138 Probl Hig Epidemiol 2014, 95(1): 138-142 Ocena aktywności przeciwutleniającej prób kakao dostępnego na rynku Evaluation of the antioxidant activity of cocoa samples available on the market Joanna Kobus-Cisowska, Ewa Flaczyk, Marzanna Hęś, Dominik Kmiecik, Małgorzata Kobus-Moryson, Monika Przeor Katedra Technologii Żywienia Człowieka, Uniwersytet Przyrodniczy w Poznaniu Cel pracy. Ocena i porównanie aktywności przeciwutleniającej w próbach kakao dostępnego na rynku detalicznym. Materiał i metody. W ekstraktach wodnych oraz wykonanych z użyciem octanu etylu oznaczono ogólną zawartość polifenoli oraz określono aktywność przeciwrodnikową w testach z DPPH i ABTS. Wyniki. Stwierdzono, że ekstrakty wodne kakao zawierały około 30-krotnie więcej polifenoli. Ponadto, wykazano wyższą aktywność przeciwrodnikową ekstraktów wodnych w porównaniu z ekstraktami otrzymanymi z użyciem octanu etylu co było skorelowane z zawartością polifenoli. Słowa kluczowe: kakao, przeciwutleniacze, wolne rodniki, polifenole Probl Hig Epidemiol 2014, 95(1): 138-142 www.phie.pl Nadesłano: 26.07.2013 Zakwalifikowano do druku: 23.02.2014 Aim. To evaluate and compare the antioxidant activity of cocoa available on the retail market. Material & methods. In the aqueous and ethyl acetate extracts of cocoa, the total content of polyphenols and the antioxidant activity with the DPPH and ABTS test were determined. Results. It has been found that aqueous extracts of cocoa contain about 30 times more polyphenols. Moreover, the aqueous extracts possess higher antioxidant activity in comparison with the ethyl acetate extracts, which was correlated with the content of polyphenols. Key words: cocoa, antioxidants, free radicals, polyphenols Adres do korespondencji / Address for correspondence Małgorzata Kobus-Moryson Katedra Technologii Żywienia Człowieka, Uniwersytet Przyrodniczy w Poznaniu ul. Wojska Polskiego 31, 60-624 Poznań, tel. 61 848 73 07, e-mail: joanna.kobus@up.poznan.pl Wprowadzenie i cel badań Kakao stanowi osobną grupę wyrobów cukierniczych i jest otrzymywane poprzez rozdrobnienie półproduktu kuchu kakaowego. Dla tego celu nasiona kakaowca, nazywane ziarnem, poddaje się fermentacji, uszlachetnianiu, suszeniu, a następnie miażdżeniu [1, 2]. Efektem końcowym jest miazga kakaowa, z której po usunięciu części tłuszczu otrzymuje się kuch kakaowy. Ustawodawstwo dopuszcza występowanie w handlu kakao pełnotłustego, zawierającego ponad 20% tłuszczu; tłustego, w którym tłuszcz stanowi 15-20% oraz kakao tzw. niskotłuszczowego. Aktualnie najbardziej popularne na rynku jest kakao niskotłuszczowe, występujące pod nazwą kakao, w którym tłuszcz stanowi 8-15%. Inne przetwory zawierające miazgę kakaową lub kakao to czekolady, słodycze i wyroby cukiernicze [3]. Kakao i inne produkty pochodzące z ziarna kakaowego wnoszą z dietą znaczne ilości naturalnych przeciwutleniaczy, głównie polifenoli. Uważa się, że polifenole stanowią około 12-18% całkowitej masy suszonego ziarna kakaowego [4, 5]. Najważniejsze grupy polifenoli ziarna kakaowego to kwasy fenolowe, w tym kwas chlorogenowy i flawonoidy. Wśród tych ostatnich dominują flawanole, głównie katechiny i epikatechiny oraz proantocyjanidyny, czyli oligomery katechin i epikatechin. Uważa się, że flawonoidy stanowią około 10% suchej masy proszku kakao [6, 7]. Wiele badań klinicznych wskazuje na kardioochronne działanie kakao