Metody inaktywacji czynników chorobotwórczych w składnikach krwi

PRACA POGLĄDOWA Review Article Acta Haematologica Polonica 2011, 42, Nr 3, str. 425 434 ELśBIETA LACHERT, MAGDALENA ŁĘTOWSKA Metody inaktywacji czynników chorobotwórczych w składnikach krwi Methods of pathogen inactivation in blood products Zakład Transfuzjologii Instytutu Hematologii i Transfuzjologii, Warszawa Kierownik: Prof. nadzw. dr hab. med. Magdalena Łętowska STRESZCZENIE Przetaczanie krwi i jej składników jest obecnie znacznie bardziej bezpieczne niŝ kilkadziesiąt lat temu. Wynika to przede wszystkim z wprowadzenia takich procedur jak: rygorystyczne zasady kwalifikacji dawców, oznaczanie czynników chorobotwórczych metodami biologii molekularnej, wprowadzenie karencji, a ostatnio równieŝ wdraŝanie metod inaktywacji czynników chorobotwórczych w składnikach krwi. Metody te działają zarówno na czynniki zakaźne o uznanym znaczeniu (oznaczane rutynowo lub nie) oraz na czynniki dotychczas nie odkryte. Metody stosowane rutynowo w centrach krwiodawstwa opracowano do inaktywacji czynników chorobotwórczych w osoczu i KKP. Są to: System Intercept, wykorzystujący właściwości chlorowodorku amotosalenu oraz System Mirasol, z zastosowaniem ryboflawiny. System Macopharma Macotronic (z błękitem metylenowym) opracowano do inaktywacji czynników chorobotwórczych w osoczu. Nadal trwają prace nad opracowaniem metody inaktywacji czynników chorobotwórczych w koncentratach krwinek czerwonych lub krwi pełnej. SŁOWA KLUCZOWE: Inaktywacja Czynnik chorobotwórczy KKCz KKP Osocze. SUMMARY Transfusion of blood and blood components is now much safer than several decades ago mainly due to the implementation of procedures such as: restrictive donor selection, screening for pathogens with molecular biology tests, quarantine, and more recently the implementation of pathogen inactivation techniques in labile blood components. The latter are effective for recognized pathogens ( either routinely detected or not ) as well as any new emerging pathogens still unrecognized. The inactivation methods in routine use at blood centers have been developed for the purpose of pathogen inactivation in plasma and red blood cell concentrates. These systems are: Intercept based on the properties of amotosalen and Mirasol based on riboflavin. The Macopharma Macotronic system (based on methylene blue) was developed for pathogen inactivation in plasma. Development of methods for pathogen inactivation in red blood cell concentrates and whole blood is still in progress. KEY WORDS: Inactivation Pathogens Red blood cell concentrates Platelet concentrate Plasma. WSTĘP Współczesne metody przygotowywania krwi i jej składników dla chorych, oparte na najnowszych osiągnięciach biologiczno-medycznych spowodowały, Ŝe przetaczanie krwi jest obecnie procedurą bardzo bezpieczną. Na bezpieczeństwo to wpływają: rygorystyczne zasady kwalifikacji dawców, stosowanie bardziej czułych testów przesiewowych, opartych między innymi na technikach biologii molekularnej jak równieŝ karencjonowanie składników krwi. Zastosowanie metod biologii molekularnej znacznie zmniejszyło ryzyko przeniesienia wirusów zapalenia wątroby B i C oraz wirusa HIV, których markery rutynowo oznaczane są w kaŝdej donacji poprzez skrócenie okienka serologicznego. JednakŜe ryzyko nie zostało całkowicie wyeliminowane [1]. Co więcej, oprócz przeniesienia drogą krwi wirusów, których markery oznaczane są rutynowo w kaŝdej donacji, zawsze istnieje moŝliwość przeniesie-

426 E. LACHERT, M. ŁĘTOWSKA nia: nieznanych czynników chorobotwórczych, czynników chorobotwórczych, których markery nie są rutynowo oznaczane (np.cmv, malaria) oraz czynników, dla których nie opracowano jeszcze odpowiednich testów. Dodatkowym ryzykiem zwiększającym zagroŝenie przeniesienia infekcji są migracje ludności. Przemieszczanie się ludności, szczególnie z terenów endemicznego występowania czynników zakaźnych powoduje, Ŝe choroby dotąd niewystępujące w danym regionie moŝna spotkać w róŝnych krajach. Przykładem jest rozprzestrzenienie się wirusa Zachodniego Nilu (West Nile Wirus WNV) w Stanach Zjednoczonych