FLEX Monolclonal Mouse Anti-Human Progesterone Receptor Ready-to-Use (Dako Autostainer/Autostainer Plus) Nr kat. IS068 Przeznaczenie Do badań diagnostycznych in vitro. Przeciwciała FLEX Monoclonal Mouse Anti-Human Progesterone Receptor,, Ready-to-Use (Dako Autostainer/Autostainer Plus), są przeznaczone do stosowania w immunohistochemii w urządzeniachautostainer/autostainer Plus razem z zestawem do wizualizacji EnVision FLEX+, High ph, do wykrywania ludzkiego receptora progesteronowego metodą półilościową w utrwalonych w formalinie i zatopionych w parafinie skrawkach tkanek nowotworu piersi. Przeciwciała znakują komórki posiadające receptory progesteronowe i są przydatne w ocenie statusu tych receptorów w ludzkich komórkach nowotworu piersi. Interpretacja kliniczna wystąpienia barwienia lub jego braku musi być uzupełniona o badania morfologiczne z wykorzystaniem odpowiednich prób kontrolnych i powinna być przeprowadzana przez doświadczonego patologa z uwzględnieniem historii choroby pacjenta i innych badań diagnostycznych. Synonimy antygenu Streszczenie i informacje ogólne Dostarczony odczynnik PR Rola receptorów hormonów steroidowych w przebiegu choroby nowotworowej piersi została dobrze poznana (1,2). Brak receptorów estrogenowych (ER) i progesteronowych (PR) pozwala na przewidywanie wystąpienia wczesnych nawrotów i niskiej przeŝywalności u pacjentów z nowotworem piersi (3-6). Z kolei obecność ER i PR w guzach wskazuje na moŝliwość uzyskania korzyści ze stosowania tamoksyfenu i innych terapii hormonalnych. Wykrywanie ER i PR moŝna prowadzić przy uŝyciu półilościowych metod immunohistochemicznych (IHC) lub metod ilościowych przy uŝyciu węgla opłaszczonego dekstranem lub immunoenzymatycznych. Wartość korelacji pomiędzy półilościową i ilościową oceną zawartości PR wynosiła 73 91% w zaleŝności od laboratorium i stosowanych przeciwciał (7-9). Patrz dokument General Instructions for Immunohistochemical Staining (Ogólne instrukcje wykonywania odczynów immunohistochemicznych) firmy Dako lub instrukcje do systemu detekcji IHC, aby poznać: 1) Zasady procedury, 2) Niezbędne materiały niedostarczone z zestawem, 3) Przechowywanie, 4) Przygotowanie preparatu, 5) Wykonanie odczynu, 6) Kontrola jakości, 7) Rozwiązywanie problemów, 8) Interpretacja wyniku odczynu, 9) Ograniczenia metody. Gotowe do uŝycia mysie przeciwciało monoklonalne dostarczane w postaci ciekłej w buforze zawierającym białko stabilizujące z dodatkiem 0,015 mol/l NaN 3. Klon: PgR 636 (10) Izotyp: IgG1, kappa Immunogen Rekombinowana forma A ludzkiego receptora progesteronowego o pełnej długości, utrwalona w formalinie (10) Swoistość W badaniach metodą Western blot wyciągów z całych komórek wykazano reaktywność przeciwciał Anty-PR, PgR 636, z izoformami PR-A i PR-B, zarówno wolnymi, jak i po przyłączeniu hormonu (10). Epitop został zmapowany do domeny N-końcowej, wspólnej dla PR-A i PR-B. Środki ostroŝności 1. Do badań diagnostycznych in vitro. 2. Do stosowania przez wyszkolony personel. 