RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) OPIS PATENTOWY (19) PL (11) 202168 (13) B1 (21) Numer zgłoszenia: 346195 (51) Int.Cl. C12N 15/50 (2006.01) A61K 39/12 (2006.01) Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (22) Data zgłoszenia: 28.02.2001 (54) Wirus kurzej anemii, szczepionka do ochrony drobiu zawierająca ten wirus, sposób namnożenia wirusa, sposób wytwarzania szczepionki i zastosowanie tego wirusa (30) Pierwszeństwo: 29.02.2000,EP,00200719.3 (73) Uprawniony z patentu: INTERVET INTERNATIONAL B.V.,Boxmeer,NL (43) Zgłoszenie ogłoszono: 10.09.2001 BUP 19/01 (72) Twórca(y) wynalazku: Carla Christina Schrier,Boxmeer,NL Henricus Johannes Maria Jagt,Venlo,NL (45) O udzieleniu patentu ogłoszono: 30.06.2009 WUP 06/09 (74) Pełnomocnik: Janina Kossowska, PATPOL Sp. z o.o. PL 202168 B1 (57) 1. Wirus kurzej anemii (CAV), znamienny tym, że jest neutralizowany przez próbkę referencyjną obejmującą przeciwciało monoklonalne R2 wydzielane przez linię hybrydoma, zdeponowaną w ECACC pod numerem 00020304, przy czym wirus kurzej anemii jest swoiście neutralizowany w teście neutralizacji przez próbkę referencyjną przeciwciała monoklonalnego R2, której miano próbki referencyjnej przeciwko CAV wynosi co najmniej 5 log 2 na 50 μl, podczas badania wobec 300-1000 TCID 50 na 50 μl CAV. 2. CAV według zastrz. 1, znamienny tym, że wirus jest w postaci żywej. 3. CAV według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że miano próbki referencyjnej przeciwko CAV wynosi przynajmniej 10 (log 2 ) na 50 μl, bardziej korzystnie przynajmniej 12 (log 2 ) na 50 μl albo nawet przynajmniej 14 (log 2 ) na 50 μl w badaniu wobec 300-1000 TCID 50 na 50 μl CAV.
2 PL 202 168 B1 Opis wynalazku Przedmiotem wynalazku jest wirus kurzej anemii, szczepionka do ochrony drobiu zawierająca ten wirus, sposób namnożenia wirusa, sposób wytwarzania szczepionki i zastosowanie tego wirusa. Wirus kurzej anemii (CAV) jest czynnikiem przyczynowym choroby znanej jako zakaźna anemia kurcząt, zespół anemii i zapalenia skóry albo choroba niebieskich skrzydeł i został po raz pierwszy opisany przez Yuasa i in. W 1979 r.(avian Diseases, 23:366-385, 1979). Większość wybuchów naturalnie występującej choroby indukowanej CAV opisano u młodych kurcząt. Choroba jest ostra i pierwsze objawy zwykle występują w 10-14 dniu życia. Choroba klinicznie charakteryzuje się nagłym wzrostem śmiertelności, zwykle około 5-10%, ale opisywano nawet 60% wzrost. Szczyt śmiertelności występuje w ciągu 5-6 dni od początku choroby. Dalsze objawy choroby obejmują depresję i anoreksję. Ponadto, u chorych kurcząt obserwuje się ciężką anemię, krwotoki wewnętrzne, atrofię grasicy i torebki Fabrycjusza oraz żółtawy szpik (McNulty, Avian Pathol., 20:187- -203, 1991). CAV rozsiewa się wśród kurcząt horyzontalnie i wertykalnie. Gdy zarażą się nioski bez uprzedniej ekspozycji na wirusa, CAV przenosi się wertykalnie na potomstwo. Nie obserwuje się objawów klinicznych u niosek, jak również nie ma to wpływu na produkcję jaj, nieśność albo płodność. Potomstwo zakażone wertykalnie wygląda normalnie po wykluciu, ale wykazuje zwiększoną śmiertelność i w wieku 10-14 dni nabawia się typowej choroby (zespół anemii i zapalenia skóry). Rozsiew horyzontalny następuje przez kontakt z kurczętami zakażonymi wertykalnie, zakażonymi materiałami, kurnikami itp. Rozsiew horyzontalny na młode podatne kurczęta, tzn. bez matczynych przeciwciał przeciwko CAV, może również prowadzić do choroby klinicznej dwa tygodnie później. Rozwój przeciwciał przeciwko CAV w rodzicielskich stadach kur przed rozpoczęciem znoszenia jaj może zapewnić opanowanie zespołu anemii skórnej. Wysoki poziom przeciwciał przeciwko CAV przed rozpoczęciem znoszenia jaj będzie zapobiegał przenoszeniu wertykalnemu podczas znoszenia i zapewniał potomstwo z przeciwciałami matczynymi, które chronią przed zakażeniem horyzontalnym podczas pierwszych kilku tygodni po wykluciu. Zatem istotne jest, aby wszystkie ptaki były szczepione szczepionką CAV przed rozpoczęciem znoszenia jaj. Przeciwciała matczyne przeciwko CAV zwykle zanikają po około 3 tygodniach życia. W tym czasie ma miejsce zakażenie horyzontalne. Zakażenia zwykle są subkliniczne, jednakże zakażenie subkliniczne związane jest ze znacznymi stratami gospodarczymi spowodowanymi obniżonym wzrostem brojlerów (McNulty i in., Avian Dis., 35:263-268, 1991). Chorobie subklinicznej można zapobiec przez szczepienie kurcząt bezpośrednio po wykluciu, korzystnie w pierwszym dniu życia. Tak więc, istnieje zapotrzebowanie na bezpieczną szczepionkę, która indukuje skuteczną ochronę przed chorobą kliniczną i subkliniczną związaną z zakażeniem CAV. Ponieważ istnieje w praktyce możliwość rozsiewu wirusów szczepionkowych na podatne stada młodych kurcząt, żywe szczepionki CAV do szczepienia stad rodzicielskich powinny być oparte na CAV o niskiej patogenności. Ponadto, ponieważ młode kurczęta są bardzo podatne na zakażenie CAV, żywe szczepionki do bezpośredniego podawania młodym kurczętom wymagają izolatów CAV o niskiej patogenności, które nie wpływają ujemnie na młode kurczęta. Jednakże, wszystkie naturalnie występujące CAV wyizolowane do tej pory są patogenne dla młodych kurcząt (McNulty, Avian Pathol., 20:187-203, 1991; Noteborn i Koch, Avian Pathol., 24:11-31, 1995; McNulty, Brit. Poultry Sci., 38 :7-13, 1997). Ponadto, atenuowanie izolatów CAV przez pasażowanie in vitro na hodowli komórkowej dało dwuznaczne wyniki. Bulow i Fuchs (J. Vet. Med., B 33:568-573, 1986) donoszą o zmniejszeniu patogenności izolatu Cux-1 po 12 pasażach na komórkach MDCC-MSB1, która dalej obniżyła się po dodatkowych 100-112 pasażach. Jednakże, Yuasa (Nat. Inst. Anim. Health Quarterly 23:13-20, 1983) i Goryo i in., (Avian Pathol. 16:149-163, 1987) nie stwierdzili dowodów atenuacji izolatów CAV po poddaniu ich, odpowiednio, 19 i 40 pasażom na hodowli komórkowej. Todd i in., (Avian Pathol., 24:171-187, 1995) wykazali atenuację izolatu Cux-1 przez pasaż (173-krotny) na komórkach MDCC-MSB1, ale stwierdzono, że atenuacja nie była stabilna i następował nawrót zjadliwości. W europejskim zgłoszeniu patentowym nr 0533294 ujawniono izolaty CAV atenuowane przez pasaże na zalęgniętych jajach. Izolaty te wykazywały resztkową zjadliwość wobec jednodniowych kurcząt, a więc nie były szczególnie przydatne do szczepienia kurcząt młodszych niż jednotygodniowe.
