Borelioza z Lyme. Diagnostyka laboratoryjna, trudności i wyzwania

Forum Zakażeń 2013;4(4):223 Praca poglądowa Joanna M. Zajkowska Justyna Dunaj Borelioza z Lyme. Diagnostyka laboratoryjna, trudności i wyzwania Lyme borreliosis. Challenges and difficulties of laboratory diagnosis Klinika Chorób Zakaźnych i Neuroinfekcji Uniwersytetu Medycznego w Białymstoku }} Joanna M. Zajkowska, Klinika Chorób Zakaźnych i Neuroinfekcji, Uniwersytet Medyczny w Białymstoku, ul. Żurawia 14, 15-540 Białystok, Tel.: (85) 740 95 14, Fax: (85) 740 95 15, e-mail: zajkowsk@umb.edu.pl Wpłynęło: 29.07.2013 Zaakceptowano: 15.08.2013 Streszczenie: Rozpoznanie boreliozy z Lyme opiera się na rozpoznaniu klinicznym oraz immunoserologicznym potwierdzeniu zakażenia B. burgdorferi. Potwierdzenia laboratoryjnego nie wymaga jedynie wczesna postać boreliozy rumień wędrujący. Standardem diagnostycznym jest metoda dwustopniowa, polegająca na zastosowaniu testu o mniejszej swoistości i dużej czułości (ELISA lub EIA), a następnie wykonaniu testu metodą western blot (WB), immunoblot (IB) lub multiplex. Istotnym problemem klinicznym jest odsetek wyników dodatnich u osób klinicznie zdrowych, a także długie utrzymywanie się przeciwciał po zakończeniu leczenia i ustąpieniu objawów chorobowych. Testy bezpośrednie hodowla oraz metoda PCR (ang. polymerase chain reaction) mają liczne ograniczenia. Leczenie boreliozy zgodnie z obowiązującymi standardami trwa od 10 do 28 dni. W profilaktyce ważna jest rzetelna ocena ryzyka zachorowania. Słowa kluczowe: ELISA immunoblot laboratoryjna diagnostyka boreliozy PCR standardy diagnostyczne western blot Abstract: The diagnosis of Lyme disease is a combination clinical diagnosis with laboratory immunoserologic confirmation. Laboratory confirmation is not required in the form of erythema migrans. The diagnostic standard is it 2-tier testing. First it is use of a test that has less specificity and high sensitivity, ELISA or EIA, and then performing the test, western blot (WB), immunoblott (IB) or multiplex. Clinical problem is the percentage of positive results in healthy persons, and the persistence of the antibody after treatment and resolution of symptoms. Direct-culture tests and PCR (polymerase chain reaction) are numerous limitations. Treatment takes 10 to 28 days, in accordance with the accepted standards. Extremely important in preventive actions seem to reliably estimate the risk. Key words: diagnostic standards ELISA immunoblot laboratory diagnosis of Lyme boreliosis PCR western blot Wstęp Borelioza z Lyme jest bakteryjną chorobą zakaźną, przenoszoną na człowieka przez kleszcze z rodzaju Ixodes. W odróżnieniu od Ameryki Północnej, gdzie występuje przede wszystkim szczep Borrelia burgdorferi sesnu stricto (B. burgdorferi ss), w Eurazji za boreliozę jest odpowiedzialnych co najmniej 5 patogennych (spośród kilkunastu) genogatunków bakterii Borrelia burgdorferi, należących do Borrelia burgdorferi sensu lato complex, przez co obraz kliniczny choroby jest bardziej zróżnicowany. Spośród bakterii kompleksu Borrelia burgdorferi sensu lato (B. burgdorferi sl), krętki wywołujące boreliozę z Lyme to przede wszystkim B. burgdorferi ss, B. afzelii oraz B. garinii, a także według niektórych doniesień: B. valaisiana, B. lusitaniae, B. spielmanii oraz B. bissetti. Opisy kliniczne różnych postaci boreliozy są znane w Europie od niemal 100 lat, jednak dopiero 30 lat temu w Stanach Zjednoczonych Willy Burgdorfer zidentyfikował bakterię Borrelia burgdorferi oraz wskazał na związek zachorowań ludzi z pokłuciami przez zakażone kleszcze [1, 2]. Zebrane przez ten czas doświadczenia, a także dynamiczny rozwój metod diagnostycznych, wymiana doświadczeń oraz szeroki dostęp do informacji naukowej (bazy internetowe) pozwalają obecnie na zweryfikowanie opinii dotyczących boreliozy i zawężenie szerokiego wachlarza objawów z nią związanych, ponieważ do niedawna przypisywano jej niemal wszystkie możliwe symptomy (Tabela 1). Zaledwie niewielki procent ukąszeń przez kleszcze powoduje wystąpienie objawów chorobowych (Ryc. 1). Większość zakażeń jest bezobjawowa i eliminowana przez własne mechanizmy obronne, co pozostawia ślad w postaci swoistych przeciwciał. Tylewska i wsp. wykazali, że przeciwciała anty-borrelia są obecne nawet u 12% badanych zdrowych osób [3].