3. Opisywany produkt zawiera silnie toksyczny związek azydek sodu (NaN 3), w czystej postaci. Azydek sodu, zastosowany w produkcie w stęŝeniu, które nie jest sklasyfikowane jako niebezpieczne, moŝe reagować z elementami kanalizacji wykonanymi z ołowiu i miedzi, powodując nagromadzenie silnie wybuchowych azydków metali. Po usunięciu spłukać duŝą ilością wody, aby zapobiec nagromadzeniu się azydków metali w kanalizacji. 4. Podobnie jak w przypadku wszelkich materiałów pochodzących ze źródeł biologicznych, naleŝy stosować właściwe procedury postępowania. 5. W celu uniknięcia kontaktu z oczami i skórą naleŝy nosić odpowiednie osobiste wyposaŝenie ochronne. 6. Niewykorzystany roztwór usuwać zgodnie z rozporządzeniami lokalnymi, wojewódzkimi i krajowymi. (117244-004) 307142PL_004 p. 1/5
Przechowywanie Przygotowlanie próbek oraz materiały wymagane, ale niedostarczane Procedura barwienia oraz materiały wymagane, ale niedostarczane Interpretacja wybarwienia Ograniczenia swoiste dla opisywanego produktu Charakterystyka działania Przechowywać w temperaturze 2 8 C. Nie naleŝy uŝywać odczynników po upływie terminu waŝności podanego na fiolce. Jeśli odczynniki są przechowywane w warunkach innych niŝ podane powyŝej, uŝytkownik powinien zweryfikować te warunki. Nie ma wyraźnych oznak wskazujących na niestabilność produktu. Dlatego jednocześnie z badaniem próbek pochodzących od pacjenta naleŝy wykonywać kontrole pozytywne i negatywne. W przypadku uzyskania nieoczekiwanego wyniku odczynu, którego nie moŝna wyjaśnić róŝnicami w procedurach laboratoryjnych, i gdy podejrzewa się problem z przeciwciałem, naleŝy skontaktować się z działem wsparcia technicznego firmy Dako. Skrawki parafinowe: przeciwciała mogą być wykorzystywane do znakowania skrawków utrwalonych w formalinie i zatopionych w parafinie. Preparaty tkankowe naleŝy pociąć na skrawki o grubości około 4 µm. Obróbka wstępna: wymagana jest wstępna obróbka skrawków tkankowych utrwalonych w formalinie i zatopionych w parafinie. Optymalne wyniki uzyskuje się po przeprowadzeniu na tkankach wstępnej obróbki HIER przy uŝyciu rozcieńczonego roztworu EnVision FLEX Target Retrieval Solution, High ph (50x) (nr kat. K8012/K8004). Odparafinowanie, nawodnienie i odmaskowanie antygenu moŝna przeprowadzić w urządzeniu Dako PT Link (nr kat. PT100/PT101/PT200). Szczegółowe informacje zawiera instrukcja uŝytkownika aparatu PT Link (PT Link User Guide). W aparacie PT Link naleŝy ustawić następujące parametry pomiarowe: temperatura wstępnego ogrzewania: 65 C; temperatura i czas odmaskowania d eterminanty antygenowej: 97 C przez 20 minut (±1 mi n); schłodzenie do 65 C. Usunąć statyw z preparatami ze zbiornika PT i natychmiast zanurzyć preparaty w naczyniu/zbiorniku (np. PT Link Rinse Station, nr kat. PT109) zawierającym rozcieńczony bufor EnVision FLEX Wash Buffer (20x) (nr kat. K8007) o temperaturze pokojowej. Pozostawić preparaty w buforze Wash Buffer na 1 5 minut. W trakcie obróbki wstępnej oraz podczas procedury znakowania immunohistochemicznego skrawki nie powinny wyschnąć. W celu uzyskania lepszego przylegania skrawków do szkiełek podstawowych zaleca się stosowanie szkiełek FLEX IHC Microscope Slides (nr kat. K8020). Po przeprowadzeniu barwienia skrawki muszą zostać odwodnione, oczyszczone