Zak³ócenie homeostazy oksydacyjnej hepatocytów spowodowane teofilin¹ i glukoz¹, obecnymi w preparacie Theophyllinum badania in vitro Interference in oxidative homeostasis in hepatocytes, induced by theophylline and glucose contained in drug named Theophyllinum in vitro assay Dr n. med. Ma³gorzata Stec 1, dr n. med. Stefan Gawe³ 2, mgr farm. Cezary Wiœniewski 1, prof. dr hab. Maria Wardas 1 1 Katedra i Zak³ad ywnoœci i ywienia, Wydzia³ Œl¹skiej Akademii Medycznej, ul. Jagielloñska 4, 41-200 Sosnowiec; 2 Wojewódzki Szpital Specjalistyczny Nr 5 im. Œw. Barbary, ul. 3-Maja 33, 41-200 Sosnowiec Kierownik Katedry: prof. dr hab. Maria Wardas 4 Streszczenie Teofilina jest lekiem rozszerzającym oskrzela i stymulującym oddychanie, skutecznym w leczeniu astmy ostrej i przewlekłej, bezdechów noworodków, przewlekłej obturacyjnej chorobie płuc (POChP) i innych chorobach dolnych dróg oddechowych. Jest ona stosowana pomocniczo w leczeniu zastoinowej niewydolności serca i obrzęku ostrym. Podana dożylnie jest skuteczna w leczeniu stanów ostrych. Stężenie teofiliny w surowicy pomiędzy 10 a 20 mikrogramów/ml stabilizuje nadmiernie aktywne drogi oddechowe, charakterystyczne dla astmy. Celem pracy była ocena zmian aktywności dysmutazy ponadtlenkowej (SOD), peroksydazy glutationowej (GPx) i reduktazy glutationowej (GR) hepatocytów inkubowanych w podłożu Hepatocyte Medium z preparatem Theophyllinum (do wlewu dożylnego, zawierającego rozpuszczoną glukozę) lub z glukozą. Badania przeprowadzono na hepatocytach, izolowanych z wątrób szczurów metodą enzymatyczną z użyciem kolagenazy. Zaobserwowane zmiany aktywności oznaczanych enzymów zależały od stężenia preparatu Theophyllinum i od stężenia glukozy oraz od czasu trwania inkubowania. Zwiększone aktywności oznaczonych enzymów w hepatocytach były wynikiem obrony przeciw stresowi oksydacyjnemu, wywołanemu w komórkach przez teofilinę i glukozę. S³owa kluczowe: Theophyllinum, glukoza, hepatocyty, dysmutaza ponadtlenkowa, peroksydaza glutationowa, reduktaza glutationowa Abstract Theophylline is a bronchodilator and respiratory stimulant that is effective in treatment of acute and chronic asthma, apnea/bradycardia episodes in newborns, chronic obstructive lung disease (COPD) and in other lower airways diseases. It is also used as an adjunct in the treatment of congestive heart failure and acute oedema. Intravenous is appropriates for acute therapy. Serum theophylline concentrations between 10 and 20 micrograms/ml stabilise the hyperactive airways that characterise asthma. The aim of this works was estimation of changes in activity of superoxide dismutase (SOD), glutathione peroxidase (GPx) and glutathione reductase (GR) in hepatocytes incubated in Hepatocyte Medium with drug, which was Theophyllinum (for intravenous infusion; it contains diluting glucose) or with glucose. The studies were realised on hepatocytes isolated from the rat livers by the enzymatic method with collagenase. The observed changes of activity assayed enzymes were dependent on concentration of the Theophylline or concentration of glucose and on incubation time also. The highest activities assayed enzymes into hepatocytes were the result of defence against oxidative stress induced by teophylline and glucose into cells. Key words: Theophylline, glucose, hepatocytes, Superoxide Dismutase, Glutathione Peroxidase, Glutathione Reductase
