RECENZJA Rozprawy doktorskiej Pana mgr Piotra Zygmunta Trzeciaka pt.: Wpływ podwyższonej temperatury na poziom ekspresji wybranych genów w komórkach kompleksu wzgórek jajonośny oocyt u krów w badaniach in vitro, wykonanej w ramach Stacjonarnego Studium Doktoranckiego Biologiczne podstawy regulacji wzrosty zwierząt i utrzymania ich zdrowia. Kierownik studium: prof. dr hab. Tomasz Motyl Od 14 marca 2003 roku w Ustawie: O stopniach naukowych i tytule naukowym oraz o stopniach i tytule w zakresie sztuki Dz. U. nr 65 poz. 595/203 umieszczony został zapis, że osoba podejmująca się recenzji pracy doktorskiej winna przy ocenie uwzględnić następujące trzy punkty: 1. czy w rozprawie doktorskiej rozwiązany został oryginalny problem naukowy 2. czy w oparciu o treść rozprawy recenzent jest w stanie wydać opinię, że Doktorant posiada ogólną wiedzę teoretyczną z danej dyscypliny naukowej 3. czy Doktorant nabył umiejętność samodzielnego prowadzenia pracy naukowej Z postanowienia tego wyłania się obowiązek nałożony na recenzenta aby w oparciu o pracę, jej założenia naukowe, cel, metody badawcze, użyty materiał doświadczalny, jego analizę i wnioski wypływające z wykonanych badań, wyraził opinię jakie możliwości intelektualne posiada Doktorant i jakie są Jego horyzonty myślowe oraz wiedza. Powinno to także, posłużyć do rekomendacji, że Pan mgr Piotr Zygmunt Trzeciak rokuje osiągnięcie takiego poziomu wiedzy, iż będzie nie tylko osobą specjalistycznie wykształconą, ale znajdzie również swoje miejsce na rynku pracy. Przystępując do recenzji chciałbym najpierw zatrzymać się nad dokonanym przez Doktoranta wyborem tematu. Wyborem tematu bardzo ambitnego i bardzo trudnego do realizacji, ze względu na potrzebę opanowania nie tylko, technik manualnych do prac laboratoryjnych, ale i wiedzy koniecznej do oceny materiału biologicznego, jego hodowli in vitro, zapłodnienia pozaustrojowego, oceny zarodków a także skomplikowanych procedur niezbędnych do pracy w zakresie biologii molekularnej. Tematu, który w bardzo ogólnym ujęciu sprowadza się do ustaleniu roli połączeń szczelinowych pomiędzy komórkami ziarnistymi wzgórka jajonośnego a oocytem w transporcie cząstek termodestrukcyjnych lub 1
termoprotekcyjnych, identyfikacji tych cząstek oraz określenia kompetencji rozwojowych oocytów w odpowiedzi na stres cieplny. Tak nakreślony cel jest całkowicie nowym, jeszcze nie podejmowanym w aspekcie pracy badawczej zmierzającej do wyjaśnienia bardzo ważnych regulacji molekularnych. Bez dostępu do unikatowego materiału badawczego, oraz drogiej i specjalistycznej aparatury i doskonale wyposażonego laboratorium wykonanie tego zadania byłoby nie możliwe. Trudno sobie też wyobrazić, że nakreślony cel badań można było by osiągnąć,poza Zakładem Histologii i Embriologii Katedry Nauk Morfologicznych Wydziału Medycyny Weterynaryjnej Szkoły Głównej Gospodarstwa Wiejskiego w Warszawie oraz Zakładem Biologii Molekularnej Instytutu Genetyki i Hodowli Zwierząt Polskiej Akademii Nauk w Jastrzębcu i dotacji celowych SGGW. Przypuszczam, że na podjęcie się przez Doktoranta realizacji zaproponowanego tematu miały wpływ: fascynacja możliwościami jakie stwarza obecnie embriologia eksperymentalna i techniki biologii molekularnej oraz logiczne