PL 202 168 B1 3 Oprócz tego, atenuowane izolaty CAV wywoływały zmiany w zarodkach kurzych, co powoduje, że te wirusy szczepionkowe mniej przydatne do szczepienia in ovo. Kura jest uważana za naturalnego gospodarza CAV. CAV nie stwierdzono w surowicy indyków i kaczek na terenie Zjednoczonego Królestwa, zaś jednodniowe pisklęta indycze zaszczepione CAV nie wykazują objawów klinicznych anemii i nie wykształcają przeciwciał przeciwko wirusowi (McNulty i in., Avian Pathol., 17:315-324, 1988; McNulty, Avian Pathol., 20:187-203, 1991). Jedynie ostatnio, Farkas i in., (Avian Pathol., 27:316-320, 1998) opisali, że przeciwciała przeciwko CAV wykryto u gatunku innego niż kura (tj. u przepiórki). Celem niniejszego wynalazku jest dostarczenie dodatkowych CAV o niskiej patogenności, które korzystnie można zastosować do wytwarzania żywych szczepionek CAV, np. do szczepienia brojlerów. Innym celem wynalazku jest dostarczenie CAV o niskiej patogenności, w szczególności niepatogennych CAV, które można zastosować do szczepienia ptaków najbardziej podatnych na CAV,. np. do szczepienia in ovo albo szczepienia jednodniowych piskląt. Stwierdzono, że cele te można osiągnąć przez dostarczenie wirusa kurzej anemii (CAV) według wynalazku, który charakteryzującego się tym, że ulega neutralizacji przez próbkę referencyjną, obejmującą przeciwciało monoklonalne R2, wydzielane przez linię komórkową hybrydoma, próbkę, którą zdeponowano w European Collection of Animal Cell Cultures (ECACC), Salisbury, UK, 3 lutego, 2000 pod numerem dostępu 00020304, przy czym CAV jest swoiście neutralizowany w teście neutralizacji wirusa przez próbkę referencyjną przeciwciała monoklonalnego R2, której miano przeciwko CAV wynosi co najmniej 5 log 2 na 50 μl, w badaniu wobec 300-1000 TCID 50 na 50 μl CAV. Korzystnie wirus jest w postaci żywej. Nieoczekiwanie stwierdzono, że występują naturalnie szczepy CAV o niskiej patogenności. CAV według wynalazku wykazują istotnie zmniejszoną patogenność wobec jednodniowych kurcząt, w porównaniu z opisanymi do tej pory naturalnie występującymi szczepami, co określono zdolnością wirusa do wywoływania atrofii grasicy, bladości szpiku i/lub anemii (Tablica 2). Podobnie nieoczekiwanie stwierdzono, że te CAV można izolować od zakażonych dzikich indyków. CAV według wynalazku można odróżnić antygenowo od znanych do tej pory szczepów CAV wyizolowanych od zakażonych kurcząt, jak również od kilku innych szczepów CAV wyizolowanych od indyków. Do celów identyfikacji cech charakterystycznych czynnika zakaźnego oraz do określania antygenowych podobieństw i różnic wśród różnych izolatów tego samego albo podobnego mikroorganizmu przydatne są monoklonalne przeciwciała. W Tabeli 1 pokazano, że CAV według wynalazku wykazują wzorzec reagowania z przeciwciałem monoklonalnym, które jest inne niż obserwowane u znanych szczepów kurzych albo szczepów indyczych o charakterze patogennym. W szczególności stwierdzono, że szczep CAV według wynalazku jest wirusem ulegającym neutralizacji przez próbkę zawierającą przeciwciało monoklonalne R2, w przeciwieństwie do znanych szczepów CAV izolowanych od kur, które nie ulegają neutralizacji przez to przeciwciało. W celu zbadania, czy szczep CAV ulega neutralizacji przez próbkę obejmującą przeciwciało monoklonalne R2, należy najpierw ustalić miano przeciwciała neutralizującego próbki przeciwciała R2 wobec CAV szczepu 319, zdeponowanego w European Collection of Animal Cell Cultures (ECACC), Salisbury, UK, 26 stycznia, 2000 pod numerem dostępu 00012608 w teście neutralizacji wirusa, jak opisano w Przykładzie 1, poniżej. Zależnie od miana przeciwciała, próbkę referencyjną przeciwciała monoklonalnego R2 przygotowuje się przez rozcieńczenie albo zatężenie próbki przeciwciała monoklonalnego R2 tak, że 50 μl zawiera miano przeciwciała równe 16 (log 2 ) w badaniu wobec 300-1000 TCID 50 na 50 μl CAV szczepu 319 w teście neutralizacji wirusa jak opisano w Przykładzie 1. Uważa się, że szczep CAV jest objęty niniejszym wynalazkiem, gdy ulega swoistej neutralizacji w teście neutralizacji wirusa przez próbkę referencyjną przeciwciała monoklonalnego R2. Oznacza to, że w teście neutralizacji wirusa, miano przeciwciała R2 w próbce referencyjnej wynosi przynajmniej 5 (log 2 ) na 50 μl w badaniu wobec 300-1000 TCID 50 na 50 μl szczepu CAV. W szczególności, niniejszy wynalazek dotyczy szczepu CAV, który ulega neutralizacji przez wyższe rozcieńczenia próbki referencyjnej przeciwciała monoklonalnego R2. Szczepy CAV, które ulegają neutralizacji przez wyższe rozcieńczenia próbki referencyjnej przeciwciała monoklonalnego R2, również wykazują niższą patogenność wobec kurcząt. Stąd, w korzystnym wykonaniu wynalazku, szczep CAV charakteryzuje się tym, że miano przeciwciał monoklonalnych R2 w próbce referencyjnej, wobec tego szczepu CAV wynosi przynajmniej 10 (log 2 ) na 50 μl, korzystniej przynajmniej 12 (log 2 ) na 50 μl albo
