ROCZNIKI GLEBOZNAW CZE T. X X, Z. i, W A R SZA W A 1969 A N N A KRAUZE, D ANUTA DOM SKA KOLORYMETRYCZNE OZNACZANIE ŻELAZA W MATERIALE ROŚLINNYM Z ZASTOSOWANIEM a,a'-dwupirydylu K atedra C hem ii R olniczej w O lsztynie K ierow nik prof. dr M. K oter Żelazo jest jednym z podstawowych składników regulujących procesy biochemiczne w organizmach roślin, zwierząt i ludzi. Wchodzi ono w skład hemoglobiny, cytochromów i peroksydaz. Ilość żelaza w roślinach jest na ogół nieduża i zależnie od wieku i gatunku waha się w granicach od 10 do 800 ppm [5]. Do oznaczania mikrogramowych ilości żelaza duże zastosowanie znalazły metody kolorymetryczne, w których wykorzystano barwną reakcję, jaką dają jony Fe3+ i Fe2+ z niektórym i odczynnikami, jak rodanek potasu lub coraz częściej stosowany dwupirydyl [1, 2, 4, 5]. Odczynnik ten odznacza się wysoką czułością i selektywnością oraz pozwala na oznaczanie w badanej próbie całkowitej zawartości żelaza po redukcji Fe3f do Fe2+. Powstałe w środowisku kwaśnym, obojętnym lub alkalicznym czerwono zabarwione kompleksowe połączenia jonów żelazawych z dwupirydylem podlegają praw u Lam berta-b eera w szerokich granicach stężeń i są trw ałe w ciągu kilku miesięcy [7]. W literaturze metodycznej odczuwa się w dalszym ciągu brak dokładnego i szybkiego sposobu oznaczania żelaza w m ateriale roślinnym. T rudności związane z określaniem tego składnika skłoniły nas do opracowania kolorymetrycznego sposobu oznaczania żelaza z zastosowaniem dwupirydylu.
232 A. Krauze, D. Dom ska CZĘŚĆ DOŚW IADCZALNA W doświadczeniu użyto następujących odczynników i roztworów: woda utleniona ok. 33%, kwas nadchlorowy o c. wł. 1,54, kwas solny o c. wł. 1,19 rozcieńczony wodą w stosunku 1 : 1, kwas siarkowy 25-procentowy, wodorotlenek sodu ln, p-hydroksyfenyloglicyna (wywoływacz fotograficzny,,glycin ) ОД g rozpuszcza się w objętości 100 m l 0,4n kwasu siarkowego, roztwór a,a'-dwupirydylu 0,5 g w 100 ml 1 0-procentowego kwasu octowego. Sporządzenie krzywej wzorcowej przebiegało następująco: roztw ór podstawowy 0,3510 g FeS0 4(NH4)2S0 4 6 H2O rozpuszcza się w wodzie destylowanej uzupełniając do objętości 500 ml; 1 ml tak sporządzonego roztw oru zawiera 100 y Fe2+; roztw ory wzorcowe: ze świeżo przygotowanego roztw oru podstawowego odmierza się po 5, 10, 15 i 20 ml do kolb miarowych na 100 ml dodając 10 ml 25-procentowego kwasu siarkowego i uzupełniając wodą destylowaną do kreski. Z roztworów tych pobiera się kolejno po 5 ml, co odpowiada 25, 50, 75 i 100 у Fe2+ do kalibrowanych probówek na 25 ml i dalej postępuje się tak, jak z badaną próbą. Oznaczenia wykonano następująco: odważa się 1-2 g powietrznie suchej, zmielonej substancji roślinnej i po zwęgleniu na łaźni piaskowej spala się przez 3-4 godz w piecu w tem peraturze 450-500 C. W celu przyspieszenia spalania do ostudzonego popiołu zwilżonego wodą destylowaną dodaje się 0,5-1 ml wody utlenionej ok. 33-procentowej i po odparowaniu na łaźni wodnej spala się jeszcze