rozpoznanie, że za jakość oocytu i jego przydatność do zapłodnienia odpowiada całościowo: kompleks; wzgórek jajonośny - środowisko oocytu. Uwzględniając, że wpływ temperatury na to ostatnie został już wcześniej w licznych badaniach rozpoznany, pozostały więc komórki ziarniste i mechanizmy oddziaływanie na nie afizjologicznej temperatury i warunki in vitro. Jest zrozumiałym, że takie postępowanie wynikało z braku możliwości technicznych, spowodowania przyżyciowo u zwierząt, lokalnego wzrostu temperatura w obrębie jajnika. Wracając do wytycznych jakie wyznacza ustawa i poszukując odpowiedzi na pierwsze pytanie, wydaje mi się, że można ją uzyskać po zapoznaniu się z pięcioma wnioskami, które na stronie 89 rozprawy przedstawił Doktorant, stwierdzając, że: 1. Podwyższona temperatura wpływa na ekspresję wybranych genów w komórkach ziarnistych wzgórka jajonośnego podczas dojrzewania in vitro: a. indukując włączenie mechanizmu obronnego, jakim jest wzrost ekspresji białka szoku cieplnego 70 (HSP70) zarówno na poziomie mrna jak i białka. b. prowadząc do zaburzeń w formowaniu macierzy zewnątrzkomórkowej poprzez wzrost ekspresji genu 6 stymulowanego czynnikiem martwicy nowotworów (TSG-6) na poziomie mrna i białka. c. wywołując zaburzenia w przekazywaniu wewnątrzkomórkowych sygnałów poprzez obniżenie ekspresji receptora folikotropowego (FSHR) na poziomie mrna i białka. 2
2. W oocytach dojrzewających in vitro w podwyższonej temperaturze nie dochodzi do włączenia mechanizmu obronnego związanego z szokiem cieplnym, czego dowodem jest stała ekspresja genu HSP70 na poziomie mrna. 3. Podwyższona temperatura wpływa negatywnie na kompleks wzgórek jajonośny oocyt powodując obniżenie kompetencji oocytów do dojrzewania i rozwoju zarodków in vitro. Pierwszy wniosek dotyczy, części pracy związanej z oceną w komórkach ziarnistych wzgórka jajonośnego ekspresji genów białka szoku cieplnego tj. genu 6 biorącego udział w formowaniu stabilizacji macierzy zewnątrzkomórkowej oraz receptora hormonu folikulotropowego wzrostu dojrzałości oocytu. Zaś drugi i trzeci wynikają jakoby z działań kontrolnych sprawdzających efekt oddziaływania wysokiej temperatury na oocyty, które nie mają specjalnych przed tym zabezpieczeń. Brak takiego czynnika obniża ich kompetencje do zapłodnienia in vitro i prawdopodobnie in vivo w przypadku chorób przebiegających z wysoką temperaturą. Bardzo przekonywujący był wybór markerów molekularnych stresu cieplnego jak określa Doktorant tj. białka szoku cieplnego HSP70, TSG 6 czynnika martwicy nowotworów oraz FSHR receptora hormonu folikulotropowego. Jest to bardzo rozważny, przemyślany i godny podkreślenia wybór najbardziej adekwatnych wskaźników do śledzenia oddziaływania temperatur na komórki struktur z których zbudowane są pęcherzyki jajnikowe ssaków. Pozwoliło to Panu mgr Piotrowi Zygmuntowi Trzeciakowi, uzyskać nowe dane odnoszące się do wskazania mechanizmu i szlaku destrukcyjnego oddziaływania temperatur na komórki jajowe. W otwierającej się obecnie nowej dziedzinie badań nad termodestrukcją nowotworzenia, obserwacje te mogą być też pomocne i wspierające w tych zmaganiach. Zachęcam Doktoranta aby zechciał sprawdzić czy uzyskane bardzo interesujące wyniki, można by było przełożyć do badań nad rysującymi się już możliwościami wykorzystania wyższych temperatur niż fizjologiczne do zahamowania wzrostu lub niszczenia komórek nowotworowych. Chcę nadmienić w bardzo uproszczonej wersji zachęty, że wzrost komórek granulozy wydaje się być podobny na wielu etapach do wzrostu komórek nowotworowych.. Komentarz. Uzyskane wyniki stanowią bardzo istotną informację dla wszystkich podejmujących 3