Ameryki Północnej i w Kanadzie w latach 1999 2003. WNV występuje w Afryce, w krajach basenu Morza Śródziemnego oraz sporadycznie w Europie. Pod koniec roku 1999 rozprzestrzenił się w Kanadzie i w USA, gdzie w roku 2003, ryzyko jego przeniesienia drogą transfuzji kształtowało się na poziomie 1,46 do 12,33 na 10 000 donacji. Spowodowało to natychmiastowe wprowadzenie badań przesiewowych (metoda molekularna) kaŝdej donacji w centrach krwiodawstwa Stanów Zjednoczonych [3, 29]. Dane statystyczne dotyczące powikłań poprzetoczeniowych nadal wskazują na duŝą częstość (1:2 000/3 000) przeniesienia bakterii wraz z przetaczanym koncentratem krwinek płytkowych (KKP). Przyczyną tych zakaŝeń bakteryjnych moŝe być nieskuteczne odkaŝenie miejsca wkłucia, nieprawidłowa sterylizacja pojemników do pobierania krwi lub bezobjawowa bakteriemia u dawcy. Bezobjawowa G-ujemna bakteriemia u dawcy jest zjawiskiem towarzyszącym zakaŝeniom przewodu pokarmowego i zatruciom pokarmowym. Przy zaburzeniach perystaltyki jelit, bakterie obecne na powierzchni błony śluzowej mogą przedostawać się do krwi. Nie są one powaŝnym zagroŝeniem dla dawców z prawidłowo funkcjonującym układem odpornościowym poniewaŝ drobnoustroje zostają wyeliminowane z krą- Ŝenia i nie dochodzi do rozwoju posocznicy. Natomiast u biorcy, szczególnie z obniŝoną odpornością, przetoczenie zakaŝonego składnika krwi moŝe spowodować powaŝne powikłanie [4]. Pomimo wprowadzenia wielu procedur zwiększających bezpieczeństwo przetaczania krwi i jej składników odkrycia kolejnych czynników zakaźnych,,przypominają słuŝbie krwi o nieustannym ryzyku przeniesienia zakaŝenia, jak równieŝ o ryzyku rozwinięcia wielu powikłań, których przyczyną są leukocyty przetaczane wraz ze składnikami krwi. W związku z powyŝszym, wysiłki naukowców skierowane są od wielu lat na opracowanie metod, które pozwolą eliminować lub znacząco zmniejszyć ryzyko powikłań związanych z przeniesieniem czynników chorobotwórczych wraz z krwią. Do metod takich naleŝą metody inaktywacji czynników chorobotwórczych wdraŝane do krwiodawstwa od początku lat 90-tych XX wieku a opracowane w oparciu o doświadczenia zdobyte podczas frakcjonowania osocza. Metoda inaktywacji moŝe zostać zarejestrowana wówczas, gdy ostatnia faza badań klinicznych wykazuje, Ŝe składnik krwi inaktywowany tą metodą jest bezpieczny, skuteczny terapeutycznie i nie wywołuje działań ubocznych. Poszczególne etapy badań prowadzone są w róŝnych ośrodkach naukowych, wymagają ogromnych nakładów finansowych i trwają wiele lat. Dlatego właśnie, chociaŝ w literaturze fachowej opisano kilkanaście metod inaktywacji, tylko kilka z nich dopuszczono do rutynowego stosowania [2, 6, 7, 9]. Inne pozostają w fazie badań laboratoryjnych i klinicznych lub badania nad nimi są wstrzymane ze względu na niekorzystne wyniki otrzymane podczas jednego z etapów badań (np. tworzenie neoantygenów). Dotychczas nie zdołano opracować jednej metody skutecznej w stosunku do szerokiego spektrum czynników chorobotwórczych, umoŝliwiającej inaktywację we wszystkich składnikach krwi. Nadal dąŝy się do tego, aby metoda inaktywacji była skuteczna w stosunku do szerokiego spektrum czynników zakaźnych, zarówno wirusów, bakterii jak i pasoŝytów, nie zmieniała właściwości terapeutycznych składnika krwi, a odczynniki lub fotoprodukty pozostające w śladowych ilościach po zakończonym procesie inaktywacji nie były toksyczne oraz nie wywoływały reakcji alergicznych u biorców. Bardzo istotny jest równieŝ czynnik ekonomiczny koszty wdraŝania metody muszą być proporcjonalne do jej skuteczności. Zanim metoda inaktywacji zostanie wdroŝona do rutynowej pracy naleŝy poddać ją pro-