Wstêp Preparaty teofiliny są lekami stosowanymi u chorych na astmę o ciężkim przebiegu z koniecznością hospitalizacji i wentylacji mechanicznej, w chorobach przebiegających z hipowentylacją (między innymi bezdechy noworodków [1]), w zespole bezdechu nocnego [2, 3], w przypadku astmy z przewagą napadów nocnych, a także w łagodnych postaciach astmy, w przewlekłej obturacyjnej chorobie płuc (POChP), w przewlekłym zapaleniu oskrzeli oraz rozedmie płuc [4,5,6,7,8]. Preparaty teofiliny działają głównie rozkurczająco na mięśnie gładkie oskrzeli i przeciwzapalnie na układ oddechowy. Korzystne działanie teofiliny w astmie polega na pobudzaniu oddychania, zwiększeniu kurczliwości przepony i poprawie oczyszczania śluzowo-rzęskowego [9]. Jako nieselektywny inhibitor fosfodiesterazy oraz antagonista receptorów adenozynowych rozkurcza mięśnie gładkie dróg oddechowych [4], zmniejsza przepuszczalność naczyń i poprawia przepływ nerkowy [10]. Wykazano też jej korzystny wpływ na wymianę gazową w płucach, zwiększenie ciśnienia cząstkowego tlenu, zmniejszenie ciśnienia dwutlenku węgla i zwiększenie utlenowania krwi tętniczej, zwłaszcza u chorych z zaawansowanymi zmianami obturacyjnymi [4], a także zmniejszenie dobowej zmienności pojemności wydechowej pierwszosekundowej (FEV 1 ) [4,11]. Poza bezpośrednim działaniem rozkurczającym na mięśnie gładkie układu oddechowego, w małych stężeniach (5-10mg/ dm 3 ) teofilina działa także przeciwzapalnie i immunomodulujaco [4,11,12]. Optymalne działanie lecznicze, z możliwym do przyjęcia ryzykiem działań niepożądanych, występuje przy stężeniu teofiliny w osoczu krwi wynoszącym 10-20 mg/dm 3. Jednym ze stosowanych w lecznictwie preparatów teofiliny jest jej roztwór do wlewu dożylnego pod nazwą Theophyllinum, w którym substancją dodatkową jest glukoza. Celem pracy była ocena wpływu preparatu Theophyllinum oraz zawartej w nim glukozy, o stężeniu identycznym jak w preparacie Theophyllinum, na homeostazę oksydacyjną hepatocytów. Założony cel realizowano poprzez ocenę zmian aktywności dysmutazy ponadtlenkowej, peroksydazy glutationowej i reduktazy glutationowej w hepatocytach inkubowanych in vitro. Zak³ócenie homeostazy oksydacyjnej hepatocytów... Materia³ i metody Badania przeprowadzono na hepatocytach izolowanych metodą enzymatyczną [13] z wątrób trzymiesięcznych szczurów szczepu Wistar, pochodzących z Centralnej Zwierzętarni Śląskiej Akademii Medycznej. Na przeprowadzenie badań uzyskano zgodę Środowiskowej Komisji Bioetycznej. Żywotność komórek oceniono po ich wybarwieniu błękitem trypanu i zliczeniu pod mikroskopem o komorze hematologicznej typu Fuchs-Rosenthal [14]. Do dalszych badań przeznaczono preparaty zawierające nie mniej niż 95% żywych komórek. Następnie hepatocyty inkubowano w podłożu Hepatocyte Medium (Sigma) z dodatkiem preparatu Theophyllinum roztwór do wlewu dożylnego (Baxter Terpol Sp. z o.o.) o stężeniach teofiliny 12,0mg/dm 3 lub 20,0mg/dm 3 podłoża oraz z dodatkiem glukozy o stężeniach 540mg/dm 3 lub 900mg/dm 3 podłoża. Próbami kontrolnymi były hepatocyty inkubowane w podłożu z dodatkiem 0,9% NaCl. Próby inkubowano w inkubatorze (typ BB-16, firmy Heraeus) w atmosferze 5% CO 2, w temperaturze 37 o C. Czas inkubowania wynosił: 30, 60, 120 i 180 minut. Po odpowiednim czasie inkubowania w homogenatach komórkowych oznaczono aktywność dysmutazy ponadtlenkowej (SOD), peroksydazy glutationowej (GPx) i reduktazy glutationowej (GR) oraz stężenie białka. Oznaczenia enzymatyczne wykonano w termostatowanej kuwecie (w temp. 37 o ) na spektrofotometrze UV-VIS (Unicam) z wykorzystaniem zestawów testowych firmy Randox, w których oznaczanie aktywności dysmutazy ponadtlenkowej jest oparte o metodę opisaną przez Beauchamp a i Fridovich a [15], aktywności peroksydazy glutationowej jest oparte o metodę opisaną przez Paglia i Valentine [16], a reduktazy glutationowej o metodę Goldberg a i Sponer a [17]. Stężenie białka w próbach oznaczano zmodyfikowaną metodą Lowry [18]. Oznaczone aktywności