pracę nad zapłodnieniem in vitro i klinicystów zajmujących się niepłodnością. Po raz pierwszy przeprowadzono analizę ekspresji TSG 6 w komórkach ziarnistych wzgórka jajonośnego poddanych dojrzewaniu w podwyższonej temperaturze. Postawiono liczne hipotezy, np.strona 79 i 80 o transporcie mrna HSP70, które powinny być według mnie wyjaśnione w kolejnych badaniach. Sugestia potrzeby określenia poziomu ekspresji innych białek z rodziny HSP ze strony 87 jest warta podjęcia realizacji. Uzyskano też wiele nowych danych wyłaniających się w dyskusji zasługujących na podkreślenie. Wykonane przez Pana mgr Piotra Zygmunta Trzeciaka badania, wydają się być na tyle przekonywujące, że nakazują zwracać uwagę na materiał biologiczny jakimi są nie tyko oocyty pobierane do procedur wspomaganego zapłodnienia,ale też status zdrowotny ich dawczyń. Brak kompetencji oocytów do zapłodnienia to nie zawsze wina komórek jajowych, ale też efekt przebytych schorzeń. Znając dynamikę funkcjonowania jajnika rodzi się pytanie czasu jak i środowiska hodowlanego. Szkoda, że wyprodukowane w laboratorium zarodki nie wykorzystano do transplantacji, bowiem potomstwo byłoby biologicznym testem wartości wykonanej pracy. Osiągnięty został więc, cel jaki zakreślił sobie Doktorant na stronie 34 maszynopisu, cel realizowany przy użyciu dostępnych bardzo nowoczesnych metod badawczych, w warunkach zorganizowanych na te potrzeby laboratoriów i przy użyciu już w większości standardowych; metod oraz aparatury. W tym miejscu należy podkreślić, że nie byłoby zapewne tych wyników bez pomocy i opieki Promotora Pani dr hab. Anny Marii Duszewskiej prof. SGGW, Pana dr hab. Rafała Starzyńskiego Promotora Pomocniczego i Pani mgr inż. Elżbiety Muchalskiej oraz współpracy zespołu pracowników Zakładu Histologii i Embriologii Katedry Nauk Morfologicznych, Wydziału Medycyny Weterynaryjnej SGGW i Zakładu Biologii Molekularnej Instytutu Genetyki i Hodowli Zwierząt PAN w Jastrzębcu. Zespoły te posiadając olbrzymie doświadczenie z tego zakresu i jako jedne z nielicznych wyspecjalizowały się w zagadnieniach rozrodu zwierząt, wprowadząc do prac badawczych z powodzeniem metody embriologii eksperymentalnej i biologii molekularnej. Drugim obowiązkiem recenzenta wynikającym ze wspomnianej wcześniej ustawy jest ocena i odpowiedź na pytanie :czy Doktorant posiada ogólna wiedzę teoretyczną z danej dyscypliny naukowej? Wstęp str. 12, i Dyskusja str. 73 są według mnie rozdziałami, których treść pozwala wyrobić sobie właściwy pogląd na ten aspekt,gdyż Pan mgr Piotr Zygmunt Trzeciak musiał z olbrzymiej liczby doniesień naukowych i danych podręcznikowych (212 cytowań) wyselekcjonować zagadnienia, które według Niego były niezbędne dla wyjaśnienia przebiegu interesujących Doktoranta zjawisk i procesów biologicznych. Musiał też wyrobić 4