Metody inaktywacji czynników chorobotwórczych 427 cesowi walidacji, który uwzględni specyficzną organizację pracy kaŝdego centrum krwiodawstwa, a wyniki tego procesu pozwolą na,,wystandaryzowanie procesu inaktywacji. Na podstawie wyników badań walidacyjnych przeprowadzonych w wielu centrach stwierdzono, Ŝe jakość składników krwi w znacznym stopniu zaleŝy od procesu ich otrzymywania i na tę jakość wpływają czynniki takie jak: temperatura, czas preparatyki i wirowania oraz okres przechowywania. Zaobserwowano, Ŝe nawet w przypadku stosowania tej samej procedury i postępowania zgodnie z instrukcją producenta jakość otrzymywanych składników krwi była róŝna. Dlatego tak istotna jest walidacja procesu i ustalenie optymalnych, szczegółowych warunków wytwarzania inaktywowanych składników krwi [27, 28, 29]. METODY INAKTYWACJI CZYNNIKÓW CHOROBOTWÓRCZYCH DOPUSZCZONE DO STOSOWANIA Metoda rozpuszczalnik/detergent (S/D) Metoda rozpuszczalnik/detergent polega na inkubacji puli osocza z rozpuszczalnikiem organicznym tri (n-butylo) fosforanem (TNBP) i detergentem (Triton X-100) przez 4 godziny w temperaturze 30 C. Po zakończonym procesie odczynniki usuwane są przez zastosowanie ekstrakcji w oleju roślinnym, filtracji Ŝelowej lub chromatografii jonowymiennej. Następnie osocze jest filtrowane i przelewane do sterylnych pojemników, w których jest zamraŝane. Metoda S/D jest najczęściej stosowaną od roku 1985 procedurą inaktywacji czynników zakaźnych w produktach krwiopochodnych, szczególnie do ich inaktywacji podczas produkcji doŝylnych immunoglobulin i koncentratów czynników krzepnięcia, ale równieŝ w czasie produkcji haptoglobiny i antytrombiny. Niestety, metoda ta skuteczna jest tylko w stosunku do wirusów posiadających otoczkę lipidową. Dlatego w czasie frakcjonowania osocza naleŝy wprowadzić druga metodę inaktywacji lub redukcji, która jest skuteczna w stosunku do pozostałych potencjalnie zakaźnych czynników, szczególnie wirusów bezotoczkowych. W latach dziewięćdziesiątych ubiegłego stulecia metodę S/D zaczęto stosować takŝe dla osocza przeznaczonego do uŝytku klinicznego. W piśmiennictwie ukazało się wiele doniesień przedstawiających wyniki badań świadczących o skuteczności metody S/D. W Stanach Zjednoczonych Ameryki Północnej prowadzono wieloośrodkowe badania kliniczne świeŝo mroŝonego osocza S/D. Przetaczano je pacjentom z przewlekłą i ostrą zakrzepową plamicą małopłytkową (thrombotic thrombocytopenic purpura TTP). W raporcie końcowym stwierdzono porównywalną skuteczność terapeutyczną FFP S/D i FFP niepoddanego procesowi inaktywacji oraz tolerancję przez pacjentów. Od wprowadzenia FFP S/D do uŝytku klinicznego nie stwierdzono Ŝadnych powikłań związanych z przeniesieniem wirusów otoczkowych. Stwierdzono jedynie pojedyncze przypadki reakcji alergicznych, spowodowanych prawdopodobnie śladową, resztkową zawartością odczynników. Ponadto, w następstwie zlewania osocza (pule) i jego rozcieńczania ryzyko związane z wystąpieniem ostrej potransfuzyjnej niewydolności płuc (transfusion-associated acute lung injury TRALI) zmniejszyło się prawie do zera. Ostatnio firma Octapharma opracowała procedurę inaktywacji w pojedynczej jednostce osocza metodą S/D (Octaplas ), którą następnie zmodyfikowano wprowadzając dodatkową inkubację z ligandem Ŝelowym, który wiąŝe potencjalnie występujące priony (OctaplasLG ). Wprawdzie w osoczu OctaplasLG, podobnie jak w osoczu Octaplas, stwierdzono obniŝone stęŝenie czynników krzepnięcia (10 do 20%), ale zachowana aktywność ADAMTS-13 powoduje, Ŝe osocze inaktywowane metodą SD skutecznie leczy TTP [11, 14, 15, 19].

428 E. LACHERT, M. ŁĘTOWSKA Metoda fotoinaktywacji czynników zakaźnych w osoczu przy zastosowaniu błękitu metylenowego Fotoinaktywacja Fotoinaktywacja polega na działaniu czynnika fotouczulającego, pod którego wpływem inny składnik biologicznego systemu reaguje na światło. MoŜna ją przedstawić jako reakcję fotodynamiczną, w której czynniki zakaźne inaktywowane są za pośrednictwem wolnych rodników tlenowych (błękit metylenowy), albo jako reakcję fotochemiczną (psoraleny) polegającą na zastosowaniu odpowiednich związków chemicznych, które z kwasami nukleinowymi czynników zakaźnych tworzą nieodwracalne wiązania kowalencyjne i uniemoŝliwiają ich namnaŝanie. Obie grupy procedur fotoinaktywacji są wzbudzane światłem widzialnym lub ultrafioletowym i róŝnią się skutecznością oraz stopniem działania na krew i jej składniki [10, 12]. Od dawna znane są właściwości bakterio/wirusobójcze barwników fenotiazynowych, ale dopiero naukowcy Instytutu w Springe (Niemcy) opracowali metodę