przez 1 godz. W przypadku ciemnej barwy popiołu należy dodać 0,5-1 ml kwasu nadchlorowego (c. wł. 1,54) i spalać na łaźni piaskowej do odparowania kwasu i uzyskania szarobiałej (słoma) lub białej (ziarno) barwy popiołu. Ostudzony popiół zwilża się 2 ml wody destylowanej i dodaje 5 ml kwasu solnego (c. wł. 1,19), rozcieńczonego wodą w stosunku 1 : 1 oraz po przykryciu szkiełkiem zegarkowym podgrzewa do wrzenia i rozpuszczenia. Po ostudzeniu dodaje się 5 ml 25-procentowego kwasu siarkowego i odparowuje do usunięcia kwasu solnego. Otrzymany roztwór rozcieńcza się gorącą wodą destylowaną i sączy przez średnie sączki do kolb m iarowych o objętości 50 ml przemywając kilkakrotnie sączek gorącą wodą destylowaną. Po ostudzeniu i uzupełnieniu wodą destylowaną do kreski oraz po dokładnym wymieszaniu pobiera się 5 ml (co odpowiada 0,1-0,2 g substancji roślinnej i stężeniu 0,5 ml 25-procentowego kwasu siarkowego) do probówek kalibrowanych na 25 ml. Następnie dodaje się 1 ml p-hydroksyfenyloglicyny i 1 ml dw upirydylu oraz 4 ml ln wodorotlenku sodu
K olorym etryczne oznaczanie Fe w m ateriale roślinnym 233 w celu doprowadzenia do ph 4,0. Uzupełniony do kreski wodą destylowaną i wymieszany barwny roztwór kolorym etruje się przy długości fali 490 mu w kiuw etach o grubości w arstw y 1 cm. W Y N IK I I D Y S K U S J A W celu sprawdzenia wartości opracowanej metody oznaczania żelaza w m ateriale roślinnym w ybrano i porównano najczęściej spotykane w literaturze metody kolorymetryczne z zastosowaniem rodanku potasu i a,a'-dwupirydylu [2, 6]. Zgodnie z zaleceniem wielu autorów [1, 3, 4, 6] wzięto przy tym pod uwagę następujące czynniki, wpływające na dokładność metody: odczyn badanego roztworu, stężenie odczynnika reagującego i jego czułość, szybkość powstawania i trwałość barwnego kompleksu, rodzaj reduktora. Przeprowadzone pomiary kontrolne stosowanych metod wykazały, że bardzo ważnym elementem, niezależnym od doboru odczynnika reagującego z żelazem, jest określony odczyn środowiska, który nie uregulowany może wpłynąć na obniżenie lub podwyższenie wyników oznaczeń. W metodzie rodankowej wpływ odczynu środowiska uwidacznia się już w roztworach wzorcowych żelaza i dopiero wyrównanie odczynu tych roztworów pozwala na otrzymanie krzywej zgodnej z prawem Lamberta- -Beera (rys. la i lb). Z przeprowadzonych dalszych badań okazało się Rys. 1. Krzyw a do oznaczania żelaza (Fe3+) m etodą rodankow ą Pipera 1 ph p o c z ą tk o w e r o ztw o ró w 1,1-1,3, 2 ph p o c z ą tk o w e ro ztw o ró w <1,0 Curve for determ ining iron (Fe3+) by the P ipers s rhodanate m ethod 1 in itia l ph o f s o lu tio n s 1,1-1,3, 2 in itia l ph o f s o lu tio n s <1,0