sobie wewnętrzne przekonanie co do celowości podejmowanych badań, oraz porównać swoją wiedzę z najnowszymi osiągnięciami z tej dziedziny innych autorów. We Wstępie, przygotowanym na 21 stronach (12-33) omawia Doktorant bardzo szeroki wachlarz zagadnień począwszy od rozważań o wpływie temperatury na płodność bydła, wpływie stresu cieplnego na oocyty, rozwój pęcherzyków jajnikowych funkcjonowanie wzgórka jajonośnego i molekularne mechanizm owulacji - do budowy badanych białek: 70HSP, TSG 6 i FSHR. Ogromna rozpiętość zagadnień. Chwalę potrzebę i zasadność przygotowania podrozdziałów 1.6 tj. Molekularny mechanizm owulacji str. 26, 1.7 Udział CGCs w procesie owulacji oocytu,1.8 Budowa i funkcje HSP70 1.9 Budowa i funkcje TSG 6 oraz 1.10 Budowa i funkcje FSHR. gdyż dogłębne analiza i rozpoznanie tej tematyki pozwoliło Doktorantowi zaplanować bardzo rozbudowaną procedurę doświadczalną. Powinna być w nich jednak zawarta według mnie bardziej szczegółowa treść naświetlająca specyfikę gatunkową gametogenezy, ze szczególnym uwzględnieniem różnych poziomów regulacji tego zjawiska w oocycie, w czasie uzyskiwania zdolności do zapłodnienia, zmiany ułatwiające jak i utrudniające ten proces, kaskadę zdarzeń podczas zapłodnienia in vivo i in vitro. Doniesień na te tematy jest obecnie bardzo wiele i nadal co roku ukazują się nowe dane, nawiązujące tematycznie do pracy Pana Magistra Piotra Zygmunta Trzeciaka tj. badań zdolności rozwojowych oocytów bydła in vitro,co wymusza, by te nowości były w sposób szczególny zaakcentowane. Jest kilka podrozdziałów ( od 1.1 do 1.6 ) mieszczących się co prawda swoją tematyką w tej obszernej pracy, ale mogły być one z powodzeniem pominięte, gdyż informacje w nich podane są dość ogólne i od dawna znane. Należało się też wystrzegać zwrotów a także stwierdzeń przypisanych częściom pracy omawiających cel badań jak i dyskusję. Wstęp bowiem,powinien zawierać przede wszystkim dane podstawowe, uzasadniające wybór tematu oraz postępowania metodyczne zapewniającego rozwiązanie postawionych sobie zadań. Chcę podkreślić, że pomimo zawartych powyżej uwag wiedza Doktoranta jest satysfakcjonująca i ugruntowana.. W każdej pracy naukowej poprowadzenie Dyskusji jest związane z wielkim wysiłkiem intelektualnym, dużą odpowiedzialnością i krytycyzmem ze względu na konieczność odniesienia i konfrontacji własnych wyników do osiągnięć innych autorów, którzy zajmowali się podobnymi zagadnieniami. Dlatego też, ta część pracy daje największą podstawę do wystawienia oceny z zasobu wiedzy teoretycznej jaką powinien posiadać Doktorant z danej dyscypliny naukowej. 5
Pani mgr inż. Piotr Zygmunt Trzeciak, rozdział zatytułowany Dyskusja (str.73) rozpoczął rozważaniami na temat metod biotechnologicznych umożliwiających nabycie kompetencji oocytów bydła do zapłodnienia.natomiast dalsza część Dyskusji, opracowana została zgodnie z chronologią prowadzonych doświadczeń i jest poprowadzona wzorowo, ostrożnie, z dużym dystansem do swoich wyników jak też, bardzo logicznym uzasadnieniem niepowodzeń wynikającymi z oddziaływania na materiał biologiczny temperatur wyższych niż fizjologiczne wywołujące tzw. szok termiczny. Doktorant spostrzega pewne utrudnienia i mankamenty w konstrukcji pracy łączącej, związaną z dużymi