Forum Zakażeń 2013;4(4) Tabela 1. Postacie kliniczne europejskiej boreliozy z Lyme (opracowano wg [4]). Postać kliniczna Kliniczna definicja Potwierdzenie laboratoryjne istotne Rumień wędrujący Erythema migrans Ryc. 2 Chłoniak limfatyczny skóry Borrelial lymphocytoma Ryc. 3 Przewlekłe zanikowe zapalenie skóry kończyn Acrodermatitis chronica atrophicans Ryc. 4 Neuroborelioza Lyme neuroborreliosis Ryc. 5 Zapalenie stawu Lyme arthritis Ryc. 6 Objawy oczne Ocular manifestations Rozszerzający się czerwonawy rumień (>5 cm), nie unoszący skóry, ostro odgraniczony Niebolesne zgrubienie, zwykle na uchu, brodawce sutkowej lub mosznie Częściej występuje u dzieci Długo utrzymujące się zaczerwienienie i ścieńczenie skóry na wyprostnych częściach kończyn U dorosłych głównie objawy korzonkowe z zapaleniem opon; rzadko zapalenie mózgu, rdzenia; bardzo rzadko zapalenie naczyń mózgu Nawracający lub długo utrzymujący się obrzęk stawu obejmujący jeden lub kilka dużych stawów Obecność przeciwciał w surowicy Żadne Pojawienie się przeciwciał (z wyniku negatywnego na pozytywny) Pozytywny wynik serologiczny Wysokie wartości przeciwciał w klasie IgG w surowicy Obecność pleocytozy i wykazanie syntezy wewnątrzoponowej Wysokie miana przeciwciał Wcześniejsze lub współistniejące objawy boreliozy z Lyme Potwierdzenie laboratoryjne uzupełniające Wykrycie materiału genetycznego krętka metodą PCR lub w hodowli Histologiczne wykrycie krętków w hodowli lub/i PCR z biopsji skóry Histologiczne wykrycie krętków w hodowli lub/i PCR z biopsji skóry Hodowla lub PCR Wewnątrzoponowa synteza przeciwciał IgM lub/i IgG W wywiadzie współistniejący rumień wędrujący Badanie płynu stawowego Hodowla lub PCR z płynu stawowego lub tkanek okołostawowych Hodowla lub PCR z płynu Diagnostyka zakażenia Pomino stałego rozwoju i udoskonalania testów, diagnostyka laboratoryjna boreliozy z Lyme stanowi duże wyzwanie. Wynika to z wielu przyczyn, m.in.: występowania kilku różniących się antygenowo genogatunków bakterii wywołujących boreliozę, zmiany prezentowanych w trakcie zakażenia antygenów oraz zmienności antygenowej pojedynczych antygenów. Ponadto interpretację kliniczną utrudniają: długie utrzymywanie się odpowiedzi immunologicznej, brak standaryzacji obowiązujących testów oraz brak testu jednoznacznie związanego z aktywnym okresem choroby. Testy diagnostyczne są stale udoskonalane, jednak chronione patentami, co utrudnia ich standaryzację i porównywanie wyników uzyskanych w różnych ośrodkach zarówno diagnostycznych, jak i naukowych [4]. Do prawidłowego rozpoznania boreliozy wywołanej przez krętka Borrelia burgdorferi s.l. niezbędna jest zatem znajomość nie tylko obrazu klinicznego choroby, lecz także rodzajów stosowanych testów laboratoryjnych, ich właściwości oraz ograniczeń. Rozpoznanie boreliozy z Lyme opiera się na połączeniu rozpoznania klinicznego oraz immunoserologicznego potwierdzenia zakażenia B. burgdorferi. Laboratoryjnego potwierdzenia nie wymaga jedynie wczesna postać boreliozy rumień wędrujący (erythema migrans), którego charakterystyczny wygląd pozwala na jednoznaczne rozpoznanie. Ponadto gdy pojawia się erythema migrans, przeciwciała potwierdzające zakażenie mogą być jeszcze niewykrywalne w badaniu laboratoryjnym. Rumień w miejscu ukłucia przez kleszcza pojawia się około 3 4 dni po pokłuciu, a jego cechą wyróżniającą jest powiększanie się obwodu. W środku zmiany może występować przejaśnienie, które ma charakter homogenny lub składa się z koncentrycznych pierścieni (Ryc. 2). Niekiedy rumień przybiera bardzo duże rozmiary, opasując niemal cały tułów czy kończynę lub jest ukryty w owłosionej skórze głowy. Zmiana typu erythema migrans może utrzymywać się przez kilka miesięcy. Charakterystyczne dla niej jest rozszerzanie się, a następnie zanikanie przez stopniowe blednięcie w tych samych granicach. Rozpoznanie rumienia nie wymaga potwierdzenia badaniami laboratoryjnymi (także po zakończeniu leczenia). Diagnostyki laboratoryjnej wymagają jedynie rumienie o wyglądzie, który nasuwa wątpliwości. Potwierdzenie klinicznego rozpoznania boreliozy z Lyme Do właściwego rozpoznania i interpretacji wyników badań laboratoryjnych niezbędna jest znajomość nie tylko obrazu klinicznego choroby, lecz także parametrów diagnostycznych stosowanego testu. Diagnostyka laboratoryjna boreliozy polega na potwierdzeniu lub wykluczeniu udziału B. burgdorferi w zakażeniu. 244