234 A. Krauze, D. Dom ska również, że stosowanie m etody rodankowej przy oznaczaniu żelaza w materiale roślinnym jest kłopotliwe. Pozwala ono wprawdzie na stosunkowo dokładne określanie małych zawartości żelaza w zakresie stężeń 1-10 у (tab. 1), ale w ystępujące w roślinach duże zróżnicowanie w ilościach T a b e l a 1 Spraw dzenie b łęd u m etody rodankow ej podanej p r z e z P ip e r a V e r i f i c a t io n o f e r r o r o f th e P ip e r s rh odanate m ethod S tężen ie Fe^+ - Fe^+ con cen tra tio n in % w badanej prób ce in th e sample t e s t e d d odatek a d d itio n razen t o t a l z n a le z io n o f о und R ó żn ica D iffe r e n c e B łąd E rror % 4,0 2,5 6,5 6,5 0,0 0,0 0 5,4 2,5 7,9 7,9 0,0 0,0 0 2,3 5,0 7,3 7,2 0,1-1,3 7 4,6 5,0 9,6 9,6 0,0 0,0 0 5,4 5,0 1 0,4 1 0,4 0,0 0,0 0 7,5 5,0 1 2,5 1 2,5 0,0 0,0 0 9,6 5,0 1 4,6 1 3,9 0,7-4,8 0 4,6 7,5 1 2,1 1 2,3 0,2 + 1,6 5 5,4 1 0,0 1 5,4 1 5,2 0,2-1,3 0 1 0,8 1 0,0 2 0,8 1 8,7 2,1-1 0,1 0 Razem - T o ta l 3,3 Î 1 9.2 2 ârednio Mean 0,3 1 i 1,9 2 tego składnika stwarza konieczność ciągłego kontrolowania i ustalania rozcieńczenia badanej próbki. Utrzym anie jednakowego odczynu środowiska decyduje również o dokładności wyników w metodach z zastosowaniem a,a'-dwupirydylu, przy czym uważa się, że optimum odczynu badanego roztworu przy stosowaniu tego odczynnika mieści się w granicach ph 3,0-4,5 [4]. W trakcie oznaczania żelaza ściśle według sposobu podanego przez PiperaiBarona [2, 6] dużą trudność sprawia wyrównanie odczynu badanych roztworów, ponieważ do tego celu autorzy stosują stężone odczynniki i roztwory (stężony amoniak i lon wodorotlenek sodu). W metodzie podanej przez Pipera [6] wywołanie barwnego kompleksu żelaza z dwupirydylem występuje wyraźnie tylko w przypadku dużych ilości żelaza w badanym roztworze. Przy małych ilościach tego pierwiastka wytwarzanie się barw nego kompleksu jest stopniowe, co wpływa na niedokładność wyników, spowodowaną niedostatecznym lub nadm iernym zalkalizowaniem środowiska. W metodzie opracowanej przez Barona używany do redukcji Fe3+ do Fe2+ kwas siarkowy nie daje pewności, że redukcja zaszła całkowicie, przy czym powstający podczas tej reakcji nadm iar dw utlenku
K olorym etryczne oznaczanie F e w m ateriale roślinnym 235 Tabela 2 Spraw d zenie b łę d u m etody p odanej p r z e z P ip e r a z zastosow an iem, c* '- d w u p irydylu V e r i f i c a t io n o f e r r o r o f th e.p ip e r s m ethod, under o i, c * '- / l i p y r i d i l a p p lic a t io n S t ę ż e n i e. F e 2+ - F e2+ c o n c e n tr a tio n i n w badanej p róbce i n th e sam ple t e s t e d d odatek a d d itio n razem t o t a l z n a le z io n o fou nd R ó żn ica D iffe r e n c e B łą d E rr o r % 2 2,5 5,0 2 7,5 2 9,0 1,5 + 5,4 5 5 7,5 5,0 6 2,5 6 4,0 1,5 + 2,4 0 2 2,5 1 0,0 3 2,5 2 9,5 3,0-9,2 4 4 0,0 1 0,0 5 0,0 4 9,0 1,0-2,0 0 5 7,5 1 0,0 6 7,5 7 1,0 3,5 + 5,1 8 2 0,0 2 5,0 4 5,0 4 0,0 5,0-1 1,1 2 4 0,0 2 5,0 6 5,0 6 8,0 3,0 + 4,6 1 4 9,0 2 5,0 7 4,0 7 1,0 3,0-4,0 6 2 0,0 5 0,0 7 0,0 6 9,0 1,0-1,4 3 2 2,5 5 0,0 7 2,5 7 1,5 1,0-1,2 5 Razem - T o ta l 2 3,5 i 4 6,7 4 Średnio - Mean 2,3 i 4,4 5 Spraw d zenie b łę d u m etody Barona V e r i f i c a t io n o f e r r o r o f th e B aron s m ethod Tabela 3 S t ę ż e n ie i F e2+ - F e2"* c o n c e