oczekiwaniami na pomyślne wyniki, utylitarną produkcją zarodków in vitro a niepowodzeniami. Z dużą łatwością Autor prowadzi rozważania o zachodzących reakcjach i zjawiskach na poziomie molekularnym w zakresie podstaw teoretycznych i praktycznych. Wykorzystuje do tego prawie 50% zacytowanych pozycji literatury opublikowanej praktycznie w ostatnich kilkunastu latach. Wybaczam Panu Magistrowi, że zmienił kolejność zagadnień omawianych w dyskusji w stosunku do wstępu, co nie koreluje z metodyką oraz omówieniem wyników. Mam zastrzeżenie co do liczebności użytego materiału biologicznego i nieco zachwianej proporcji badań embriologicznych do molekularnych. Brak mi jest też w spisie piśmiennictwa większej liczby prac własnych Doktoranta ( tylko 2 ), zazwyczaj publikowanych z badań wstępnych lub rozpoznających zagadnienie, a które są podstawą do umocnienia się w przekonaniu, że w tej dziedzinie, dana osoba zaczyna wyrastać na cennego i obiecującego pracownika naukowego.. Komentarz: Nie ulega wątpliwości, że Pan mgr Piotr Zygmunt Trzeciak posiada dużą wiedzę teoretyczną z zagadnień, które stanowią pewien wycinek embriologii stosowanej i regulacji molekularnych wzrostu, rozwoju i kompetencji do zapłodnienia gamet żeńskich, która umożliwiła wykonanie tej pracy. Wszystkie dobrane pozycje literatury są prawidłowe i w wystarczającej liczbie. W tej części opracowania, Autor prezentuje się jako osoba kompetentna i doskonale zorientowana w możliwości zastosowania tych metod badawczych w embriologii eksperymentalnej i stosowanej.. Jest ostrożny w swych przemyśleniach oraz świadom, że uzyskane wyniki będą weryfikowane zarówno w badaniach podejmowanych przez innych, jak i pracach utylitarnych dla uzyskania żywego, pełnowartościowego potomstwa. Dla unaocznienia, przed jak wielkim zadaniem stanął Doktorant narzucając sobie sam to wyzwanie, przytoczę za pracą w rozdziale Materiał i Metody (str. 35) zapis czynności a więc: 1. pobieranie materiału do badań, 2.izolacja COCs, 3. dojrzewanie in vitro oocytów, 4. 6
zapłodnienie in vitro, 5. hodowla zarodków in vitro, 6. mechaniczna izolacja CGCs, 7. analiza przeżywalności CGCs, 8. analiza ekspresji genów hsp70,tsg-6 i fshr metodą Real Time PCR, 9. izolacja całkowitego RNA, 10.synteza cdna na matrycy RNA,11.wykrywanie ekspresji genów metodą Real Time PCR,12. analiza poziomu białek HSP70,TSG-6 i FSHR metodą Western Blot,13. przygotowanie ekstraktów białkowych 14. pomiar stężenia białka w ekstraktach całkowitych,15. elektroforeza pionowa w żelu poliakrylamidowym,16 immunoblotting, 16.analiza densymetryczna,17.immunocytochemiczna analiza HSP70,TSG- 6 i FSHR w CGCs,18.analiza dojrzałości jądrowej oocytów, 19. analiza ekspresji genu hsp70 w oocytach metodą Real Time,20. immunocytochemiczna analiza HSP70 w oocytach, 21.analiza potencjj rozwojowych zarodków hodowanych in vitro. Dwadzieścia jeden bardzo ważnych rozpisanych manualno - aparaturow oznaczeniowych prac, od których w dużej mierze zależało uzyskanie pozytywnych wyników. Dochodzi do tego przygotowanie aparatury, precyzja, aseptyka i kontrola przebiegu doświadczeń (myślę tu przede wszystkim o sprawnie działających inkubatorach). Jeżeli te wszystkie czynności wykonywała Pan mgr Piotr Zygmunt Trzeciak samodzielnie, to