jako źródła związków o charakterze przeciwutleniającym. Wykazują one korzystny wpływ na prawidłową funkcję śródbłonka naczyń krwionośnych, zapobiegają procesom zapalnym i zakrzepowym, prowadzącym do rozwoju miażdżycy [7]. Jednakże kakao może być otrzymywane z ziarna kakaowego różnego pochodzenia, ze względu na różnorodność odmian, warunki klimatyczne i odmienne warunki pozyskania miazgi kakaowej. W związku z tym kakao występujące w handlu może różnić się pod względem zawartości polifenoli i ich aktywności przeciwutleniającej. Dlatego też w pracy postanowiono ocenić ogólną zawartość związków polifenolowych oraz aktywność przeciwutleniającą ekstraktów wodnych i otrzymanych z użyciem octanu etylu wybranych prób kakao.
Kobus-Cisowska J iwsp. Ocena aktywności przeciwutleniającej prób kakao dostępnego na rynku 139 Materiał i metody Materiałem do badań było kakao, dostępne w hurcie jako dodatek do produkcji żywności Cargill (producent Cargill Poland Sp. z o.o.), oraz kakao nabyte w sieci detalicznej: Baroque (producent Gellwe Sp. z o.o) Deco Moreno (producent MASPEX GMW Sp. z o.o.) i oznaczono je odpowiednio jako próby A, B i C. Charakterystykę kakao przedstawiono w tabeli I. Ekstrakcja wodny (oznaczony jako W) W kolbie stożkowej odważono 2,5 g odtłuszczonej i wysuszonej próby proszku kakao i ekstrahowano z 50 ml wody o temp. 95 C. Wykonano ekstrakcję przez 15 minut, następnie dekantację, dodano kolejne 50 ml wody o temp. 95 C, powtarzając czynności. W sumie dokonano 2-krotnej ekstrakcji tak, aby uzyskać 100 ml danego ekstraktu. z użyciem octanu etylu (oznaczony jako E) W kolbie stożkowej odważono 2,5 g odtłuszczonej i wysuszonej próby proszku kakao i zadano 40 ml octanu etylu. Wykonano ekstrakcję 15 minut w temperaturze pokojowej, następnie dekantację, dodano kolejne 30 ml octanu etylu, powtarzając czynności. W sumie dokonano 3-krotnej ekstrakcji tak, aby uzyskać 100 ml danego ekstraktu. W ekstraktach oznaczono ogólną zawartość związków redukujących posługując się metodą opisaną przez [8]. Zasada metody polegała na spektrofotometrycznym pomiarze absorbancji barwnego kompleksu przy długości fali 765 nm, powstałego w wyniku reakcji grup fenolowych z odczynnikiem Folina-Ciocalteau (Metertek SP-830, Tajwan). Określono także potencjał antyoksydacyjny ekstraktów wykorzystując w tym celu metodę z rodnikami DPPH opisaną przez Amarowicza i in. [9]. Zasada metody polegała na spektrofotometrycznym pomiarze absorbancji (Metertek SP-830, Tajwan) roztworu zawierającego wolne rodniki generowane przez metanolowy roztwór 1,1-difenylo-2-pirylohydrazyl (DPPH), mierzonej przy długości fali 517 nm po 30 minutowej inkubacji w temperaturze pokojowej bez dostępu światła. Wykonano także ocenę aktywności przeciwutleniającej z rodnikiem ABTS. Metoda ta polegała na redukcji barwnego kationorodnika ABTS [2,2 -azynobis (3-etylobenzotiazolino-6-sulfonian)] przez obecne przeciwutleniacze w badanych ekstraktach i spektrofotometrycznym (Metertek SP-830, Tajwan) pomiarze zmian stężenia kationorodnika ABTS [2,2 -azynobis (3-etylobenzotiazolino-6-sulfonian)], po 6 minutach w temperaturze 30 C, przy długości fali 734 nm [10]. Wszystkie analizy wykonano w trzech równoległych powtórzeniach, a otrzymane wyniki poddano analizie statystycznej, wykorzystując w tym celu jednoczynnikową analizę wariancji ANOVA oraz test post-hoc Tuckey a na poziomie istotności