4 PL 202 168 B1 nawet przynajmniej 14 (log 2 ) na 50 μi, zaś w szczególności przynajmniej 16 (log 2 ) na 50 μl w badaniu wobec 300-1000 TCID 50 na 50 μl szczepu CAV. Szczep CAV, który ulega neutralizacji przez wyższe rozcieńczenia próbki referencyjnej przeciwciała monoklonalnego R2 jest zasadniczo niepatogenny dla młodych kurcząt i zarodków kurzych. Stąd, taki szczep CAV szczególnie nadaje się do zastosowania w żywej szczepionce CAV do podawania kurczętom, które są najbardziej podatne na zakażenia CAV, takim jak zarodki kurze albo kurczęta jednodniowe. Najkorzystniejszym szczepem według wynalazku jest szczep 319 CAV, którego próbkę zdeponowano w ECACC pod numerem dostępu 00012608. W świetle swych niepatogennych właściwości, szczep ten jest szczególnie przydatny jako składnik szczepionek do immunizowania młodych kurcząt i zarodków kurzych. Identyfikacja nowych szczepów CAV według wynalazku umożliwia wytworzenie żywych szczepionek CAV o niskiej patogenności, które mogą wydajnie chronić drób, w szczególności młode kurczęta, przed stanami chorobowymi wynikającymi z zakażenia przez CAV. Stąd, w korzystnym wykonaniu wynalazku, szczep CAV jak określony powyżej dostarczony jest w postaci żywej. Oczywiście, szczepy CAV według niniejszego wynalazku mogą być również w postaci inaktywowanej. Inaktywowany CAV można zastosować jako podstawę szczepionki inaktywowanej, szczególnie przydatnej do szczepienia niosek. CAV według wynalazku można również wyizolować od dzikich indyków. Pokrótce, można przeprowadzić badanie przesiewowe surowic indyków pobranych od stad indyków w celu identyfikacji próbek surowic, które mogą ulegać neutralizacji CAV w standardowym teście neutralizacji wirusa. Przykład takiego badania określono w publikacji Farkas i in., (1998, wyżej). Następnie, CAV można izolować z narządów indyka, jak to opisano w Przykładzie 1. Na koniec, CAV według wynalazku można identyfikować przez badanie reakcji z przeciwciałem monoklonalnym R2. Jeżeli to konieczne, CAV o niskiej patogenności scharakteryzowany powyżej, można zaadaptować do zalęgniętych jaj, przez pasażowanie CAV na zalęgniętych jajach, tak, że wirusy będą zdolne do wzrastania do wysokich mian w zalęgniętych jajach. W europejskim zgłoszeniu patentowym nr 0533294 ujawniono, że zdolność CAV do indukowania zmian w zarodku jest związana z korzystnym wzrostem i dalej opisano sposób, w jaki można uzyskać takie wirusy. Zatem, niniejszy wynalazek dotyczy również CAV wyżej wspomnianego rodzaju, które dodatkowo wykazują właściwość wywoływania zmian w zarodkach kurzych. Takie CAV są przydatne do szczepienia in ovo zarodków 17-dniowych i starszych oraz szczepienia późniejszego po wykluciu kurcząt jednodniowych albo starszych. W zakres wynalazku wchodzi też szczepionka do stosowania do ochrony drobiu przed stanem chorobowym, zarówno klinicznym, jak i subklinicznym, spowodowanym zakażeniem CAV, obejmująca CAV według wynalazku i nośnik albo rozcieńczalnik dopuszczalny farmaceutycznie, korzystnie także adiuwant. CAV według wynalazku można włączać do szczepionki w postaci wirusa żywego albo inaktywowanego. Jednakże, słaba patogenność CAV czyni tego wirusa szczególnie przydatnym do włączania do żywych szczepionek CAV. Wynalazek dotyczy też sposobu namnożenia CAV według wynalazku obejmującego etapy: a. zaszczepienia podatnego substratu wirusem kurzej anemii CAV; b. namnażania wirusa; i c. zbierania materiału zawierającego CAV. W zakres wynalazku wchodzi również sposób wytwarzania szczepionki do ochrony drobiu przed chorobą spowodowaną zakażeniem CAV, który obejmuje łączenie zebranego CAV, uzyskanego sposobem określonym powyżej, w razie potrzeby po inaktywacji CAV, z nośnikiem albo rozcieńczalnikiem dopuszczalnym farmaceutycznie. Poszczególne etapy sposobu są typowe jak, przykładowo, powszechnie stosowane do szczepionek CAV dostępnych w handlu. Wytwarzanie weterynaryjnych kompozycji szczepionek opisano również w Handbuch der Schutzimpfungen in der Tiermedizin ( wyd. Mayr i in., Verlag Paul Parey, Berlin i Hamburg, Niemcy, 1984) oraz Vaccines for Veterinary Applications, wyd. Peters i in., Butterworth-Heinemann, Ltd., 1993. Pokrótce, odpowiedni substrat zaszczepiany jest żywym CAV według wynalazku i namnażany, dopóki wirus nie osiągnie pożądanego miana zakaźności albo masy antygenu, po czym materiał zawierający CAV jest zbierany i formułowany w postaci kompozycji farmaceutycznej o aktywności profilaktycznej.