enzymów przeliczono na gram białka komórkowego. Analiza statystyczna Obliczenia statystyczne wykonano używając komputer z procesorem Intel Celeron D315 2,4GHz. Bazę danych wyników utworzono w arkuszu kalkulacyjnym Microsoft Excel, a obliczenia matematyczne (w tym statystyczne) wykonano w arkuszu kalkulacyjnym Microsoft Excel i programie Statistica for Windows ver.6.1. Istotność statystyczną różnic między grupami oceniono testem istotności (test t Studenta) dla prób niezależnych. Wnioskowano przy założeniu: p>0,05 brak znamienności statystycznej, a p<0,05 znamienność statystyczna. Wyniki W przeprowadzonym eksperymencie stężenie preparatu Theophyllinum w pożywce inkubacyjnej hepatocytów było zbliżone do stężenia w surowicy krwi ludzi poddanych leczeniu preparatem. Stężenie glu- 5
Zak³ócenie homeostazy oksydacyjnej hepatocytów... kozy w pożywce inkubacyjnej odpowiadało stężeniu glukozy w preparacie Theophyllinum dodawanym do pożywki. Uzyskane wyniki, dotyczące zmian aktywności dysmutazy ponadtlenkowej (SOD) i reduktazy glutationowej (GR) w hepatocytach w ciągu 180 minut trwania eksperymentu wykazują w odniesieniu do kontroli jedno wspólne podobieństwo, polegające na narastaniu aktywności wyżej wymienionych enzymów do 120 minuty eksperymentu, a następnie łagodne obniżenie aktywności w przypadku dysmutazy ponadtlenkowej i stosunkowo gwałtowne w przypadku reduktazy glutationowej (ryc.1 i ryc.3). Charakter zmian aktywności peroksydazy glutationowej (GPx) jest zbliżony do zmian obserwowanych dla dysmutazy glutationowej i reduktazy glutationowej, za wyjątkiem znacznego obniżenia aktywności po 30 minutach inkubowania, czego nie obserwowano w przypadku dysmutazy ponadtlenkowej i reduktzay glutationowej. Nasilenie zmian aktywności wszystkich trzech enzymów było inne dla preparatu Theophyllinum i inne dla glukozy, a zależało od stężeń obu substancji. Zmiany aktywnoœci dysmutazy ponadtlenkowej (SOD) Po 30 minutach inkubowania obecność w pożywce glukozy o wyższym stężeniu powodowała wzrost aktywności enzymu o około 15%, natomiast obecność preparatu Theophyllinum powodowała obniżenie aktywności dysmutazy ponadtlenkowej odpowiednio do stosowanych stężeń o około 9% i 15% (ryc.1). Po 60, 120 i 180 minutach inkubowania obecność w pożywce glukozy, niezależnie od stosowanego stężenia, powodowała wzrost aktywności dysmutazy ponadtlenkowej od 18% do 27%. Obecność w podłożu preparatu Theophyllinum powodowała w hepatocytach systematyczny wzrost aktywności SOD i to intensywniejszy (aż do około 77% po 120 minutach) w przypadku niższego stężenia preparatu (ryc. 1). 6 Nr 7-8/2007 Zmiany aktywnoœci peroksydazy glutationowej (GPx) Po 30 minutach inkubowania, zarówno obecny w pożywce preparat Theophyllinum, jak i glukoza o wyższym stężeniu obniżyły aktywność peroksydazy glutationowej prawie o połowę w porównaniu z oznaczoną w hepatocytach kontrolnych. Wydłużenie czasu inkubowania komórek do 60 minut powodowało (w porównaniu z kontrolą) kilkunastoprocentowy wzrost aktywności enzymu, zarówno w hepatocytach inkubowanych w obecności glukozy, jak i w obecności preparatu Theophyllinum. Po 120 minutach inkubowania nastąpił bardzo intensywny wzrost aktywności GPx w hepatocytach - odpowiednio dla niższego stężenia glukozy o około 89%, a dla wyższego o około 67%, zaś dla preparatu Theophyllinum odpowiednio o około 145% i 121%. Wydłużenie czasu inkubowania komórek do 180 minut spowodowało (w porównaniu do inkubowania przez 120 minut) znaczne obniżenie aktywności GPx, aczkolwiek była ona jeszcze o kilkadziesiąt procent wyższa od aktywności oznaczonej w komórkach kontrolnych (ryc.2). Zmiany aktywnoœci reduktazy glutationowej (GR) Podobnie jak w