Forum Zakażeń 2013;4(4) Ryc. 1. Kleszcz żerujący w skórze. Ryc. 3. Chłoniak limfatyczny skóry. Ryc. 2. Rumień wędrujący, różne postacie. Testy pośrednie Testy serologiczne opierają się na pomiarze stężenia swoistych przeciwciał przeciwko antygenom B. burgdorferi. Najczęściej stosuje się diagnostykę serologiczną i poszukuje się przeciwciał w surowicy lub płynie mózgowo-rdzeniowym (PMR). Test ELISA (ang. enzyme-linked immunosorbent assay) jest jednym z najpowszechniej stosowanych testów w badaniach biomedycznych zarówno naukowych, jak i diagnostycznych. Testów tych nie powinno się stosować do monitorowania leczenia boreliozy z Lyme, ponieważ u części zakażonych miano przeciwciał jest podwyższone przez wiele miesięcy, a nawet wiele lat po eliminacji bakterii [5 9]. Przyczynia się to często do postawienia błędnej diagnozy, a w następstwie do zlecenia pacjentowi zbędnej antybiotykoterapii. ELISA jest jednak najczęściej stosowaną metodą diagnostyczną, zalecaną jako badanie przesiewowe. Testy mogą być jakościowe, półilościowe i ilościowe. W testach wstępnych metodą ELISA wykorzystywana jest mieszanina antygenów pochodzących z jednego lub kilku genogatunków z hodowli, tzw. antygenów natywnych, wzbogaconych antygenami syntetyzowanymi, tzw. rekombinowanymi. Czułość testu jest tym większa, im szerszy zestaw gatunków B. burgdorferi wchodzi w skład antygenów testu [7]. ELISA jest z definicji testem bardzo czułym, jednak zakładającym nadrozpoznawalność, czyli względnie częste wyniki fałszywie dodatnie, które mogą być spowodowane także innymi niż zakażenie B. burgdorferi sytuacjami klinicznymi [5, 7, 8]. Standaryzacja oraz powtarzalność testów dotyczą jednego produktu (własnej jednostki producenta). Wiele 245

Forum Zakażeń 2013;4(4) Ryc. 4. Późna postać zmian skórnych (Acrodermatiitis chronica atrophicans). Ryc. 5. Porażenie nerwu twarzowego, jednostronne i obustronne w przebiegu neuroboreliozy. Ryc. 6. Lyme arthritis boreliozowe zapalenie stawu. wątpliwości wynika z faktu, że testy diagnostyczne opracowuje się na podstawie różnych zestawów antygenowych. Ze względu na heterogenność genogatunków i niejednakową konstrukcję testów oraz brak ich standaryzacji (podobny, ale niejednakowy skład antygenowy), mają one różne jednostki nadawane przez producenta (np.: U/ml, BBU/ml, AU/ml), a porównywanie otrzymywanych wyników różnych testów może prowadzić do rozbieżności i trudności interpretacyjnych. Metoda ELISA z założenia cechuje się nadrozpoznawalnością (duża czułość, mniejsza swoistość), a wynik testu otrzymuje się w postaci wartości liczbowej, sumującej wszystkie reakcje antygen przeciwciało, wychwycone przy użyciu danego testu. Po uzyskaniu dodatniego wyniku z zastosowaniem tej metody należy go potwierdzić przez oznaczenie przeciwciał przeciwko poszczególnym antygenom z wykorzystaniem metod: western blot, immunoblot lub multiplex. 246

Forum Zakażeń 2013;4(4) Testy western blot, immunoblot i multiplex W teście western blot mieszanina antygenów bakterii jednego lub kilku gatunków, wzbogacona antygenami rekombinowanymi, podlega rozdziałowi elektroforetycznemu, co pozwala na wyodrębnienie przeciwciał skierowanych przeciw pojedynczym antygenom uszeregowanym według ciężaru cząsteczkowego. W wyniku rozdziału elektroforetycznego lizatu całych komórek zidentyfikowano około 30 różnych pasm białkowych o różnym znaczeniu [8]. W teście immunoblot wybrane, istotne dla diagnostyki, antygeny zostały naniesione na wyznaczone pola na paskach, co znacznie ułatwia interpretację wyniku. Dodatkowo mogą zawierać antygeny istotne dla diagnostyki różnicowej, jak np. wirusa Epsteina-Barr (EBV) lub kiły [10]. Innowacją jest zastosowanie testów w technice multiplex, gdy badane jest stężenie przeciwciał przeciw pojedynczym wybranym antygenom równocześnie w technice innej niż wizualizacja prążków na paskach [11]. Wykazanie obecności przeciwciał przeciw pojedynczym swoistym antygenom potwierdza dodatni wynik badania metodą ELISA. Test oceniany jest wzrokowo przez porównanie z szablonem identyfikującym pola dla poszczególnych przeciwciał lub za pomocą skanera, który mierzy natężenie wysycenia porównywanych prążków. Wynik badania nie ma standaryzacji. Za wynik dodatni zaleca się uznawanie obecności co najmniej dwóch prążków w klasie IgM i trzech w klasie IgG, jednak nie ma identycznych zaleceń ze względu na brak standaryzacji stosowanych testów i zróżnicowane występowanie genogatunków Borrelii w poszczególnych rejonach świata [8]. Znaczenie antygenów w diagnostyce boreliozy z Lyme Wśród białek immunogennych B. burgdorferi, które generują przeciwciała w czasie zakażenia, zidentyfikowano liczną grupę białek pospolitych (dających reakcje krzyżowe z innymi krętkami, a nawet niespokrewnionymi bakteriami) oraz białka specyficzne, uznane za charakterystyczne dla Borrelia burgdorferi. Należy pamiętać, że szczepy laboratoryjne