PL 202 168 B1 5 Do wytworzenia szczepionki według wynalazku można zastosować każdy substrat zdolny podtrzymać replikację CAV, jak określono powyżej. Odpowiednie substraty obejmują hodowle komórkowe, takie jak komórek MDCC-MSB1, zarodki kurze i kurczęta, do wytwarzania szczepionki in vivo. W celu wytwarzania na hodowli komórkowej, wirus zwykle namnaża się przez 3-10 dni po zaszczepieniu komórek, po czym zbiera się supernatant komórkowy i jeżeli to konieczne, filtruje albo odwirowuje w celu usunięcia resztek komórkowych. Alternatywnie, CAV według wynalazku można namnażać na zalęgniętych jajach kurzych, poczym zbierać materiał CAV rutynowymi sposobami, jak opisano w europejskim zgłoszeniu patentowym nr 0533294. Szczepionkę według wynalazku, zawierającą żywe CAV można wytwarzać i sprzedawać w postaci (zamrożonej) zawiesiny albo w postaci liofilizowanej. Szczepionka dodatkowo zawiera nośnik albo rozcieńczalnik dopuszczalny farmaceutycznie, zwyczajowo stosowany do takich kompozycji. Nośniki obejmują stabilizatory, konserwanty i bufory. Przydatnymi stabilizatorami są, przykładowo, SPGA, węglowodany (takie jak sorbitol, mannitol, skrobia, sacharoza, dekstran albo glukoza, glutaminian), białka (takie jak wysuszone osocze mleka, albumina albo kazeina) albo produkty ich rozkładu. Przydatnymi buforami są, przykładowo, fosforany metali alkalicznych. Przydatnymi konserwantami są: tiomerosal, mertiolat i gentamycyna. Rozcieńczalniki obejmują wodę, bufory wodne (takie jak buforowany roztwór soli), alkohole i poliole (takie jak gliceryna). Korzystnie szczepionka ponadto obejmuje adiuwant. Przykłady odpowiednich związków chemicznych i kompozycji o aktywności adiuwantu są takie same jak wspomniane poniżej do wytwarzania szczepionek inaktywowanych. Chociaż możliwe jest podawanie szczepionki przez iniekcję, np. domięśniową, podskórną żywej szczepionki według wynalazku, żywą szczepionkę jednak korzystnie podaje się przez niedrogie podawanie masowe powszechnie stosowane do szczepienia drobiu. Techniki te obejmują podawanie szczepionki w wodzie do picia i przez rozpylanie. Alternatywne sposoby podawania żywej szczepionki obejmują podawanie in ovo, w kroplach do oczu oraz przez moczenie dzioba. Wynalazek dotyczy również zastosowania CAV według wynalazku do wytwarzania szczepionki do szczepienia in ovo lub wytwarzania szczepionki do podawania pozajelitowego kurczętom 1-dniowym. Ponieważ niniejszy wynalazek dotyczy CAV, które są zasadniczo niepatogenne po podaniu in ovo w ostatniej kwadrze okresu inkubacji, szczególnie korzystną drogą podawania szczepionki według wynalazku jest podawanie in ovo. Zwykle, szczepionkę wstrzykuje się do zalęgniętych jaj podczas ostatniego etapu rozwoju zarodkowego, zasadniczo podczas ostatniej kwadry okresu inkubacji (dzień 15-21), korzystnie w dniu 18 okresu inkubacji. Mechanizm wstrzykiwania do zalęgniętych jaj nie jest szczególnie krytyczny, pod warunkiem, że nie powoduje niepotrzebnego uszkodzenia tkanki i narządów zarodka. Przykładowo, przekłuwa się niewielki otwór przy użyciu igły (2,5-3,75 cm (1-1 1 / 2 cala), około 22 gauge) połączonej ze strzykawką, na większym końcu skorupki i wstrzykuje się szczepionkę poniżej wewnętrznej błony skorupki i błony kosmówkowo-owodniowej. Następnie, zaszczepione zalęgnięte jaja przenosi się do inkubatora w celu wyklucia (patent USA nr 4,458,630; 5,427,791; WO 98/56413 i WO 95/35121). Korzystnie, cały proces szczepienia zarodka przeprowadza się stosując automatyczne systemy szczepienia, takie jak dostępny w handlu Inovoject. W innym wykonaniu szczepionka przeciwko stanowi chorobowemu spowodowanemu zakażeniem CAV według wynalazku, obejmująca CAV w postaci inaktywowanej. Zaletą szczepionki inaktywowanej jest możliwość uzyskania zwiększonego poziomu przeciwciał ochronnych o długim okresie trwania. Właściwość ta powoduje, że szczepionka inaktywowana jest szczególnie odpowiednia do szczepienia niosek. Wytwarzanie inaktywowanej szczepionki CAV według wynalazku można przeprowadzić rutynowymi sposobami znanymi specjalistom w dziedzinie (np. sposobem opisanym w europejskim zgłoszeniu patentowym nr 0533294). Szczepionka zawierająca inaktywowane CAV może, przykładowo, obejmować jeden albo wiele opisanych wyżej nośników albo rozcieńczalników dopuszczalnych farmaceutycznie, odpowiednich do tego celu. Korzystnie, inaktywowana szczepionka według wynalazku obejmuje jeden albo wiele związków o aktywności adiuwantowej. Odpowiednie dla tego celu związki lub kompozycje obejmują wodorotlenek, fosforan albo tlenek glinu, emulsje olej w wodzie albo woda w oleju oparte, przykładowo, na oleju
6 PL 202 168 B1 mineralnym, takim jak Bayol F albo Marcol 52 albo na oleju roślinnym, takim jak octan witaminy E i na saponinach. Inaktywowane szczepionki podaje się zwykle pozajelitowo, np. domięśniowo albo podskórnie. Szczepionka według wynalazku obejmuje skuteczną dawkę CAV określonego powyżej jako składnik czynny, tj. ilość immunizującą CAV, która wywołuje odporność u szczepionych ptaków albo ich potomstwa, przeciwko prowokacji zakaźnym wirusem. W znaczeniu tu zastosowanym, odporność oznacza wywołanie istotnego poziomu ochrony w populacji ptaków po szczepieniu, w porównaniu z grupą nieszczepioną. Zwykle, żywą szczepionkę według wynalazku można podawać w dawce 10 2-10 9 TCID 50 na ptaka, korzystnie w zakresie od 10 2-10 6 TCID 50, zaś szczepionki inaktywowane mogą zawierać antygenowy równoważnik w ilości 10 4-10 10 TCID 50 na ptaka. Chociaż szczepionkę CAV według wynalazku można stosować skutecznie u kur, również inne gatunki drobiu, takie jak indyki i przepiórki można pomyślnie szczepić szczepionką. Kury obejmują brojlery, stada reprodukcyjne i stada nośne. Ponieważ choroba kliniczna i subkliniczna spowodowana CAV opisywana była głównie u młodych kurcząt, w szczególności brojlerów, szczepionka według wynalazku korzystnie jest przeznaczona do stosowania w ochronie brojlerów przed stanem chorobowym wywołanym CAV. Wiek zwierząt otrzymujących szczepionkę żywą albo inaktywowaną według wynalazku może być taki sam jak wiek zwierząt otrzymujących uprzednio znane szczepionki CAV. Oprócz tego, słabo patogenny charakter CAV według wynalazku umożliwia podawanie szczepionki CAV młodym ptakom, tj. w wieku poniżej dwóch tygodni, w szczególności pisklętom jednodniowym, albo nawet zarodkom, drogą podawania in ovo w końcowej kwadrze okresu inkubacji. Przykładowo, młode ptaki, np. brojlery, można szczepić bezpośrednio, powyżej jednego dnia życia żywą szczepionką według wynalazku w celu zapobieżenia chorobie