p=0,05. Stosowano program Statistica 6,0 firmy StatSoft. Czystość wszystkich zastosowanych odczynników chemicznych odpowiadała wymogom analitycznych ilościowych i preparatywnych metod stosowanych w pracy. Wyniki i omówienie Całkowitą zawartość związków fenolowych przeliczono na kwas ferulowy, a wyniki przedstawiono w tabeli II. Zarówno ekstrakty wodne jak i wykonane z użyciem octanu etylu były źródłem polifenoli, przy czym w ekstraktach wodnych zawartość ich oznaczono na ponad trzydziestokrotnie wyższym poziomie. Spośród badanych kakao najwięcej związków fenolowych oznaczono w próbie B (8673,69 mg/100 g s.m. ekstraktu), następnie A i C, odpowiednio 7946,63 i 7989,09 mg/100 g s.m. ekstraktu. Stwierdzono zróżnicowanie zawartości polifenoli w ekstraktach wykonanych z użyciem octanu etylu najwyższą zawartością charakteryzowała się próba B (263,23 mg/100 g s.m. Tabela I. Charakterystyka kakao Table I. Characteristics of cocoa samples Oznaczenie /Index Zawartość tłuszczu [%] /Fat content [%] 10,4 11 7,5 Białko /Protein 25,1 27,8 26,5 Popiół /Ash 11,48 10,79 11,13 Wartość ph /ph value 7,40 7,37 7,51 Rozdrobnienie [%] /Grinding [%] 99,9 99,5 99,7 Zawartość wody [%] /Water content [%] 3,4 3,4 3,8 Ogólna liczba drobnoustrojów /Total number of micro-organisms 300 CFU/GM 300 CFU/GM 300 CFU/GM Pleśnie CFU/GM /Mould CFU/GM poniżej 10 poniżej 10 poniżej 10 Drożdże CFU/GM /Yeast CFU/GM poniżej 10 poniżej 10 poniżej 10 Enterobakterie /Enterobacteria nieobecne nieobecne nieobecne E. coli w 1 gr /E. coli in 1 gram nieobecne nieobecne nieobecne Salmonella w 750 gr /Salmonella in 750 gram nieobecne nieobecne nieobecne
140 Probl Hig Epidemiol 2014, 95(1): 138-142 ekstraktu), natomiast na podobnym poziomie związki te występowały w próbach A i C, odpowiednio 251,64 i 246,72 mg/100 g s.m. ekstraktu. Tabela II. Ogólna zawartość związków fenolowych w ekstraktach wodnych i wykonanych z użyciem octanu etylu wyrażona w mg kwasu ferulowego/100 g s.m. ekstraktu Table II. Total content of phenolic compounds in the aqueous and ethyl acetate extracts, expressed in mg of ferulic acid/100 g d.m. extract 7949,63 aa ±159,09 251,64 ab ±11,69 8673,69 ba ±120,05 263,23 ab ±12,16 7989,09 aa ±200,57 246,72 ab ±11,32 Na podstawie przeprowadzonej analizy statystycznej stwierdzono, że rodzaj użytego rozpuszczalnika wpływał na ekstrakcję związków fenolowych-ekstrakty wodne zawierały ich statystycznie istotnie więcej. Ponadto nie stwierdzono istotnego zróżnicowania pomiędzy zawartością związków fenolowych w ekstraktach E badanych prób kakao, a spośród ekstraktów W statystycznie najwięcej związków fenolowych znajdowało się w próbie B. Wyższa zawartość związków fenolowych w ekstraktach wodnych, wynikała z polarności użytych rozpuszczalników [11]. W wodzie rozpuszcza się większość polifenoli obecnych w kakao. Polifenole kakao były przedmiotem również innych badań. Kowalska i Sidorczuk [12] oznaczali całkowitą zawartość związków fenolowych w ekstrakcie otrzymanym z ziaren kakaowych, wykorzystując metodę z odczynnikiem Folina-Ciocalteu. Wykazano, że ziarna kakaowe charakteryzowały się wysoką zawartością polifenoli (około 2234,27 mg/100 g produktu). Z kolei Jonfia-Essien i in. [13] analizowali całkowitą zawartość związków fenolowych w różnych odmianach ziarna kakaowego. Oznaczenia wykonano w ekstraktach metanolowych (70%). Wykazano, że wszystkie próby zawierały wysoką zawartość