i zatopione w środku do trwałego zatapiania. Zalecanym systemem wizualizacji jest EnVision FLEX+, Mouse, High ph, (nr kat. K8012). Oprogramowanie urządzeń Dako Autostainer/Autostainer Plus zawiera wstępnie zaprogramowane etapy odczynu i czasy inkubacji, które są aktywne podczas korzystania z następujących protokołów: Protokół wzorcowy: FLEXRTU2 (200 µl dozowanych odczynników) lub FLEXRTU3 (300 µl dozowanych odczynników) Autoprogram: PR (bez barwienia kontrastowego) lub PRH (z barwieniem kontrastowym) Dla etapu Auxiliary (Pomocniczy) naleŝy ustawić opcję rinse buffer ( płukanie buforem ) w programach barwienia 10 preparatów. Dla etapu Auxiliary (Pomocniczy) naleŝy ustawić opcję none ( brak ) w programach barwienia >10 preparatów. Zapewni to porównywalne czasy płukania. Wszystkie procedury inkubacji naleŝy przeprowadzać w temperaturze pokojowej. Szczegółowe informacje zawiera podręcznik uŝytkownika odpowiedniego aparatu. Jeśli protokoły nie są dostępne w uŝywanym urządzeniu Dako Autostainer, naleŝy skontaktować się z działem wsparcia technicznego firmy Dako. Zalecane jest barwienie kontrastowe hematoksyliną przy uŝyciu odczynnika EnVision FLEX Hematoxylin, (Dako Autostainer/Autostainer Plus) (nr kat. K8018). Zaleca się stosowanie niewodnego środka do trwałego zatapiania. Równolegle z odczynami na materiale pochodzącym od pacjentów naleŝy wykonywać pozytywne i negatywne próby kontrolne z uŝyciem identycznego protokołu. Tkankowa kontrola pozytywna powinna obejmować komórki nabłonka walcowatego, komórki nabłonka płaskiego warstwy przypodstawnej i komórki zrębu, a komórki/struktury powinny wykazywać odczyn taki, jak opisany dla tej tkanki w części Charakterystyka działania. Zalecana kontrola negatywna to FLEX Negative Control, Mouse, (Dako Autostainer/Autostainer Plus) (nr kat. IS750). Odczyn komórkowy ma charakter. W przypadku wystąpienia odczynu cytoplazmatycznego naleŝy go traktować jako nieswoisty. Dodatni odczyn definiuje się jako wybarwienie jąder komórkowych 1% komórek nowotworowych niezaleŝnie od nasilenia odczynu. Jest to zgodne z zalecaną przez ASCO/CAP wartością graniczną wynoszącą 1% komórek nowotworowych z odczynem dodatnim (11). 1. Wyniki fałszywie ujemne mogą być spowodowane procesem stopniowego rozkładu antygenu w tkankach. JeŜeli próbki przechowywano w temperaturze pokojowej, powinny być poddane barwieniu w ciągu 2 miesięcy od osadzenia preparatów tkankowych na szkiełkach (12). 2. Limfocyty i komórki zrębu w przypadku znakowania przeciwciałem FLEX Monoclonal Mouse Anti-Human PR,, mogą wykazywać odczyn dodatni i nie naleŝy ich zaliczać do komórek nowotworowych wykazujących ekspresję PR. 3. W celu uzyskania optymalnych, powtarzalnych wyników, białko PR wymaga odmaskowania antygenu w preparatach utrwalanych standardowo (w obojętnej buforowanej formalinie) i zatapianych w parafinie. 4. Nie przeprowadzono weryfikacji stosowania przeciwciała Dako Anti-PR,, w przypadku tkanek utrwalanych środkami innymi niŝ formalina. Precyzja: do badania precyzji przeznaczono serie skrawków pochodzących z 12 róŝnych bloczków tkankowych nowotworu piersi utrwalonych w formalinie i zatopionych w parafinie, które prezentowały cały zakres nasilenia ekspresji PR. Badanie wykonano w następujący sposób: Precyzja w obrębie serii: zgodnie ze standardowym protokołem EnVision FLEX+, High ph, trzy skrawki z kaŝdego bloczka tkankowego wyznakowano przeciwciałem Anti-PR,. Jednocześnie, jeden skrawek z kaŝdego bloku został poddany barwieniu kontrolą ujemną. (117244-004) 307142PL_004 p. 2/5