subklinicznej, spowodowanej horyzontalną transmisją CAV. Szczepienie stada rodzicielskiego, takiego jak brojlery rozrodcze, można przeprowadzić przy użyciu żywej albo inaktywowanej szczepionki według wynalazku albo przy użyciu protokołu obejmującego obie szczepionki. Zaletą tego rodzaju programów szczepienia jest natychmiastowa ochrona jednodniowego potomstwa, zapewniana przez przeciwciała matczyne przenoszone wertykalnie na młode pisklęta. Typowy schemat szczepienia niosek obejmuje szczepienie od 6-go tygodnia życia przy użyciu żywej szczepionki, albo szczepienie między 14-18 tygodniem życia szczepionką inaktywowaną. Korzystnie szczepionka według wynalazku obejmuje oprócz CAV według wynalazku, jeden albo więcej składników szczepionkowych innych patogenów zakaźnych dla drobiu, korzystnie wybranych z grupy składającej się z wirusa choroby Marek'a (MDV), wirusa zakaźnego zapalenia oskrzeli (IBV), wirusa choroby Newcastle (NDV), wirusa zakaźnej zapalenia torby Fabrycjusza (IBDV), adenowirusa drobiu (FAV), wirusa EDV, wirusa zapalenia nosa i tchawicy indyków (TRTV), wirusa zapalenia krtani i tchawicy (ILTV) i reowirusa. W szczególności żywa skojarzona szczepionka według wynalazku obejmuje CAV według wynalazku i szczep szczepionkowy MDV, taki jak HVT. Kombinację tę można korzystnie zastosować do szczepienia in ovo. Przykłady P r z y k ł a d 1 Izolowanie i identyfikacja in vitro szczepów CAV o niskiej patogenności A. Szczepy CAV izolowano z narządów pochodzących od różnych indyków według następującej procedury: Narządy homogenizowano i wirowano przez 15 minut przy 3000 g. Supernatant dodawano do komórek MDCC-MSB1 i następnie inkubowano zawiesiny w +37 C. Po 2-3 dniach inkubacji komórki badano mikroskopowo, a następnie poddawano subkulturze. Procedurę tę powtarzano, dopóki nie nastąpił efekt cytopatyczny (CPE), charakterystyczny dla CAV. Gdy wystąpił CPE charakterystyczny dla CAV, zawiesinę wirowano przez 15 minut przy 3000 g, a następnie zbierano supernatant i przechowywano w -70 C. Kolejne pasaże prowadzono zgodnie z tą samą procedurą. Izolaty kurzego CAV namnożono również na komórkach MDCC-MSB1 według powyższej procedury. Dalszą grupę szczepów CAV według wynalazku wyizolowano w podobny sposób od indyków wykazujących depresję z nieznanej przyczyny. Po dostarczeniu, indyki zabito i pobrano ich wątroby. W laboratorium dodano równą objętość pożywki RPMI 1640 i wytwarzono 50% homogenat wątroby
PL 202 168 B1 7 stosując nadstawkę Ultra-Turrax. Po odwirowaniu przez 10 minut przy 4000 g, supernatant zebrano przez filtr 15 μm. Supernatant przechowywano w -70 C do dalszych prób izolowania wirusa. W celu ponownego wyizolowania wirusa, 0,2 ml każdego z supenatantów wątroby dodano do 30 ml pożywki RPMI 1640 (5% FCS) zawierającej 3x10 5 komórek MDCC-MSB1 na ml. Po inkubacji przez 2 lub 3 dni w 37 C (5% CO 2 ), komórki MDCC-MSB1 badano mikroskopowo na obecność efektu cytopatycznego charakterystycznego dla CAV (duże, obrzmiałe komórki z przejrzystą cytoplazmą). Gdy CPE charakterystyczny dla CAV nie wystąpił, komórki poddano subkulturze przez dodanie 5 ml zawiesiny komórek MDCC-MSB1 do 25 ml świeżej pożywki RPMI 1640 (5% FCS). Następnie, zawiesinę komórkową ponownie inkubowano przez 2 lub 3 dni w 37 C (5% CO 2 ). Zawiesiny komórek MDCC-MSB1 poddawano subkulturze do 10 razy, albo dopóki nie zaobserwowano CPE charakterystycznego dla CAV. Gdy zaobserwowano CPE charakterystyczny dla CAV, zebrano zawiesinę komórka-wirus i wirowano przez 10 minut przy 4000 g. Supernatant zebrano i przechowywano w -70 C do dalszego użycia. B. W kolejnym doświadczeniu badano, czy szczepy CAV według wynalazku można odróżnić od znanych kurzych i indyczych szczepów CAV testem neutralizacji wirusa, z użyciem przeciwciał monoklonalnych R2, pozytywnych i negatywnych surowic kurzych skierowanych przeciwko CAV. Materiały i metody Szczepy CAV Kurzy szczep CAV 26P4 (typ dziki i atenuowany); zgłoszenie patentowe EP 0533294; Kurzy szczep CAV Gifu (typ dziki i atenuowany); zgłoszenie patentowe EP 0533294; Kurzy szczep CAV Angstrom; Angstrom i in., Avian Pathol. 17:23-32, 1988; Kurzy szczep CAV Cux; von Bülow i in., Zentralbl. Veterinarmed. 30:742-750, 1983; Kurzy szczep CAV Clone-1; Lamichane i in., Avian Dis. 35:515-522, 1991; Kurzy szczep CAV; izolat holenderski, szczep referencyjny; Szczepy indycze CAV 18938, SP6198, 18933, 17382, 319, 3571, 3533, 3527, 3570, 3572, 18012, 18936, 18010 i 18941. Przeciwciała skierowane przeciwko CAV Przeciwciało monoklonalne R2; Surowica pozytywna CAV; Surowica negatywna CAV. Test neutralizacji wirusa Rozpoczynając od rozcieńczenia przynajmniej 1:16, wytworzono kolejno dwukrotne rozcieńczenia próbki referencyjnej przeciwciał monoklonalnych w płytce do mikromiareczkowania w pożywce do hodowli tkankowej (RPMI 1640 + 5% FCS) kończąc na 50 μl każdego z rozcieńczeń (surowice pozytywne i negatywne włączono stosując te same rozcieńczenia). Następnie, do każdego z rozcieńczeń przeciwciała monoklonalnego R2 dodano równą objętość zawiesiny CAV. W celu śledzenia miana zakaźności CAV w teście neutralizacji, równocześnie miareczkowano rozcieńczenie robocze CAV. Dlatego, kolejne 10-krotne rozcieńczenia (10-1 do 10-4 ) każdego z rozcieńczeń roboczych CAV wytworzono w probówkach poza płytką do mikromiareczkowania. Następnie, 50 μl każdego z rozcieńczeń przeniesiono do płytki do mikromiareczkowania w 12-krotnym powtórzeniu. Kolejne 12 studzienek tej samej płytki wypełniono 100 μl pożywki do hodowli tkanek służącej jako kontrola negatywna. Następnie, do rozcieńczeń wirusa dodano 50 μl pożywki do hodowli tkanek. Mieszaniny wirusa z przeciwciałami monoklonalnymi i rozcieńczenia wirusa inkubowano przez noc w 4 C. Następnie, do mieszanin wirusa z przeciwciałami, jak również rozcieńczeń wirusa i kontroli miareczkowania, dodano 100 μl zawiesiny komórek MDCC-MSB1, zawierającej 6x10 5 komórek. Płytki do mikromiareczkowania przeniesiono do inkubatora (37 C, 5% CO 2 ). Po inkubacji przez dwa do trzech dni w 37 C, komórki objęte miareczkowaniem badano na obecność efektu cytopatycznego (CPE) charakterystycznego dla CAV. Gdy miareczkowanie wykazało, że było obecne mniej niż 300 do 1000 TCID 50 CAV na 50 μl, komórki włączone do testu neutralizacji i miareczkowania poddano subkulturze i ponownie inkubowano przez dwa do trzech dni w 37 C. Procedurę inkubacji i subkultury komórek przeprowadzono dopóki miano CAV nie osiągnęło 300 do 1000 TCID 50 na 50 μl. Miana CAV obliczono zgodnie z metodą Reed i Muench (American Journal of Hygiene. 27:493-497, 1937).