trzeba z wielkim uznaniem ocenić ten wysiłek. Do badań w ramach realizowanego tematu wykorzystano łącznie 500 jajników z których pozyskano metodą aspiracji 2500 oocytów oraz 40 zarodków (?). Z całym szacunkiem odnoszę się do tego wysiłku, muszę jednak z przykrością krytycznie ustosunkować się do niepotrzebnego wyeksponowania pewnych czynności i ich kilku zdaniowego opisu i dokumentacji. Komentarz: Nie ulega dla mnie żadnej wątpliwości, że mogę odpowiedzieć twierdząco, iż Doktorant nabył i posiada bardzo wysokie kwalifikacje do prowadzenia badań naukowych. Jest oczywistym, że w tej pracy można było zastosować też wiele innych metod badawczych, ale te, które zaprezentowano są nowoczesne optymalne i obecnie preferowane. W sposób wyróżniający opracowany został rozdział Wyniki (str 52) a jego czytelność, odpowiedni dobór rycin, wykresów, obrazowania, zachowanie właściwej kolorystyki oraz przedstawienie najbardziej wyselekcjonowanych danych,może być wzorem dla innych. Podsumowanie: Badania z zakresu embriologii eksperymentalnej i biologii molekularnej bardzo dawno wyszły już ze specjalistycznych laboratoriów i dlatego termin ten został rozszerzony o nazwę embriologia stosowana. Wydawałoby się, że działalność ta wprowadza pewne uproszczenia, jednak w rzeczywistości stawia większe wymagania wobec osób ją podejmujących, bowiem 7
narzuca konieczność przekazania wyników praktyce. Częstokroć jest również tak, że zawierzenie udostępnianym rozwiązaniom zawodzi i niezbędne jest stawienie czoła kolejnym wyzwaniom poprzez śledzenie najnowszych doniesień literatury oraz opanowywanie innych, zaawansowanych i kosztownych technik doświadczalnych. Choć temat pracy należycie wykorzystuje znane i opracowane wcześniej metody, nie był łatwy do realizacji i wymagał bardzo dobrego przygotowania technicznego oraz posiadania dużej wiedzy z zakresu anatomii, fizjologii, embriologii biologii molekularnej i kultur in vitro. Na pewno trzeba było pokonać wiele trudności na każdym etapie badań. Jestem jednak przekonany, że Doktorant z powodzeniem przeszedł przez ten ciężki, ale obiecujący okres w swoim życiu. Jak każda praca, także i ta ma swoje mankamenty. Praca doktorska jest pracą naukową, przygotowaną na prawach rękopisu, dlatego też będzie czas na korektę, przemyślenia i ewentualne nowe sformułowania podczas przygotowywania jej do druku. Po szczegółowej analizie nadesłanej mi do recenzji pracy doktorskiej stwierdzam, iż wszystkie wymienione wcześniej punkty (str. 1) zostały spełnione. Zwracam się zatem z prośbą do Wysokiej Rady Wydziału Medycyny Weterynaryjnej Szkoły Głównej Gospodarstwa Wiejskiego w Warszawie o przyjęcie pracy i dopuszczenie Pana mgr Piotra Zygmunta Trzeciaka do dalszych etapów przewodu doktorskiego. Spełnia bowiem ona wymogi ustawy z dnia 14.03.2003 O stopniach naukowych i tytule naukowym oraz o stopniach i tytule w zakresie sztuki opublikowanej w Dz. U. z 2003 roku nr 65. poz. 595.Biorąc pod uwagę wkład pracy Doktoranta w udokumentowane znaczące osiągnięcia,ustalające nowe nieznane mechanizmy regulujące oddziaływanie wysokich temperatur na kompleks: komórki wzgórka jajonośnego - oocyt,wnioskuję o jej wyróżnienie. Prof. dr hab. Edward Wierzchoś Kraków dn. 2 października 2014 r. 8
9