inaktywacji wirusów w pojedynczych jednostkach osocza. Osocze naświetlano światłem widzialnym w obecności małych dawek barwników fenotiazynowych, takich jak błękit metylenowy lub błękit toluidynowy. Po pierwszych próbach wybrano błękit metylenowy, który jest związkiem wykazującym wysokie powinowactwo zarówno do kwasów nukleinowych, jak i struktur powierzchniowych wirusów, szczególnie tych z otoczkami lipidowymi. Penetruje on otoczkę lipidową wirusa i łączy się z resztą guaniny kwasu nukleinowego. Wirusy bezotoczkowe są bardziej oporne na inaktywację błękitem metylenowym. Prawdopodobnie przyczyną tej oporności jest zwarty rdzeń wirusów bezotoczkowych oraz białkowa otoczka ochronna. 2. Filtracja 4. Usuwanie: MB, fotoprodukty ( Azurs B,C,A) 1. Połączenie poj. donacji osocza z zestawem do inaktywacji (TSCD) 5. ZamroŜenie 3. Naświetlanie: utleniająca reakcja katalityczna MB + hν => 1 MB => 3 MB 3 MB + O 2 => MB + 1 O 2 (DNA + utlenianie białek). Rys. 1. Fotoinaktywacja z błękitem metylenowym Fig. 1. Photoinactivation with methylene blue

Metody inaktywacji czynników chorobotwórczych 429 Zastosowanie błękitu metylenowego do inaktywacji wirusów w osoczu dobrze udokumentował Mohr i wsp [13] juŝ w latach 1991 1995. Od tego czasu przetoczono ponad 3 miliony jednostek tak inaktywowanego osocza i nie zaobserwowano Ŝadnych efektów ubocznych. Niestety, kationy fenotiazynowych barwników reagują nie tylko z kwasami nukleinowymi i lipidowymi otoczkami, ale takŝe z białkami, szczególnie z resztami histydynowymi, co tłumaczy obniŝenie stęŝenia niektórych białek po inaktywacji (20% fibrynogen, 10% inne czynniki krzepnięcia). Bardzo wraŝliwe na inaktywację są: HIV, WNV oraz wirus grypy. Z powodu swej hydrofilowej struktury błękit metylenowy z trudnością penetruje do komórek i nie inaktywuje wirusów wewnątrzkomórkowych. Dlatego w procedurze Springe wprowadzono zamraŝanie i rozmraŝanie osocza w celu uzyskania dostępu do wirusów wewnątrzleukocytarnych (np. HTLV). Procedura opracowana przez niemieckich naukowców została unowocześniona przez zespół badaczy z firmy MacoPharma (Francja), w której wyprodukowano zestawy pojemników zawierające błękit metylenowy w postaci tabletki oraz filtry do usuwania leukocytów i błękitu metylenowego po inaktywacji. Etapy mroŝenia/rozmraŝania w oryginalnej procedurze Springe zastąpiono filtracją (0,65 µm), w celu usunięcia komórek i agregatów przed dodaniem błękitu metylenowego. Proces naświetlania osocza odbywa się w specjalnym urządzeniu Macotronic, które połączone jest z systemem komputerowym umoŝliwiającym automatyczne jego monitorowanie (Rycina 1). Z doniesień literaturowych nie wynika jednoznacznie czy błękit metylenowy w stęŝeniu stosowanym w inaktywowanym osoczu przetaczanym wielokrotnym biorcom ma działanie toksyczne ( np. w leczeniu methemoglobinemii stosowany był w dawce kilkaset razy większej). Dlatego do zestawu pojemników do inaktywacji wprowadzono dodatkowo filtr usuwający ten barwnik. Filtr obniŝa stęŝenie błękitu metylenowego w osoczu, o 95%, co ma istotne znaczenie w przypadku chorych otrzymujących wielokrotne transfuzje oraz w przypadku przetoczeń u małych dzieci. Wprawdzie metoda przeznaczona jest przede wszystkim do inaktywacji osocza stosowanego do celów klinicznych, nie naleŝy jednak wykluczyć zastosowania jej do inaktywacji osocza przeznaczonego do frakcjonowania [5, 18, 21, 23, 29]. Metoda fotoinaktywacja z zastosowaniem psoralenu Od dawna znane są właściwości bakteriobójcze psoralenów. Pierwszym psoralenem wykorzystanym do inaktywacji czynników zakaźnych był 8-metoxypsoralen (8-MOP). ChociaŜ inaktywował on szerokie spektrum wirusów oraz bakterii, jego konkurencyjne łączenie z białkami osocza spowodowało zaprzestanie dalszych badań. Zwrócono uwagę na syntetyczną pochodną psoralenów - aminometylo 4,5,8 trimetylopsoralen; niestety związek ten wykazywał właściwości mutagenne. Dopiero chlorowodorek amatosalenu (S-59) okazał się związkiem odpowiednim do inaktywacji czynników zakaźnych. Związek ten zastosowano w Systemie Intercept (Cerus, USA), który umoŝliwia inaktywację czynników chorobotwórczych zarówno w