8 PL 202 168 B1 Miana przeciwciał określono przez badanie komórek dodanych do mieszanin wirusa-przeciwciał na obecność CPE charakterystycznego dla CAV. Miano przeciwciał (log 2 ) wyrażano jako odwrotność najwyższego rozcieńczenia próbki referencyjnej przeciwciał monoklonalnych R2, w którym szczepy CAV są całkowicie neutralizowane, tj. nie obserwowano CPE charakterystycznego dla CAV. Gdy miano przeciwciała próbki referencyjnej przeciwciała monoklonalnego R2 wynosi <5 (log 2 ), uważa się, że konkretny szczep CAV nie jest neutralizowany przez przeciwciało R2. Wyniki T a b e l a 1: Log 2 mian przeciwciał oznaczony w teście neutralizacji wirusa R2 Surowica pozytywna CAV Surowica negatywna CAV Szczepy kurze CAV 26P4 (typ dziki) <4 13 <4 CAV 26P4 (atenuowany) <4 13 <4 CAV Gifu (typ dziki) <4 13 <4 CAV Gifu (atenuowany) <4 13 <4 CAV Cux-1 <4 13 <4 CAV Angstrom <4 12 <4 CAV Clone-1 <4 13 <4 CAV izolat holenderski <4 11 <4 Szczepy indycze CAV SP6198 <4 12 <4 CAV 319 16 11 <4 CAV 18938 16 12 <4 CAV 18933 14 10 <4 CAV 17382 7 10 <4 CAV 3571 16 11 <4 CAV 3533 16 12 <4 CAV 3527 16 12 <4 CAV 3570 16 12 <4 CAV 3572 16 12 <4 CAV 18012 16 12 <4 CAV 18936 16 12 <4 CAV 18010 16 12 <4 CAV 18941 16 12 <4 Wnioski Test neutralizacji wirusa ujawnił, że grupa szczepów indyczych CAV, która wykazuje niską patogenność wobec kurcząt może być odróżniona od atenuowanych i patogennych izolatów kurzego CAV i patogennych izolatów indyczych (Tabela 1). Przeciwciało monoklonalne R2 neutralizuje jedynie słabo patogenne szczepy CAV indyków, podczas gdy nie neutralizuje patogennego izolatu indyczego, ani żadnego ze znanych izolatów kurzych. Wyniki doświadczeń dotyczących patogenności pokazano w Przykładzie 2.
PL 202 168 B1 9 P r z y k ł a d 2 Charakterystyka in vivo szczepów CAV o słabej patogenności A. W doświadczeniu tym, izolaty CAV zbadano na patogenność na kurczętach SPF. Patogenność izolatów CAV ustalono przez badanie makroskopowe grasicy i szpiku oraz oznaczenie wartości hematokrytu (Ht). Protokół doświadczenia Jednodniowe kurczęta SPF zaszczepiano domięśniowo przy użyciu 10 6 TCID 50 każdego z izolatów CAV. Jedna grupa kurcząt nie została zaszczepiona, aby służyć jako kontrola. Z każdej grupy pobrano pewną liczbę kurcząt w wieku 14 dni. Próbki krwi gromadzono w celu oznaczenia wartości Ht. Grasicę i szpik badano makroskopowo. Pozostałe kurczęta trzymano do osiągnięcia wieku czterech tygodni. Kurczętom pobrano próbki krwi przed rozpoczęciem doświadczenia i w wieku czterech tygodni. Surowice badano na obecność/nieobecność przeciwciał CAV w teście neutralizacji wirusa, jak to opisano powyżej. Rzeczywiste miano zakaźności preparatów zastosowanych do zaszczepienia określono przez miareczkowanie na komórkach MDCC-MSB1 według procedur standardowych. Zawiesiny wiruskomórkowe poddano subkulturze co 2-3 dni do około 10 razy. Następnie, określono miano końcowe przez mikroskopowe badanie komórek na obecność CPE charakterystycznego dla CAV. Miano obliczono według metody Reed i Muench (1937, wyżej). Wyniki Wyniki badania makroskopowego i oznaczenia hematokrytu podsumowano w Tabeli 2. Wyniki serologii podsumowano w Tabeli 3. Nie można było wykryć przeciwciał CAV w surowicach pochodzących od 10-dniowych kurcząt pochodzących z tych samych wylęgów. Również, nie można było stwierdzić przeciwciał przeciwko CAV w surowicach pochodzących od 4-tygodniowych kurcząt kontrolnych. T a b l i c a 2: Wyniki badania makroskopowego i oznaczenia Ht Inokulum Podawane rzeczywiste miano zakaźne (log 2 TCID 50 ) % kurcząt z atrofią grasicy % kurcząt z bladym szpikiem % kurcząt z anemią (Ht<27%) Szczepy kurze CAV Clone-1 6,0 79% 50% 21% CAV Gifu 5,8 100% 100% 67% Szczepy indycze CAV SP6198 4,9 100% 93% 20% CAV 18938 4,9 40% 0 0 CAV 18933 5,3 0 0 0 CAV 17382 6,6 53% 27% 7% CAV 319 6,1 13% 0 0 Inokulum T a b l i c a 3: Wyniki badania serologicznego Log 2 średniego miana przeciwciał CAV w wieku 4 tygodni 1 2 CAV Clone-1 nd CAV Gifu 12,0 (± 0,0) CAV SP6198 9,9 (± 1,7) CAV 18938 10,3 (± 1,6)
10 PL 202 168 B1 cd. tabeli 3 1 2 CAV SP6198 9,9 (± 1,7) CAV 18933 10,8 (± 1,3) CAV 17382 10,2 (± 1,5) CAV 319 11,4 (± 1,0) () = standardowe odchylenie nd = nie wykonano Wnioski Wyniki otrzymane w tym doświadczeniu wskazują, że szczepy CAV według wynalazku wykazują zmniejszoną patogenność wobec kurcząt, w porównaniu ze szczepami CAV pochodzącymi od innych szczepów kurzych i indyczych. B. W tym doświadczeniu badano, czy szczepy CAV wyizolowane od indyków wywołują zmiany w zarodkach charakterystyczne dla CAV. W europejskim zgłoszeniu patentowym nr 0533294 ujawniono atenuowane CAV o zmniejszonej zjadliwości wobec kurcząt. Ta korzystna właściwość jest związana z właściwością wirusów ze stanu techniki do wywoływania zmian w zalęgniętych jajach. Protokół doświadczenia 30 zapłodnionych jaj SPF zaszczepiono po 0,2 ml każdego ze szczepów CAV drogą przez woreczek żółtkowy. Objętość inokulum zawierała zakaźne miano w wysokości 10 6 TCID 50. Jako kontrolę pozytywną zaszczepiono 30 jaj SPF atenuowanym szczepem CAV 26P4, o którym wiadomo, że wywołuje zmiany w zarodkach. 30 zapłodnionych jaj SPF, których nie zaszczepiono, służyły jako kontrola negatywna. Następnie, jaja inkubowano w inkubatorze w 37 C. Od 7 dnia życia zarodkowego jaja codziennie prześwietlano. Śmierć zarodka poniżej 10 dnia życia zarodkowego uważano za niewywołaną przez CAV i dlatego jajo takie usuwano. Śmierć zarodka występującą od 11 dnia życia embrionalnego uważano za spowodowaną przez CAV, i dlatego pobierano zarodki i badano mikroskopowo na obecność zmian wywołanych przez CAV. W 17 dniu życia zarodkowego wszystkie pozostałe zarodki zbierano i badano mikroskopowo na obecność zmian wywołanych przez CAV. Wyniki Śmierć zarodków pokazano w Tabeli 4 T a b e l a 4: Śmiertelność zarodków Inokulum Liczba zaszczep. jaj Dni życia zarodkowego 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 CAV 319 30 13 1-1 - - - 1 - - - CAV 18933 30 15 1 - - - - -- - - - - CAV 18938 30 15 - - 1 - - - 1 - - - CAV 26P4 atenuowany kontrola nieszczep. 30 11 - - 1 - - - 3 1-2 30 3 1 - - - - - - - - - Badanie mikroskopowe Szczep CAV 319 Zarodki obumarłe w 14 dniu życia zarodkowego nie wykazywały zmian charakterystycznych dla CAV. Podczas badania mikroskopowego 14 ocalałych 17-dniowych zarodków również nie zauważono zmian charakterystycznych dla CAV. Szczep CAV 18933 Podczas badania mikroskopowego 14 ocalałych 17-dniowych zarodków nie zauważono zmian charakterystycznych dla CAV.
