznaczania PCDD i PCDF w mączkach rybnych i mieszankach paszowych optymalne wyniki dla mieszanek paszowych i mączek rybnych uzyskano stosując mieszaninę metanolu z toluenem (2:8, v/v). Choć najlepszą spośród testowanych okazała się technika ekstrakcji ASE, za optymalne rozwiązanie przyjęto wytrząsanie mechaniczne, kierując się kosztami i parametrami wykonawczymi metody. Do oczyszczania ekstraktów dla wszystkich badanych matryc wybrano chromatografię kolumnową na dwóch kolumnach, zawierających żel krzemionkowy (33% H2SO4) i mieszaninę węgla aktywnego z celitem. Etap oczyszczania wymaga jednak podjęcia dalszych badań mających na celu poprawę efektywności usuwania interferencji. Należy zauważyć, że chociaż zastosowanie kolumny węglowej pozwala na oddzielenie frakcji zawierającej dioksynopodobne polichlorowane bifenyle PCB, to ze względu na podobne właściwości fizykochemiczne usunięcie szerokiej gamy polibromowanych analogów PCDD i PCDF, polichlorowanych naftalenów, polibromowanych eterów bifenylowych nie jest możliwe. Związki te w teście CALUX wykazują wysokie wartości REP [2, 8, 9, 22, 38]. Ponieważ związki te często towarzyszą syntezie dioksyn, a nawet występują w stężeniach wyższych niż dioksyny, ich obecność jest najprawdopodobniej głównym źródłem rozbieżności w wynikach oznaczania PCDD i PCDF metodą chemiczną i biologiczną i dlatego należy prowadzić w tym kierunku badania. Efektem przeprowadzonych badań było opracowanie metody przesiewowej z zastosowaniem biotestu CALUX, właściwej do detekcji dioksyn w mączkach rybnych i paszach przemysłowych. Piśmiennictwo 11

1. Archer J.C., Mobley R.J., Shojaee S., Pence M.L., Earnheart C.: Alternate extraction and clean-up for CALUX analysis of feeds and feed components. Organohalogen Comp. 2003, 60: 207-210. 2. Behnish P.A., Hosoe K., Sakai S.: Brominated dioxin-like compounds: in vitro assessment in comparison to classical dioxin-like compounds and other polyaromatic hydrocarbons. Environ Int 2003, 29: 861-877. 3. Bernard A., Broeckaert F., De Poorter G., De Cock A., Hermans C., Saegerman C., Houins PCB/dioxin incident: analysis of the food chain contamination and health risk evaluation. Environ Res. 2002, 88: 1-18. 4. Bernsmann T., Furst P.: PCDD/PCDF determination in feedingstuffs by means of accelerated solvent extraction (ASE) and HRGC/HRMS. Organohalogen Comp. 2003, 60: 408-411.. Bernsmann T., Furst P.: Comparison of accellerated solvent extraction (ASE) with integrated sulfuric acid clean up and Soxhlet extraction for determination of PCDD/PCDF, dioxin-like PCB and indicator PCB in feeding stuffs. Organohalogen Comp. 2004, 66: 19-163. 6. Bjorklund E., Von Holst C., Anklam E.: Fast extraction, clean-up and detection methods for the rapid analysis and screening of seven indicator PCBs in food matrices. Trends Anal. Chem. 2002, 21: 39-2. 7. Bovee T.F.H., Hoogenboom L.A.P., Hamers A.R.M., Traag W.A., Zuidema T., Aarts J.M.M.J.G., Brouwer A., Kuiper H.: Validation and use of the CALUX-bioassay for the determination of dioxins and PCBs in bovine milk. Food Add. Contam. 1998, 1: 86387. 8. Brown D.J., Chu M., Van Overmeire I., Chu A., Clark G.C.: Determination of REP values for the CALUX bioassay and comparison to the WHO TEF values. Organohalogen Comp. 2001, 48: 211-214. 9. Brown D.J., Van Overmeire I., Goeyens L., Chu M., Denison M.S., Clark G.C. : Elimination of interfering compounds in preparation for analysis by an Ah receptor based bioassay. Organohalogen Comp. 2002, 8: 401-40. 10. Commission Directive 2002/69/EC of 26 July 2002 laying down the sampling methods of analysis for the official control of dioxins and the determination of dioxin-like PCBs in foodstuffs. OJ 2002, L 209: -14. 11. Commission Directive 2002/70/EC of 26 July 2002 laying down the sampling methods of analysis for the official control of dioxins and the determination of dioxin-like PCBs in feedstuffs. OJ 2002, L 209: 1-21. 12. Commission Regulation (EC) No 1883/2006 of 19 December 2006 laying down methods of sampling for the official control of levels of dioxins and dioxin-like PCBs in certain foodstuffs. OJ 2006, L 364: 32-43. 13. Dean J.R., Xiong G.: Extraction of organic pollutants from environmental matrices: selection of extraction technique. Trends in Analytical Chemistry 2000, 19: 3-64. 14. Fayez L., Brunato R., Reiner E.: Comparison of manual and automated extraction and clean-up of PCDDs, PCDFs and dlpcbs in fish tissue. Organohalogen Comp. 2004, 67: 308-314. 1. Focant J.-F., Pirard C., de Pauw E.: Automated sample preparation-fractionation for the measurement of dioxins and related compounds in biological matrices: a review. Talanta 2004, 63: 1101-1113. 16. Garrison P.M., Tullis K., Aarts J.M.M.J.G., Brouwer A. Giesy J.P., Denison M.S.: Species specific recombinant cell lines as bioassay systems for detection of 2,3,7,8-TCDD like chemicals. Fundam Appl Toxicol 1996, 30: 194-203. 12