przypadku dysmutazy ponadtlenkowej i peroksydazy glutationowej, aktywność reduktazy glutationowej w hepatocytach po 30 minutach ich inkubowania w obecności glukozy i preparatu Theophyllinum wykazała nieznaczne zmiany (ryc.3), a inkubowanie odpowiednio przez 60 i 120 minut wywołało sukcesywny wzrost aktywności reduktazy glutationowej w komórkach. Po 60 minutach obecność preparatu Theophyllinum w pożywce (niezależnie od jego stężenia) spowodowała około 28% wzrost aktywności reduktazy glutationowej w hepatocytach, zaś po 120 minutach aż o około 60% w przypadku niższego stężenia i o około 50% w przypadku wyższego stężenia. Obecność glukozy w pożywce także skutkowała wzrostem aktywności reduktazy glutationowej w hepatocytach po 60 minutach o około 5% w przypadku niższego stężenia i o około 17% w przypadku wyższego jej stężenia, zaś po 120 minutach odpowiednio o około 32% i aż o około 75%. Po 180 minutach inkubowania aktywność reduktazy glutationowej w hepatocytach gwałtownie zmalała i była zaledwie kilka procent wyższa od oznaczonej w komórkach kontrolnych (ryc.3). Dyskusja Teofilina, podobnie jak większość ksenobiotyków, jest metabolizowana w wątrobie, w której hepatocyty stanowią około 80% komórek, dlatego też jako model biologiczny w prezentowanej pracy wybrano hepatocyty. Na farmakokinetykę teofiliny w organizmie wpływa wiele czynników, między innymi te, które uszkadzają tkankę i zaburzają pracę narządu. Szereg z tych czynników nie jest istotnych dla badań prowadzonych na izolowanych hepatocytach, aczkolwiek mogą pojawić się nowe czynniki wynikające z faktu pozbawienia izolowanych komórek na przykład wzajemnego kontaktu, czy sterowania hormonalnego. Jednym z pierwszych objawów zakłócenia prawidłowego metabolizmu komórek jest naruszenie równowagi oksy-
Zak³ócenie homeostazy oksydacyjnej hepatocytów... Ryc. 1. Procentowe zmiany aktywności SOD w hepatocytach inkubowanych Fig.1. Percentage changes in activity of SOD in hepatocytes incubated with the Ryc. 2. Procentowe zmiany aktywności GPx w hepatocytach inkubowanych Fig. 2. Percentage changes in activity of GPx in hepatocytes incubated with the Ryc. 3. Procentowe zmiany aktywności GR w hepatocytach inkubowanych Fig.3. Percentage changes in activity of GR in hepatocytes incubated with the dacyjno-redukcyjnej, a w konsekwencji również energetycznej. Obecność glukozy w preparacie Theophyllinum, wprowadzonym do pożywki inkubacyjnej, może oczywiście modyfikować działanie samej teofiliny choćby dlatego, że glukoza jest głównym i szybko dostępnym źródłem energii dla komórek. Obserwowane zmiany aktywności oznaczonych enzymów w hepatocytach traktowanych preparatem Theophyllinum i glukozą każdorazowo odnoszono do aktywności oznaczonej w komórkach kontrolnych, a zatem stwierdzone podczas prowadzonych badań zmiany aktywności badanych enzymów, zarówno w obecności preparatu Theophyllinum, jak i samej glukozy, wskazują jedno- 7
Zak³ócenie homeostazy oksydacyjnej hepatocytów... znacznie na ingerencję obu substancji w homeostazę oksydacyjną komórek. Obserwowany po 30 minutach eksperymentu niewielki spadek aktywności wszystkich trzech enzymów w hepatocytach traktowanych preparatem Theophyllinum, w porównaniu z kontrolą, należy przypisać działaniu teofiliny obecnej w preparacie, przy czym w stosunku do SOD i GPx efekt ten nasila się dla teofiliny o wyższym stężeniu. Ponieważ obecność glukozy w pożywce, w porównaniu do kontroli, nasila aktywność SOD, dlatego też obserwowany efekt działania preparatu Theophyllinum po 60 i 120 minutach jest działaniem wypadkowym obecnej w preparacie teofiliny i glukozy. Niewielki spadek aktywności SOD po 180 minutach, jak również obecny w tym czasie