PL 202 168 B1 11 Szczep CAV 18938 Zarodki obumarłe w 14 dniu życia zarodkowego nie wykazywały zmian charakterystycznych dla CAV. Podczas badania mikroskopowego 14 ocalałych 17-dniowych zarodków również nie zauważono zmian charakterystycznych dla CAV. Szczep CAV 26P4 (atenuowany) Zarodki obumarłe w wieku 14, 15 i 17 dni życia zarodkowego wykazywały zmiany charakterystyczne dla CAV. Podczas badania mikroskopowego 12 ocalałych 17-dniowych zarodków zauważono zmiany charakterystyczne dla CAV u sześciu zarodków. Wnioski Z doświadczenia można wywnioskować, że naturalnie występujące szczepy CAV wyizolowane od indyków nie wywołują zmian w zarodkach. P r z y k ł a d 3 Szczepienie in ovo Protokół doświadczenia 60 18-dniowych zalęgniętych jaj SPF zaszczepiono in ovo przy użyciu 0,2 ml dostępnej w handlu szczepionki CAV Nobilis szczep P4 (EP 0533294), szczepu CAV 319 albo homogenatu uzyskanego z zalęgniętych jaj SPF. Jaja zaszczepiono wyliczonym mianem zakaźności 10 3,0 TCID 50 na jajo. Po zaszczepieniu, jaja przeniesiono do inkubatora i po wykluciu kurczęta umieszczono w izolatkach podciśnieniowych. W 7, 14 i 21 dniu życia z każdej grupy pobrano 5 kurcząt. Zebrano próbki krwi do oznaczenia hematokrytu. Następnie, kurczęta zabito do badania pośmiertnego. Badanie pośmiertne grasicy i szpiku przeprowadzono mikroskopowo. W 6 i 8 tygodniu życia próbki krwi pobrano od pewnej liczby kurcząt z każdej grupy i badano surowice na obecność/nieobecność przeciwciał CAV. Przez okres 8 tygodni po wykluciu, kurczęta obserwowano codziennie na okoliczność objawów klinicznych choroby albo śmiertelności. Materiały i metody Miareczkowanie wirusa Rzeczywiste miano zakaźności określono przez miareczkowanie na komórkach MDCC-MSB1, stosując standardową procedurę opisaną powyżej. Oznaczanie hematokrytu Próbki krwi obwodowej pobrano w podwójnym powtórzeniu do heparynizowanych kapilarów hematokrytowych (Ht). Po wirowaniu przez 10 minut przy 15000 g, odczytano wartości hematokrytu. Następnie obliczono dla każdego kurczęcia średnią wartość Ht. Uznano, że kurczęta o Ht poniżej 27% mają anemię. Badanie mikroskopowe Podczas badania mikroskopowego określono procent zwierząt dotkniętych atrofią grasicy i bladością szpiku. Obserwacja objawów klinicznych choroby Podczas trwania doświadczenia, wszystkie kurczęta obserwowano codziennie na obecność objawów klinicznych choroby albo śmiertelności. Serologia Próbki surowicy badano na obecność/nieobecność przeciwciał CAV stosując kompetycyjny enzymatyczny test immunosorpcyjny (ELISA) z antygenem CAV związanym z fazą stałą, przeciwciałem monoklonalnym przeciwko CAV i HRP sprzęgniętą z awidyną. Miana przeciwciał (log 2 ) stanowiły odwrotność najwyższego rozcieńczenia surowic, w których biotynylowane przeciwciało monoklonalne nie wiązało się maksymalnie. Próbki surowic o mianach <5 (log 2 ) uważano za negatywne pod względem przeciwciał CAV. Szczepienie in ovo Tępy koniec 18-tygodniowych zalęgniętych jaj SPF oczyszczono roztworem jodyny w celu zdezynfekowania powierzchni. Następnie, wykonano otwór w skorupce przy użyciu wiertła do jajek. Następnie jaja zaszczepiano rozcieńczeniem wirusa przy użyciu strzykawki Diskardit 1,0 ml i igieł Microlance orange 0,6x25. Przed przeniesieniem jaj do inkubatora, otwory zaklejano parafiną. Wyniki Miareczkowanie zakaźności Stwierdzone rzeczywiste miana zakaźności inokulów podano niżej: Szczepionka CAV Nobilis szczep P4 : 10 1,9 TCID 50 /jajo
12 PL 202 168 B1 Szczep CAV 319 : 10 2,9 TCID 50 /jajo Wyniki badania makroskopowego Średnią ocen badania makroskopowego pokazano w Tabeli 5. Szczepionka CAV Nobilis szczep P4 W 7 i 21 dniu życia nie zaobserwowano zmian w grasicy. W 14 dniu życia 3 kurczęta wykazywały niewielką atrofię grasicy, zaś dwa kurczęta wykazywały umiarkowaną atrofię grasicy. W dniu 7, 14 i 21 nie zaobserwowano zmian w szpiku. Szczep CAV 319 W 7, 14 i 21 dniu życia nie zaobserwowano zmian w grasicy i szpiku. Negatywny homogenat zarodka W 7, 14 i 21 dniu życia nie zaobserwowano zmian w grasicy i szpiku. Oznaczanie wartości hematokrytu Wartości hematokrytu określone w 7, 14 i 21 dniu życia pokazano w Tabeli 6. Wszystkie określone wartości hematokrytu wynosiły powyżej 27%. Serologia Średnie miano przeciwciał CAV pokazano w Tabeli 7. Szczepionka CAV Nobilis szczep P4 W szóstym tygodniu życia wykryto przeciwciała przeciwko CAV w 15 spośród 17 badanych surowic. W ósmym tygodniu wszystkie 17 kurcząt odpowiedziało na CAV. Szczep CAV 319 W szóstym tygodniu życia przeciwciała przeciwko CAV wykryto w 17 spośród 18 badanych surowic. W 8 tygodniu życia wszystkie 18 kurcząt odpowiedziało na CAV. Negatywny homogenat zarodka W szóstym i ósmym tygodniu życia we wszystkich badanych surowicach nie wykryto