n tr a tio n i n ^ w badanej prób ce i n th e sample t e s t e d d odatek a d d itio n razem t o t a l z n a le z io n o fou n d R ó żn ica D iffe r e n c e B łąd E rror 3 0,0 1 0,0 4 0,0 4 0,0 0,0 0,0 0 5 0,0 1 0,0 6 0,0 6 0,0 0,0 0,0 0 2 8,0 2 5,0 5 3,0 5 7,5 4,5 + 8,4 9 5 0,0 2 5,0 7 5,0 7 6,0 1,0 + 1,3 3 5 1,5 2 5,0 7 6,5 7 7,0 0,5 + 0,6 5 5 7,5 2 5,0 8 2,5 9 4,0 1 1,5 + 1 3,9 3 3 0,0 5 0,0 8 0,0 9 1,0 1 1,0 + 1 3,7 5 5 0,0 '5 0,0 1 0 0,0 1 0 5,0 5,0 ; +5,0 0 2 7,5 7 5,0 102,5 n ie odczytano - unread 5 0,0 7 5,0 125,0 n ie odczytano - unread % Raze::. T o ta l 3 3,5-4 3,1 5 Średnio - Me an 4,1 i 5,3 9 siarki nie pozostaje także bez wpływu na dokładność wyników [3, 7]. Przy tym sposobie oznaczania żelaza w ykreślona krzyw a wzorcowa w y kazuje zgodność z praw em Lam berta-b eera dopiero po dłuższym okre-
236 A. Krauze, D. Dom ska sie czasu (rys. 2). Odczytane wartości żelaza na podstawie tej krzywej odbiegają znacznie od wyników uzyskanych w metodach opisanych przez Pipera z zastosowaniem rodanku potasu i dw upirydylu (tab. 5). Metoda opracowano > Recently developed method Metoda Barona Boron's method Rys. 2. K rzyw e do oznaczania żelaza (Fe2+) z zastosow aniem a,a'-dw upirydylu A p om iar E w y k o n a n y od razu, В p o m ia r E w y k o n a n y na d ru gi d zień Curve for determ ining iron (Fe2+) under a,a'-dipyridil application A E m e a su r em en t carried o u t im m a d ia te ly, В E m e a su rem en t ca rried o u t on a n o th er d ay Ze względu na wynikające trudności przy oznaczaniu żelaza w m a teriale roślinnym opracowano dokładną i prostą metodę oznaczania całkowitej ilości tego pierw iastka (po redukcji Fe3+ do Fe24*) z zastosowaniem a,a'-dwupirydylu. Różni się ona od metod podanych przez Pipera i Barona większą precyzją wykonania (niezależnie od rozpiętości zaw artości żelaza), wynikającą ze ścisłego ustalenia optym alnego odczynu badanych roztworów, doboru odpowiedniego reduktora oraz właściwego stężenia odczynnika reagującego. Drogą pomiarów analitycznych ustalono, że najbardziej optym alny odczyn środowiska, w którym powstaje trw a ły, barwny, kompleksowy związek żelaza z dwupirydylem jest ph = 4,0 (tab. 6). Ze stosowanych reduktorów, jak kwas siarkowy, p-hydroksyfenyloglicyna i siarczyn sodu najbardziej zadowalające wyniki otrzymano przy użyciu wywoływacza,,glycin w roztworze 0,4n kwasu siarkowego (tab. 5). W celu zlikwidowania wpływu przeszkadzających jonów cynku, miedzi, niklu i innych pierwiastków oraz przyspieszenia powstania barw nego kompleksu Fe2+ z dw upirydylem zastosowano odczynnik reagujący 0 stężeniu 0,5 g w 100 ml 10-procentowego kwasu octowego (tab. 6). Oznaczona zawartość żelaza według opracowanej m etody jest dokładna 1 zgodna z wynikami otrzym anym i sprawdzoną metodą rodankową i dwu-
