Ocena właściwości biologicznych kompozytów na bazie chitosanu do stosowania w inżynierii tkankowej kości Agata Przekora*, Grażyna Ginalska Uniwersytet Medyczny w Lublinie, Wydział Farmaceutyczny z Oddziałem Analityki Medycznej, Katedra i Zakład Biochemii i Biotechnologii, ul. Chodźki 1, 20-093 Lublin * E-mail: agata.przekora@umlub.pl Streszczenie Ceramika wapniowo-fosforanowa w formie granul, jak i porowatego rusztowania na bazie biodegradowalnego biopolimeru jest materiałem powszechnie stosowanym jako substytut tkanki kostnej w ortopedii i stomatologii. Właściwości biologiczne chitosanu sprawiają, że jest on idealnym polisacharydowym składnikiem kompozytów na bazie hydroksyapatytu. Celem inżynierii tkankowej jest produkcja biodegradowalnego, porowatego, trójwymiarowego rusztowania, które miałoby zdolność wspierania, wzmacniania i organizowania regenerującej się tkanki. Biomateriały powinny posiadać optymalną porowatość, moduł sprężystości oraz mikrostrukturę aby zapewnić odpowiednie połączenie implantu z otaczającym środowiskiem. Celem niniejszej pracy było określenie właściwości biologicznych 2 typów kompozytów na bazie krylowego chitosanu o potencjalnym zastosowaniu w inżynierii tkankowej kości. Testy in vitro przeprowadzono z wykorzystaniem linii komórkowej hfob 1.19 (ludzkie płodowe osteoblasty). W celu określenia biokompatybilności kompozytów dokonano oceny 1
ich toksyczności względem osteoblastów metodą MTT, zobrazowano wzrost komórek na powierzchni biomateriałów przy użyciu mikroskopu konfokalnego oraz określono aktywność frakcji kostnej fosfatazy alkalicznej (b-alp) komórek rosnących na powierzchni biomateriałów. Podsumowując, na podstawie uzyskanych wyników można wysnuć wniosek, że testowane biokompozyty są nietoksyczne, sprzyjają zasiedlaniu komórek oraz powodują wzrost aktywności b-alp w czasie, a zatem stymulują procesy różnicowania osteoblastów. WSTĘP Głównym składnikiem części mineralnej kości i zębów jest hydroksyapatyt (HAp). Ceramika wapniowo-fosforanowa w formie granul, jak i porowatego rusztowania jest materiałem powszechnie stosowanym jako substytut tkanki kostnej w ortopedii i stomatologii [1-3]. W celu polepszenia własności mechanicznych oraz poręczności chirurgicznej hydroksyapatytu można wprowadzać do niego dodatkowy komponent organiczny np. polisacharydowy [4,5]. Właściwości biologiczne chitosanu sprawiają, że jest on idealnym polisacharydowym składnikiem kompozytów na bazie hydroksyapatytu. Chitosan jest szeroko stosowany w inżynierii tkankowej dzięki swoim charakterystycznym właściwościom, takim jak brak toksyczności, szybka biodegradacja, podatność na chemiczną i enzymatyczną modyfikację, stymulacja adhezji i proliferacji komórek, strukturalne podobieństwo do glikozaminoglikanów pozakomórkowej macierzy tkanki kostnej oraz osteoinduktywność [6-8]. 2