Precyzja między seriami: powyŝszą procedurę powtarzano przez pięć nienastępujących po sobie dni, wybarwiając jeden skrawek z kaŝdego bloczka tkankowego. Jednocześnie, jeden skrawek z kaŝdego bloku został poddany barwieniu kontrolą ujemną. Precyzja między urządzeniami: powyŝsza procedura była wykonywana w trzech róŝnych urządzeniach Autostainer przez trzech róŝnych operatorów i obejmowała wybarwienie łącznie trzech skrawków z kaŝdego bloczka tkankowego. Jednocześnie, jeden preparat z kaŝdego bloku został poddany barwieniu kontrolą ujemną. W testach dokładności przeprowadzonych w jednej serii, pomiędzy seriami oraz pomiędzy urządzeniami z uŝyciem przeciwciał Anti-PR,, uzyskano zgodność wyników. W badaniu utrzymywano stałe warunki wykonywanych testów, a pomiędzy testami odczynniki przechowywano w temperaturze 2 8 C. Tkanki prawidłowe: w tabeli 1 przedstawiono podsumowanie immunoreaktywności przeciwciał Anti-PR, Clone PgR 636, w odniesieniu do zalecanych tkanek prawidłowych. Wszystkie preparaty tkankowe zostały utrwalone w formalinie i zatopione w parafinie, a następnie wybarwione z uŝyciem przeciwciał Anti- PR,, zgodnie z zaleceniami zawartymi w ulotce dołączonej do opakowania. W kilku róŝnych składnikach komórkowych, w tym nabłonka powierzchniowego, zrębu, komórkach śródmiąŝszowych i komórkach tkanki zapalnej, wyznakowanych przeciwciałem Anti-PR,, obserwowano odczyn cytoplazmatyczny. Pomimo wystąpienia odczynu cytoplazmatycznego nie uznano go za odczyn diagnostyczny z uwagi na przeznaczenie tego przeciwciała. Tabela 1: Podsumowanie reaktywności przeciwciał Anti-PR,, w tkankach prawidłowych Rodzaj tkanki (liczba badanych przypadków) Nadnercza (3) Składniki tkankowe wykazujące odczyn dodatni Rodzaj tkanki (liczba badanych przypadków) Składniki tkankowe wykazujące odczyn dodatni 1/3 Komórki warstwy kłębkowatej Nerwy obwodowe (3) 0/3 (50%), 1/3 Komórki warstwy kłębkowatej (50%), Jajniki (3) 3/3 Komórki zrębu (50 70%), Szpik kostny (3) 0/3 Trzustka (3) 2/3 Komórki wysp Langerhansa (50 90%), Gruczoły sutkowe (3) 2/3 Komórki nabłonka gruczołowego (50 90%), Przytarczyce (3) 3/3 Komórki nabłonka gruczołowego (1 10%), MóŜdŜek (3) 0/3 Przysadka mózgowa (3) 3/3 Komórki części gruczołowej przysadki (1 40%), Mózgowie (3) 1/3 Komórki oponowe (100%), Gruczoł krokowy (3) 3/3 Komórki zrębu (30 80%), Szyjka macicy (3) 3/3 Komórki nabłonka (50 90%), Ślinianki (3) 3/3 Komórki nabłonka gruczołowego(<1% 60%), 3/3 Komórki zrębu, w tym komórki Skóra (3) 0/3 tkanki zapalnej (50%), Jelito grube (3) 1/3 Komórki limfoidalne/tkanki zapalnej (<10%), Jelito cienkie (3) 3/3 Komórki zrębu i komórki tkanki zapalnej (30 50%), 1/3 Komórki limfoidalne/tkanki Śledziona (3) 0/3 zapalnej (10%), Przełyk (3) 1/3 