K olorym etryczne oznaczanie Fe w m ateriale roślinnym 237 Spraw dzenie b łęd u opracow anej metody V e r i f i c a t io n o f e r r o r o f th e own, r e c e n t ly d ev elo p ed method S tężen ie Fe2+ - Fe2+ con cen tra tion in ^ v; badajioj próbce in th e sample t e s t e d dodatek a d d itio n razem t o t a l z n a le z io n o found R ó żn ica D iffe r e n c e B łąd «E rror % 1 2,0 2 5,0 5 7,0 3 8,0 1,0 +2,7 0 2 0,0 2 5,0 4 5,0 4 4,5 0,5-1,1 2 2 1,0 2 5,0 4 6,0 4 4,5 1,5-5,2 7 5 4,0 2 5,0 7 9,0 7 8,5 0,5-0,6 4 1 0,0 5 0,0 6 0,0 6 2,0 2,0 + 5,0 5 1 2,0 5 0,0 6 2,0 6 1,5 0,5-0,8 1 2 1,0 5 0,0 7 1,0 7 0,5 0,5-0,7 1 2 4,5 5 0,0 7 ^,5 7 6,0 1,5 +2,0 1 2 9,0 5 0,0 7 9,0 8 0,5 1,5 + 1,8 9 1 0,0 7 5,0 8 5,0 8 6,0 1,0 + 1,1 7 Razem - T o ta l 1 0,5-1 7,5 5 śred n io - L'ean 1,0 1 1,75 XX/ W ystęp ujące n a j c z ę ś c i e j w ahania b łę d u ozn aczeń ż e la z a w z a k r e sie s tężeń od 10-90 Й /n a 60 ZDadanych/ E rror f lu c t u a t io n s o c c u r r in g m ost f r e q u e n t ly in ir o n d e te r m in a tio n w ith in th e range o f c o n c e n tr a tio n s o f 1 0-9 0 ^ /p e r ea ch o f th e 60 c o n c e n tr a tio n s in v e s t ig a t e d / Z aw artość ż e la z a w r o ś lin a c h w ppm ozn aczonego k ilk om a m etcdar.i Iron con ten t in p la n ts / i n ppm /, determ ined by sev era l methods Tabela 5 Metody - îûethod z c*, e x ' - dwupirydylem w ith cà, o i.1 - d ip y r id il R o ślir ^ P la n t rodankowa rh od anate wg P ip e r a a cc o rd in g to P ip e r Barona -- Baron rod za j red u k tora redu ctor kind nowo opracowana r e c e n t ly d ev elo p ed G ly cin G ly cin e H2so3 KagSOj G ly cin G ly cin e Żyto - słom a - Rye - straw 96,0 98,0 115,0 78,0 98,0 Owies - ziarno - O ats - grain 80,0 80,0 110,0 72,0 80,0 Rzepak - ziarn o - Rape - seed 150,0 160,0 200,0-164,0 K oniczyna - sian o - C lover - hay 76,6 7 5,0 100,0 66,6 79,2 Buraki - k orzenie - B eets - ro o ts 108,5 115,0 162,0 114,0 116,0
238 A. K rauze, D. D om ska Tabela 6 Wpływ odczynu śro d o w isk a, cz a su i s t ę ż e n i a o d czyn n ik a rea g u ją c e g o n a w y n ik i o z n a c z e n ia z a w a r to ś c i ż e la z a E f f e c t o f r e a c t io n medium, tim e and c o n c e n tr a tio n o f resp o n d in g r e a g e n t upon th e r e s u l t s o f ir o n c o n te n t d e te r m in a tio n S tężen ie O i, oi. ' - dwupirydylu % <Ы., ' - d ip y r id il c o n c e n tr a tio n, % ph roztw oru ph o f s o lu t io n S te ż e n ie F e2+ w % F e2+c o n c e n tr a tio n, i n J 0,2 0,2 0,5 w c z a s ie od 1-6 g o d zin y w ith in 1-6 h ours X F e2+ po skolorym etrow an iu Û F e2+ a f t e r c o lo r im e tr ic d e te r m in a tio n na d ru g i d z ie ń on th e n ext day od razu Im m ediately w roztw orach wzorcowych - in standard s o lu tio n s 5,0 25 23 25 25 3,5 " 23 25 25 4.0 11 23 25 2 5 If 4,5 22 25 25 5,0 1 19 24-5,0 50 48 50 50 3,5 " 48 50 50 4,0 i 50 53 50 4,5 " 4 4-4 7-4 8 50 50 5,0 " 38 45-3,0 75 71 75 75 3,5 и 71 75 75 4,0 ii 71 75 75 4,5 it 61-67 - 71 75 75 5,0 " 59 65-3,0 100 96 96 98 3,5 " 96 98 98 4,0 " 98 100 100 4,5 II 92-94 100 100 5,0 n 82 87 - w roztw orach badanych r o ś l i n - i n s o lu t io n s o f t e s t e d p la n t s 3,0 6,5 6,0 6,5 6,0 3,5 it 6,5 6,5 6,5 4,0 " 6,5 6,5 6,5 4,5 it 6,5 6,5 6,5 4,0 25 23 25 n.o. n 4,5 22 25 n.o. 5,0 M 19 24 n.o. 3,0 3 4,5 34 3 4,5 34 3,5 " 34 3 4,5 34 4,0 " 3 4,5 3 4,5 3 4,5 1 4,5 3 2,5 3 4,0 3 2,5