17. Gizzi G., Hoogenboom L.A.P., Von Holst C., Rose M., Anklam E.: Determination of dioxins (PCDDs/PCDFs) and PCBs in food and feed using DR CALUX bioassay: results of an international validation study. Food Additives and Contaminants 200, 22: 472-481. 18. Han D., Nagy S.R., Denison M.S.: Recombinant cell lines for the detection of dioxins and Ah receptor ligands - not all assays are created equal. Organohalogen Comp. 2002, 8: 421-424. 19. Hermann T., Collingro C., Papke O.: PCDDs/PCDFs and dioxin-like PCBs in fish, fish products, and fish feed. Organohalogen Comp. 2004, 66: 2122-2126 20. Hoogenboom R., Bovee T., Portier L., van der Weg G., Ostenk C., Bor G., Traag W.: The German bakery waste incident; use of a combined approach of screening and confirmation for dioxins in feed and food. Talanta 2004, 63: 1249-123. 21. Huwe J.K.: Comparison of Soxhlet and accelerated solvent extractions in the analysis of dioxins and furans from liver samples. Organohalogen Comp. 2002, 8: 229-232. 22. Jeong S.-H., Cho J.-H., Jong-Myung P., Denison M.S.: Rapid bioassay for the determination of dioxins and dioxin-like PCDFs and PCBs in meat and animal feeds. J. Anal. Toxicol. 200, 29: 16-162. 23. NP2/rNP27_nl.pdf 24. Sandell E., Kokkonen J.: A new acreditated method developed fort he analysing of polychlorinated- p-dioxin and polychlorinated furans from food and feed matrixes. Organohalogen Comp. 2002, : 7-60. 2. Schoeters G., Van Cleuvenbergen R.: Een snelle in vitro biologische test voor controle van dioxine-achtige stoffen in voeding. (An in vitro bioassay for screening dioxin-like substances in food samples). Vlaamse Instelling voor Technologisch Onderzoek Boeretang 200 Mol Belgium, 2001 http://www.belspo.be/belspo/home/publ/pub_ostc/ 26. Scippo M.L., Eppe G., De Pauw E., Maughin-Rogister G.: DR-CALUX screening of food sample: evaluation of the quantitative approach to measure dioxins, furans and dioxin-like PCBs. Talanta 2004, 63: 1193-1202 27. Scippo M., Rybert T., Eppe G., Massart P.: Dioxin analysis in feed: cell based assay versus mass spectrometry method. Accred Qual Assur 2006, 11: 38-43. 28. Stypuła S., Carbonnelle S., Van Overmeire I., Windal I.,Van Wouwe N., PiskorskaPliszczyńska J.: Analiza porównawcza zawartości w rybach PCDD i PCDF oznaczonych metodą ćhemicznie aktywowanej ekspresji genu lucyferazy oraz GC/MS/MS 29. Stypuła-Trębas S., Warenik M., Małagocki P., Piskorska-Pliszczyńska J.: Evaluation of the recombinant cell-based bioassay as a screening method for dioxin monitoring in fish tissue. The First International Environmental Best Practices Conference, Abstract Book, Olsztyn 2006, 38. 30. Tsutsumi T., Amakura Y., Nakamura M., Brown D.J., Clark G.C., Sasaki K., Toyoda M., Maitani T.: Validation of the CALUX bioassay for the screening of PCDD/Fs and dioxinlike PCBs in retail fish. Analyst 2003, 128: 486-492. 31. U.S. EPA Method 1613 revision B: Tetra- through octa-chlorinated dioxins and furans by isotope dilution HRGC/HRMS. U.S. Environmental Protection Agency, Office of Water, Engineering and Analysis Division (4303) 401 M Street S.W. Washington, D.C. 20460. 32. U.S. EPA Method 30 revision C: Ultrasonic extraction. U.S. Environmental Protection Agency, Office of Water, Engineering and Analysis Division (4303) 401 M Street S.W. Washington, D.C. 20460. 33. Van Overmeire I., Goeyens L., Beernaert H., Srebrnik S., De Poorter G., Baeyens W., Clark G., Chu A., Chu D., Morris R., Brown D.: A comparative study of GC-HRMS and CALUX-TEQ determinations in food samples by the Belgian Federal Ministries of Public Health and Agriculture. Organohalogen Comp. 2000, 4:196-199. 13

34. Van Overmeire, I., Clark, G.C., Brown, D.J., Chu, M.D., Cooke, W.M., Denison, M.S., Baeyens, W., Srebrnik, S., Goeyens, L. Trace contamination with dioxin-like chemicals: evaluation of bioassay-based TEQ determination for hazard assessment and regulatory responses. Environmental Science and Policy 2001, 4: 34-37. 3. Vanderperren H., Van Wouwe N., Behets S., Windal I., Van Overmeire I., Fontaine A.: TEQ-value determinations of animal feed; emphasis on the CALUX bioassay validation. Talanta 2004, 63: 1277-1280. 36. Vestraete F.: Rapid methods and EU legislation. Rapid methods for biological and chemical contaminants in food and feed. Ed. von Amerongen. 2006, 6-84. 37. Windal I., Van Wouwe N., Carbonnelle S., Van Overmeire I., Eppe G., Xhrouet C., Debacker V., Depauw E., Baeyens W., Joiris C., Goeyens L.: Validation and discussion of CALUX analysis for marine samples. Organohalogen Comp. 2003, 60: 21-218. 38. Windal I., Denison M.S., Birnbaum L.S., Van Wouwe N., Baeyens W., Goeyens L.: Chemically Activated Luciferase Gene Expression (CALUX) cell bioassay analysis for the estimation of dioxin-like activity: critical parameters of the CALUX procedure that impact assay results. Environ. Sci. Technol. 200, 39: 1741-1748. 14