Komórki podścieliska (50%), śołądek (3) 1/3 Komórki śródmiąŝszowe (20%), Nerki (3) 3/3 Komórki śródmiąŝszowe (1 5%), Jądra (3) 3/3 Komórki śródmiąŝszowe (5 80%), Wątroba (3) 0/3 Grasica (3) 0/3 Płuca (3) 2/3 Komórki śródmiąŝszowe Tarczyca (3) 0/3 (1 10%), 2/3 Komórki tkanki zapalnej Migdałki (3) 0/3 (1 10%), Komórki międzybłonka (2) 0/2 Macica (2) 2/2 Komórki nabłonka gruczołowego(100%), Mięsień sercowy (3) 3/3 Miocyty (30%), około 2/2 Komórki zrębu warstwy mięśniowej macicy (100%), Mięśnie szkieletowe (3) 0/3 Porównanie metod: przeciwciała Monoclonal Mouse Anti-Human PR,, badano metodą EnVision FLEX+ i oceniono je zgodnie z wytycznymi ASCO/CAP (wartość graniczna 1%) (11). Badania przeciwciałanti-pr (Clone 1294) przeprowadzono z wykorzystaniem zestawu Dako ER/PR pharmdx Kit i oceniono je według wytycznych skali Allreda opisanych w ulotce dołączonej do opakowania. Dane z porównania metod przedstawiono w tabeli 2. Na podstawie wymienionych metod oceny wykazano zgodność przeciwciał Monoclonal Mouse Anti- Human PR,, z przeciwciałami Anti-PR z zestawu Dako ER/PR pharmdx Kit, co potwierdzają uzyskane wartości zgodności wszystkich wyników, wyników dodatnich i ujemnych wynoszące odpowiednio 94,5%, 95,8% i 93,1%. Tabela 3 przedstawia porównanie obu testów ocenionych zgodnie z wytycznymi ASCO/CAP. (117244-004) 307142PL_004 p. 3/5
Tabela 2: Zgodność przeciwciał Anti-PR, (ASCO/CAP), z przeciwciałami Anti-PR z zestawu ER/PR pharmdx Kit (wg. skali Allreda) Przeciwciała Anti-PR z zestawu ER/PR pharmdx Kit Przeciwciała Monoclonal Mouse Anti- Human PR, Dodatnie 115 8 123 Ujemne 5 108 113 Razem 120 116 236 Procentowa zgodność wyników dodatnich = 95,8% (95% CI: 91,1 96,8) Procentowa zgodność wyników ujemnych = 93,1% (95% CI: 90,5 96,7) Procentowa zgodność wszystkich wyników = 94,5% (95% CI: 90,8 96,8) Tabela 3: Zgodność przeciwciał Anti-PR, (ASCO/CAP), z przeciwciałami Anti-PR z zestawu ER/PR pharmdx Kit (ASCO/CAP) Przeciwciała Anti-PR z zestawu ER/PR pharmdx Kit Przeciwciała Monoclonal Mouse Anti- Human PR, Dodatnie 115 8 123 Ujemne 1 112 113 Razem 116 120 236 Procentowa zgodność wyników dodatnich = 99,1% (95% CI: 93,0 98,0) Procentowa zgodność wyników ujemnych = 93,3% (95% CI: 92,8 98,0) Procentowa zgodność wszystkich wyników = 96,2% (95% CI: 93,0 98,0) Odtwarzalność między laboratoriami: badanie odtwarzalności z uŝyciem przeciwciał Anti-PR,, przeprowadzono w trzech laboratoriach badawczych przez pięć nienastępujących po sobie dni z uŝyciem 21 skrawków tkanek nowotworu piersi i oceniono je zgodnie z wytycznymi ASCO/CAP (wartość graniczna 1%), wykonując łącznie 315 testów. W tabelach 4, 5 i 6 przedstawiono odtwarzalność pomiędzy ośrodkami. Obliczenia średniej procentowej zgodności wyników dodatnich, ujemnych i wszystkich wyników potwierdzają wysoką odtwarzalność testu PR (PgR 636) stosowanego w celu określenia statusu PR w warunkach klinicznych. Tabela 4: Porównanie ośrodka 1 z ośrodkiem 2 w ramach badania odtwarzalności pomiędzy laboratoriami z uŝyciem przeciwciał Anti-PR, 2 1 Dodatnie 55 0 55 Ujemne 4 46 50 Razem 59 46 105 Średnia procentowa zgodność wyników dodatnich = 96,5% Średnia procentowa zgodność wyników ujemnych = 95,8% Tabela 5: Porównanie ośrodka 1 z ośrodkiem 3 w ramach badania odtwarzalności pomiędzy laboratoriami z uŝyciem przeciwciał Anti-PR, 3 1 Dodatnie 59 1 60 Ujemne 0 45 45 Razem 59 46 105 Średnia procentowa zgodność wyników dodatnich = 99,2% Średnia procentowa zgodność wyników ujemnych = 98,9% (117244-004) 307142PL_004 p. 4/5