CAV. Obserwacja objawów klinicznych W trakcie doświadczenia nie zaobserwowano objawów choroby i śmiertelności u kurcząt zaszczepionych szczepem P4, szczepem 319 czy negatywnym homogenatem zarodkowym. Dyskusja Po zaszczepieniu 18-dniowych zalęgniętych jaj szczepem P4 CAV albo szczepem CAV 319, nie zaobserwowano objawów klinicznych w trakcie doświadczenia. Oznaczanie wartości hematokrytu wykazało, że żadne kurczę nie było anemiczne. Badanie serologiczne wykazało, że większość kurcząt zaszczepionych szczepem CAV 319 albo szczepem CAV P4 uległo serokonwersji w 6 tygodniu życia. Badanie makroskopowe ujawniło, że szczep CAV P4 indukował niewielką do umiarkowanej atrofię grasicy tylko w 14 dniu życia. Jednakże, szczep CAV P4 nie wywoływał zmian w szpiku kostnym. Badanie makroskopowe dalej ujawniło, że szczep CAV 319 nie wywołuje zmian w grasicy i szpiku kostnym. Wnioski Z doświadczenia można wywnioskować, że po zaszczepieniu in ovo 18-dniowych zalęgniętych jaj SPF, szczep CAV 319 jest mniej patogenny dla kurcząt, niż atenuowana szczepionka CAV Nobilis szczep P4. T a b e l a 5: Wyniki badania makroskopowego Procent zmian patologicznych obserwowanych w danym dniu Inokulum Szpik Grasica 7 14 21 7 14 21 CAV Nobilis szczep P4 0% 0% 0% 0% 100% 0% CAV 319 0% 0% 0% 0% 0% 0% Negatywny homogenat zarodkowy 0% 0% 0% 0% 0% 0%
PL 202 168 B1 13 Inokulum CAV Nobilis szczep P4 T a b e l a 6: Wartości hematokrytu Średnia wartość Ht (%) oznaczona w danym dniu życia 7 14 21 33,0 (± 1,0) 34,6 (± 2,3) n. d. CAV 319 32,4 (± 1,1) 34,4 (± 3,4) 34,2 (± 1,5) Negatywny homogenat zarodkowy 32,4 (± 1,1) 34,2 (± 1,6) n.d. n.d. = nie oznaczono z powodu zniszczenia probówek hematokrytowych podczas wirowania. () = standardowe odchylenie. Inoculum T a b e l a 7: Wyniki serologii Średnia log 2 miana przeciwciał CAV w danym tygodniu życia 6 tygodni 8 tygodni CAV Nobilis szczep P4 6,5 (± 1,4) 7,8 (± 1,2) CAV 319 6,9 (± 1,8) 8,8 (± 2,2) Negatywny homogenat zarodkowy () = odchylenie standardowe <4,0 (± 0,0) <4,0 (± 0,0) Zastrzeżenia patentowe 1. Wirus kurzej anemii (CAV), znamienny tym, że jest neutralizowany przez próbkę referencyjną obejmującą przeciwciało monoklonalne R2 wydzielane przez linię hybrydoma, zdeponowaną w ECACC pod numerem 00020304, przy czym wirus kurzej anemii jest swoiście neutralizowany w teście neutralizacji przez próbkę referencyjną przeciwciała monoklonalnego R2, której miano próbki referencyjnej przeciwko CAV wynosi co najmniej 5 log 2 na 50 μl, podczas badania wobec 300-1000 TCID 50 na 50 μl CAV. 2. CAV według zastrz. 1, znamienny tym, że wirus jest w postaci żywej. 3. CAV według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że miano próbki referencyjnej przeciwko CAV wynosi przynajmniej 10 (log 2 ) na 50 μl, bardziej korzystnie przynajmniej 12 (log 2 ) na 50 μl albo nawet przynajmniej 14 (log 2 ) na 50 μl w badaniu wobec 300-1000 TCID 50 na 50 μl CAV. 4. CAV według zastrz. 3, znamienny tym, że miano próbki referencyjnej przeciwko CAV wynosi przynajmniej 16 (log 2 ) na 50 μl, w badaniu wobec 300-1000 TCID 50 na 50 μl CAV. 5. CAV według zastrz. 4, znamienny tym, że jest szczepem CAV 319, którego próbkę zdeponowano w ECACC pod numerem 0012608. 6. Szczepionka do ochrony drobiu przed chorobą wywołaną zakażeniem CAV, obejmująca nośnik albo rozcieńczalnik dopuszczalny farmaceutycznie i substancję czynną, znamienna tym, że substancją czynną jest CAV określony w zastrz. 1-5. 7. Szczepionka według zastrz. 6, znamienna tym, że ponadto obejmuje adiuwant. 8. Szczepionka według zastrz. 6 albo 7, znamienna tym, że ponadto obejmuje jeden albo więcej składników innych patogenów zakaźnych dla drobiu wybranych z grupy składającej się z wirusa choroby Mareka, wirusa zakaźnego zapalenia oskrzeli, wirusa choroby Newcastle, wirusa zakaźnego zapalenia torby Fabrycjusza, adenowirusa drobiu, wirusa EDS, wirusa zakaźnego zapalenia nosa i tchawicy indyków, wirusa zapalenia krtani i tchawicy i reowirusa. 9. Sposób namnożenia CAV określonego w zastrz. 1-5, znamienny tym, że obejmuje etapy: a. zaszczepienia podatnego substratu wirusem kurzej anemii CAV;
14 PL 202 168 B1 b. namnażania wirusa; i c. zbierania materiału zawierającego CAV. 10. Sposób wytwarzania szczepionki do ochrony drobiu przed chorobą spowodowaną zakażeniem CAV, znamienny tym, że obejmuje łączenie zebranego CAV, uzyskanego sposobem określonym w zastrz. 9, w razie potrzeby po inaktywacji CAV, z nośnikiem albo rozcieńczalnikiem dopuszczalnym farmaceutycznie. 11. Zastosowanie CAV określonego w zastrz. 1-5, do wytwarzania szczepionki do szczepienia in ovo. 12. Zastosowanie CAV określonego w zastrz. 1-5, do wytwarzania szczepionki do podawania pozajelitowego kurczętom 1-dniowym. Departament Wydawnictw UP RP Cena 4,00 zł.