spadek aktywności GPx i GR są zapewne efektem obniżenia kondycji metabolicznej hepatocytów już dość długo przebywających w warunkach in vitro. Wyniki dotyczące oznaczania aktywności GPx w hepatocytach inkubowanych z badanymi związkami korespondują z poziomem aktywności SOD, ponieważ produkt reakcji katalizowanej przez SOD, tzn. nadtlenek wodoru (H 2 O 2 ) jest substratem dla reakcji katalizowanej przez GPx. Zatem spadek aktywności SOD skutkuje spadkiem aktywności GPx. W świetle przedstawionych powyżej obserwacji można przypuszczać, że ani teofilina zawarta w preparacie Theophyllinum, ani glukoza nie wpływają na aktywność GPx poprzez ingerencję w metabolizm glutationu. Potwierdzają to również zmiany aktywności reduktazy glutationowej, które w zasadzie korespondują ze zmianami SOD i GPx. Wnioski Efekt wywołany preparatem Theophyllinum był konsekwencją obecności w pożywce zarówno teofiliny, jak i glukozy. Uzyskane wyniki pozwalają na stwierdzenie, że teofilina zawarta w preparacie Theophyllinum i glukoza wywołują w hepatocytach inkubowanych in vitro określony stres oksydacyjny, czemu komórki usiłują przeciwdziałać uruchamiając system antyoksydacyjny, jakim były zmiany aktywności komórkowych enzymów antyoksydacyjnych. 8 Nr 7-8/2007 Piœmiennictwo 1. Łoniewska B.: Zastosowanie teofiliny pod kontrolą monitorowania jej stężenia we krwi u noworodków przedwcześnie urodzonych, w czasie odzwyczajania ich od mechanicznej wentylacji. Probl. Ter. Monitor., 2000; 11: 97-105. 2. Kassur-Siemiańska B., Milewska-Bobula B., Domeńska H., Idzik M., Bauer A., Marciński P., Dunin-Wąsowicz D., Lipka B., Migdał M.: Wyniki leczenia dzieci z dysplazją oskrzelowo-płucną -doświadczenia własne. Pediat. Pol., 2001; 76: 771-776. 3. Kurzawa R., Doniec Z.: Zasady przewlekłego leczenia farmakologicznego astmy oskrzelowej u dzieci. Pulmonol., 1995; 4: 26-31. 4. Chazan R.: Rola teofiliny w leczeniu chorych na astmę. Medipress Chor. Ukł. Oddech., 1996; 1: 6-13. 5. Fromm R.E., Varon J.: Nagłe zaostrzenie choroby obturacyjnej płuc. Med. Dypl., 1995; 4: 51-59. 6. Jacobs M.: Leczenie podtrzymujące obturacyjnej choroby płuc. Med. Dypl., 1995; 4: 41-49. 7. Rogala B.: Teofilina w leczeniu chorób bronchoobturacyjnych. Wiad. Lek., 1998; 51 (3/4): 117-121. 8. Zieliński J.: Przewlekła obturacyjna choroba płuc (PO- CHP). Gab. Pryw., 2001; 4: 57-62. 9. Droszcz W.: Rola teofiliny w astmie. Pneumon. Alergol. Pol., 1999; supl. 1.: 57-61. 10. Bochenek G., Kryj-Radziszewska E.: Współczesne poglądy na temat leczenia astmy oskrzelowej u dorosłych. Prob. Med. Rodz., 1999; 1: 33-38. 11. Zawadzka- Krajeńska A.: Teofilina w leczeniu astmy oskrzelowej. Nowa Pediatr., 1999; 3: 22-27. 12. Sulivan P., Songul B., Jaffar Z., Page C., Jeffery P., Costello J.: Anti- inflammatory effects of low-dose oral theophylline in atopic asthma. Lancet, 1994; 343: 1006-1008. 13. Seglen P.O.: Preparation of isolated rat liver cells. Methods Cell. Biol., 1976; 13: 29-83. 14. Page R.A., Stowel K.M., Hardman M.J., Kitson K.E.: The assessment of viability in isolated rat hepatocytes. Anal. Biochem., 1992; 200: 171-175. 15. McCord J.M., Fridovich I.: Superoxide dismuthase. An enzymatic function for erythrocuprein (hemocuprein). J. Biol. Chem., 1969; 244: 6049-6055. 16. Paglia D.E., Valentine W.N.: Studies on the quantitative and qualitative characterization of erythrocyte glutathione peroxidase. Lab. Clin. Med., 1967; 70: 158-167. 17. Goldberg D.M., Sponer R.J.: Methods of enzymatic analysis. Bergmeyen, H.V.Ed 3 rd edn. Verlog Chemie, Deerfield Beach, Fl., 1983; 3: 258-265. 18. Wang C.S., Smith R.L.: Lowry determination of protein in the presence of Triton X-100. Anal. Biochem., 1975; 63: 414-417.