W medycynie regeneracyjnej, kompozyty na bazie chitosanu często stosowane są w formie hydrożeli, implantów, czy rusztowań mających zdolność dostarczania leków, czynników wzrostu oraz komórek do miejsca implantacji [8]. Pod względem właściwości mechanicznych biokompozyty powinny charakteryzować się optymalną porowatością oraz modułem sprężystości dostosowanymi do miejsca implantacji (np. kość zbita lub gąbczasta) [9,10]. Optymalna mikrostruktura wszczepu umożliwia wrastanie tkanek w zaimplantowany biomateriał przez co uzyskuje się dobre połączenie implant-tkanka, zapewniając odpowiednią wytrzymałość zmęczeniową implantu i połączenia [11]. Celem niniejszej pracy było określenie właściwości biologicznych kompozytów składających się z krylowego chitosanu oraz dwóch typów ceramiki wapniowo-fosforanowej: granul HAp (granule HA BIOCER, Ø 0,5-1,6 mm, Chema Elektromet Rzeszów) kompozyt oznaczony jako chitosan/ha BIOCER mieszanki granul HAp/TCP (granule HT BIOCER, Ø 0,5-1,6 mm, Chema Elektromet Rzeszów) kompozyt oznaczony jako chitosan/ht BIOCER. MATERIAŁY I METODY Ocena cytotoksyczności metodą MTT Cytotoksyczność biomateriałów oszacowano metodą pośrednią za pomocą płynnych ekstraktów uzyskanych przez umieszczenie kompozytów w pełnym podłożu hodowlanym w stosunku 0,1 g próbki/ml podłoża na 24 godziny w temperaturze 37 C (ISO 10993-5). Kontrolę negatywną cytotoksyczności stanowiło podłoże hodowlane inkubowane w takich samych warunkach, ale bez biomateriałów. Kontrolę pozytywną cytotoksyczności stanowił 3
0,1% roztwór fenolu. Żywotność komórek hfob po 24 i 48-godzinnej ekspozycji na działanie ekstraktów określono z użyciem testu MTT (ocena aktywności dehydrogenazy mitochondrialnej). Wyniki testu MTT wyrażono jako procent kontroli oraz przedstawiono jako wartości średnie ± odchylenie standardowe. Ocena wzrostu komórek na powierzchni kompozytów Wzrost komórek linii hfob 1.19 na powierzchni biomateriałów określono prowadząc długoterminową hodowlę osteoblastów bezpośrednio na biomateriałach. Po 16 dniach hodowli, komórki barwiono barwnikiem fluorescencyjnym Hoechst 33342 (niebieska fluorescencja jąder komórkowych) i obserwowano ich wzrost przy pomocy mikroskopu konfokalnego (Olympus Fluoview FV1000). Oznaczenie aktywności frakcji kostnej fosfatazy alkalicznej Biokompatybilność kompozytów określono również poprzez pomiar aktywności frakcji kostnej fosfatazy alkalicznej (b-alp) markera II stadium różnicowania osteoblastów. W tym celu hodowlę komórek linii hfob 1.19 prowadzono bezpośrednio na biomateriałach w podłożu osteogennym przez okres 20 dni. Po 4,8,12,16 i 20 dniach oznaczono aktywność b- ALP poprzez pomiar ilości powstającego p-nitrofenolu (pnp). WYNIKI Wyniki testu MTT na oznaczanie cytotoksyczności jednoznacznie wykazały, że kompozyty chitosan/ha BIOCER oraz chitosan/ht BIOCER nie wpływają negatywnie na żywotność komórek linii hfob 1.19 przez cały czas trwania doświadczenia. 4
% kontroli 120 100 MTT test 24 h 48 h 80 60 40 20 0 kontrola chitosan/ha BIOCER chitosan/ht BIOCER 0.1 % fenol Obserwacja wybarwionych fluorescencyjnie komórek w mikroskopie konfokalnym sugeruje, że powierzchnia kompozytu chitosan/ha BIOCER bardziej sprzyja wzrostowi osteoblastów niż powierzchnia kompozytu chitosan/ht BIOCER. Hodowla komórek bezpośrednio na biomateriałach w podłożu osteogennym wykazała, że oba kompozyty powodują wzrost aktywności b-alp w czasie. Osteoblasty rosnące na 5