Tabela 6: Porównanie ośrodka 2 z ośrodkiem 3 w ramach badania odtwarzalności pomiędzy laboratoriami z uŝyciem przeciwciał Anti-PR, 2 3 Dodatnie 55 5 60 Ujemne 0 45 45 Razem 55 50 105 Średnia procentowa zgodność wyników dodatnich = 95,7% Średnia procentowa zgodność wyników ujemnych = 94,7% Piśmiennictwo 1. Henderson C.Breast cancer. In: Harrison s principles of internal medicine, 12th edition, Wilson JD, Braunwald E, Isselbacher KJ, Petersdorf RG, Martin JB, Fauci AS, Root RK (eds). McGraw-Hill, Inc. New York, 1991 2. Fuqua SAW. Estrogen and progesterone receptors and breast cancer. Diseases of the Breast, Harris et al, eds. Lippincott-Raven, 1996. p. 261. 3. McGuire WL, Clark GM. The prognostic role of progesterone receptors in human breast cancer. Sem Oncol 1983;10:2. 4. Clark GM, McGuire WL, Hubay CA, Pearson OH, Marshall JS. Progesterone receptors as prognostic factor in stage II breast cancer. N Engl J Med 1983;39:1343. 5. Ravdin PM, Green S, Dorr TM, McGuire WL, Fabian C, Puch RP, et al. Prognostic significance of progesterone receptor levels in estrogen receptor-positive patients with metastatic breast cancer treated with tamoxifen: Results of a prospective southwest oncology group study. JCO 1992;10:1284. 6. Chevallier B, Heintzmann F, Mosseri V, Dauce JP, Bastit P, Graic Y, Brunelle P, Basuyay JP, Comoz M, Asselain B. Prognostic value of estrogen and progesterone receptors in operable breast cancer: Results of a univariate and multivariate analysis. Cancer 1988; 62:2517 7. Page DL, Jensen RA, Simpson JF. Routinely available indicators of prognosis in breast cancer. Breast Can Res Treat 1998;51:195. 8. Allred DC, Harvey JM, Berardo M, Clark GM. Prognostic and predictive factors in breast cancer by immunohistochemical analysis. Mod Pathol 1998;11:155. 9. Fitzgibbons PL, Page DL, Weaver D, Thor AD, Allred DC, Clark GM, et al. Prognostic factors in breast cancer. College of American Pathologists consensus statement. Arch Pathol Lab Med 2000;124:966. 10. Press M, Spaulding B, Groshen S, Kaminsky D, Hagerty M, Sherman L, et al. Comparison of different antibodies for detection of progesterone receptor in breast cancer. Steroids 2002; 67:799. 11. Hammond MEH, Hayes DF, Dowsett M, Allred C, Hagerty KL, Badve S, et al. American Society of Clinical Oncology/College of American Pathologists Guideline Recommendations for Immunohistochemical Testing of Estrogen and Progesterone Receptors in Breast Cancer. Arch Pathol Lab Med 2010;134:907 22. 12. Clinical and Laboratory Standards Institute (formerly NCCLS). Quality assurance for immunocytochemistry; Approved guideline. CLSI document MM4-A (1-56238-396-5)- CLSI, 940 West Valley Road, Suite 1400. Wayne, PA 19087-1898 USA 1999. Wydanie 11/15 (117244-004) 307142PL_004 p. 5/5