osoczu, jak i w koncentratach krwinek płytkowych. Poszczególne etapy procedury przedstawia Rycina 2. Podczas procesu fotoinaktywacji w Systemie Intercept krwinki płytkowe zawieszane są w roztworze składającym się z 35% osocza i 65% roztworu wzbogacającego (PAS III). Dodawany jest chlorowodorek amotosalenu (S-59), po czym następuje proces naświetlania, a następnie krwinki płytkowe przenoszone są do satelitarnego pojemnika, w celu usunięcia S-59 (CAD). Po zakończeniu procesu krwinki płytkowe przenoszone są do integralnego pojemnika i przechowywane przez 5 dni. W trzech ośrodkach naukowych przeprowadzono badania kliniczne polegające na podawaniu pacjentom KKP bez usuwania S-59; nie wykazano toksyczności ani S-59 ani jego fotoproduktów. Fotoinaktywacja z S-59 jest metodą skuteczną w stosunku do szerokiego spektrum wirusów i bakterii (np. HIV, CMV, kaczy HBV, HCV, BVDV). Wykazano równieŝ, Ŝe tak inaktywowane koncentraty krwinek płytkowych są bezpieczne, sterylne przez cały czas przechowywania, a funkcje metaboliczne krwinek

430 E. LACHERT, M. ŁĘTOWSKA płytkowych są zachowane ( w 7 dniu przechowywania). Badania na zwierzętach nie wykazały właściwości mutagennych S-59, a krwinki płytkowe mają odpowiednio długą Ŝywotność w krąŝeniu biorcy. Stwierdzono takŝe, Ŝe zastosowanie psoralenu S-59 oraz promieniowania UVA inaktywuje limfocyty T w KKP. Zdolność proliferacji limfocytów i synteza cytokin jest zahamowana. Dalsze badania wykazały, Ŝe metoda ta zapobiega potransfuzyjnej chorobie przeszczep przeciwko biorcy oraz INTERCEPT dla KKP 1 2 amotosalen naświetlanie 3 CAD 4 przechowywanie INTERCEPT dla osocza Ryc. 2. Procedura inaktywacji czynników chorobotwórczych w systemie Intercept Fig. 2. Procedure of pathogen inactivation in Intercept System zmniejsza ryzyko gorączkotwórczych, niehemolitycznych reakcji poprzetoczeniowych wywołanych obecnością cytokin. Procedura inaktywacji osocza została opracowana dla puli 2 3 jednostek otrzymanych z krwi pełnej lub osocza z aferezy. Po zakończeniu procedury inaktywacji i usunięciu S-59 wraz z fotoproduktami jego reakcji, osocze rozlewane jest do 3 pojemników. NaleŜy zwrócić uwagę, Ŝe w przypadku osocza otrzymanego z krwi pełnej w kaŝdym pojemniku znajduje się osocze pochodzące z trzech róŝnych donacji [20, 22, 24, 31]. Metoda inaktywacji z zastosowaniem ryboflawiny W procedurze inaktywacji czynników chorobotwórczych w systemie Mirasol (Caridian, USA) zastosowano światło i ryboflawinę (witaminę B2), której fotochemiczne właściwości zostały wszechstronnie zbadane ze względu na jej zastosowanie w dietetyce oraz fototerapii. Metodę tę stosuje się do inaktywacji czynników zakaźnych w osoczu i koncentracie krwinek płytkowych. Ryboflawina jest obojętnie naładowaną molekułą, łatwo przenikającą przez błony lipidowe komórek czynników zakaźnych. Dodatkowo zastosowanie światła potęguje jej właściwości inaktywujące poprzez wytworzenie rodników tlenowych oraz utlenianie reszt guanozyny.

Metody inaktywacji czynników chorobotwórczych 431 Zasadą metody stosowanej w Systemie Mirasol jest naświetlanie promieniowaniem UV (265 370 nm) osocza lub KKP zawierającego 500 µm ryboflawiny, która wykazuje wysokie powinowactwo zarówno do kwasów nukleinowych, jak i struktur powierzchniowych wirusów. Ryboflawina reaguje nieodwracalnie z kwasami nukleinowymi (guanina) wirusów oraz innych czynników chorobotwórczych uniemoŝliwiając ich dalszą replikację. Metoda ta działa na bardzo szerokie spektrum wirusów, do których naleŝą zarówno wirusy otoczkowe (HIV, HCV, WNV, CMV, HBV), jak i wirusy bezotoczkowe (parvowirus B19, HAV) oporne na inne metody inaktywacji oraz bakterie i pasoŝyty. Na podstawie wyników wielu badań stwierdzono, Ŝe metoda Mirasol, podobnie jak promieniowanie gamma, inaktywuje limfocyty T odpowiedzialne za TA-GvHD i prawdopodobnie moŝe być stosowana jako alternatywa napromieniania zabezpieczająca KKP przed rozwinięciem tego groźnego powikłania poprzetoczeniowego. W Systemie Mirasol KKP są zawieszane w osoczu lub w mieszaninie osocza z roztworem wzbogacającym a następnie naświetlane po uprzednim dodaniu ryboflawiny (6,2 J/cm 2 ; UV). W