pnp [µm] powierzchni kompozytu chitosan/ha BIOCER wykazywały nieznacznie wyższą aktywność b-alp w porównaniu do komórek kontrolnych rosnących na powierzchni płytki polistyrenowej. Natomiast osteoblasty rosnące na powierzchni kompozytu chitosan/ht BIOCER wykazywały obniżoną aktywność b-alp w porównaniu do kontroli. 120 100 80 60 40 20 0 aktywność b-alp kontrola chitosan/ha BIOCER chitosan/ht BIOCER 0 4 8 12 16 20 24 dni inkubacji WNIOSKI Podsumowując, na podstawie uzyskanych wyników można wysnuć wniosek, że kompozyty chitosan/ha BIOCER oraz chitosan/ht BIOCER są nietoksyczne, sprzyjają zasiedlaniu przez osteoblasty oraz powodują wzrost aktywności b-alp w czasie, a zatem stymulują różnicowanie komórek. Jednakże, warto zaznaczyć, że kompozyt chitosan/ha BIOCER wykazuje nieznacznie większą biokompatybilność niż kompozyt chitosan/ht BIOCER i jest bardziej odpowiedni do stosowania jako rusztowanie dla komórek w inżynierii tkankowej kości. 6
Podziękowania Praca finansowana w ramach DS MNd 2. Badania przeprowadzono z wykorzystaniem sprzętu zakupionego w projekcie realizowanym zgodnie z umową nr POPW.01.03.00-06-010/09-00 w ramach Programu Operacyjnego Rozwój Polski Wschodniej 2007-2013, Osi Priorytetowej I, Nowoczesna Gospodarka, Działanie 1.3. Wspieranie Innowacji. Literatura 1. Aronov D., Karlov A., Rosenman G., Hydroxyapatite nanoceramics: Basic physical properties and biointerface modification, J. Eur. Ceram. Soc., 2007, 27, 4181-4186 2. Belcarz A., Ginalska G., Zalewska J., Rzeski W., Ślósarczyk A., Kowalczuk D., Godlewski P., Niedźwiadek J., Covalent coating of hydroxyapatite by keratin stabilizes gentamicin release, J. Biomed. Mater. Res. B Appl. Biomater., 2009, 89, 102-113 3. Sopyan Y.I., Mel M., Ramesh S., Khalid K.A., Porous hydroxyapatite for artificial bone applications, Sci. Technol. Adv. Mater., 2007, 8, 116-123 4. Belcarz A., Ginalska G., Pycka T., Zima A., Slósarczyk A., Polkowska I., Paszkiewicz Z., Piekarczyk W., Application of β-1,3-glucan in production of ceramics-based elastic composite for bone repair, Cent. Eur. J. Biol., 2013, 8(6), 534-548 5. Tsioptsias C., Panayiotou C., Preparation of cellulose-nanohydoxyapatite composite scaffolds from ionic liquid solutions, Carbohydr. Polym., 2008, 74, 99-105 6. Kim E.S., Cho W.Y., Kang J.E., Kwon C.I., Lee B.E., Kim H.J., Chung H., Jeong Y.S., Three-dimensional porous collagen/chitosan complex sponge for tissue engineering, Fibers and Polymers, 2001, 2(2), 64-70 7
7. Malafaya B.P., Reis L.R., Bilayered chitosanu-based scaffolds for osteochondral tissue engineering: Influence of hydroxyapatite on in vitro cytotoxicity and dynamic bioactivity studies in a specific double-chamber bioreactor, Acta Biomater., 2009, 5, 644-660 8. Muzzarelli A.A.R., Chitins and chitosans for the repair of wounded skin, nerve, cartilage and bone, Carbohydr. Polym., 2009, 76, 167-182 9. Hannink G., Arts C.J.J., Bioresorbability, porosity and mechanical strength of bone substitutes: What is optimal for bone regeneration?, Injury, 2011, 42, S22 S25 10. Schliephake H., Neukam F.W., Klosa D., Influence of pore dimensions on bone ingrowth into porous hydroxylapatite blocks used as bone graft substitutes. Ahistometric study, Int. J. Oral Maxillofac. Surg., 1991, 20, 53 58 11. Otsuki B., Takemoto M., Fujibayashi S., Neo M., Kokubo T., Nakamura T., Novel Micro- CT based 3-dimentional structural analyses of porous biomaterials, Key Eng. Mater., 2007, 330-332, 967-970 8