polifenoli ogółem w przeliczeniu na kwas ferulowy (około 70-80 mg/g próby). Całkowitą ich zawartość w ekstraktach wodnych i etanolowych kakao oznaczali także Othman i in. [14]. Otrzymane wyniki autorzy wyrazili w mg/g ekstraktu (w przeliczeniu na kwas ferulowy) i wykazali, że ekstrakty wodne badanych odmian ziaren kakaowych charakteryzowały się niższą zawartością polifenoli ogółem (około 0,01-0,055 mg/g ekstraktu) w porównaniu do ekstraktów etanolowych (około 0,08-0,011 mg/g ekstraktu). Uważa się, że nie tylko ziarno kakaowca jest bogatym źródłem polifenoli. Osman i in. [15] oznaczali ogólną zawartość związków fenolowych w młodych liściach kakaowca i odnosili ją do zawartości w zielonej herbacie. Wykazali, że młode liście kakaowca stanowiły lepsze ich źródło (28,4 mg/100 mg próby) w porównaniu do zielonej herbaty, która zawierała 17,3 mg/100 mg związków fenolowych. W pracy oznaczono aktywność ekstraktów kakao w układzie z rodnikiem DPPH. Metoda ta polegała na określeniu zdolności do wygaszania wolnych rodników z metanolowego roztworu DPPH przez badane ekstrakty [16]. Uzyskane wyniki wyrażono jako aktywność w przeliczeniu na mm Troloxu/100 g s.m. ekstraktu i przedstawiono w tabeli III. Tabela III. Zdolność zmiatania rodnika DPPH przez ekstrakty wodne i wykonane z użyciem octanu etylu wyrażona w mm Troloxu/100 g s.m. ekstraktu Table III. DPPH radical scavenging ability of the aqueous and ethyl acetate extracts expressed in mm Troloxu/100g d.m. extract 13,48 aa ±0,04 16,75 ba ±0,07 12,56 ca ±0,03 6,37 ab ±0,05 5,58 bb ±0,08 5,41 cb ±0,07 Najwyższą zdolność neutralizowania rodników stwierdzono dla ekstraktu wodnego kakao B (16,75 mm Troloxu/100 g s.m. ekstraktu), a najniższą dla kakao C (12,56 mm Troloxu/100 g s.m. ekstraktu). Natomiast w przypadku ekstraktów wykonanych z użyciem octanu etylu największą zdolnością charakteryzowało się kakao A (6,37 mm Troloxu/100 g s.m. ekstraktu). Analiza statystyczna wykazała istotne różnice pomiędzy aktywnością przeciwutleniającą badanych prób, zarówno w zależności od użytego rozpuszczalnika jak i badanej próby. Przeprowadzono analizę korelacji i stwierdzono statystycznie istotną zależność korelacyjną pomiędzy zawartością polifenoli a zdolnością zmiatania rodnika DPPH (r=0,90; p 0,05), podczas gdy w ekstraktach wykonanych z użyciem octanu etylu korelacja ta nie była istotna. Szereg związków fenolowych obecnych w kakao w większym stopniu rozpuszczał się w polarnym rozpuszczalniku, jakim była woda. Stąd ekstrakty te posiadały wyższą aktywność przeciwrodnikową. Z drugiej strony na aktywność przeciwutleniającą miała wpływ prawdopodobnie ogólna ilość związków polifenolowych, jak i przede wszystkim proporcja występowania poszczególnych grup w ogólnej puli tych substancji. W pracy nie frakcjonowano ekstraktów, stąd można się tylko spodziewać, że w największym stopniu na uzyskany efekt z rodnikiem DPPH wpłynę-