mogą się różnić od szczepów dzikich podlegających zmianom w czasie zakażenia [7, 9, 12]. Białka specyficzne są kluczowe dla rozpoznania. Istotne są również antygeny, tzw. in vivo, czyli takie, których nie ma w szczepach laboratoryjnych, a które pojawiają się dopiero w zakażonym kręgowcu (np. VlsE). Ważne są również komponenty białkowe o stałej masie molekularnej 41 kda (p41 lub flagellina) i 60 kda (HSP60) [8, 9, 12]. Obie wymienione grupy białek pospolicie występują w przyrodzie i w związku z tym często dają reakcje krzyżowe z innymi bakteriami. Obecność przeciwciał przeciwko nim, wraz z przeciwciałami przeciw antygenom swoistym, ma znaczenie w interpretacji uzyskanych wyników. Obecność przeciwciał skierowanych przeciw antygenowi p41 stanowi potwierdzenie odpowiedzi immunologicznej na kontakt z krętkami (brak tych przeciwciał przemawia za zakażeniem innym niż krętkowe) [9]. Inne często stwierdzane antygeny pospolite to: p66, p68, p71, p73 [8, 9]. Do białek specyficznych należą: OspA (31 kda), OspB (34 kda), OspC (21 24 kda), BmpA (p39), p93, p83/100, OspE (19 kda), OspF (26 kda). Białkiem, które zwiększyło jakość testów jest białko VlsE (C6) powierzchowna lipoproteina, która podlega antygenowej zmienności [7 9, 12]. Wysoko heterogenne białko VlsE zawiera konserwatywne epitopy, wspólne dla większości genogatunków. Znajomość właściwości poszczególnych antygenów i kolejności ich pojawiania się w trakcie zakażenia jest istotna dla interpretacji wyników badań wykonywanych metodą western blot lub immunoblot. Znaczenie klas swoistych przeciwciał w rozpoznaniu boreliozy z Lyme Przeciwciała IgM pojawiają się najwcześniej, utrzymują się długo, często są skierowane przeciwko flagelli, części zewnętrznej i wewnętrznej (41 kda) i występują wraz z poliklonalną aktywacją limfocytów B. Obecność izolowanych przeciwciał IgM nie powinna być podstawą rozpoznania późnej boreliozy, ponieważ przeciwciała mogą utrzymywać przez wiele miesięcy, często dając wyniki fałszywie dodatnie [5 9]. Odpowiedź immunologiczna w klasie IgG pojawia się po około 3 6 tygodniach od zakażenia [7, 10, 13]. Przeciwciała w klasie IgG towarzyszą zmianom narządowym i podlegają ewolucji w czasie reagują z coraz większą liczbą antygenów. Mogą nie zapobiegać reinfekcjom [6, 12]. Przeciwciała w klasie IgG mogą pozostawać wykrywalne po latach od klinicznej remisji choroby, nawet po wyleczeniu boreliozy. Są bardziej swoiste od przeciwciał klasy IgM [8 10]. Testy nieróżnicujące klasy przeciwciał nie są zalecane, z wyjątkiem testu, w którym użyto antygenu C6 [5, 8, 9]. Ze względu na wczesną serokonwersję przeciwciał z klasy M do G i dużą swoistość, test ten zyskał popularność w Stanach Zjednoczonych. Standardy w diagnostyce boreliozy z Lyme Standardem diagnostycznym jest metoda dwustopniowa, która polega na zastosowaniu w pierwszej kolejności testu o mniejszej swoistości i dużej czułości (ELISA lub EIA), a następnie wykonanie oznaczeń metodą potwierdzającą western blot, immunoblott lub multiplex. Wybór klasy przeciwciał We wczesnej fazie boreliozy można spodziewać się obecności przeciwciał w klasie IgM, natomiast w późnej przeciwciał w klasie IgG. Jeśli objawy chorobowe trwają kilka 247

Forum Zakażeń 2013;4(4) tygodni, oczekuje się serokonwersji przeciwciał z klasy IgM do klasy IgG. Diagnostyka boreliozy z Lyme, poza problemami ze znaczną heterogennością szczepów B. burgdorferi, stwarza również trudności interpretacyjne. Wyniki fałszywie ujemne Negatywny wynik badania serologicznego nie wyklucza choroby, szczególnie we wczesnej zlokalizowanej postaci zakażenia wyniki większości testów są ujemne (u około 50% badanych) [5, 10]. Leczenie antybiotykiem we wczesnym etapie może spowodować szybką eliminację antygenów, niską produkcję przeciwciał i brak możliwości wykrycia przeciwciał [5, 13]. Zatem negatywny wynik nie wyklucza wczesnej boreliozy, ponieważ próbkę surowicy można pobrać zanim pojawią się przeciwciała lub gdy wystąpią one w ilości niższej niż próg wykrywalności testu. Wyniki fałszywie dodatnie Reakcja krzyżowa może spowodować pojawienie się wyników fałszywie dodatnich, będących przyczyną nadrozpoznawalności boreliozy. W zdrowej populacji stwierdza się 8 12% wyników fałszywie dodatnich [3, 7]. Reakcja krzyżowa może nastąpić zarówno z niektórymi bakteriami (Treponema pallidum, Treponema pertenue i inne borrelie niepatogenne, leptospiry), jak i w czasie niektórych infekcji wirusowych, które wzbudzają poliklonalną produkcję przeciwciał, takich jak na przykład zakażenie wirusem EBV. Fałszywie dodatnia odpowiedź może się pojawić w chorobach autoimmunizacyjnych (np. reumatoidalne zapalenie stawów