odróŝnieniu od Systemu Intercept, metoda inaktywacji czynników chorobotwórczych w Systemie Mirasol nie wymaga usuwania ryboflawiny. Jakość KKP inaktywowanych w Systemie Mirasol oceniano na podstawie ich właściwości funkcjonalnych i metabolicznych. Ocenie poddawano takie parametry jak: szok hipotoniczny (HSR), stęŝenie ATP, zdolność do agregacji. Nie stwierdzono statystycznie znamiennych róŝnic pomiędzy grupą kontrolną KKP i grupą KKP poddanych inaktywacji w Systemie Mirasol. System Mirasol dopiero niedawno został opracowany i zarejestrowany w krajach Unii Europejskiej, dlatego liczba przeprowadzonych badań klinicznych jest znacznie mniejsza niŝ w przypadku Systemu Intercept [17, 20, 28, 29]. METODY INAKTYWACJI CZYNNIKÓW CHOROBOTWÓRCZYCH W FAZIE OPRACOWYWANIA Inaktywacja czynników chorobotwórczych w krwi pełnej Przy masywnych krwotokach, nagłych urazach lub wypadkach konieczne moŝe okazać się przetoczenie duŝych ilości świeŝej krwi pełnej (KP). Ze względu na to, Ŝe metoda inaktywacji czynników chorobotwórczych w KP jest w fazie badań, publikacje na temat jej skuteczności są nieliczne. Ostatnio opublikowano pracę, w której autorzy oceniali jakość krwi pełnej po inaktywacji w Systemie Mirasol, przechowywanej w temperaturze pokojowej do 7 dni. Oceniano parametry charakterystyczne zarówno dla koncentratu krwinek czerwonych (hemoliza, stęŝenie ATP, stęŝenie jonów sodu, potasu) jak i dla osocza (APTT i PT). Autorzy stwierdzili, Ŝe KP poddana inaktywacji w Systemie Mirasol (80 J/ml RBC ) wykazuje niewielką, utrzymującą się w zakresie normy, hemolizę w 7 dniu przechowywania [30]. Inaktywacja czynników chorobotwórczych w koncentratach krwinek czerwonych Prace kliniczne nad wdraŝaniem metod inaktywacji czynników chorobotwórczych w koncentratach krwinek czerwonych są mniej zaawansowane niŝ podobne prace dotyczące osocza i koncentratów krwinek płytkowych. Podobnie jak w przypadku osocza i KKP, do inaktywacji krwinek czerwonych próbowano zastosować chlorowodorek amotosalenu, który pod wpływem UVA (reakcja fotochemiczna), wiąŝe się nieodwracalnie z zasadami kwasów nukleinowych (wiązanie kowalencyjne) inaktywując czynniki chorobotwórcze. Metoda ta okazała się nieskuteczna, poniewaŝ hemoglobina absorbuje światło UVA, uniemoŝliwiając wbudowanie chlorowodorku amotosalenu do struktury kwasu nukleinowego. Związkiem, z którym wiązano znaczne nadzieje jest czynnik S-303, inaktywujący bakterie i wirusy w KKCz poprzez krzyŝowe połączenia DNA i RNA w szybkiej reakcji zaleŝnej od ph i niezaleŝnej od światła. Wyniki in vivo były zachęcające, jednakŝe tworzenie przeciwciał przeciwko inaktywowanym krwinkom czerwonym wymusiło na badaczach doskonalenie tej procedury. Rozpoczęto równieŝ dodat-

432 E. LACHERT, M. ŁĘTOWSKA kowe badania nad opracowaniem optymalnych parametrów środowiska zapewniającego podtrzymanie właściwości fizjologicznych krwinek czerwonych. Kolejnym takim związkiem jest inaktyna (PEN 110), drobnocząsteczkowy, elektrofilowy, rozpuszczalny w wodzie związek chemiczny, wybiórczo wiąŝący i nieodwracalnie modyfikujący kwasy nukleinowe. Procedura nie wymaga dostarczenia energii. Udowodniono, Ŝe inaktyna skutecznie inaktywuje HIV (>5 log 10 ), prawdopodobnie działa takŝe na wirusy bezotoczkowe (PPV) oraz uniemoŝliwia proliferację limfocytów. Koncentrat krwinek czerwonych, poddany działaniu inaktyny zachowuje swoje funkcje w badaniach in vitro. Wyniki wstępnych badań na zwierzętach są zachęcające, aczkolwiek, podobnie jak po zastosowaniu S-303, stwierdzono, Ŝe metoda ta stymuluje powstawanie neoantygenów [25, 26, 28]. Inaktywacja krwinek białych Równolegle z badaniami oceniającymi skuteczność metod inaktywacji w stosunku do czynników chorobotwórczych prowadzone są takŝe badania nad alternatywnym wykorzystaniem (zamiast napromieniania) metod inaktywacji w celu zabezpieczenia biorców przed rozwinięciem TA-GvHD. Badania na zwierzętach wykazały, Ŝe zarówno metoda inaktywacji z ryboflawiną (System Mirasol), jak i metoda oparta na właściwościach psoralenu (System Intercept) skutecznie inaktywują limfocyty T, których przetoczenie biorcom, szczególnie z upośledzonym