K olorym etryczne oznaczanie Fe w m ateriale roślinnym 239* pirydylową Pipera (tab. 5). K rzywa wzorcowa przebiega zgodnie z p rawem Lamberta-Beera w zakresie stężeń 0-100 y, średni błąd metody wynosi ± 1,7%. W NIOSKI W wyniku przeprowadzonych badań stwierdzono, że przy oznaczaniu żelaza w materiale roślinnym przy użyciu a, a -dwupirydylu dokładność oznaczeń zależy głównie od określonego ph środowiska, rodzaju reduktora i stężenia odczynnika reagującego. Najbardziej miarodajne wyniki otrzymano przy ph 4,0 i zastosowaniu odczynnika reagującego w stężeniu 0,5% oraz przy użyciu do redukcji żelaza p-hydroksyfenyloglicyny. Czułość m etody mieści się w zakresie stężeń od 0-100 y przy średnim błędzie ±1,7%. LITERATURA [1] Allport N.L.: A naliza kolorym etryczna. PZWL, W arszawa 1956. [2] Baron H.: L andw. Forsch., В. 4, H. 1, 13, 1954. [3] Beicher R., Wilson C.L.: N ow e m etody w analizie chem icznej. PW T W arszawa 1958. [4] M a r с z e n к o Z.: O dczynniki organiczne w analizie nieorganicznej. PW N, W arszawa 1959. [5] N ow otny-m ieczyńska A.: F izjologia m ineralnego żyw ienia roślin.. PW RiL, W arszawa 1965. [6] Piper C.S.: A naliza gleby i roślin. PW N, W arszawa 1957. [7] Struszyński М.: A naliza ilościow a i techniczna. PWT, W arszawa 1952. А. К Р А У З Е, Д. Д О М СКА КОЛОРИМЕТРИЧЕСКОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ Ж Е Л Е ЗА В РАСТИТЕЛЬНОМ ВЕЩ ЕСТВЕ С ПРИМЕНЕНИЕМ а,а'-дип ИРИДИ ЛА К а ф е д р а А гр охи м и и В ы сш ей С ел ь ск о х о зя й ст в ен н о й Ш колы, О лы итин Резюме Разработан метод определения общего количества ж ел еза (после восстановления F e3+ до F e2+) в растениях с применением а,а'-дипиридила. Метод разрешает точно определить содерж ание этого элемента при реакции испытуемогораствора ph 4,0 в диапазоне концентрации от 0 до 100 у. По сравнении с обычно рекомендованными в литературны х сведениях способами определения ж ел еза, разработанный метод пригоден для массовых определений этого элемента в растительном вещ естве с большой диф ф еренцированностью содерж ания ж ел еза. Средняя погрешность метода ± 1,7 %.
240 A. Krauze, D. Dom ska A. KRAUZE, D. DOM SKA COLORIMETRIC DETERM INATION OF IRON IN PLANT MATERIAL U SING a,a'-d IPY R ID Y L D epartm ent of A gricultural C hem istry C ollege of A griculture in O lsztyn Summary A m ethod has been developed for the determ ination of total iron (after F e3+ to Fe2+ reduction) in plants using a,a'-dipyridyl. The m ethod allows, exact determ ination of that elem ent at ph 4,0 w ithin the range of 0-100 y; it is applicable to serial determ inations of iron in plants containing different am ount of this elem ent. The m ean error of the m ethod is ±l,7 /o. W płynęło do redakcji w lipcu 1968 r.