RZS, toczeń układowy) i schorzeniach wątroby (wirusowe zapalenie wątroby typu C WZW C) [6, 9, 12, 13]. Problemem klinicznym jest odsetek wyników dodatnich u osób klinicznie zdrowych, a także długie utrzymywanie się przeciwciał po zakończeniu leczenia i ustąpieniu objawów chorobowych. W Stanach Zjednoczonych dużą popularnością cieszy się test wykrywający przeciwciała przeciw antygenowi VlsE (C6) w obu klasach IgM i IgG (tzn. total), który wychwytuje przeciwciała w początkowej fazie choroby (IgM) oraz w czasie i po konwersji do IgG. Testy oparte na konserwatywnym białku C6 z grupy VlsE mają wyższą czułość, gdyż umożliwiają wykrywanie swoistych przeciwciał przeciw bakteriom o dużej zmienności antygenowej, a nawet wewnątrzgatunkowej [8, 9]. Monitorowanie przeciwciał po leczeniu Monitorowanie stężenia przeciwciał po leczeniu nie ma uzasadnienia, o ile nie podejrzewa się reinfekcji [12]. Bezwładność produkcji przeciwciał jest duża i nie idzie w parze z eliminacją zakażenia. Częstym zjawiskiem jest utrzymywanie się przeciwciał IgM po skutecznym leczeniu, bez serokonwersji do IgG. Monitorowanie jest użyteczne na terenach endemicznych, gdzie możliwa jest reinfekcja. Wskazuje na nią pojawienie się nowych objawów oraz nasilenie dolegliwości połączone z istotnym wzrostem miana przeciwciał [5, 6, 12]. Diagnostyka neuroboreliozy Oznaczanie przeciwciał potwierdzających zakażenie układu nerwowego jest trudne. Stosowanie metody ELISA do badania PMR ma te same zastrzeżenia interpretacyjne jak w przypadku surowicy (nadrozpoznawalność). Ponadto stężenie przeciwciał w poszczególnych przestrzeniach płynowych różni się od siebie. Zależy to od lokalnej zmienności (sekwestracji anatomicznej) reakcji odpornościowych, które przebiegają odmiennie w miejscach immunologicznie uprzywilejowanych, takich jak np. ośrodkowy układ nerwowy (OUN) [14]. W praktyce wykazanie syntezy przeciwciał w OUN wymaga pomiaru przeciwciał w surowicy i PMR oraz takiego przeliczenia, które uwzględnia różnice stężeń białek w obu przestrzeniach, a wynik podawany jest w postaci tzw. indeksu syntezy (ang. antibody index AI) [5, 7, 9, 10]: Indeks PMR/surowica [AI]= ELISA jednostki w PMR total IgG w surowicy ELISA jednostki w surowicy total IgG w PMR Wynik dodatni to wartość >1,3 [8]. Metodą alternatywną, wskazująca na syntezę wewnątrzoponową, jest porównanie oznaczeń wyników przeciwciał metodą western blot lub immunoblot, wykonanych jednocześnie w płynie mózgowo-rdzeniowym i surowicy. Obecność silniej wybarwionych pasków w PMR lub pojawienie się pasków nieobecnych w surowicy wskazuje na syntezę wewnątrzoponową [10]. Testy WB oraz IB, skonstruowane identycznie dla surowicy i PMR, umożliwiają wykrycie przeciwciał przeciw poszczególnym antygenom, obiektywizując wynik badania uzyskany metodą ELISA. Spełniają one również funkcję testu na obecność pasm oligoklonalnych pojawienie się pasm w PMR, jednocześnie nieobecnych w surowicy, wskazuje jednoznacznie na syntezę wewątrzoponową innych przeciwciał w płynie mózgowo-rdzeniowym niż w surowicy. W praktyce klinicznej nie należy zapominać, że (neuro) borelioza z Lyme jest rozpoznaniem klinicznym potwierdzanym w badaniu laboratoryjnym [7, 8, 10]. Chemokina CXCL13 w diagnostyce neuroboreliozy Obiecującym markerem w diagnostyce wczesnej neuroboreliozy jest oznaczanie w PMR i surowicy chemokiny 248

Forum Zakażeń 2013;4(4) CXCL13. W płynie mózgowo-rdzeniowym w przeciwieństwie do surowicy stężenie CXCL13 jest wysokie i obniża się wraz z zastosowaniem leczenia [10]. Diagnostyka bezpośrednia Testy bezpośrednie Do testów bezpośrednich, które pozwalają bezpośrednio wykryć czynnik zakaźny należą: metoda PCR (amplifikacja bakteryjnego DNA), hodowla bakterii Borrelia burgdorferi oraz uwidocznienie ich w materiałach biologicznych [5, 8, 9, 12, 13]. Mikroskopia elektronowa w różnych modyfikacjach może być przydatna zwłaszcza w wykrywaniu komórek bakteryjnych przebywających wewnątrzkomórkowo. Testy bezpośrednie hodowla i metoda PCR mają liczne ograniczenia, wiążą się z wysokimi kosztami oraz długim czasem oczekiwania na wynik, co powoduje, że nie mają zastosowania w standardowej diagnostyce klinicznej [9]. Diagnostyka mikrobiologiczna w kierunku krętków Borrelia jest długotrwała i daje znikome efekty. Hodowla bakterii na podłożu BSK II (ang. Barbour-Stoenner-Kelly) lub MKP (ang. Marsic-Kelly-Preac) przez około 5 dni w warunkach mikroaerofilnych pozwala na uzyskanie dodatniego wyniku w I fazie choroby u 40 50% chorych, a w kolejnych stadiach zaledwie u 5% pacjentów [8, 9]. Zastosowanie metody PCR w diagnostyce boreliozy z Lyme We wczesnym okresie po ułuciu przez kleszcza (borelioza wczesna zlokalizowana i rozsiana), od wprowadzenia bakterii (B. garinii wnika do organizmu człowieka w ciągu 24 godzin od kontaktu z wektorem, podczas gdy B. burgdorferi ss po upływie 48 godzin) do momentu pojawienia się wykrywalnego poziomu swoistych przeciwciał przeciw antygenom krętków B. burgdorferi sl (do 4 8 tygodni), uzasadnione jest zastosowanie techniki PCR, służącej potwierdzeniu rozpoznania lub wykryciu koinfekcji innymi patogenami odkleszczowymi [7, 13]. W późniejszej fazie choroby (borelioza późna) metoda PCR może wspomagać badania immunoserologiczne w grupie pacjentów z defektami immunologicznymi, z innymi chorobami współistniejącymi, współzakażeniami lub w przypadkach reinfekcji, gdy swoiste przeciwciała są już obecne [12, 13]. Metoda PCR może być także przydatna w wypadkach bezobjawowego przebiegu oraz utajonego okresu choroby (aktywacja zakażenia może nastąpić po miesiącach od kontaktu z wektorem) ze względu na wewnątrzkomórkowe umiejscowienie krętków w niszach organizmu (stawy, serce, mielina) [7, 13]. Metoda PCR stwarza także dodatkowe możliwości w sposobie diagnozowania pacjentów z długotrwale utrzymującymi się swoistymi przeciwciałami, szczególnie w klasie IgM [4, 8, 9, 13]. Technika PCR umożliwia diagnostykę boreliozy z Lyme w zróżnicowanym materiale klinicznym: wycinki skórne, płyn stawowy, PMR, krew i mocz [8, 9, 13]. Bioptaty skórne z granicy EM (erythema migrant borelioza wczesna) oraz u osób z ACA (acrodermatitis chronica atrophicans przewlekłe zanikowe zapalenie skóry kończyn) dają pozytywne wyniki amplifikacji materiału genetycznego krętków B. burgdorferi sl w 50 70% przypadków i mogą służyć w celu potwierdzenia zakażenia, zwłaszcza w przypadkach niecharakterystycznych zmian skórnych, jak na przykład mini-em [4]. U pacjentów z LA (Lyme arthritis zapalenie stawu) dodatni wynik PCR w płynie stawowym oprócz potwierdzenia zakażenia może również wskazywać na oporne na leczenie zapalenie stawów wynikające z obecności krętków Borrelia [9, 13]. Według wytycznych EFNS (ang. European Federation of Neurological Societes) badanie PCR w kierunku krętków B. burgdorferi sl w PMR ma znaczenie jedynie w bardzo wczesnym (do 6 tygodni) okresie zakażenia, gdy brak jest wskaźników serologicznych neuroboreliozy, z tym że ze względu na niewielką liczbę bakterii w tym materiale oraz ich powinowactwo do struktur mielinowych należy liczyć się z uzyskaniem wyniku ujemnego (70 85% przypadków) [5, 10, 13]. Wykrywanie DNA B. burgdorferi sl we krwi ogranicza się do wczesnego okresu zakażenia, gdyż spirochotemia jest przejściowa i krótkotrwała, a krętki ze względu na wysoki tropizm tkankowy wędrują z krwiobiegu do różnych narządów i tkanek, określanych często jako nisze organizmu (serce, stawy, mielina, opony mózgowe). Diagnostyka moczu w kierunku boreliozy z Lyme jest według wszelkich standardów odradzana [4, 8, 9, 13]. Reakcja typu End-Point PCR: qpcr (ang. qualitative PCR), npcr (ang. nested PCR) lub FEP PCR (ang. Fluorescent End-Point PCR) o charakterze jakościowym jest wystarczająca do celów diagnostycznych w przypadku boreliozy z Lyme [2, 13]. Wykrywa specyficzne, unikatowe fragmenty genomu B. burgdorferi sl, do których należą sekwencje DNA plazmidowego (OspA, OspB, OspC, VlSE) oraz DNA chromosomalnego (gen fla, rec A, 16S rdna, p66, hbb, rpob, przestrzeń międzygenowa 5S 23S) [13, 15]. Pomimo możliwości diagnostycznych, jakie stwarza reakcja PCR w potwierdzeniu zakażenia krętkami Borrelia, należy również pamiętać o trudnościach związanych z jej prawidłowym przeprowadzeniem. Do otrzymania negatywnych rezultatów testu PCR mogą prowadzić: ryzyko wystąpienia kontaminacji, inhibicji reakcji (m.in. związkami w organizmie człowieka: hemoglobina, heparyna, melanina lub substancjami utrwalającymi, takimi jak patafina, etanol), cechy własne krętków Borrelia (przejściowa spirochotemia we krwi i płynie mózgowo-rdzeniowym oraz zdolność do wiązania się za pomocą licznych receptorów, np. glikozaminoglikanowych, z różnymi komórkami organizmu gospodarza), wcześniej wdrożona antybiotykoterapia 249