Kobus-Cisowska J iwsp. Ocena aktywności przeciwutleniającej prób kakao dostępnego na rynku 141 ła obecność antocyjanów i tanin, które mają największe powinowactwo do wody, a następnie flawonole. Kowalska i Sidorczuk [12] oznaczali zdolność zmiatania rodników DPPH przez ekstrakt acetonowy kakao, wyniki wyrazili w % zmiatania. Otrzymany ekstrakt zmiatał 90% rodników, a jego dziesięciokrotne rozcieńczenie około 70%. Aktywność wobec rodników ekstraktu acetonowego kakao była wysoka i podobna do półfermentowanych herbat Oolong (70%) i Pu-erh (67,5%) [18]. Othman i in. [14] wykazali, że zarówno ekstrakty wodne jak i etanolowe z kakao charakteryzowały się aktywnością przeciwrodnikową i zmiatały odpowiednio 70% i 80% rodników. Kulczak i in. [18] analizowali natomiast aktywność antyoksydacyjną z rodnikiem DPPH w produktach zawierających kakao. Spośród badanych prób, najwyższą zdolność zmiatania rodnika DPPH wykazywał koncentrat pasty deserowej kakaowej (5,33 mg Troloxu/g produktu). Wynikało to prawdopodobnie z wysokiej zawartości w paście kakaowej kakao składnika o dobrych właściwościach antyoksydacyjnych. W pracy oznaczano także aktywność przeciwutleniającą wobec kationorodnika ABTS. Uzyskane wyniki przedstawiono w tabeli IV i wyrażono jako aktywność Troloxu (mm Troloxu/100 g s.m. ekstraktu). Tabela IV. Zdolność zmiatania kationorodnika ABTS przez ekstrakty wodne i wykonane z użyciem octanu etylu wyrażona w mmtroloxu/100 g s.m. ekstraktu Table IV. ABTS radical scavenging ability of the aqueous and ethyl acetate extracts expressed in mm Troloxu/100g d.m. extract 591,26 aa ±1,59 578,80 ba ±0,99 389,55 ca ±1,50 6,32 abb ±0,22 11,02 ab ±0,58 4,29 bb ±0,42 Zarówno ekstrakty wodne jak i wykonane z użyciem octanu etylu badanych prób kakao charakteryzowały się zdolnością zmiatania kationorodnika ABTS. Aktywność przeciwrodnikowa badanych ekstraktów wodnych wynosiła od 389,55 dla próby C do 591,26 mm Troloxu/100 g s.m. ekstraktu dla próby A, a wykonanych z użyciem octanu etylu była niższa odpowiednio 4,29 w próbie C 11,02 mm Troloxu/100 g s.m. ekstraktu w próbie B. Nie stwierdzono istotnych statystycznie różnic pomiędzy zdolnością zmiatania ABTS przez kakao B i kakao A (6,32 mm Troloxu/100 g s.m. ekstraktu). Analiza statystyczna wykazała, że aktywność mierzona w układzie z ABTS była istotnie zróżnicowana i zależała od użytego rozpuszczalnika oraz próby kakao. Statystycznie istotnie większą aktywnością wobec tego rodnika charakteryzowały się ekstrakty wodne niż wykonane z użyciem octanu etylu. Stwierdzono dodatnią korelację pomiędzy zawartością związków fenolowych, a zdolnością do zmiatania kationorodnika ABTS (r=0,74; p 0,05). Aktywność przeciwutleniająca mierzona w testach wolnorodnikowych jest związana z zawartością polifenoli, co potwierdziły liczne badania, nie tylko dotyczące kakao, ale też zielonej herbaty, miłorzębu dwuklapowego, grzybów i wielu innych surowców [8, 11, 12,]. Kowalska i Sidorczuk [12] oceniali aktywność przeciwrodnikową ekstraktów ziarna kakaowego wyrażoną jako procent zmiatania kationorodnika ABTS. Najwyższym poziomem charakteryzowały się ekstrakty wyjściowe (procent zmiatania ABTS na poziomie 100%), ekstrakty o stężeniu 10% miały zdolność hamowania na poziomie około 95%, natomiast dla ekstraktu o stężeniu 1% zmiatanie rodników oznaczono na poziomie około 50%. Przedstawione wyniki wymagają z pewnością dalszych badań, a ich efekty mogą stanowić cenne wskazówki zarówno dla producentów żywności wykorzystujących kakao jak również dla badaczy z zakresu technologii żywności. Znajomość zmian aktywności przeciwutleniającej ekstraktów w zależności od użytego rozpuszczalnika i od jego polarności, a tym samym od zawartości związków fenolowych, jest ważnym zagadnieniem przy właściwym konstruowaniu preparatów przeciwutleniajacych, tym bardziej, że nie są to zależności prostolinijne. Podsumowanie 1. y wodne kakao zawierały ponad trzydzieści razy więcej związków fenolowych w porównaniu do ekstraktów otrzymanych z użyciem octanu etylu. Spośród badanych prób, najwięcej polifenoli ogółem zawierały ekstrakty kakao Baroque. 