układem odpornościowym, moŝe spowodować rozwinięcie TA-GvHD. W ostatnich latach pojawia się coraz więcej prac na ten temat. Jedna z nich opublikowana przez naukowców z Australijskiego Czerwonego KrzyŜa oraz laboratorium Caridian BCT (Stany Zjednoczone AP), dotyczy wyizolowanych granulocytów i komórek jednojądrzastych poddanych inaktywacji w Systemie Mirasol. Na podstawie przeprowadzonej analizy wyników badań in vitro stwierdzono, Ŝe proliferacja limfocytów w odpowiedzi na stymulację fitohemaglutyniną (anty CD3/anty CD28) była znacząco mniejsza w komórkach inaktywowanych w porównaniu z komórkami kontrolnymi, a ekspresja antygenu CD69 została całkowicie zahamowana po zastosowaniu Systemu Mirasol. Odnotowano takŝe wpływ inaktywacji na Ŝywotność komórek. Po 24 godzinach tylko 30% komórek było Ŝywych w porównaniu z grupą kontrolną (75% komórek Ŝywych) [8, 28]. Ocena Ŝywotności i inaktywacji limfocytów po zastosowaniu inaktywacji przy uŝyciu Systemu Mirasol była przedmiotem badań Antoniewicz-Papis i wsp. W badaniach wykonanych w Instytucie Hematologii i Transfuzjologii w Warszawie wykazano statystycznie znamienny wzrost martwych limfocytów po 6 dniach przechowywania KKP po inaktywacji (dwukrotnie wyŝszy wzrost niŝ w przypadku KKP napromienianych). Stwierdzono ponadto statystycznie znamiennie mniejszą aktywację limfocytów (ekspresja CD 69) w KKP inaktywowanych w Systemie Mirasol niŝ w grupie KKP kontrolnych i napromienianych w radiatorze Gammacell 3000 Elan (Nordion, Kanada). Na podstawie wyników tych prac moŝna sądzić, Ŝe w przyszłości System Mirasol będzie moŝna stosować jako metodę alternatywną do napromieniania. Konieczne są jednak dalsze badania (praca przygotowywana do druku). PODSUMOWANIE Doświadczenia związane ze stosowaniem metod inaktywacji czynników zakaźnych w składnikach krwi ograniczają się właściwie do ostatnich 10 lat. Co więcej, nie wszystkie potencjalnie niepoŝądane zdarzenia moŝna przewidzieć na etapie badań przedklinicznych i klinicznych. Liczebność badanej grupy nie zawsze jest wystarczająca, aby stwierdzić moŝliwość wystąpienia rzadkich niepoŝądanych działań jak np. tworzenie nowych antygenów podczas długotrwałego przetaczania inaktywowanych składników krwi. Zatem, niezaleŝnie od wiedzy na temat profilu bezpieczeństwa i rodzaju metod inaktywacji czynników chorobotwórczych, naleŝy uwzględnić konieczność monitorowania jakości inaktywowanych składników krwi. Monitorowanie powinno uwzględniać nie tylko kontrolę jakości inaktywowanych składników krwi, ale przede wszystkim obserwację pacjentów, którym przetoczono inaktywowane

Metody inaktywacji czynników chorobotwórczych 433 składniki krwi jak równieŝ rozwiązywanie problemów związanych z wystąpieniem powikłań poprzetoczeniowych. PIŚMIENNICTWO 1. Łętowska M (red). Medyczne zasady pobierania krwi, oddzielania jej składników i wydawania, obowiązujące w jednostkach organizacyjnych publicznej słuŝby krwi, Zasady kwalifikowania kandydatów na dawców oraz dawców do oddania krwi lub jej składników, Warszawa 2008; wyd. I: 1-14. 2. Garwood M, Cardigan RA, Drummond O. The effect of methylene blue photoinactivation and methylene blue removal on the quality of fresh-frozen plasma. Transfusion 2003; 43: 1238-1247. 3. Biggerstaff BJ, Petersen LR. Estimated risk of transmission of the West Nile virus through blood transfusion in the US, 2002. Transfusion 2003; 43: 1007-1017. 4. Pawińska A, Antoniewicz-Papis J. Powikłania bakteryjne, związane z transfuzją krwi i metody ich zapobiegania. Czynniki zakaźne przenoszone przez krew red. E. Brojer, OINPHARMA Sp. z o.o., Warszawa, 2008; 161-178. 5. Hornsey VS, Drummond O, Young D, Docherty A, Prowse CV. A potentially improved approach to methylene blue virus inactivation of plasma: the Maco Pharma Maco-Tronic system. Transf Med 2001; 11: 31-36. 6. Janetzko K, Lin L, Eichler H, Mayaudon V, Flament J, Kluter H. Implementation of the INTERCEPT Blood System for Platelets into routine blood bank manufacturing procedures: evaluation of apheresis platelets. Vox Sang. 2004; 86: 239-345. 