Forum Zakażeń 2013;4(4) Tabela 2. Leczenie boreliozy z Lyme. Zalecenia Polskiego Towarzystwa Epidemiologów i Lekarzy Chorób Zakaźnych (opracowano wg [12]). Obraz kliniczny Lek Dawkowanie Droga Czas terapii dni) Ukłucie przez kleszcza Obserwacja i uświadomienie możliwych objawów* Liczne ukłucia kleszczy w rejonie endemicznym Doksycyklina 1 200 mg p.o. 1 osoby spoza tego terenu Rumień wędrujący Amoksycylina 3 500 mg (dzieci: 50 mg/kg/dzień) p.o. 14 21 Borrelial lymphocytyma Porażenie nerwów czaszkowych Doksycyklina 2 100 mg lub 1 200 mg p.o. 14 21 Aksetyl 2 500 mg p.o. 14 21 cefuroksymu (dzieci: 30 mg/kg/dzień) Azytromycyna** 1 dzień: 2 500 mg p.o. 5 2 5 dni: 1 500 mg (dzieci: 1 dzień 1 20 mg 2 5 dzień 1 10 mg) Penicylina V 3 1000 mg p.o. 14 21 Zapalenie stawów (pierwszy rzut) Amoksycylina 3 500 1000 mg (dzieci: 50 mg/kg/dzień) p.o. 14 28 Doksycyklina 2 100 mg lub 1 200 mg p.o. 14 28 Aksetyl cefuroksymu 2 500 mg (dzieci: 30 mg/kg/dzień) p.o. 14 28 Neuroborelioza (zapalenie opon mózgowordzeniowych, Ceftriakson 1 2000 mg i.v. 14 28 mózgu, korzeni) Zapalenie stawów (nawrót) Cefotaksym 3 2000 mg i.v. 14 28 Zapalenie mięśnia sercowego*** Penicylina G 3 4 MU co 4 godziny i.v. 14 28 Przewlekłe zanikowe zapalenie skóry Amoksycylina 3 500 1000 mg p.o. 14 28 Doksycyklina 2 100 mg lub 1 200 mg p.o. 14 28 Ceftriakson 1 2000 mg i.v. 14 28 Cefotaksym 3 2000 mg i.v. 14 28 Peniciylina G 3 4 MU co 4 godziny i.v. 14 28 Zapalenie stawów oporne na antybiotykoterapię Niesteroidowe leki przeciwzapalne lub inna terapia objawowa; należy poszukiwać innej przyczyny dolegliwości * Ewentualne zastosowanie jednorazowej dawki doksycykliny (p.o. 200 mg) jest uzasadnione tylko w przypadku mnogiego pokłucia przez kleszcze podczas pobytu w rejonie endemicznym osoby pochodzącej spoza tego terenu. ** Azytromycyna jest zalecana wyłącznie w przypadku oporności na antybiotyki beta-laktamowe tylko w rumieniu wędrującym, gdzie ma potwierdzoną skuteczność. *** Zapalenie mięśnia sercowego może być leczone do 21 dni, przy czym w przypadku szybkiej poprawy dopuszczalne jest kontynuowanie leczenia antybiotykami doustnymi (jak rumień wędrujący). oraz brak standaryzacji metody (wynikający z rozbieżności wyników otrzymywanych w różnych ośrodkach naukowych i diagnostycznych). Natomiast dodatni wynik nie pozwala na potwierdzenie aktywnego zakażenia, gdyż nie różnicuje czy materiał genetyczny pochodzi z żywych bakterii, czy z ich fragmentów jakie mogą pozostać w organizmie na przykład po leczeniu [4, 8, 9, 13, 15]. Testy nie zalecane w diagnostyce boreliozy to: poszukiwanie krętków w kleszczu; test transformacji limfocytów LTT Melisa, Elispot LTT; poszukiwanie postaci cyst ; ocena liczebności subpopulacji limfocytów CD57; biorezonans, kanały energetyczne itd.; testy VCS (ang. visual contrast sensitivity test). Leczenie boreliozy z Lyme W leczeniu boreliozy z Lyme najistotniejsza jest eliminacja krętków za pomocą antybiotyku. Bakteria pochodząca ze środowiska zwierzęcego nie posiada oporności na antybiotyki. Długość leczenia wynosi zgodnie ze standardami obowiązującymi w Europie według EBM (ang. Evidence Based Medicine) od 10 do 28 dni [6, 7, 16]. Ponadto ważne jest minimalizowanie zapalenia za pomocą niesterydowych leków przeciwzapalnych i rehabilitacja ruchowa we wczesnej rozsianej i późnej boreliozie z Lyme [7]. Schemat leczenia boreliozy, zgodny z zaleceniami Polskiego Towarzystwa Epidemiologów i Lekarzy Chorób Zakaźnych, przedstawiono w Tabeli 2. Reinfekcja Ponowne zachorowanie na boreliozę z Lyme u pacjentów z wcześniej rozpoznaną chorobą jest mało prawdopodobne, lecz możliwe zwłaszcza u osób pochodzących z obszarów endemicznych. W takich przypadkach konieczne jest wykazanie serokonwersji miedzy ostrą fazą choroby a fazą rekonwalescencji. 250

Forum Zakażeń 2013;4(4) Ciąża Nie udowodniono szkodliwego wpływu zakażenia Borrelia burgdorferi u kobiet w ciaży na rozwój płodu. Kobiety ciężarne oraz matki karmiące z rozpoznaniem boreliozy z Lyme powinny być leczone zgodnie z zaleceniami zawartymi w Tabeli 1, lecz z wyłączeniem doksycykliny [16]. Profilaktyka Kleszcze nie mają w środowisku naturalnych wrogów, lecz same wywierają znaczący wpływ na populacje różnych grup zwierząt, szczególnie na terenach endemicznych półkuli północnej [12, 17]. Liczba kleszczy może zmniejszyć się po wyjątkowo suchych latach bądź długich mroźnych zimach, które wpływają na liczbę gryzoni, ptaków, a także zwierząt z rodziny jeleniowatych, które to grupy są głównymi żywicielielami kleszczy [17]. W ostatnim czasie obserwowane są jednak tendencje zupełnie odwrotne, skutkujące wzrostem liczebności kleszczy. Można próbować stosować środki kleszczobójcze na pewnych grupach zwierząt, jednak te działania mają zastosowanie ograniczone do określonego terenu, natomiast w parkach pomaga tworzenie ścieżek utrudniających poruszanie się drobnym zwierzętom. Ochrona osobista polega na unikaniu ukłucia przez kleszcze dzięki odpowiednim ubieraniu się w czasie wycieczek do lasu (długie rękawy, spodnie utrudniające kleszczom przedostanie się do gołej skóry) oraz stosowaniu repelentów. Ważne jest zachowanie szczególnej ostrożności w okresie nasilenia aktywności kleszczy (od