2. y kakao charakteryzowały się zróżnicowaną zdolnością zmiatania rodników DPPH oraz kationorodników ABTS. Wyższa aktywność przeciwrodnikowa ekstraktów wodnych wynikała z większej zawartości związków fenolowych. 3. Obecność polifenoli ogółem w ekstraktach kakao determinuje ich aktywność przeciwrodnikową. y stanowią nieznaną dotąd mieszaninę związków, co stwarza konieczność podjęcia dalszych badań nad ich składem. Praca zrealizowana w ramach projektu: POIG 01.01.02-00-061/09 Nowa żywność bioaktywna o zaprogramowanych właściwościach prozdrowotnych.
142 Probl Hig Epidemiol 2014, 95(1): 138-142 Piśmiennictwo / References 1. Świechowski C. Ziarno kakaowe pochodzenie, odmiany, gatunki. Prz Piek Cukier 2000, 1: 45-47. 2. Krotki M, Stoparczyk B. Właściwości przeciwutleniające kakao w zapobieganiu chorobom układu krążenia. Post Fitoter 2009, 1: 45-49. 3. Kania-Lentes P. Od ziarna kakaowego do czekolady. Prz Piek Cukier 2005, 10: 62-63. 4. Kawińska Z. Tabliczka czekolady. Med dla Ciebie 2007, 12: 18-19. 5. Rusconi M, Conti A. Theobroma cacao L., the food of the Gods: A scientific approach beyond myths and claims. Pharmacol Res 2010, 61: 5-13. 6. Jalil AM, Ismail A. Polyphenols in Cocoa and Cocoa Products: Is There a Link between Antioxidant Properties and Health. Mol 2008, 13: 2190-2219. 7. Steinberg FM, Bearden M, Keen C. Cocoa and chocolate flavonoids: Implications for cardiovascular health. J Am Diet Assoc 2003, 103: 215-223. 8. Cheung LM, Cheung P, Ooi V. Antioxidant activity and total phenolics of edible mushroom extracts. Food Chem 2003, 81: 249-255. 9. Amarowicz R, Naczk M, Shahidi F. Antioxidant activity of crude tannins of canola and rapeseed hulls. JAOCS 2000, 77: 957-961. 10. Re R, Pellegrini N, Proteggente A, et al. Antioxidant activity applying in improved ABTS radical cation decolorization assy. Free Radic Biol Med 1999, 26(9/10): 1231-1237. 11. Kobus J, Flaczyk E, Siger A, et al. Phenolic compounds and antioxidant activity of extracts of Ginkgo leaves. Eur J Lipid Sci Technol 2009, 111: 1150-1160. 12. Kowalska J, Sidorczuk A. Analysis of the effect of technological processing on changes in antioxidant properties of cocoa processed products. Pol J Food Nut. Sci 2007, 2: 95-99. 13. Jonfia-Essien WA, West G, Alderson PG, Tucker G. Phenolic content and antioxidant capacity of hybrid variety cocoa beans. Food Chem 2008, 108: 1155-1159. 14. Othman A, Ismail A, Ghani NA, et al. Antioxidant capacity and phenolic content of cocoa beans. Food Chem 2007, 100: 1523-1530. 15. Osman H, Nasarudin R, Lee SL. Extracts of cocoa (Theobroma cacao L.) leaves and their antioxidation potential. Food Chem 2004, 86: 41-46. 16. Kusznierewicz B, Wolska L, Bartoszek A i wsp. Metody oznaczania in vitro właściwości przeciwutleniających próbek żywności. Cz. I. Bromat Chem Toksykol 2006, 39(3): 251 260. 17. Fik M, Zawiślak A. Antioxidant activity of some selected teas a comparison. Żywn Nauk Technol Jakość 2004, 40: 98-105. 18. Kulczak M, Przygoński K, Jeżewska M i wsp. Właściwości antyoksydacyjne nowych koncentratów spożywczych z udziałem preparowanej fasolki kolorowej red kidney. Bromat Chem Toksykol 2008, 41(3): 293-297.