7. Klein HG, Dodd RY, Dzik WH, Luban NL, Ness PM, Pisciotto P, Schiff PD, Snyder EL et al. Current status of solvent/detergent treated frozen plasma. Transfusion 1998; 38: 102-107. 8. Marschner S, Fast LD, Baldwin III WM, Slichter SJ, Goodrich RP. White blood cell inactivation after treatment with riboflavin and ultraviolet light. Transfusion 2010; 50(11): 2489-2498. 9. Li J, De Korte D, Woolum MD, Ruane PH, Keil SD, Lockerbie O, McLean R, Goodrich RP. Pathogen reduction of buffy coat platelet concentrates using riboflavin and light: comparisons with pathogen-reduction technology-treated apheresis platelet products. Vox Sang 2004; 87: 82-90. 10. Lambrecht B, Mohr H, Knuver-Hopf J, Schmitt H. Photoinactivation of viruses in human fresh plasma by phenothiazine dyes in combination with visible light. Vox Sang 1991; 60: 207-213. 11. Lerner RG, Nelson J, Sorcia E, Grima K, Kancherla RR, Zarou-Naimo CM, Pehta JC. Evaluation of Solvent/Detergent- Treated Plasma in Patients with a Prolonged Prothrombin Time. Vox Sanq 2000; 79: 161-167. 12. Margolis-Nunno H, Robinson R, Ben-Hur E, Horowitz B. Quencher-enhanced specificity of psoralen-photosensitized virus inactivation in platelet concentrates. Transfusion 1994; 34: 802-810. 13. Mohr H, Knuver-Hopf J, Gravemann U, Redecker-Klein A, Muller TH. West Nile virus in highly sensitive methylene blue-light treatment. Transfusion 2004; 44: 886-890. 14. Pamphilon D. Viral inactivation of fresh frozen plasma. BJ of Haematol 2000; 109: 680-693. 15. Pehta JC. Clinical Studies With Solvent Detergent-Treated Products. Transf Med Rev 1996; 10(4): 303-311. 16. AuBuchon JP. Current status of pathogen inactivation methods. Vox Sang 2010; 5: 125 133. 17. Ruane PH, Edrich R, Gampp D, Keil SD, Leonard RL, Goodrich RP. Photochemical inactivation of selected viruses and bacteria in platelet concentrates using riboflavin and light. Transfusion 2004; 44: 877-885. 18. Suomela H. Inactivation of Viruses in Blood and Plasma Products. Transfus.Med.Rev. 1993; 7: 42-57. 19. Solheim BG, Rollag H, Svennevig JL, Arafa O, Fosse E, Bergerud U. Viral safety of solvent/detergent treated plasma. Transfusion 2000; 40: 84-90. 20. Singh Y, Sawyer LS, Pinkoski LS i wsp.: Photochemical treatment of plasma with amotosalen and long-wavelength ultraviolet light inactivates pathogen while retaining coagulation function. Transfusion 2006; 46: 1168-1179. 21. Simonsen AC, Sorensen H. Clinical Toreance of Methylene Blue Virus-Inactivated Plasma. Vox Sang. 1999; 77: 210-217. 22. Williamson LM, Allain JP. Virally Inactivated Fresh Frozen Plasma. Vox Sang 1995; 69: 159-165. 23. Williamson LM, Cardigan R, Prowse CV. Methylene blue-treated fresh frozen plasma: what is its contribution to blood safety? Transfusion 2003; 43: 1322-1329. 24. Wu Y.Y., Snyder E.L.: Safety of the blood supply: role of pathogen reduction. Blood Rev. 2003; 17(2): 111-122. 25. Klein HG, Anderson D, Bernardi MJ, Cable R, Carey W, Hoch JS, Robitaille N, Sivilotti MLA, Smaill F. Pathogen inactivation: making decisions about new technologies. Report of a consensus conference. Transfusion 2007; 47: 2338-47. 26. Webert KE, Cserti CM, Hannon J i wsp.: Proceedings of a Consensus Conference: pathogen inactivation-making decisions about new technologies. Transfus Med Rev 2008; 22: 1 34. 27. Lachert E. Inaktywacja patogenów we krwi i jej składnikach. Laboratorium 2006; 4: 54-63. 28. Lachert E, Antoniewicz-Papis J. Metody inaktywacji czynników chorobotwórczych w składnikach krwi. Journal of Transfusion Medicine 2010; 3: 112-119.

434 E. LACHERT, M. ŁĘTOWSKA 29. Lachert E, Antoniewicz-Papis J. Inaktywacja czynników zakaźnych w produktach krwiopochodnych i składnikach krwi,,czynniki zakaźne przenoszone przez krew red. E. Brojer, OINPHARMA Sp. z o.o., Warszawa 2008; 222-238. 30. Reddy L., Marschner S., Doane S.: Room temperature storage of whole blood treated with the Mirasol System. Vox Sang 2010; 99(1): 243 244. Praca wpłynęła do Redakcji 20.06.2011 r. i została zakwalifikowana do druku 29.06.2011 r. Adres do korespondencji: Magdalena Łętowska Instytut Hematologii i Transfuzjologii ul. Indiry Gandhi 14 02-776 Warszawa letowska@ihit.waw.pl tel: 22 3496 371