czerwca do października). Istotne jest również mycie ciała po pobycie w lesie, koszeniu trawy, a także dokładne oglądanie szczególnie często atakowanych części ciała (Ryc. 1). Kleszcz żerujący w skórze może być słabo widoczny, a nawet przypominać drobne znamię. Często lokalizuje się w okolicach karku, pach, pachwin czy dołów podkolanowych, gdzie może pozostać długo niezauważony. Nimfa ma wielkość kropki w tekście pisanym (1 mm). Aby uniknąć zakażenia Borrelia burgdorferi należy nie tylko szybko, lecz przede wszystkim prawidłowo usunąć kleszcza. Wprowadzenie bakterii B. burgdorferi do skóry następuje po co najmniej 24 godzinach żerowania [13, 17]. Wczesne usunięcie zapobiega zatem zakażeniu. Wkłutego kleszcza należy chwycić pęsetą jak najbliżej skóry i wyciągnąć zdecydowanym prostym ruchem na zewnątrz. Niebezpieczne jest nie tyle pozostawienie aparatu gębowego kleszcza (hypostomu) w skórze, co może skutkować wprowadzeniem bakterii, ile wciśnięcie treści jelit do ranki, gdy kleszcz został nieprawidłowo wyjęty (ściśnięty palcami, podrażniony toksycznymi chemikaliami lub rozerwany w ten sposób, że jego wnętrzności miały kontakt z raną po ukąszeniu), co zwiększa ryzyko zakażenia [18]. Niezwykle ważna w działaniach profilaktycznych wydaje się rzetelna ocena ryzyka zachorowania, edukacja pacjentów oraz lekarzy. Konflikt interesów: nie zgłoszono. Deklaracja przejrzystości: Justyna Dunaj jest stypendystką w ramach projektu: Studiuję, badam, komercjalizuję program wsparcia doktorantów UMB, poddziałanie 8.2.1 Programu Operacyjnego Kapitał Ludzki, współfinansowanego przez Unię Europejską w ramach Europejskiego Funduszu Społecznego. Piśmiennictwo 1. Stanek G, Reiter M. The expanding Lyme Borrelia complex clinical significance of genomic species? Clin Microbiol Infect 2011;17(4):487 493. 2. Steere AC, Coburn J, Glickstein L. The emergence of Lyme disease. J Clin Invest 2004;113(8):1093 1101. 3. Chmielewski T, Tylewska-Wierzbanowska S. Występowanie przeciwciał swoistych dla Borrelia burgdorferi u ludzi zdrowych na terenie Polski. Prz Epidemiol 2002;56:33 38. 4. Wilske B. Diagnosis of Lyme borreliosis in Europe. Vector Borne Zoonotic Dis 2003;3(4):215 227. 5. Stanek G, Fingerle V, Hunfeld KP et al. Lyme borreliosis: clinical case definitions for diagnosis and management in Europe. Clin Microbiol Infect 2011;17(1):69 79. 6. Pancewicz SA, Zajkowska JM, Kondrusik M, Moniuszko A, Grygorczuk S. Znaczenie epidemiologiczne i kliniczne chorób przenoszonych przez kleszcze. In: Żmudziński JF. Epidemiologiczne Zagrożenia dla Zdrowia Człowieka. PIWet-PIB, Puławy, 2010, pp. 107 125. 7. Zajkowska JM, Pancewicz SA, Grygorczuk S, Kondrusik M, Moniuszko A, Lakwa K. Neuroborelioza wybrane aspekty patogenezy, diagnostyki i leczenia. Pol Merk Lek 2008;24(143):453 457. 8. Wang G, Aguero-Rosenfeld ME, Wormser GP, Schwartz I. Detection of Borrelia burgdorferi. In: Samuels S, Radolf JD (eds). Borrelia. Molecular Biology, Host Interaction and Pathogenesis. Caister Academic Press, Norfolk, UK, 2010, pp. 443 466. 9. Aguero-Rosenfeld ME, Wang G, Schwartz I, Wormser GP. Diagnosis of lyme borreliosis. Clin Microbiol Rev 2005;18(3):484 509. 10. Mygland A, Ljøstad U, Fingerle V et al. EFNS guidelines on the diagnosis and management of European Lyme neuroborreliosis. Eur J Neurol 2010;17(1):8 16. 11. Porwancher RB, Hagerty CG, Fan J et al. Multiplex immunoassay for Lyme disease using VlsE1-IgG and pepc10-igm antibodies: improving test performance through bioinformatics. Clin Vaccine Immmunol 2011;18(5):851 859. 12. Radolf JD, Salazar JC, Dattwyler RJ. Lyme disease in humans. In: Samuels S, Radolf JD (eds). Borrelia. Molecular Biology, Host Interaction and Pathogenesis. Caister Academic Press, Norfolk, UK, 2010, pp. 487 533. 13. Dunaj J, Moniuszko A, Zajkowska JM, Pancewicz S. The role of PCR in diagnostics of Lyme borreliosis. Prz Epidemiol 2013;67(1):35 39. 14. Zajkowska JM, Pancewicz SA. Wybrane aspekty patogenezy i diagnostyki neuroboreliozy. Pol Prz Neurol 2007;3(2):116 122. 15. Lee SH, Vigliotti VS, Vigliotti JS, Jones W, Pappu S. Increased sensitivity and specifity of Borrelia burgdorferi 16S ribosomal DNA detection. Am J Clin Pathol 2010;133(4):569 576. 16. Flisiak R, Pancewicz S. Diagnostyka i leczenie boreliozy z Lyme. Rekomendacje Polskiego Towarzystwa Epidemiologów i Lekarzy Chorób Zakaźnych. Prz Epdemiol 2008;62(1):193 199. 17. Zajkowska JM. Transmisja i krążenie patogenów odkleszczowych (KZM i boreliozy) i rola zmieniającego się środowiska. Prz Epidemiol 2010; 64(4):525 531. 18. Wanyura H, Wagner T, Kowalska K. Borelioza choroba z Lyme. Czas Stomatol 2006;59(9):640 648. 251